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Chemistry

化学イメージングのためのハイパースペクトル刺激ラマン散乱とコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡の直接比較

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63677
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Purdue University

Summary

この論文では、同じ顕微鏡プラットフォームに統合された誘導ラマン散乱(SRS)とコヒーレント抗ストークスラマン散乱(CARS)の解像度、感度、イメージングコントラストを直接比較します。結果は、CARSの空間分解能が優れており、SRSはコントラストとスペクトル分解能が優れており、どちらの方法も感度が類似していることを示しています。

Abstract

刺激ラマン散乱(SRS)およびコヒーレント抗ストークスラマン散乱(CARS)顕微鏡は、最も広く使用されているコヒーレントラマン散乱イメージング技術です。ハイパースペクトルSRSおよびCARSイメージングは、すべてのピクセルでラマンスペクトル情報を提供し、異なる化学組成のより良い分離を可能にします。どちらの技術も2つの励起レーザーを必要としますが、それらの信号検出スキームとスペクトル特性はまったく異なります。このプロトコルの目標は、ハイパースペクトルSRSとCARSイメージングの両方を単一のプラットフォームで実行し、異なる生物学的サンプルをイメージングするための2つの顕微鏡技術を比較することです。スペクトル集束法は、フェムト秒レーザーを用いてスペクトル情報を取得するために採用されています。標準的な化学サンプルを使用することにより、同じ励起条件におけるSRSとCARの感度、空間分解能、スペクトル分解能(すなわち、サンプルでのパワー、ピクセル滞留時間、対物レンズ、パルスエネルギー)が比較されます。生体サンプルのCARSとSRSのイメージングコントラストを並置して比較します。CARSとSRSの性能を直接比較することで、化学イメージングのモダリティを最適に選択することができます。

Introduction

ラマン散乱現象は、1928年にC. V. Raman1によって初めて観測された。入射光子がサンプルと相互作用しているとき、非弾性散乱事象が自発的に起こり得、光子のエネルギー変化は分析された化学種の振動遷移と一致する。このプロセスでは、化学タグを使用する必要がないため、サンプルの摂動を最小限に抑えながら、化学分析のための汎用性の高いラベルフリーツールになります。その利点にもかかわらず、自発的ラマン散乱は、低散乱断面(典型的には赤外線[IR]吸収断面よりも1011 低い)に悩まされ、分析2のために長い取得時間を必要とする。したがって、ラマン散乱プロセスの感度を高めるための探求は、ラマン技術をリアルタイムイメージングに推進する上で不可欠です。

ラマン散乱の感度を大幅に高める効果的な方法の1つは、コヒーレントラマン散乱(CRS)プロセスによるものであり、そのために2つのレーザーパルスが分子振動遷移を励起するために典型的に使用される3,4。2つのレーザー間の光子エネルギー差がサンプル分子の振動モードと一致すると、強いラマン信号が生成されます。イメージングに最も一般的に使用される2つのCRSプロセスは、コヒーレント抗ストークスラマン散乱(CARS)と刺激ラマン散乱(SRS)5です。過去20年間、技術開発により、CARSおよびSRS顕微鏡技術が進歩し、生体サンプル中の標識のない定量化および化学変化の解明のための強力なツールになりました。

CARS顕微鏡による化学イメージングは、Duncanら6によって実証されたように、レーザースキャニングがCARS画像を取得するために最初に適用された1982年にさかのぼることができます。CARS顕微鏡の近代化は、レーザー走査型多光子蛍光顕微鏡7の幅広い応用の後、大幅に加速されました。高繰り返し速度レーザーを使用したXieグループの初期の研究は、CARSを生物学的サンプル中の分子の特性評価のための高速、ラベルフリーの化学イメージングプラットフォームに移行しました8,9,10。CASイメージングの主な問題の1つは、非共振背景の存在であり、これは画像のコントラストを低下させ、ラマンスペクトルを歪める。非共鳴バックグラウンド11、12、13、14、15を減少させるか、またはCARSスペクトル16、17から共鳴ラマン信号を抽出するために多くの努力がなされている。この分野を大幅に進歩させたもう1つの進歩は、ハイパースペクトルCARイメージングであり、これは改善された化学的選択性18、19、20、21で各画像ピクセルでのスペクトルマッピングを可能にする。

刺激ラマン散乱(SRS)は、CARSよりも若いイメージング技術ですが、22年初めに発見されました。2007年に、低繰り返し率レーザー光源23を用いたSRS顕微鏡法が報告された。まもなく、いくつかのグループは、高繰り返し速度レーザー24、25、26を用いた高速SRSイメージングを実証した。CARSに対するSRS顕微鏡法の主な利点の1つは、非共振バックグラウンド27がないことであるが、クロスフェーズ変調(XPM)、過渡吸収(TA)、2光子吸収(TPA)、および光熱(PT)効果などの他のバックグラウンドがSRS28で起こり得る。さらに、SRS信号およびサンプル濃度は、二次信号濃度依存性を有するCARSとは異なり、線形関係を有する29。これにより、化学定量とスペクトルアンミキシングが簡素化されます。マルチカラーおよびハイパースペクトルSRSは、異なる形態30、31、32、33、34、35、36で進化しており、スペクトル集束は化学イメージングのための最も一般的なアプローチの1つである37,38。

CARSとSRSの両方は、信号励起のための分子の振動遷移に一致させるために、ポンプとストークスレーザービームをサンプルに集束させる必要があります。CARS顕微鏡とSRS顕微鏡にも多くの共通点があります。しかし、これら2つのプロセスの根底にある物理学と、これらの顕微鏡技術に関わる信号検出には、3,39の格差があります。CARSは、正味の光子-分子エネルギー結合3を持たないパラメトリックプロセスである。しかし、SRSはノンパラメトリックプロセスであり、光子と分子系27との間のエネルギー移動に寄与する。CARSでは、アンチストークス周波数で新しい信号が生成されますが、SRSはポンプとストークスレーザービーム間のエネルギー移動として現れます。

CARS 信号は Eq (1)28 を満たします。

Equation 1 (1)

一方、SRS信号はEq(2)28と書くことができる。

Equation 1(2)

ここで、Ip、Is、I CARSおよびΔISRSは、それぞれポンプビーム、ストークスビーム、CARS信号、およびSRS信号の強度である。χ(3) はサンプルの 3 次非線形光学感受性であり、実数部と虚数部で構成される複素数値です。

これらの方程式は、CARSとSRSのスペクトルプロファイルと信号濃度依存性を表します。物理学の違いにより、これら2つの顕微鏡技術の検出スキームが異なります。CARSにおける信号検出は、通常、新たに生成された光子のスペクトル分離と、光電子増倍管(PMT)または電荷結合素子(CCD)を用いた検出を伴う。SRSの場合、ポンプビームとストークスビーム間のエネルギー交換は、通常、光変調器を使用した高速強度変調と、ロックインアンプと対になったフォトダイオード(PD)を使用した復調によって測定されます。

近年、CARとSRSの両方の分野で多くの技術開発と応用が発表されていますが、特にハイパースペクトルCARSとSRS顕微鏡では、2つのCRS技術の体系的な比較は同じプラットフォーム上で行われていません。感度、空間分解能、スペクトル分解能、および化学分離能力を直接比較することで、生物学者は化学定量に最適なモダリティを選択できます。このプロトコルでは、フェムト秒レーザーシステムとスペクトル集束に基づくハイパースペクトルCARモダリティとSRSモダリティの両方を備えたマルチモーダルイメージングプラットフォームを構築するための詳細な手順が提供されます。2つの技術は、スペクトル分解能、検出感度、空間分解能、および細胞のイメージングコントラストについて順方向で比較されてきた。

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Protocol

1. ハイパースペクトルCRSイメージングのための機器セットアップ

メモ:CRS信号の生成には、高出力(クラス3Bまたはクラス4)レーザを使用する必要があります。安全プロトコルに対処し、このような高いピーク電力で作業する場合は、適切な個人用保護具(PPE)を常に着用する必要があります。実験する前に、適切なドキュメントを参照してください。このプロトコルは、ビーム経路の設計、フェムト秒パルスのチャープ、およびイメージング条件の最適化に焦点を当てています。このハイパースペクトルCRS顕微鏡の一般的な光学レイアウトを 図1に示す。ここに示すコンフィギュレーションは、CRS 顕微鏡用の多くの既存のコンフィギュレーションの 1 つです。このプロトコルで使用されるCRS顕微鏡システムは、デュアル出力フェムト秒レーザー光源とレーザー走査顕微鏡上に構築されています。

  1. レーザー光源が、ストークスビームとして使用される1,045nmの固定波長と、ポンプビームとして使用される680〜1,300nmの同調可能な波長を含む、80MHzの繰り返しレートを有する2つのフェムト秒パルス列(120fs幅)を提供することを確認する。出力パルスを光遅延差と同期させます。顕微鏡フレームを使用して、イメージングプラットフォームを構築します。
  2. ビーム経路の設計
    1. サンプルでのレーザー出力を制御するには、レーザービームごとに 1/2 波長板と偏光ビームスプリッター (PBS) の組み合わせを使用します。
    2. 音響光学変調器(AOM)をストークスレーザービーム経路に取り付けます。150 mm 焦点距離レンズでビームを AOM に集束させ、0 次出力 を 400 mm 焦点距離レンズと再コリメートします。
    3. 同じレンズペア(150 mmと400 mmの焦点距離)を使用して、レーザービームサイズとストークスを一致させるためにポンプビームを拡張します。
    4. 400mmの焦点距離レンズをポンプとストークスの両方のビーム経路に別々の1次元平行移動ステージに配置して、顕微鏡に入る前にビーム発散を微調整し、ビームサイズを最適化します。
    5. 光学遅延チューニングのために電動平行移動ステージに取り付けられた直角反射鏡でポンプビームを指示します。ストークスビームに光遅延が必要な場合は、代わりにこれらのコンポーネントをビームパスに配置します。
    6. カットオフ波長が約1,000nm(ポンプとストークス波長の間)のダイクロイックミラーで両方のビームを結合できるようにして、ストークスビームがダイクロイックミラーを通過し、ポンプビームがダイクロイックミラーで反射されるようにします。コリンアーリー結合レーザービームを顕微鏡に送ります。
    7. ポンプとストークスの梁をチャープするには、ガラス棒を梁の経路に配置します。詳細については、ステップ 1.5 を参照してください。
    8. 適切なアライメントとビームサイズを確認するには、ダイクロイックミラーの後と顕微鏡の前に虹彩ダイヤフラムを使用します。具体的には、ダイクロイックミラーに近い位置に、もう一方をダイクロイックミラーから離れた位置に設置し、良好な位置合わせとビームの重なりを確認します。IRビューイングカードまたはIRビューアを使用して、アライメント中のビームを視覚化します。
    9. 高速PDとオシロスコープを使用して、ポンプとストークスパルス間の光学遅延をほぼ測定します。レーザーパルス列をサンプリングしてオシロスコープをトリガーします。
    10. ポンプビームをブロックし、ストークスビームをサンプリングします。パルスの1つを拡大し、その上に垂直カーソルを置いて、オシロスコープ上の時間的位置をマークします。
    11. ポンプビームのブロックを解除し、ストークスビームをブロックします。サンプルポンプのパルスが時間的にマークされた位置に揃うまで、遅延ステージを平行移動します。
  3. レーザー走査顕微鏡
    1. 直立顕微鏡構成の場合は、組み合わせたレーザービームを潜望鏡に通し、適切なレベルまで上昇してから2Dガルボスキャンミラーに到達します。
    2. 顕微鏡の前にレーザービームのサイズを測定し、ガルボミラーの後に適切なレンズペアを設定して、対物レンズの入射瞳孔のサイズに最も一致するようにレーザービームを拡大します。
    3. 対物レンズの背面絞りと2つのガルボミラーの中心を共役平面として、2つのレンズを使用して4-fシステムを構築します。または、レーザースキャン用に2つの4-fレンズシステムを備えた2つの別々の1Dガルボミラーを使用します。
    4. コンデンサーの後、信号収集のためにレーザービームを反射するフリップミラーに2を設計します。直径2のレンズを送信ビーム経路に配置して、送信信号を完全に収集し、検出器に焦点を合わせます。
    5. 776nmにカットオフを有するダイクロイックミラーを用いてCARS信号をPMTに向け、送信されたSRS信号をPDが検出できるようにします。PMTの前にバンドパスフィルタ(655/30nm)を使用して、残留励起レーザパルスを除去します。PDの前にショートパスフィルタ(980nmショートパス)を使用して、ストークスビームが検出器に入るのをブロックします。
    6. CARS信号検出の場合は、PMTの後、データ・アクイジション・システムに信号を送信する前に、プリアンプと電流電圧コンバータを接続します。PMT電圧を調整して、信号と画像のコントラストを最適化します。
    7. ファンクションジェネレータを使用してAOMを1~10MHzで変調し、ロックイン復調のリファレンスと同じ周波数を使用します。ロックインアンプを使用して、データ集録前にSRS信号を抽出します。
  4. データ集録と表示
    1. デジタルデータ集録(DAQ)カードと端子台を組み合わせてデータ集録を行います。
    2. DAQからのアナログ出力を使用して、信号集録用のガルボミラーとアナログ入力を制御します。
    3. LabVIEWをベースにしたラボ作成のソフトウェアを使用して、画像をリアルタイムで表示および保存できる同時マルチチャンネルディスプレイを備えています( 補足ファイルを参照)。
  5. フェムト秒光源を鳴らし、スペクトル分解能を測定する
    注:スペクトル集束を使用して良好なスペクトル分解能を達成するために、ガラス棒を使用して、フェムト秒からピコ秒までの分散液およびチャープレーザーパルスを導入する。最高のスペクトル分解能を達成するには、ポンプビームのチャープレートをストークスビームのチャープレートと等しくする必要があります。このレーザーシステムの場合、最大120 fsの出力レーザーパルスをポンプの場合は3.4 ps、ストークスの場合は1.8 psにチャープすることで、最高のスペクトル分解能を達成できます。このチャーピングは、後述するように、150 mm ガラス棒 (SF-57) の組み合わせの 4+1 の組み合わせ (結合ビームに 4 つ、ストークス ビームでのみ 1 つ) を使用することによって達成され、15 cm-1 のスペクトル分解能を達成する必要があります。パルス持続時間は、オートコレレータを使用して測定することができます。
    1. 150 mm のガラス棒をストークスビーム経路のみに挿入します。
    2. 2本の150 mmガラス棒をダイクロイックビームスプリッターの後のポンプ/ストークスビーム経路に挿入します。チャーピングを増やすには、ロッドの一端に誘電体ミラーを配置して、結合されたレーザービームを2つのガラスロッドに二重通過させます。
    3. スペクトル分解能を測定するには、標準的な化学物質(例えば、ジメチルスルホキシド[DMSO])サンプルを2つのガラスカバーグラスの間に押し込み、最大信号が達成されるまで遅延段階をスキャンします。
    4. 光遅延を赤方偏移方向に1,000μm移動させます。次に、ブルーシフト方向に向かって10μm/ステップで200フレームを実行し、ハイパースペクトル画像スタックを収集します。
    5. フレーム番号を波数に変換するには、DMSO および対応するフレーム番号40 からの対称 (2,913 cm-1) および非対称 (2,994 cm-1) の C-H ストレッチを使用して線形回帰を実行します。
    6. XPM信号を使用して、スペクトル集束強度プロファイルを測定します。コンデンサーのダイアフラムを半分閉じ、フォーカスを空のカバースリップに移動します。ハイパースペクトルSRSの場合と同じステップ数を収集します。CARS非共振背景を測定するには、ガラスカバースリップに焦点を合わせ、ハイパースペクトルCARS測定の同じステップ数を収集します。
  6. 画像の信号対雑音比(SNR)の最適化
    1. システムアライメント用の化学サンプルを準備します。サンプル調製については、ステップ 3.1 で説明した手順に従います。
      注:DMSOは、強いラマンシグナルとよく分離されたC-H対称および非対称ピークを有する一般的なラボ化学物質であるため、良い選択です。
    2. サンプルを顕微鏡ステージに置き、必要に応じて対物レンズまたはコンデンサーに水または浸漬油を加えます。DMSO液滴の端を視野内で適切に動かし、対物レンズを調整して最適な焦点を得ます。ケーラー照明法41を用いて凝縮器をセンタリングする。コンデンサーのダイヤフラムを完全に開きます。
    3. ポンプビームの波長を800 nm(1,045 nm Stokes)に調整して、2,913 cm-1 CH3 ピークをターゲットとします。1/2波長板を調整して、ポンプとストークスビームの両方のパワーを顕微鏡の前に〜30mW(サンプル面で〜10mWのパワー)に設定します。
    4. SRS の場合、時定数が 7 μs でロックイン アンプのゲインを ~10 に設定します (10 μs ピクセルのドウェル時間を使用する場合)。時定数がピクセルの滞留時間よりも小さいことを確認します。SRS 信号の AUX 出力には Demod R を使用します。
    5. CARSの場合は、PMT出力をプリアンプと電流電圧コンバータに送ります。DAQを使用してコンバータから出力を集録します。
    6. 画像取得パラメータを集録ソフトウェアで設定します。200 x 200 のピクセル番号を使用し、スキャン サイズは 100 x 100 μm2 です。イメージに DMSO 液滴と空の領域の両方が含まれていることを確認します。
    7. サンプルをスキャンし、コンピュータ画面で画像を確認します。リアルタイム画像を監視しながら、ストークス/ポンプビームの電動遅延ステージをスキャンします。信号が最大になるまで遅延をスキャンします。
    8. DMSO液滴を視野全体をカバーするように動かし、DC信号の最大値が画像の中央にあるかどうかを確認します(信号はポンプビームに依存します)。ミラー を介して ポンプビームの位置またはイメージングソフトウェアで電圧オフセットを調整します。
    9. DC最適化後、〜50%の飽和度を表示するようにしきい値を調整して、AC信号が最大になるまでストークスビームミラーを調整します。彩度が画像の中央にあるかどうかを確認します。そうでない場合は、ストークスビームでのみミラーを微調整します。アライメント中の信号を、アライメントの品質に関するリアルタイムのフィードバックとして監視します。
    10. SNRを求めるには、DMSO画像の小さな領域を選択し、平均値を測定します。ノイズについては、画像の空の領域の小さな領域を選択し、平均値と標準偏差の両方を決定します。信号平均値からノイズ平均値を減算し、結果を空領域の標準偏差で除算します。
    11. 計算されたSNRが十分に高くない場合(この電力の組み合わせで、PMT電圧0.4VでSRSの場合は通常800~1,000、CARSの場合は>10,000)、ビームオーバーラップ、ビームサイズ、遅延段位置を確認して再最適化し、AOMを微調整し、期待されるSNRが得られるまでファンクションジェネレータの変調周波数を変更します。

2. 画像解析・データ処理

  1. SNR 分析
    1. ImageJ ソフトウェアを開きます。保存した DMSO サンプル.txtファイルをインポートするには、[ファイル|] をクリックします。 インポート|テキスト画像|開く。
    2. 画像が読み込まれたら、Ctrl + Shift + Cを押して明るさとコントラスト機能(B&C)を表示します。最大サンプル信号を見つけるには、DMSOサンプルの領域が飽和しているように見えるまで、B&Cの自動ボタンを押します。
    3. ImageJ インターフェイスの 楕円形 選択ツールをクリックし、飽和 DMSO 領域の小さな領域を強調表示します。ハイライト表示されたら、 M キーを押して、選択した領域の平均と標準偏差を測定します。
    4. 背景を測定するには、空の領域の信号が観測されるまで、B&C関数のバーを調整します。 楕円形 の選択範囲をクリックし、手順 2.1.3 と同じサイズの背景の領域を強調表示します。選択した領域に DMSO が含まれていないことを確認します。 M を押して、選択した領域の統計を測定します。
    5. ステップ 1.6.10 に従って SNR を計算します。
  2. ハイパースペクトルCRS画像の処理
    1. ステップ 2.1.1 に従って.txtファイルをインポートします。インポートしたら、[画像|]をクリックします。 スタック|ツール|積み重ねるモンタージュ... をクリックして、ファイルをイメージスタックに変換します。
    2. 最初の DMSO ピークが表示されるまでモンタージュをスクロールします。DMSOで領域を選択し、[画像]|をクリックします。 スタック|Z軸プロファイル をプロットして、強度対フレーム数スペクトルをプロットします。生のスペクトルデータを抽出するには、リストをクリックしてプロファイルデータをコピーします。
    3. 回復したスペクトルを波数単位に変換するには、手順 1.5.5 で概説した線形回帰を実行します。
  3. スペクトル分解能を測定するためのフィッティング
    注:ローレンツ関数は、SRSスペクトルとCARSスペクトル28を適合させるために使用されます。
    1. フィッティングソフトウェアを開き、線形回帰データをコピーしてプログラムに貼り付けます。SRS データを当てはめるには、データを強調表示し、散布図としてデータをプロットします。
    2. 散布図を引き上げます。 [解析|]をクリックします。ピークとベースライン|複数のピークフィット|ダイアログを開き 、ピークアナライザを表示します。プルアップしたら、入力が現在のプロットであることを確認し、ピーク関数をローレンツ(ローレンツ)に変更します。
    3. グラフ上の 2 つの DMSO ピークのそれぞれをダブルクリックして、フィッティングする領域を強調表示します。次に、「 NLfitを開く 」をクリックして フィッティング ウィンドウを表示します。 [収束するまで適合] ボタンをクリックし、[ OK]をクリックして、適合係数の表形式の要約を表示します(Eq (3)を参照)。
      メモ: 以下の式は、ソフトウェアのローレンツ関数形式を示しています。1/2 は適合ピークの振幅、w1/2 は適合ピークの幅、x01/02 値は適合ピークの中心です。独立変数は x で、従属変数は y です。
      Equation 1 (3)
    4. CARS スペクトルフィッティングについては、「解析」|をクリックしてください。 フィッティング|非線形カーブフィット|ダイアログを開きます。 カテゴリ: 新規 を選択して、CARS の新しい関数を定義します。CARS スペクトルフィッティングには、以下で定義する 2 ピークの CARS フィッティング関数 (Eq (4) を参照) を使用します。
      Equation 1 (4)
  4. 空間分解能の決定
    メモ: この手順を実行する前に、特定の倍率でのピクセルサイズ、ピクセル番号、およびステップサイズ (μm 単位) の間の変換を把握しておくことが重要です。これは、予想されるイメージング解像度よりも大きい既知の直径のサンプルを使用し、そのラインプロファイルを測定し、ガウス関数をフィッティングして半値での全幅(FWHM)値を決定することによって実行できます。分離ターゲットまたはポリマービーズなどの均一なサンプルを使用することができる。
    1. 直径200nm未満の細胞またはポリマー粒子の画像を取得します。
    2. ImageJ を使用して、画像内の最小のパーティクルに線を描画します。
    3. Kを押して強度プロファイルをプロットします。
    4. ポップアップウィンドウから リスト をクリックし、フィッティングソフトウェアに情報をコピーします。
    5. 継ぎ手ソフトウェアでプロファイルをプロットし、ガウス継ぎ手を使用します( 解析|をクリックフィッティング|非線形カーブフィット|ダイアログ|を開くカテゴリ: 基本機能;機能:ガウス)。
    6. フィッティング後にピーク幅を読み取ります。ピクセルを使用してサイズ変換を行い、顕微鏡の実際の解像度を取得します。

3. ハイパースペクトルCRSイメージング用サンプルの調製

  1. イメージングスライドおよび化学サンプルの調製
    1. カバースリップの上に両面テープを貼り、貼ったテープの中央から小さな長方形のテープを切り取り、サンプルを入れるためのオープンエリアを作ります。
    2. 純粋なDMSOのピペット1〜2μLを、空孔の中心に液滴を分配する。
    3. 上部カバースリップを慎重に置き、カバースリップの端を静かに押してチャンバーを密封し、DMSOサンプルがテープの端に接触しないようにします。
    4. 感度実験のために、DMSOの段階希釈物を重水素酸化物(D2O)で調製し、50%〜0%の濃度範囲を与える。各溶液を1〜2μL採取し、上記のようにプレスサンプルを調製する。
  2. 細胞調製
    1. ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)の35 mmガラス底皿(またはそれ以上)に、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを入れた細胞を播種します。
    2. 〜50%〜80%のコンフルエンシーが達成されるまで、5%CO2 雰囲気中で37°Cのインキュベーションチャンバ中で一晩またはそれ以上細胞をインキュベートする。
    3. 生細胞を直接イメージングするか、イメージング用の10%ホルマリン溶液で細胞を固定します。

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Representative Results

スペクトル分解能の比較
図2は、DMSOサンプルを用いたハイパースペクトルSRS(図2A)およびCARS(図2B)顕微鏡のスペクトル分解能を比較したものである。SRSスペクトルについては、スペクトルに適合するように2つのローレンツ関数(プロトコルステップ2.3を参照)を適用し、2,913cm-1ピークを用いて14.6cm-1の分解能を得た。CARSでは、ガウスバックグラウンドを持つ2ピークフィッティング関数(プロトコルステップ2.3を参照)をフィッティングに利用し、スペクトル分解能は17.1cm-1でした。これらの結果は、同じ測定条件で、SRSがCARSよりも優れたスペクトル分解能を有することを示している。CARSのスペクトル分解能の低下は、主に非共振バックグラウンドの関与によって寄与されます。さらに、SRSとCARSでは、対称(2,913 cm-1)と非対称(2,995 cm-1)のピーク比が非常に異なることがわかった。これは、式(1)および式(2)で説明されるように、3次非線形光学感受性との信号相関が異なるためである。CARSの二次依存性により、2つのピーク間の強度差が増幅されます。SRSピークの対称ライン形状とCARSピークの非対称ライン形状をスペクトルで観察することができます。CARS信号の非対称性は、主に非共振バックグラウンド干渉の存在によるものです。CARSスペクトルピークは、SRSピークに対してわずかに赤方偏移(1-2cm-1)して見える。これはまた、共鳴ピークとの非共振バックグラウンド干渉から生じる。

検出感度の比較
図3は、ハイパースペクトルSRSとCARS顕微鏡の検出感度を比較したものである。高濃度のD2O中のDMSO濃度の関数としてのDMSO SRSシグナル(2,913cm−1)のSNRを最初にプロットする(1%−50%、図3A)。結果は線形関係を示し、式(2)を満たす。図3Bは、0.1%および0.01%濃度でのDMSOスペクトルをプロットしており、2,913cm-1ピークは前者では分解できるが後者では分解できず、検出限界が0.1%〜0.01%DMSOであることを示している。ブランク基準の限界を用いて、SRS検出限界は0.021%DMSOであると推定した。図3Cは、DMSO濃度(1%〜50%)の関数としてCARS SNRをプロットし、式(1)と一致する二次依存性を示す。位相検索されたCARSスペクトルを、0.1%および0.01%DMSOの図3Dに示します。これらのスペクトルを達成するために、Kramers-Kronig関係に基づくスペクトル位相検索法が使用され、追加のバックグラウンド除去が実施された16。SRSスペクトルと同様に、DMSO 2,913 cm-1ピークは0.1%DMSOでは明確に分解できますが、0.01%では分解できず、これら2つの濃度間の検出限界を示しています。ブランク基準の限界を用いて、SRS検出限界は0.015%DMSOであると推定した。0.02%DMSOは2.8mMに相当する。したがって、ここで用いられるハイパースペクトルCRS顕微鏡の検出限界は〜2.1〜2.8mM DMSOである。

空間分解能の比較
図4は、SRS(図4A)画像とCARS(図4B)画像で検出された小さな細胞特徴の分解能を比較したものです。同じ線の強度プロファイルが表示され、ガウス関数を使用して適合し、解像度比較用のFWHM値を決定します。SRS信号の分解能は398.6nm(図4C)で、CARS信号の分解能は330.3nmでした(図4D)。CARSの解像度はSRSの解像度よりも約1.2倍優れていた。分解能差の理由は、式(1)と式(2)にもあります。ポンプビームとストークスビームの両方に、焦点にガウス点拡散関数があります。CARS の信号は 3 つのガウス関数の乗算に比例し、幅がおよそ √3 倍に減少します。同様に、SRS の場合、幅は √2 分の 1 に縮小されます。したがって、CARSの分解能はSRSの分解能の√3/√2 = 1.2倍良好であった。

細胞の画像の比較
図5は、異なる光学遅延位置にあるMIA PaCa-2セルからのSRS画像とCARS画像を比較したものです。図5Aは、最も強い信号を与えた光遅延時のSRS画像を示しています。この画像では、脂肪滴(LD)、小胞体(ER)、および核(NU)を検出することができ、最も強いシグナルを有するLDは明るいドットとして示されている。図5Bは、同じ光遅延でのCARSチャネル画像を示しており、LDのコントラストが大幅に低下しています。このコントラストの違いの主な理由は、CARSスペクトルにおける非共鳴背景の存在と同じラマンピークの赤方偏移です。この光遅延において、生成された信号は、水の非共振バックグラウンドから大きな寄与を有する。CARSにおける脂質コントラストを増強するために、光学遅延を赤方偏移値に同調させた。赤方偏移は、全体的な信号レベルが低下したが、SRS(図5C)とCARS(図5D)の両方で2,850cm-1により多くのエネルギーを集中させることによって脂質コントラストを改善した。CARSの場合、スペクトル集束において約98cm-1の赤方偏移によってSRSと同様のLDのコントラストが達成されたが(図5D)、SRS画像よりも高い背景は依然として観察された。この光学的遅延では、SRS画像は、タンパク質および核酸含有量がはるかに少ないが、LD、ER、および細胞膜において強い脂質含有量を示す(図5C)。

CARS はパラメトリックなプロセスですが、SRS はノンパラメトリックなプロセスです。このような違いは、2つのモダリティのコントラストの違いにも寄与します。パラメトリックCAR信号は、レーザ焦点に近い異なる層からのCAR信号の干渉によって決定され、図5Bおよび図5D(図4Bにも)の矢印で示すように負のコントラストを示す可能性がある。このような信号干渉誘発性の負のコントラストは、SRS画像には存在しない。CARS の負のコントラストは、対象のターゲットの軸方向の位置に関する情報を提供する場合があります。

SRS信号は分子濃度と線形の関係にあり、CARS信号はほぼ二次的な濃度依存性を満たす。したがって、CH2リッチLDは、SRS画像よりもCARS画像のERおよび細胞膜よりもはるかに強いシグナルを示す(図5E、F)。SRSスペクトルは、ハイパースペクトル画像から抽出することができる。図5Gは、LD、ER、サイトゾル(CY)、およびNUからの典型的なSRSスペクトルを示す。強度とスペクトル形状はどちらも、細胞コンパートメントごとに異なります。LDは、他の細胞小器官よりも2,850cm-1ではるかに強いシグナルを示す。CARSに関しては、形状は異なるものの、同様のスペクトルが得られる。生のCARSスペクトルは、対応するSRSスペクトルと比較して小さな赤方偏移を示す。スペクトル位相検索は、CARSスペクトルを使用してラマン応答を抽出するためにさらに使用することができる。

Figure 1
図1:ハイパースペクトルCARS/SRS顕微鏡の概略図。 略語: CARS = 首尾一貫した反ストークス・ラマン散乱;SRS = 刺激ラマン散乱;PBS = 偏光ビームスプリッタ;PD = フォトダイオード;PMT = 光電子増倍管;AOM = 音響光学変調器。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:DMSOスペクトル(A)SRSおよび(B)DMSOのCARSスペクトル。ドットは実験データです。曲線はスペクトルフィッティング結果です。略語: CARS = 首尾一貫した反ストークス・ラマン散乱;SRS = 刺激ラマン散乱;DMSO=ジメチルスルホキシド;w = スペクトル分解能。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:DMSOの信号対雑音比とスペクトル(A)SRSによって測定されたD2O中の濃度の関数としての2,913cm-1におけるDMSO対称ピークの信号対雑音比。ドットは実験データです。線は線形フィッティング結果です。(B)D2Oにおける0.1%および0.01%DMSOのSRSスペクトル(C)CARSによって測定されたD2O中の濃度の関数としての2,913cm-1におけるDMSO対称ピークの信号対雑音比。ドットは実験データです。曲線は 2 次多項式フィッティング結果です。(D)D2O.略語における0.1%および0.01%DMSOのCARSスペクトル:CARS=コヒーレントな反ストークスラマン散乱;SRS = 刺激ラマン散乱;DMSO=ジメチルスルホキシド;SNR = 信号対雑音比;D2O=重水素酸化物。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:MIA PaCa-2細胞のSRSおよびCARS画像と強度プロファイル(A)MIA PaCa-2細胞のSRS画像。(B) パネル A と同じ視野にある MIA PaCa-2 セルの CARS 画像。(C)パネルAの黄色い線に沿ったSRSの強度プロファイル。(D)パネルBの黄色い線に沿ったCARSの強度プロファイル。ドットは実験データです。曲線はガウス関数フィッティング結果です。スケールバー = 5 μm。略語: CARS = 首尾一貫した反ストークス・ラマン散乱;SRS = 刺激ラマン散乱;w = 解像度。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:MIA PaCa-2細胞の画像と強度プロファイル(A)SRS強度に最適化された時間遅延におけるMIA PaCa-2細胞のSRS画像。(B) パネル A と同じ遅延での CARS 画像。(C) パネル A のように 98 cm-1 の赤方偏移遅延での SRS 画像。(D) パネル C と同じ光学遅延での CARS 画像。(E,F)SRS および CARS 強度プロファイルは、パネル A および D の点線に沿ってプロットされています。(g)脂肪滴、小胞体、細胞質ゾル、および核からの典型的なSRSスペクトル。(h)4つの細胞組成物の典型的なCARSスペクトル。緑色と赤色の点線は、それぞれパネル A/B および C/D の遅延位置です。スケールバー = 10 μm。略語: CARS = 首尾一貫した反ストークス・ラマン散乱;SRS = 刺激ラマン散乱;LD = 脂肪滴;ER = 小胞体;CY = 細胞質ゾル;NU = 核。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル:LabVIEWをベースにしたラボ作成のソフトウェアで、画像をリアルタイムで表示および保存するための同時マルチチャンネルディスプレイを備えています。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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Discussion

ここで紹介するプロトコルは、マルチモーダルCRS顕微鏡の構築と、CARSとSRSイメージングの直接比較について説明しています。顕微鏡の構築にとって重要なステップは、空間的および時間的なビームのオーバーラップとビームサイズの最適化です。SNRを最適化し、ラマンシフトを較正するために、生物学的イメージングの前にDMSOなどの標準サンプルを使用することをお勧めします。CARS画像とSRS画像を直接比較すると、CARSの方が空間分解能が優れているのに対し、SRSはスペクトル分解能が向上し、複雑な化学コントラストが少ないことが明らかになります。CARS と SRS の両方に同様の検出限界があります。

CARSおよびSRSイメージングは、励起に高エネルギーパルスレーザを使用します。これにより、プラットフォームは、多光子励起蛍光、高調波発生、および追加の化学的コントラスト28,39のための過渡吸収などの他の非線形光学イメージングモダリティを統合することができる。

CARSおよびSRSは、高い化学的選択性を有する脂質組成を研究するために広く使用されている。しかしながら、これらの技術は脂質の定量に限定されない。SRSは、薬物分布42、タンパク質合成43、およびDNA44をマッピングするために適用されている。CARSおよびSRSはまた、錠剤45、46、47、48中の医薬品成分および賦形剤の画像にも適用されている。ハイパースペクトルCARSおよびSRSは、癌診断49、心血管疾患評価50、および神経画像化51における用途を見出した。また、COVID-19研究にも適用できます52。3,000cm-1の広いスペクトル窓をカバーできるブロードバンドCARSは、生体試料中の豊富な化学構造を解明することができる53。しかしながら、CCDの読み出し速度が遅いため、画素滞留時間はミリ秒のレベルにあり、SRS顕微鏡34のマイクロ秒画素滞留時間よりもはるかに遅い。ハイパースペクトルSRS顕微鏡は現在、200〜300cm−1の典型的な帯域幅を有し、レーザー帯域幅およびロックイン統合アレイ検出器34の欠如によって制限される。フーリエ変換SRS顕微鏡は、SRSスペクトルカバレッジ35を潜在的に広げるための代替方法である。

CARSやSRSは標識を必要とせずに豊富な化学情報を提供しますが、化学選択性は化学結合にあり、特定のタンパク質を区別することは困難です。ラマンタグは、CARSおよびSRS54,55の化学的選択性を高める可能性を示している。しかし、コヒーレントラマンイメージングは、蛍光検出と比較して感度がはるかに低いままです。表面増強は、信号レベル56を改善するために自発的ラマン散乱分光法に使用した。また、信号増幅のためのCARSおよびSRSにも適用された57、58、59。増強因子は自発的ラマン散乱ほど高くはないが、表面増強CARSおよびSRS顕微鏡は依然として単一分子を検出する可能性を示している59,60。それにもかかわらず、金属粒子または表面の使用は、ラベルフリーアプローチの利点を奪う。金属表面を使用せずにコヒーレントラマン顕微鏡の感度を向上させることは、生物科学におけるこの技術の応用を大幅に拡大するだろう。

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Disclosures

著者は利益相反がないと宣言しています。

Acknowledgments

この研究は、パデュー大学化学科のスタートアップファンドの支援を受けました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D galvo scanner set Thorlabs GVS002
Acousto-optic modulator Isomet M1205-P80L-0.5
AOM driver Isomet 532B-2
Data acquisition card National Instruments PCle 6363 Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage Zaber X-LSM050A
Deuterium oxide Millipore Sigma 151882-100G
Dichroic mirror for beam combination Thorlabs DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation Semrock FF776-Di01-25x36
DMSO MiliporeSigma 200-664-3
MIA PaCa 2 Cells ATCC CRL-1420
Femtosecond laser system Spectral Physics InSightX3+
Filter for CARS Chroma AT655/30m
Filter for SRS Chroma ET980sp
Function generator Rigol DG1022Z
Glass rods Lattice Electro Optics SF-57
Half-wave plate Newport 10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020 National Instruments This is the image acquisition software
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI
Microscope housing Olympus BX51W1
Objective lens Olympus UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b OriginLab Corporation This is the spectral fitting software
Oscilloscope Tektronix TBS2204B
Photodiode Hamamatsu S3994-01
PMT detector Hamamatsu H7422P-40
PMT voltage amplifier Advanced Research Instrument Corp. PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube Thorlabs PBS255
Terminal block National Instruments BNC-2110

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化学イメージングのためのハイパースペクトル刺激ラマン散乱とコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡の直接比較
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Clark, M. G., Brasseale III, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging. J. Vis. Exp. (182), e63677, doi:10.3791/63677 (2022).

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