Summary
Le risposte vascolari della circolazione polmonare arteriosa possono essere esplorate utilizzando l'arteria intrapolmonare (IPA) e le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC). Il presente studio descrive in dettaglio l'isolamento dell'IPA e i protocolli utilizzati per studiare la vasorilassazione in risposta a stimoli fisiologici.
Abstract
L'arteria intrapolmonare (IPA) e le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) isolate dai polmoni di ratto possono essere utilizzate per studiare i meccanismi sottostanti di vasocostrizione e vasorilassamento. Dopo aver isolato IPA e VSMC, le caratteristiche delle risposte vascolari in condizioni fisiologiche e patologiche possono essere valutate in assenza di fattori estrinseci come segnali nervosi, ormoni, citochine, ecc. Pertanto, l'IPA e i VSMC fungono da modelli eccellenti per lo studio della fisiologia / fisiopatologia vascolare, insieme a varie indagini sperimentali, come la modulazione da parte di agenti farmacologici, l'analisi elettrofisiologica patch-clamp, l'imaging del calcio, ecc. Qui, abbiamo usato una tecnica per isolare l'IPA per studiare le risposte vascolari in una configurazione di bagno d'organo. I segmenti di IPA sono stati montati sulla camera da bagno dell'organo tramite fili intraluminali e stimolati da vari agenti farmacologici. I cambiamenti nel tono vascolare IPA (cioè vasocostrizione e vasorilassamento), sono stati registrati utilizzando un trasduttore di forza isometrico e un programma software di analisi dei dati fisiologici. Abbiamo implementato diversi protocolli sperimentali, che possono essere adattati per studiare i meccanismi di vasorilassamento/vasocostrizione per lo studio delle attività farmacologiche di farmaci fitochimici o sintetici. I protocolli possono anche essere utilizzati per valutare il ruolo dei farmaci nella modulazione di varie malattie, tra cui l'ipertensione arteriosa polmonare. Il modello IPA ci permette di studiare la curva concentrazione-risposta, che è cruciale nella valutazione dei parametri farmacodinamici dei farmaci.
Introduction
La vascolarizzazione polmonare è un sistema vascolare a bassa pressione in cui la funzione principale è quella di fornire sangue deossigenato all'area di scambio di gas dei polmoni. Le arterie polmonari nei polmoni sono disposte in rami paralleli all'albero bronchiale, formando in definitiva una vasta rete di capillari che è continua su diversi alveoli e, infine, si uniscono in venule e vene. Il tono vascolare dell'arteria polmonare è controllato da diversi fattori, che coinvolgono l'interazione tra l'endotelio e le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC)1.
In questo studio, ci concentriamo sulla vasorilassazione endotelio-dipendente e indipendente dell'arteria intrapolmonare (IPA). Per quanto riguarda la vasorilassazione endotelio-dipendente, vari meccanismi che si verificano sulla superficie delle cellule endoteliali potrebbero aumentare la concentrazione intracellulare di Ca2+ (ad esempio, l'acetilcolina [ACh] si lega al recettore muscarinico [M3]), portando alla formazione di ossido nitrico (NO), prostaciclina (PGl2) e fattore iperpolarizzante derivato dall'endotelio (EDHF) (Figura 1 ). L'NO è il principale fattore rilassante derivato dall'endotelio sintetizzato dalla L-arginina mediante ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS)2, che poi si dissocia dalle cellule endoteliali ai VSMC (Figura 1) e stimola l'enzima solubile guanylyl cyclase (sGC); questo enzima trasforma la guanosina trifosfato (GTP) in guanosina monofosfato ciclico (cGMP), che attiva la protein chinasi G (PKG) e riduce i livelli citosolici di Ca2+, causando così vasorilassamento (Figura 1). PGl2 è sintetizzato dalle cellule endoteliali attraverso la via della ciclo-ossigenasi (COX) 3,4. Si lega con il recettore della prostaciclina (IP) sui VSMC e stimola l'enzima adenilil ciclasi (AC), che converte quindi l'adenosina trifosfato (ATP) in adenosina monofosfato ciclico (cAMP) (Figura 1)3,4. cAMP attiva la proteina chinasi A (PKA), riducendo i livelli citosolici di Ca2+ e causando vasorilassamento5 (Figura 1). La via EDHF partecipa anche alla vasorilassamento endotelio-dipendente attraverso vari mediatori endoteliali ed eventi elettrici. L'attivazione della via EDHF porta all'iperpolarizzazione dei VSMC, chiudendo così i canali Ca 2+ (COVC) azionati in tensione, riducendo i livelli intracellulari di Ca2+ e inducendo vasorilassamento6. La vasorilassazione endotelio-indipendente avviene direttamente sui VSMC attraverso diversi meccanismi, come la riduzione del livello intracellulare di Ca 2+, l'inibizione della miosina chinasi a catena leggera (MLCK), l'attivazione della fosfatasi della catena leggera della miosina (MLCP) e la riduzione della sensibilità di Ca2+ al macchinario contrattile delle VSMC. In questo studio, ci concentriamo sulla vasorilassamento causato dall'apertura di vari canali K+, il blocco dei COVC e l'inibizione del rilascio di Ca 2+ dal reticolo sarcoplasmatico7, che porta alla riduzione dei livelli intracellulari di Ca 2+, diminuendo così la fosforilazione della catena leggera della miosina VSMC e il legame miosina-actina o la formazione di ponti incrociati, rispettivamente, alla fine con conseguente vasorilassamento.
La tecnica per valutare le misure di vasocostrizione e vasorilassamento nell'IPA isolata è ben consolidata per i roditori, ma i dati variavano a seconda dei protocolli sperimentali. Il presente studio descrive il metodo utilizzato per valutare le reattività vascolari dei preparati IPA di ratto in vitro, che sono stati effettuati in assenza di fattori esterni che modulano la risposta vascolare in vivo, come segnali nervosi, ormoni, citochine, pressione sanguigna, ecc.
Abbiamo impiegato diversi protocolli sperimentali utilizzando l'estratto vegetale come esempio per studiare le reattività vascolari dell'IPA. Vari bloccanti (Figura 1) sono stati utilizzati per identificare i meccanismi di vasorilassamento endotelio-dipendente e indipendente indotto dall'estratto vegetale. Tuttavia, gli stessi protocolli possono essere adattati per valutare le risposte vascolari dell'IPA a qualsiasi farmaco, estratto o fitochimico utilizzato per il trattamento di varie patologie polmonari.
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Protocol
Gli esperimenti eseguiti in questo studio sono stati approvati dal Comitato Etico del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Naresuan (NUACUC), numero di protocollo NU-AE620921, per la cura e l'uso di animali per scopi scientifici.
1. Composizione delle soluzioni fisiologiche
- Formulare la soluzione di Krebs sciogliendo le sostanze chimiche in acqua distillata per ottenere le concentrazioni finali come segue: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaHPO4, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2 e 11 mM glucosio8. Regolare il pH della soluzione a 7,3 con 1 M NaOH e preriscaldare a 37 °C prima dell'uso.
- Preparare la soluzione fredda di Krebs in modo simile a quanto indicato al punto 1.1. da utilizzare come mezzo di isolamento dell'IPA, come descritto nella fase 2.
2. Isolamento dell'arteria intrapolmonare (IPA)
- Anestetizzare ratti Wistar maschi di 8 settimane con un'iniezione intraperitoneale di sodio tiopentale (100 mg/kg)9. Controlla i ratti per la loro reazione agli stimoli dolorosi nel sonno profondo usando una pinza bloccata ai loro piedi, quindi assicurati che i ratti non abbiano una reazione di pull-back del piede prima di eutanasia nel passaggio 2.2.
- Tagliare il torace medio del ratto e il terminale cardiaco con le forbici (dimensione 14 cm). Quindi, individuare la radice del polmone con le forbici (dimensione 14 cm). Raccogliere l'intero polmone tagliando con le forbici e immergerlo nella soluzione fredda di Krebs10,11.
- Tagliare un singolo lobo del polmone con le forbici (dimensione 11 cm) e posizionarlo su una capsula di Petri (dimensioni 9 cm) con il lato mediale / radice del polmone rivolto verso l'alto (Figura 2A, B). Osservare e identificare l'allineamento della vena, dei bronchi e dell'arteria dall'alto verso il basso (Figura 2B).
- Tagliare il bronco longitudinalmente con le forbici (taglia 11 cm). Quindi, utilizzare la pinza (dimensione 11 cm) per afferrare la punta del bronco. Sezionare delicatamente e rimuovere i bronchi e le vene dal polmone. Si noti che l'IPA è sempre anatomicamente allineato sotto il bronco.
- Successivamente, è possibile visualizzare l'IPA principale (Figura 2C). Utilizzare la pinza (dimensione 11 cm) per afferrare la punta dell'IPA e sezionarla con cura dal tessuto polmonare con le forbici (dimensione 11 cm).
- Conservare l'alcool isopropilico isolato in una soluzione fredda di Krebs fino all'installazione del gruppo bagno d'organo (pH 7,3 e temperatura 4 °C)1 1.
3. Isolamento delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC)
- Isolare l'IPA come descritto in precedenza nel passaggio 2. Tagliare longitudinalmente il ramo principale dell'IPA con le forbici (dimensione 11 cm) e tagliarlo a strisce piccole (2 mm) (Figura 3A).
- Immergere le strisce IPA in un mezzo di dissociazione (DM)10,12 contenente 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaH 2 PO4, 10 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,03 mM rosso fenolo, 10 mM taurina, 0,5 mM EDTA, 2 mM MgCl 2, 11 mM glucosio e 0,16 mM CaCl 2, e regolare il pH a 7,0 con 1 M NaOH. Incubare le strisce per 1 ora a 4 °C in DM contenenti 1 mg/ml di papaina, 0,04% di albumina sierica bovina (BSA) e 0,4 mM di 1,4-ditiotreitolo (DTT), quindi incubare ulteriormente a 37 °C per 15 minuti. Aggiungere 1 mg/mL di collagenasi di tipo 1A nel DM e incubare ulteriormente a 37 °C per 5 minuti.
NOTA: DM è una soluzione utilizzata per preservare la vitalità cellulare. La papaina e la collagenasi di tipo 1A sono enzimi che abbattono le proteine della matrice extracellulare per isolare le singole cellule. BSA è una proteina dell'albumina sierica utilizzata per la stabilizzazione degli enzimi durante lo stoccaggio e le reazioni enzimatiche. Il DTT è un agente riducente utilizzato per stabilizzare e promuovere l'attività degli enzimi durante il processo di isolamento cellulare. La taurina è acido solforico amminico utilizzato per stabilizzare la membrana cellulare e l'integrità cellulare. - Trasferire i tessuti in DM fresco e disperderli mediante triturazione delicata con una pipetta Pasteur di vetro (Figura 3B). Continuare a triturare fino a quando i VSMC isolati diventano visibili nella soluzione da bagno al microscopio (Figura 3C).
NOTA: I VSMC appena isolati possono essere utilizzati per studiare la fisiologia / fisiopatologia vascolare, insieme a varie indagini sperimentali, come la modulazione da parte di agenti farmacologici, l'analisi elettrofisiologica patch-clamp, l'imaging del calcio, ecc. Tuttavia, il presente studio si concentra solo sulla vasorilassazione dell'IPA isolata utilizzando la tecnica del bagno d'organo.
4. Tecnica del bagno d'organo
- Isolare l'IPA come descritto in precedenza nel passaggio 2. Tagliare il ramo principale dell'IPA in anelli di ~ 2 mm di lunghezza (Figura 2D)13.
- Fissare gli anelli IPA nelle camere da bagno degli organi (Figura 4) infilandoli su due fili di acciaio inossidabile del diametro di 40 μm (Figura 2E)11,13,14.
- Collegare fili di acciaio inox montati con anelli IPA ai trasduttori di forza isometrici collegati al dispositivo di acquisizione dati e al sistema informatico installato con l'apposito software fisiologico per la registrazione e l'analisi dei dati, quindi sollevare delicatamente la tensione dell'anello IPA a 1 g11.
- Lasciare che i segmenti del vaso si equilibrino per circa 45 minuti a una tensione di riposo di 1 g. Durante il periodo di equilibrio, assicurarsi che la soluzione di Krebs venga cambiata regolarmente ogni 15 minuti. Dopo questo periodo di equilibrio, testare la vitalità dei vasi misurando la loro vasocostrizione in una soluzione extracellulare K+ (80 mM) ad alta concentrazione contenente 47,4 mM NaCl, 80 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaHPO4, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2 e 11 mM glucosio 10,11.
- Valutare la presenza o l'assenza di endotelio calcolando la risposta di rilassamento all'acetilcolina (1 x 10−5 M) in anelli precontratti con fenilefrina (PE, 1 x 10−5 M) (Si noti che le contrazioni vascolari rimangono stabili per 1 ora dopo l'aggiunta di PE). Considerare gli anelli come endotelio-intatti se quantificano per più del 70% di rilassamento (Figura 5A). Se hanno meno del 10% di rilassamento, considerare gli anelli come denudati con endotelio13 (Figura 5B). Rimuovere meccanicamente l'endotelio strofinando delicatamente all'interno del vaso con un piccolo filo per indurre la denudazione.
- Equilibrare nuovamente gli anelli arteriosi per 30 minuti prima dell'inizio degli esperimenti di prova.
5. Risposta vasorilassante all'estratto vegetale
- Studiare l'effetto rilassante dell'estratto vegetale precontraendo gli anelli IPA con PE (1 x 10−5 M).
- Quindi, aggiungere con cautela l'estratto vegetale (1-1.000 μg / ml) cumulativamente agli anelli intatti dell'endotelio e agli anelli denudati con endotelio per indurre la vasorilassazione (Figura 6A, B) e acquisire una curva di risposta dipendente dalla concentrazione (Figura 6C).
- Assicurarsi che anche l'effetto del dimetilsolfossido (DMSO) utilizzato come solvente sia valutato in modo simile per fungere da controllo negativo (Figura 6C).
6. Meccanismo di vasorilassamento indotto da estratti vegetali attraverso l'endotelio
- Valutare il meccanismo d'azione vasorilassante dell'estratto vegetale attraverso l'ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS), la ciclo-ossigenasi (COX)13 e le vie del fattore iperpolarizzante derivato dall'endotelio (EDHF) incubando gli anelli IPA intatti dall'endotelio per 30 minuti con i seguenti inibitori (Figura 7A): 1 x 10−4 M NG-nitro-L-arginina estere metilico (L-NAME, un inibitore di eNOS)9, 1 x 10−5 M indometacina (un inibitore della COX)9, o una combinazione di 1 x 10−7 M apamin (un piccolo calcio-antagonista del potassio attivato) e 1 x 10−7 M caribdotossina (un bloccante dei canali del potassio attivato dal calcio a conduttanza intermedia e grande), prima di indurre contrazioni di IPA con 1 x 10−5 M PE.
- Quindi, dopo che le contrazioni a PE si sono stabilizzate, aggiungere concentrazioni cumulative (0,1-1.000 μg / ml) dell'estratto vegetale.
- Presentare gli effetti dell'estratto vegetale come rilassamento percentuale degli anelli IPA in presenza di inibitori rispetto alla risposta degli anelli IPA senza inibitori (Figura 7B-D) e costruire la curva concentrazione-risposta.
7. Meccanismo di vasorilassamento indotto dall'estratto vegetale attraverso i canali K+ della muscolatura liscia vascolare
- Anelli IPA denudati con endotelio pre-incubati per 30 minuti con 1 x 10−3 M 4-amminopiridina (4-AP), un bloccante del canale del potassio voltaggio-dipendente (KV) (Figura 8A), 1 x 10−5 M glibenclamide, un bloccante del canale del potassio sensibile all'ATP (KATP), o 1 x 10−7 M iberiotossina, un bloccante dei canali K+ attivatida Ca 2+ di grande conduttanza (KCa), prima di indurre contrazioni di IPA con 1 x 10−5 M PE.
- Quindi, aggiungere concentrazioni cumulative dell'estratto vegetale.
- Presentare gli effetti dell'estratto vegetale come rilassamento percentuale degli anelli IPA con inibitore rispetto agli anelli IPA senza inibitore (Figura 8B-D) e costruire la curva concentrazione-risposta.
8. Meccanismo di vasorilassamento indotto da estratti vegetali attraverso l'inibizione dell'afflusso extracellulare di calcio (Ca2+) nei VSMC
- Anelli IPA denudati con endotelio pre-incubati per 30 minuti in una soluzione di Krebs priva di Ca2+ contenente 1 mM di glicole etilenico-bis (2-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA) (Figura 9A).
- Quindi, sostituire la soluzione di bagno con una soluzione Ca2 + libera-80 mM K+ per 10 minuti per depolarizzare i VSMC, che quindi aprono i VOCC (Figura 9A).
- Aggiungere cumulativamente CaCl2 (0,01-10 mM) per indurre vasocostrizione dell'IPA e costruire la curva concentrazione-risposta (Figura 9A).
- Ripetere questo protocollo negli stessi anelli IPA ma pre-incubarli con estratto vegetale o 1 μM di nicardipina (bloccante dei canali Ca 2+ di tipo L) in Ca2+ contenente 80 mM di soluzione K+ per 10 minuti seguita dall'aggiunta cumulativa di CaCl28.
- Infine, confrontare la risposta contrattile con la contrazione massima precedentemente indotta dalle sfide di controllo CaCl2 (Figura 9B).
9. Meccanismo di vasorilassamento indotto dall'estratto vegetale attraverso l'inibizione del rilascio intracellulare di calcio (Ca2+) dal reticolo sarcoplasmatico (SR)
- Esporre anelli IPA denudati con endotelio a una soluzione di 80 mM K+ per circa 5 minuti, depolarizzando i VSMC, aprendo i COVC e infine generando il carico di Ca2+ nell'SR (Figura 10A).
- Sostituire la soluzione di bagno per 10 minuti con una soluzione di Krebs priva di Ca2+ contenente 1 mM di EGTA (Figura 10A).
- Quindi, sfidare gli anelli IPA con 1 x 10−5 M PE, che attiva la via della fosfolipasi C/IP3 , rilasciando infine Ca2+ dall'SR ed evocando una contrazione transitoria dell'IPA (Figura 10A).
- Ripetere lo stesso protocollo per accertare anche le contrazioni transitorie all'EP.
- Sfidare nuovamente gli anelli IPA con una soluzione di 80 mM K+ per circa 5 minuti, quindi sostituire la soluzione da bagno con una soluzione di Krebs priva di Ca2+ contenente 1 mM EGTA con o senza estratto vegetale per 10 minuti.
- Ancora una volta, sfida gli anelli IPA con 1 x 10−5 M PE.
- Confrontare le contrazioni IPA indotte da PE tra la condizione con e senza l'estratto vegetale (Figura 10B).
10. Analisi statistica
- Esprimere i risultati come media ± SEM. Confrontare questi valori utilizzando il t-test di Student o analizzare mediante un'analisi della varianza (ANOVA) seguita dal test post hoc di Tukey-Kramer utilizzando un software statistico adatto. Considera le differenze a p < 0,05 come statisticamente significative. Qui, c'erano n = 6 ratti / protocollo sperimentale.
NOTA: La registrazione della vasocostrizione e del vasorilassamento può essere valutata con un apposito software installato sul computer. Ad esempio, la Figura 5A mostra che, quando i vasi sanguigni sono stimolati dal PE che causa la contrazione, questo potrebbe essere osservato dall'aumento della tensione del tracciato originale. Il tracciamento si stabilizzerà in 20-30 minuti, che è considerato una contrazione al 100%. Successivamente, l'ACh stimola i vasi sanguigni, causando rilassamento, che potrebbe essere osservato dalla diminuzione della tensione del tracciato originale. Pertanto, la tensione ridotta viene calcolata come percentuale rispetto alla contrazione del 100%.
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Representative Results
Il protocollo nel presente studio è stato sviluppato per determinare le condizioni sperimentali ottimali per misurare i fenomeni fisiologici osservati nelle risposte vascolari di preparati isolati di IPA. Gli esperimenti pilota sono stati eseguiti per descrivere i potenziali risultati che aiutano la comprensione degli effetti vascolari e delle basi meccanicistiche dell'azione vasorilassante dell'estratto vegetale, come segue.
Effetto vasorilassante dell'estratto vegetale
Come mostrato nella Figura 6A,B, nell'IPA intatta dall'endotelio (E+), l'estratto vegetale ha suscitato una risposta di vasorilassamento dipendente dalla concentrazione (EC50 = 66,88 μg/ml, Figura 6C). L'eradicazione dell'endotelio (E-) ha ridotto profondamente la vasorilassazione indotta dall'estratto vegetale (p < 0,01), come riflesso dall'aumento della EC 50 di 2,2 volte (E-, EC50 = 150,60 μg/ml, Figura 6C). Il veicolo, DMSO, non ha avuto alcun effetto. Pertanto, l'estratto vegetale ha prodotto vasorilassamento principalmente attraverso una via endotelio-dipendente e parzialmente attraverso una via indipendente dall'endotelio.
Meccanismo dell'azione vasorilassante dell'estratto vegetale attraverso vie endotelio-dipendenti
Come mostrato in Figura 7, l'utilizzo di L-NAME per l'inibizione di eNOS (Figura 7B) e la combinazione di apamina più caribdotossina per bloccare EDHF (Figura 7D) ha evidentemente diminuito la risposta vasorilassante all'estratto vegetale. Ciò ha spostato la curva concentrazione-risposta verso destra e aumentato l'EC50 senza alterare i valori Emax. Al contrario, l'indometacina (un inibitore della COX) (Figura 7C), non ha mostrato alcun effetto sulla risposta vasorilassante all'estratto vegetale.
Caratterizzazione del ruolo dei canali K+ nell'azione vasorilassante dell'estratto vegetale
Negli anelli IPA denudati dall'endotelio, il bloccante dei canali KCa (iberiotossina) ha diminuito la risposta vasorilassante all'estratto vegetale (Figura 8C), mentre i bloccanti dei canali Kv (4-AP) o KATP (glibenclamide) non hanno modificato la vasorilassamento indotto dall'estratto vegetale (Figura 8B,D).
Meccanismo di azione vasorilassante dell'estratto vegetale tramite inibizione dell'afflusso extracellulare di Ca 2+
Per indagare se il meccanismo dell'azione vasorilassante dell'estratto vegetale coinvolgesse l'inibizione dell'afflusso extracellulare di Ca 2+, la vasocostrizione degli anelli IPA denudati dall'endotelio è stata evocata da 1 x 10−5-1 x 10−2 M CaCl2 in una soluzione di Krebs priva di Ca2+ incorporata con 80 mM K+ per attivare i VOCC (Figura 9A,B). La pre-incubazione con l'estratto vegetale (68 μg/ml, valore EC50) ha inibito la contrazione indotta da CaCl2 (p < 0,001 vs. veicolo).
Meccanismo di azione vasorilassante dell'estratto vegetale attraverso l'inibizione del rilascio intracellulare di Ca2+ dalla SR
Per esaminare se il rilascio intracellulare di Ca 2+ dalla SR abbia avuto un ruolo nell'effetto vasorilassante, gli anelli IPA denudati con endotelio sono stati pre-incubati con soluzione di Krebs priva di Ca2+, seguita dall'aggiunta di PE (1 x 10−5 M), ottenendo una contrazione transitoria (Figura 10A). Quindi, nello stesso anello IPA, questo esperimento è stato replicato in presenza di un veicolo o di un estratto vegetale. Rispetto al veicolo, l'estratto vegetale ha ridotto significativamente (p < 0,001) la contrazione indotta dall'EP (Figura 10B).
Figura 1: Regolazione del tono vascolare attraverso vie endotelio-dipendenti e indipendenti. AA = Acido arachidonico, ACh = Acetilcolina, AC = Adenylyl cyclase, ATP = Adenosina 5'-trifosfato, cAMP = Adenosina monofosfato ciclico, cGMP = Guanosina monofosfato ciclico, COX = Cicloossigenasi, DAG = Diacilglicerolo, EDHF = Fattore iperpolarizzante derivato dall'endotelio, eNOS = Ossido nitrico sintasi endoteliale, Gq = G-proteina tipo q, G s = G-proteina tipos, GTP = Guanosina trifosfato, IP = Recettore della prostaciclina, IP 3 = Inositolo 1, 4, 5 trisfosfato, IP3 R = recettore IP3, IK Ca = canale K+ attivato a conduttanza intermedia Ca 2+, KV = canali del potassio voltaggio-dipendenti, K ATP = canali del potassio sensibili all'ATP, KCa = canali K+ attivati da Ca2+ a grande conduttanza, M3 = recettore muscarinico, MEGJ = giunzione mioendoteliale del gab, NO = ossido nitrico, PE = fenilefrina, PGI 2 = prostaciclina, PGs = prostaglandine,PIP 2 = Fosfatidilinositolo 4,5 bisfosfato, PKA = Protein chinasi A, PKG = Protein chinasi G, PLA 2 = Fosfolipasi A2, PLC = Fosfolipasi C, ROCCs = Canali Ca 2+ operati dal recettore, RYR = Recettore della ryanodina, sGC = Guanylyl cyclasi solubile, SK Ca = Canale K+ attivato da Ca 2+ a piccola conduttanza, SR = reticolo sarcoplasmatico, VOCC = CanaliCa 2+ azionati in tensione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Fasi chiave dell'isolamento dell'arteria intrapolmonare (IPA) del ratto. (A) L'immagine raffigura un polmone di ratto con IPA. (B) Dissezione del lato mediale/radice del polmone rivolto verso l'alto. (C) IPA principale visualizzato dopo aver rimosso le vene e i bronchi. d) IPA isolato. (E) Gli anelli IPA sono stati montati su una coppia di fili di acciaio inossidabile per uno studio di risposta vascolare utilizzando la tecnica del bagno d'organo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Fasi chiave dell'isolamento delle cellule muscolari lisce vascolari IPA (VSMC). (A) L'IPA isolato è stato tagliato in piccole strisce e immerso nel mezzo di dissociazione (DM). (B) Triturazione di strisce vascolari per isolare VSMC. (C) VSMC isolati dopo triturazione delicata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Illustrazione schematica dell'apparecchiatura utilizzata per testare la reattività vascolare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Record rappresentativo che mostra vasorilassamento di anelli IPA precontratti con 10 μM PE per 10 μM acetilcolina (ACh ). (A) Anello endotelio-intatto (E+) e (B) anello denudato con endotelio (E-). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Vasorilassamento dell'alcool isopropilico da parte dell'estratto vegetale. (A) Documentazione rappresentativa che mostra la vasorilassamento degli anelli IPA da parte dell'estratto vegetale (1-1.000 μg/ml) precontratto con 10 μM PE negli anelli intatti dell'endotelio (E+) e (B) denudati con endotelio (E-). (C) Curve concentrazione-risposta della vasorilassazione indotta dall'estratto vegetale negli anelli IPA (E+, n = 6 e E-, n = 6). La vasorilassamento è espressa come percentuale della contrazione indotta dall'EP. Tutti i dati sono espressi come media ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001 rispetto al veicolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7. I meccanismi della vasorilassazione IPA indotta dall'estratto vegetale attraverso la via endotelio-dipendente. (A) Documentazione rappresentativa che mostra vasorilassamento da parte dell'estratto vegetale (1-1.000 μg/ml) di anelli IPA intatti con endotelio (E+) preincubati con L-NAME (inibitore di eNOS) e precontratti con 10 μM di PE. (B-D) Curve concentrazione-risposta delle vasorilassazioni indotte dall'estratto vegetale di anelli IPA endotelio-intatti (E+) precontratti con PE e preincubati con inibitori di varie vie di segnalazione endoteliale, tra cui (B) 100 μM L-NAME, (C) 10 μM di indometacina, o (D) 0,1 μM apamin più 0,1 μM di caribdotossina. I valori sono medie ± SEM. (n = 6). **p < 0,01, ***p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8. Effetto dei bloccanti dei canali K + sulla vasorilassamento IPA indotta dall'estratto vegetale. (A) Documentazione rappresentativa che mostra vasorilassamento mediante estratto vegetale (1-1.000 μg/ml) di anelli IPA denudati con endotelio (E-) incubati con 4-AP (bloccante del canale KV) e precontrattuali con PE 10 μM. (B-D) Curve concentrazione-risposta della vasorilassazione indotta dall'estratto vegetale di anelli IPA denudati con endotelio (E-) precontratti con PE e preincubati con vari bloccanti dei canali K+, tra cui (B) 1 mM 4-AP, (C) glibenclamide 10 μM o (D) iberiotossina 30 nM. I valori sono medie ± SEM. (n = 6). p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9. Effetto dell'estratto vegetale sull'afflusso extracellulare di Ca2+. (A) Registrazioni rappresentative che mostrano la contrazione degli anelli IPA indotta da CaCl2 in assenza (controllo) o presenza dell'estratto vegetale. Gli anelli IPA sono stati immersi in una soluzione di Ca2+free ad alto K+ (80 mM) contenente 10 mM di EGTA ed è stata misurata la contrazione evocata da una concentrazione cumulativa di CaCl2. Questo protocollo è stato poi ripetuto da solo (controllo, n = 6) o in presenza dell'estratto vegetale (n = 6). (B) Curve concentrazione-risposta per la contrazione indotta da CaCl2 degli anelli IPA in assenza (controllo) o presenza dell'estratto vegetale o 1 μM di nicardipina (bloccante dei canali Ca2+ di tipo L). La contrazione indotta da CaCl 2 è stata calcolata come percentuale della contrazione massima registrata dalla prima applicazione di CaCl2 ed espressa come media ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001 rispetto alla nicardipina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 10. Effetto dell'estratto vegetale sul rilascio di Ca2+ dal reticolo sarcoplasmatico (SR). (A) Registrazione rappresentativa che mostra la contrazione degli anelli IPA indotta da fenilefrina (PE) mediante rilascio di Ca2+ dall'SR di anelli IPA denudati con endotelio in presenza di DMSO (controllo) e 10 μM di estratto vegetale. I dati sono contrazioni percentuali a contrazioni indotte da PE di 10 μM rispetto alle contrazioni prodotte dal protocollo iniziale senza l'estratto vegetale. I valori sono mezzi ± SEM. **p < 0,01 rispetto al veicolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 11: Meccanismo proposto di azione vasodilatatrice dell'estratto vegetale sull'arteria intrapolmonare del ratto attraverso vie endotelio-dipendenti e -indipendenti AA = acido arachidonico, ACh = acetilcolina, AC = adenilil ciclasi, ATP = adenosina 5'-trifosfato, cAMP = adenosina monofosfato ciclico, cGMP = guanosina monofosfato ciclico, COX = cicloossigenasi, DAG = diacilglicerolo, EDHF = fattore iperpolarizzante derivato dall'endotelio, eNOS = ossido nitrico sintasi endoteliale, Gq = proteina G tipo q, G s = proteina G tipos, GTP = guanosina trifosfato, IP = recettore della prostaciclina, IP 3 = inositolo 1, 4, 5 trisfosfato, IP 3 R = recettoreIP3, IK Ca = conduttanza intermedia Ca 2+-attivato canale K+, KV = canali del potassio voltaggio-dipendenti, K ATP = canali del potassio sensibiliall'ATP, K Ca = Grande conduttanzaCa 2+-attivato K+ canali, M3 = Recettore muscarinico, MEGJ = Giunzione gab mioendoteliale, NO = Ossido nitrico, PE = Fenilefrina, PGI 2 = Prostaciclina, PGs = Prostaglandine, PIP 2 = Fosfatidilinositolo 4,5 bisfosfato, PKA = Protein chinasi A, PKG = Protein chinasi G, PLA 2 = Fosfolipasi A 2, PLC = Fosfolipasi C, ROCCs = Canali Ca2+ operati dal recettore, RYR = Recettore della rianodina, sGC = Guanylyl cyclasi solubile, SK Ca = Piccola conduttanzaCa Canale K+ attivato 2+, SR = reticolo sarcoplasmatico, VOCC = canali Ca2+ azionati in tensione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
In questo manoscritto, descriviamo la tecnica per l'isolamento di IPA e VSMC di ratto. Diversi protocolli sperimentali sono stati impiegati per studiare la risposta vascolare dell'IPA in vitro, che possono essere utilizzati per caratterizzare l'effetto farmacologico e le basi meccanicistiche della vasorilassazione dell'IPA indotta dall'estratto vegetale.
Per quanto riguarda l'azione vasodilatatrice endotelio-dipendente dell'estratto vegetale, sono stati impiegati vari bloccanti come L-NAME (eNOS), indometacina (COX) e apamina + caribdotossina (EDHF). I dati rappresentativi hanno mostrato sia risultati positivi (cioè una significativa riduzione della risposta vasodilatatrice in presenza di inibitori di eNOS o EDHF) che risultati negativi (cioè nessun cambiamento nella risposta vasodilatatrice in presenza dell'inibitore della COX), suggerendo che l'estratto vegetale agisce attraverso le vie endoteliali eNOS e EDHF. L'effetto vasorilassante indipendente dall'endotelio indotto dall'estratto vegetale è stato valutato attraverso il coinvolgimento dei canali K +, l'afflusso extracellulare di Ca 2+ e il rilascio di Ca2+ dalla SR. I risultati hanno mostrato che la vasorilassamento in risposta all'estratto vegetale è stata ridotta da un bloccante dei canali K Ca (iberiotossina) ma non da un bloccante dei canali KV (4-AP) o da un bloccante dei canali KATP (glibenclamide), suggerendo che l'estratto agisce attraverso l'apertura dei canali KCa. Inoltre, la vasocostrizione indotta da CaCl2 è stata ridotta dall'estratto vegetale, suggerendo che il suo meccanismo implicava l'inibizione dei VOCC sui VSMC o l'interferenza con le interazioni di Ca2+ con i macchinari contrattili. Studi complementari dovrebbero essere condotti per analizzare ulteriormente la sua azione meccanicistica dettagliata. Inoltre, la contrazione transitoria a PE nei Krebs privi di Ca 2+ è stata ridotta, indicando che l'estratto vegetale ha inibito il rilascio di Ca2+ dalla SR, portando alla riduzione della vasocostrizione. Un riassunto del meccanismo interpretato dell'azione vasorilassante dell'estratto vegetale è illustrato nella Figura 11.
I protocolli sperimentali proposti nel presente studio sono tecnicamente fattibili e mostrano una buona riproducibilità; Tuttavia, alcuni passaggi cruciali sono essenziali per garantire il successo. In primo luogo, la composizione della soluzione fisiologica deve essere mantenuta con precisione durante la preparazione per garantire che la procedura funzioni correttamente. Inoltre, è fondamentale evitare di toccare, allungare o danneggiare l'arteria polmonare durante la preparazione. Il mezzo deve essere continuamente sostituito ogni 15 minuti (3 volte) per stabilizzare i test e la valutazione una volta che l'arteria polmonare è fissata nella camera da bagno dell'organo. La pretensione del recipiente deve essere aumentata leggermente al di sopra del livello richiesto e quindi gradualmente diminuita fino al raggiungimento dell'optimum (cioè 1 g).
Diversi protocolli sperimentali, come la vitalità dei vasi sanguigni, la presenza di cellule endoteliali e l'effetto degli estratti vegetali sul rilassamento dei vasi sanguigni, sono valutati con questa tecnica. La procedura chiarita per l'isolamento dell'IPA del ratto può essere adattata ad altre specie (ad esempio, topo, coniglio e uomo). Tuttavia, le condizioni ottimali richieste per l'assemblaggio di un bagno d'organo possono differire tra i vari modelli animali e possono essere adattate di conseguenza. È importante sottolineare che le condizioni sperimentali non sono una replica esatta delle condizioni fisiologiche e i risultati non possono essere estrapolati direttamente al fenomeno in vivo .
Questo metodo di isolamento IPA e le misurazioni della risposta vascolare sono approcci pratici per valutare la fisiologia vascolare, la patologia e la farmacologia. Consente ai ricercatori di studiare la vasocostrizione e la vasorilassamento in un ambiente isolato ma ben controllato. Inoltre, può essere adattato per studiare l'azione terapeutica dei farmaci utilizzati per la patologia vascolare polmonare, come l'ipertensione arteriosa polmonare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Consiglio Nazionale delle Ricerche della Thailandia, il Centro di eccellenza per l'innovazione in chimica (PERCH-CIC) e la Rete internazionale di ricerca (IRN61W0005) per aver fornito supporto finanziario e il Dipartimento di Fisiologia della Facoltà di Scienze Mediche, Naresuan University, per il supporto delle strutture di ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | - | - | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | - | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | - | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. - |
References
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