Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Isolering av arteria intrapulmonal og glatt muskulatur for å undersøke vaskulære responser

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63686
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 3, 4, 1, 1
1Department of Physiology, Faculty of Medical Science and Center of Excellence for Innovation in Chemistry, Naresuan University, 2Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Naresuan University, 3Cosmetics and Natural Products Research Center, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Naresuan University, 4Snyder Institute for Chronic Diseases, Airways Inflammation Research Group, Department of Physiology and Pharmacology, University of Calgary

Summary

Vaskulære responser av arteriell lungesirkulasjon kan utforskes ved hjelp av intrapulmonal arterie (IPA) og vaskulære glatte muskelceller (VSMCs). Denne studien beskriver isoleringen av IPA i detalj og protokollene som brukes til å undersøke vasorelaxation som respons på fysiologiske stimuli.

Abstract

Den intrapulmonale arterien (IPA) og vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) isolert fra rotte lunger kan brukes til å studere de underliggende mekanismene for vasokonstriksjon og vasorelaxasjon. Etter å ha isolert IPA og VSMC, kan egenskapene til vaskulære responser i fysiologiske og patologiske forhold vurderes i fravær av ekstrinsiske faktorer som nervesignaler, hormoner, cytokiner, etc. Dermed tjener IPA og VSMCs som gode modeller for å studere vaskulær fysiologi / patofysiologi, sammen med ulike eksperimentelle undersøkelser, for eksempel modulering av farmakologiske midler, patch-clamp elektrofysiologisk analyse, kalsiumavbildning, etc. Her har vi brukt en teknikk for å isolere IPA for å undersøke vaskulære responser i et organbadoppsett. IPA-segmenter ble montert på orgelbadkammeret via intraluminale ledninger og stimulert av forskjellige farmakologiske midler. Endringene i IPA vaskulær tone (dvs. vasokonstriksjon og vasorelaxasjon), ble registrert ved hjelp av en isometrisk krafttransduser og fysiologisk dataanalyseprogram. Vi implementerte flere eksperimentelle protokoller, som kan tilpasses for å undersøke mekanismene for vasorelaxation / vasokonstriksjon for å studere farmakologiske aktiviteter av fytokjemiske eller syntetiske stoffer. Protokollene kan også brukes til å evaluere stoffets roller i modulerende ulike sykdommer, inkludert pulmonal arteriell hypertensjon. IPA-modellen gjør det mulig å undersøke konsentrasjon-respons-kurven, noe som er avgjørende for å vurdere legemidlers farmakodynamiske parametere.

Introduction

Lungevaskulaturen er et lavtrykks vaskulært system der hovedfunksjonen er å levere deoksygenert blod til gassutvekslingsområdet i lungene. Lungearteriene i lungene er ordnet i grener parallelt med bronkialtreet, og danner til slutt et omfattende nettverk av kapillærer som er kontinuerlig over flere alveoler og til slutt kommer sammen i venuler og årer. Den vaskulære tonen i lungearterien styres av flere faktorer, som involverer samspillet mellom endotelet og vaskulære glatte muskelceller (VSMCs)1.

I denne studien fokuserer vi på endotelavhengig og -uavhengig vasorelaxasjon av arteria intrapulmonal arterie (IPA). Med hensyn til den endotelavhengige vasorelaxasjonen kan forskjellige mekanismer som forekommer på overflaten av endotelceller øke intracellulær Ca2+-konsentrasjon (f.eks. acetylkolin [ACh] binder seg til muskarinreseptor [M3]), noe som fører til dannelse av nitrogenoksid (NO), prostacyklin (PGl2) og endotelavledet hyperpolariserende faktor (EDHF) (figur 1 ). NO er den viktigste endotelavledede avslappende faktoren syntetisert fra L-arginin av endotelial nitrogenoksidsyntase (eNOS)2, som deretter dissosieres ut av endotelcellene til VSMCs (figur 1) og stimulerer det oppløselige guanylcyklase (sGC) enzymet; dette enzymet endrer guanosintrifosfat (GTP) til syklisk guanosinmonofosfat (cGMP), som aktiverer proteinkinase G (PKG) og reduserer cytosoliske Ca2+ nivåer, og dermed forårsaker vasorelaxasjon (figur 1). PGl2 syntetiseres av endotelceller via cyklo-oksygenase (COX) -banen 3,4. Det binder seg til prostacyklinreseptoren (IP) på VSMCs og stimulerer adenylylsyklase (AC) enzymet, som deretter omdanner adenosintrifosfat (ATP) til syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) (figur 1) 3,4. cAMP aktiverer proteinkinase A (PKA), reduserer cytosolisk Ca2+ nivå og forårsaker vasorelaxasjon5 (figur 1). EDHF-banen deltar også i endotelavhengig vasorelaxasjon via ulike endotelmediatorer og elektriske hendelser. Aktiveringen av EDHF-banen fører til hyperpolarisering av VSMCs, og lukker dermed spenningsopererte Ca2+ kanaler (VOCCs), reduserer intracellulære Ca2 + nivåer og induserer vasorelaxation6. Den endoteluavhengige vasorelaxasjonen skjer direkte på VSMCs via flere mekanismer, for eksempel reduksjon av intracellulært Ca 2+ nivå, inhibering av myosin lettkjedekinase (MLCK), aktivering av myosin lettkjedet fosfatase (MLCP), og reduksjon av Ca2+ følsomhet for kontraktilmaskineriet til VSMCs. I denne studien fokuserer vi på vasorelaxasjonen forårsaket av åpningen av forskjellige K + -kanaler, blokkeringen av VOCCs og inhiberingen av Ca 2 + -frigjøring fra sarkoplasmatisk retikulum7, noe som fører til reduksjon av intracellulære Ca 2 + -nivåer, og dermed reduserer VSMC myosin lyskjedefosforylering og henholdsvis myosin-aktinbinding eller kryssbrodannelse, til slutt resulterer i vasorelaxation.

Teknikken for å evaluere vasokonstriksjons- og vasorelaxasjonsmålinger i isolert IPA er godt etablert for gnagere, men dataene varierte avhengig av eksperimentelle protokoller. Denne studien beskriver metoden som ble brukt til å evaluere vaskulære reaktiviteter av rotte IPA-preparater in vitro, som ble gjort i fravær av eksterne faktorer som modulerer vaskulær respons in vivo, som nervesignaler, hormoner, cytokiner, blodtrykk, etc.

Vi benyttet flere eksperimentelle protokoller ved å bruke planteekstraktet som et eksempel for å studere vaskulære reaktiviteter av IPA. Ulike blokkere (figur 1) ble benyttet for å identifisere mekanismene for endotelavhengig og -uavhengig vasorelaxasjon indusert av planteekstraktet. Likevel kan de samme protokollene tilpasses for å evaluere IPAs vaskulære respons på legemidler, ekstrakter eller fytokjemikalier som brukes til behandling av ulike lungepatologier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsøkene som ble utført i denne studien ble godkjent av den etiske komiteen for Naresuan University Animal Care and Use Committee (NUACUC), protokollnummer NU-AE620921, for pleie og bruk av dyr til vitenskapelige formål.

1. Sammensetning av fysiologiske løsninger

  1. Formuler Krebs-løsningen ved å oppløse kjemikalier i destillert vann for å oppnå de endelige konsentrasjonene som følger: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaHPO4, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2og 11 mM glukose8. Juster pH i oppløsningen til 7,3 med 1 M NaOH og forvarm til 37 °C før bruk.
  2. Forbered kald Krebs-løsning på samme måte som nevnt i trinn 1.1. til bruk som isolasjonsmedium for IPA, som beskrevet i trinn 2.

2. Isolering av arteria intrapulmonal arterie (IPA)

  1. Bedøv 8 uker gamle Wistar-hannrotter med en intraperitoneal injeksjon av natriumtiopental (100 mg/kg)9. Sjekk rottene for deres reaksjon på smertefulle stimuli i dyp søvn ved å bruke tang festet til føttene, og sørg for at rottene ikke har en fottrekkreaksjon før de avlives i trinn 2.2.
  2. Klipp opp den midterste thoraxen av rotten og hjerteterminalen med saks (størrelse 14 cm). Finn deretter roten av lungen med saks (størrelse 14 cm). Høst hele lungen ved å kutte med saks og senk den i kald Krebs-løsning10,11.
  3. Skjær en enkelt lungelapp i skiver med saks (størrelse 11 cm) og legg på en petriskål (størrelse 9 cm) med medialsiden/roten av lungen vendt oppover (figur 2A, B). Vær oppmerksom på og identifiser justeringen av venen, bronkiene og arterien fra topp til bunn (figur 2B).
  4. Klipp opp bronkusen i lengderetningen med saks (størrelse 11 cm). Bruk deretter tangen (størrelse 11 cm) for å ta tak i spissen av bronkusen. Disseker forsiktig og fjern bronkus og vener ut av lungen. Merk at IPA alltid er anatomisk justert under bronkus.
  5. Etter det kan hoved-IPA visualiseres (figur 2C). Bruk tangen (størrelse 11 cm) til å ta tak i spissen av IPA og disseker den forsiktig ut av lungevevet med saks (størrelse 11 cm).
  6. Oppbevar den isolerte IPA-en i kald Krebs-oppløsning til organbadet er satt opp (pH 7,3 og temperatur 4 °C)1 1.

3. Isolering av vaskulære glatte muskelceller (VSMCs)

  1. Isoler IPA som tidligere beskrevet i trinn 2. Klipp opp hovedgrenen av IPA i lengderetningen med saks (størrelse 11 cm) og kutt i små strimler (2 mm) (figur 3A).
  2. Senk IPA-stripene i et dissosiasjonsmedium (DM)10,12 som inneholder 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaH 2 PO4, 10 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,03 mM fenol rød, 10 mM taurin, 0,5 mM EDTA, 2 mM MgCl 2, 11 mM glukose og 0,16 mM CaCl 2, og juster pH til 7,0 med 1 M NaOH. Inkuber strimlene i 1 time ved 4 °C i DM inneholdende 1 mg/ml papain, 0,04 % bovint serumalbumin (BSA) og 0,4 mM 1,4-dithiothreitol (DTT), og inkluder videre ved 37 °C i 15 minutter. Tilsett 1 mg/ml kollagenase type 1A i DM og inkuber videre ved 37 °C i 5 min.
    MERK: DM er en løsning som brukes til å bevare cellens levedyktighet. Papain og kollagenase type 1A er enzymer som bryter ned de ekstracellulære matriksproteinene for å isolere enkeltceller. BSA er et serumalbuminprotein som brukes til stabilisering av enzymer under lagring og enzymatiske reaksjoner. DTT er et reduksjonsmiddel som brukes til å stabilisere og fremme aktiviteten til enzymer under celleisolasjonsprosessen. Taurin er amino svovelsyre som brukes til å stabilisere cellemembranen og celleintegriteten.
  3. Overfør vevet til fersk DM og spred ved forsiktig triturasjon ved hjelp av en glass Pasteur-pipette (figur 3B). Fortsett å triturere til isolerte VSMC blir synlige i badeløsningen under mikroskopet (figur 3C).
    MERK: Nyisolerte VSMCs kan brukes til å studere vaskulær fysiologi / patofysiologi, sammen med ulike eksperimentelle undersøkelser, for eksempel modulering av farmakologiske midler, patch-clamp elektrofysiologisk analyse, kalsiumavbildning, etc. Den foreliggende studien fokuserer imidlertid bare på vasorelaxering av isolert IPA ved bruk av orgelbadteknikken.

4. Orgelbadteknikk

  1. Isoler IPA som tidligere beskrevet i trinn 2. Klipp hovedgrenen av IPA i ringer med ~ 2 mm lengde (figur 2D) 13.
  2. Fest IPA-ringene i orgelbadkamre (figur 4) ved å tre dem på to 40 μm diameter rustfrie ståltråder (figur 2E) 11,13,14.
  3. Fest ledninger i rustfritt stål montert med IPA-ringer til de isometriske krafttransduserne som er koblet til datainnsamlingsenheten og datasystemet som er installert med egnet fysiologisk programvare for dataregistrering og analyse, og øk deretter forsiktig spenningen til IPA-ringen til 1 g11.
  4. La fartøysegmentene likestille i ca. 45 minutter ved en hvilespenning på 1 g. I løpet av likevektsperioden må du sørge for at Krebs-løsningen endres regelmessig hvert 15. minutt. Etter denne likevektsperioden, test levedyktigheten til karene ved å måle vasokonstriksjonen til høy ekstracellulær K + (80 mM) oppløsning inneholdende 47,4 mM NaCl, 80 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaHPO4, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2 og 11 mM glukose10,11.
  5. Vurder tilstedeværelsen eller fraværet av endotel ved å beregne avslapningsresponsen til acetylkolin (1 x 10-5 M) i ringer som er forhåndskontraktert med fenylefrin (PE, 1 x 10-5 M) (Merk at vaskulære sammentrekninger forblir stabile i 1 time etter tilsetning av PE). Betrakt ringene som endotel-intakte hvis de kvantifiserer for mer enn 70% avslapning (figur 5A). Hvis de har mindre enn 10% avslapning, bør du vurdere ringene som endotel-denuded13 (figur 5B). Fjern endotelet mekanisk ved å gni forsiktig inne i karet med en liten ledning for å indusere denudasjon.
  6. Balanser igjen arterieringene i 30 minutter før testeksperimentene starter.

5. Vasorelaxant respons på planteekstrakt

  1. Undersøk den relakserende effekten av planteekstraktet ved å prekontrahere IPA-ringer med PE (1 x 10-5 M).
  2. Deretter tilsettes planteekstraktet (1-1000 μg/ml) kumulativt til endotel-intakte ringer og endotel-denuderte ringer for å indusere vasorelaxasjon (figur 6A, B) og for å oppnå en konsentrasjonsavhengig responskurve (figur 6C).
  3. Forsikre deg om at effekten av dimetylsulfoksid (DMSO) brukt som løsningsmiddel også evalueres på samme måte for å tjene som en negativ kontroll (figur 6C).

6. Mekanisme for planteekstrakt-indusert vasorelaxation via endotelet

  1. Evaluer den vasorelaxante virkningsmekanismen til planteekstraktet via endotelial nitrogenoksidsyntase (eNOS), cyklooksygenase (COX)13 og endotelavledet hyperpolariserende faktor (EDHF) ved å inkubere endotel-intakte IPA-ringer i 30 minutter med følgende hemmere (figur 7A): 1 x 10−4 M NG-nitro-L-argininmetylester (L-NAME, en eNOS-hemmer)9, 1 x 10−5 M indometacin (en COX-hemmer)9, eller en kombinasjon av 1 x 10−7 M apamin (en liten kalsiumaktivert kaliumkanalblokker) og 1 x 10−7 M charybdotoxin (en mellomliggende og storkonduktans kalsiumaktivert kaliumkanalblokker), før sammentrekninger av IPA med 1 x 10−5 M PE induseres.
  2. Deretter, etter at sammentrekningene til PE stabiliseres, legg til kumulative konsentrasjoner (0,1-1000 μg / ml) av planteekstraktet.
  3. Presentere effekten av planteekstrakt som prosentvis relaksasjon av IPA-ringene i nærvær av inhibitorer sammenlignet med responsen til IPA-ringene uten inhibitorer (figur 7B-D) og konstruere konsentrasjon-responskurven.

7. Mekanisme for planteekstrakt-indusert vasorelaxation via vaskulær glatt muskulatur K + kanaler

  1. Pre-inkubere endotel-denuderte IPA-ringer i 30 minutter med 1 x 10-3 M 4-aminopyridin (4-AP), en blokkering av spenningsstyrt kaliumkanal (KV) (figur 8A), 1 x 10-5 M glibenklamid, en blokkering av ATP-sensitiv kaliumkanal (KATP), eller 1 x 10-7 M iberiotoxin, en blokkering av stor konduktans Ca2+-aktiverte K+-kanaler (KCa), før indusere sammentrekninger av IPA med 1 x 10-5 M PE.
  2. Deretter legger du til kumulative konsentrasjoner av planteekstraktet.
  3. Presentere effekten av planteekstrakt som prosentvis relaksasjon av IPA-ringene med inhibitor sammenlignet med IPA-ringene uten hemmer (figur 8B-D) og konstruere konsentrasjon-responskurven.

8. Mekanisme for planteekstrakt-indusert vasorelaxasjon via inhibering av ekstracellulært kalsium (Ca2+) tilstrømning i VSMCs

  1. Pre-inkubere endotel-denuderte IPA-ringer i 30 minutter i Ca2+-fri Krebs-løsning inneholdende 1 mM etylenglykol-bis (2-aminoetyleter)-N,N,N',N'-tetraeddiksyre (EGTA) (figur 9A).
  2. Bytt deretter ut badeløsningen med Ca2 + fri-80 mM K+ -løsning i 10 minutter for å depolarisere VSMC-ene, som deretter åpner VOCC-ene (figur 9A).
  3. Legg kumulativt til CaCl2 (0,01-10 mM) for å indusere vasokonstriksjon av IPA og konstruere konsentrasjon-respons-kurven (figur 9A).
  4. Gjenta denne protokollen i de samme IPA-ringene, men inkuber dem med planteekstrakt eller 1 μM nikardipin (L-type Ca 2+ kanalblokker) i Ca2+ inneholdende 80 mM K+ løsning i 10 minutter etterfulgt av kumulativ tilsetning av CaCl28.
  5. Til slutt, sammenlign den kontraktile responsen med den maksimale sammentrekningen som tidligere ble fremkalt av kontroll CaCl2-utfordringer (figur 9B).

9. Mekanisme for planteekstrakt-indusert vasorelaxasjon via inhibering av intracellulært kalsium (Ca2+) frigjøring fra sarkoplasmatisk retikulum (SR)

  1. Utsett endotel-denuderte IPA-ringer til 80 mM K + -løsning i ca. 5 minutter, depolarisering av VSMC-ene, åpning av VOCC-ene og til slutt generering av Ca2+ lasting i SR (figur 10A).
  2. Bytt ut badeløsningen i 10 minutter med Ca2+-fri Krebs-løsning inneholdende 1 mM EGTA (figur 10A).
  3. Deretter utfordrer du IPA-ringene med 1 x 10-5 M PE, som aktiverer fosfolipase C / IP 3-banen, og til slutt frigjør Ca2 + fra SR og fremkaller en forbigående sammentrekning av IPA (figur 10A).
  4. Gjenta den samme protokollen for å fastslå likeledes forbigående sammentrekninger til PE.
  5. Utfordre IPA-ringene igjen med 80 mM K+-løsning i ca. 5 min, og erstatt deretter badeløsningen med Ca2+-fri Krebs-løsning som inneholder 1 mM EGTA med eller uten planteekstraktet i 10 min.
  6. Igjen, utfordre IPA-ringene med 1 x 10-5 M PE.
  7. Sammenlign IPA-sammentrekningene indusert av PE mellom tilstanden med og uten planteekstraktet (figur 10B).

10. Statistisk analyse

  1. Uttrykk resultatene som gjennomsnitt ± SEM. Sammenlign disse verdiene ved hjelp av studentens t-test eller analyser ved hjelp av en variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukey-Kramer post hoc-testen ved hjelp av egnet statistisk programvare. Vurder forskjellene på p < 0,05 for å være statistisk signifikante. Her var det n = 6 rotter/eksperimentell protokoll.
    MERK: Registrering av vasokonstriksjon og vasorelaxering kan vurderes med egnet programvare installert på datamaskinen. For eksempel viser figur 5A at når blodkarene stimuleres av PE som forårsaker sammentrekning, kan dette observeres fra den økte spenningen i den opprinnelige sporingen. Sporingen vil stabilisere seg i 20-30 min, noe som regnes som en 100% sammentrekning. Etter det stimulerer ACh blodkarene, forårsaker avslapning, noe som kan observeres fra den reduserte spenningen i den opprinnelige sporingen. Dermed beregnes den reduserte spenningen som prosentandelen sammenlignet med 100% sammentrekning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen i denne studien er utviklet for å bestemme de optimale eksperimentelle forholdene for måling av fysiologiske fenomener observert i vaskulære responser av isolerte IPA-preparater. Pilotforsøkene ble utført for å beskrive de potensielle resultatene som hjelper forståelsen av vaskulære effekter og mekanistisk grunnlag for den vasorelaxante virkningen av planteekstraktet, som følger.

Vasorelaxant effekt av planteekstraktet
Som vist i figur 6A, B, i endotel-intakt IPA (E +), fremkalte planteekstraktet en konsentrasjonsavhengig respons av vasorelaxasjon (EC50 = 66,88 μg / ml, figur 6C). Utryddelse av endotel (E-) reduserte kraftig vasorelaxasjonen indusert av planteekstraktet (p < 0,01), noe som gjenspeiles av økningen i EC 50 med 2,2 ganger (E-, EC50 = 150,60 μg / ml, figur 6C). Kjøretøyet, DMSO, hadde ingen effekt. Dermed produserte planteekstraktet vasorelaxering hovedsakelig via en endotelavhengig vei og delvis via en endoteluavhengig vei.

Mekanisme for vasorelaxant virkning av planteekstraktet via endotelavhengige veier
Som vist i figur 7, reduserte bruk av L-NAME for inhibering av eNOS (figur 7B) og kombinasjonen av apamin pluss charybdotoxin for blokkering av EDHF (figur 7D) tydeligvis den vasorelaksiske responsen på planteekstraktet. Dette forskjøv konsentrasjons-responskurven til høyre og økte EC50 uten å endreE-maksverdiene. Tvert imot viste indometacin (en COX-hemmer) (figur 7C) ingen effekt på den vasolelakserende responsen på planteekstraktet.

Karakterisering av rollen som K + -kanaler i vasorelaxant virkning av planteekstraktet
I de endotel-denuderte IPA-ringene reduserte K Ca-kanalblokkeren (iberiotoksin) den vasorelaxante responsen på planteekstraktet (figur 8C), mens blokkere av Kv (4-AP) eller KATP (glibenklamid) kanaler ikke endret vasorelaxasjonen indusert av planteekstraktet (figur 8B, D).

Mekanisme for vasorelaxant virkning av planteekstraktet via ekstracellulær Ca2+ tilstrømningsinhibering
For å undersøke om mekanismen for vasorelaxant virkning av planteekstraktet involverte ekstracellulær Ca 2+ tilstrømningshemming, ble vasokonstriksjonen av endotel-denuderte IPA-ringer fremkalt av 1 x 10−5-1 x 10−2 M CaCl2 i Ca2+-fri Krebs-løsning inkorporert med 80 mM K+ for å aktivere VOCCs (figur 9A,B). Preinkubasjon med planteekstraktet (68 μg / ml, EC50-verdi) hemmet CaCl 2-indusert sammentrekning (p < 0,001 vs. kjøretøy).

Mekanisme for vasorelaxant virkning av planteekstraktet via inhibering av intracellulær Ca2+ frigjøring fra SR
For å undersøke om frigjøring av intracellulær Ca 2+ fra SR spilte noen rolle i den vasorelaxante effekten, ble de endotel-denuderte IPA-ringene pre-inkubert med Ca2+-fri Krebs-løsning, etterfulgt av tilsetning av PE (1 x 10−5 M), noe som ga en forbigående kontraksjon (figur 10A). Deretter, i samme IPA-ring, ble dette eksperimentet replikert i nærvær av enten kjøretøy eller planteekstrakt. I forhold til kjøretøyet reduserte planteekstraktet signifikant (p < 0,001) sammentrekningen indusert av PE (figur 10B).

Figure 1
Figur 1: Vaskulær toneregulering via endotelavhengige og -uavhengige veier. AA = Arakidonsyre, ACh = Acetylkolin, AC = Adenylylsyklase, ATP = Adenosin 5'-trifosfat, cAMP = Syklisk adenosinmonofosfat, cGMP = Syklisk guanosinmonofosfat, COX = Cyklooksygenase, DAG = Diacylglycerol, EDHF = Endotelavledet hyperpolariserende faktor, eNOS = Endotelial nitrogenoksidsyntase, G q = G-protein typeq, G s = G-protein types, GTP = Guanosintrifosfat, IP = Prostacyklinreseptor, IP 3 = Inositol 1, 4, 5 trisfosfat, IP3 R = IP3-reseptor, IK Ca = Mellomkonduktans Ca 2+-aktivert K+-kanal, KV = Spenningsstyrte kaliumkanaler, K ATP =ATP-sensitive kaliumkanaler, K Ca = Stor konduktansCa 2+-aktiverte K+-kanaler, M3 = Muskarinreseptor, MEGJ = Myoendotelial gab-kryss, NO = Nitrogenoksid, PE = Fenylefrin, PGI 2 = Prostacyklin, PGs = Prostaglandiner, PIP2 = Fosfatidylinositol 4,5 bisfosfat, PKA = Proteinkinase A, PKG = Proteinkinase G, PLA 2 = Fosfolipase A2, PLC = Fosfolipase C, ROCCs = Reseptoroperert Ca 2+ kanaler, RYR = Ryanodinreseptor, sGC = Løselig guanylylsyklase, SK Ca = Liten konduktans Ca 2+-aktivert K+ kanal, SR = Sarkoplasmatisk retikulum, VOCC = SpenningsstyrteCa 2+ kanaler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Viktige trinn i isolasjonen av rotte intrapulmonal arterie (IPA). (A) Bildet viser rottelunge med IPA. (B) Disseksjon av medial side / rot av lungen som vender opp. (C) Visualisert hoved-IPA etter fjerning av vener og bronkier. (D) Isolert IPA. (E) IPA-ringene ble montert på et par ledninger i rustfritt stål for en vaskulær responsstudie ved bruk av orgelbadteknikken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Viktige trinn i IPA vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) isolasjon. (A) Isolert IPA ble kuttet i små strimler og nedsenket i dissosiasjonsmedium (DM). (B) Triturasjon av vaskulære strimler for å isolere VSMCs. (C) Isolerte VSMCs etter mild trituration. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Skjematisk illustrasjon av utstyret som brukes til å teste vaskulær reaktivitet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representativ registrering som viser vasorelaxering av IPA-ringer forhåndskontraktert med 10 μM PE med 10 μM acetylkolin (ACh). (A) Endotel-intakt ring (E +) og (B) endotel-denuded (E-) ring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Vasorelaxering av IPA ved planteekstraktet. (A) Representativ registrering som viser vasorelaxering av IPA-ringer av planteekstraktet (1-1,000 μg / ml) forhåndskontraktert med 10 μM PE i endotel-intakte ringer (E +) og (B) endotel-denuded (E-) ringer. (C) Konsentrasjons-responskurver for vasorelaxasjon indusert av planteekstraktet i IPA-ringer (E+, n = 6 og E-, n = 6). Vasorelaxation uttrykkes som en prosentandel av sammentrekningen indusert av PE. Alle data er angitt som gjennomsnittlig ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001 sammenlignet med kjøretøy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7. Mekanismene for planteekstrakt-indusert IPA vasorelaxation via endotel-avhengige banen. (A) Representativ registrering som viser vasorelaxering av planteekstraktet (1-1,000 μg / ml) av endotel-intakte IPA-ringer (E +) preinkubert med L-NAME (eNOS-hemmer) og forhåndskontraktert med 10 μM PE. (B-D) Konsentrasjonsresponskurver for planteekstraktinduserte vasorelaxasjoner av endotel-intakte (E +) IPA-ringer precontracted med PE og preinkubert med hemmere av forskjellige endotelsignalveier, inkludert (B) 100 μM L-NAVN, (C) 10 μM indometacin eller (D) 0,1 μM apamin pluss 0,1 μM charybdotoxin. Verdier er betyr ± SEM. (n = 6). **p < 0,01, ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8. Effekt av K + kanalblokkere på planteekstrakt-indusert IPA vasorelaxation. (A) Representativ registrering som viser vasorelaxering av planteekstraktet (1-1,000 μg / ml) av endotel-denuderte (E-) IPA-ringer inkubert med 4-AP (KV kanalblokker) og forhåndskontraktert med 10 μM PE. (B-D) Konsentrasjonsresponskurver for planteekstraktindusert vasorelaxering av endotel-denuderte (E-) IPA-ringer precontracted med PE og preinkubert med forskjellige K + kanalblokkere, inkludert (B) 1 mM 4-AP, (C) 10 μM glibenklamid, eller (D) 30 nM iberiotoxin. Verdier er betyr ± SEM. (n = 6). p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9. Effekt av planteekstraktet på ekstracellulær Ca2+ tilstrømning. (A) Representative poster som viser CaCl 2-indusert sammentrekning av IPA-ringer i fravær (kontroll) eller tilstedeværelse av planteekstraktet. IPA-ringer ble badet i Ca2+fri høy K+-løsning (80 mM) inneholdende 10 mM EGTA og kontraksjonen fremkalt av en kumulativ konsentrasjon av CaCl2 ble målt. Denne protokollen ble deretter gjentatt alene (kontroll, n = 6) eller i nærvær av planteekstraktet (n = 6). (B) Konsentrasjonsresponskurver for CaCl 2-indusert sammentrekning av IPA-ringer i fravær (kontroll) eller tilstedeværelse av planteekstraktet eller 1 μM nikardipin (L-type Ca2+ kanalblokker). CaCl 2-indusert kontraksjon ble beregnet i prosent av maksimal kontraksjon registrert fra første CaCl2-applikasjon og uttrykt som gjennomsnittlig ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001 sammenlignet med nikardipin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10. Effekt av planteekstraktet på Ca2+ frigjøring fra sarkoplasmatisk retikulum (SR). (A) Representativ registrering som viser fenylefrin (PE)-indusert sammentrekning av IPA-ringer ved Ca2+ frigjøring fra SR av endotel-denuderte IPA-ringer i nærvær av DMSO (kontroll) og 10 μM planteekstrakt. Dataene er prosentvis sammentrekning til 10 μM PE-induserte sammentrekninger sammenlignet med sammentrekninger produsert av den første protokollen uten planteekstraktet. Verdier er betyr ± SEM. **p < 0,01 sammenlignet med kjøretøy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11: Foreslått mekanisme for vasodilatorvirkning av planteekstraktet på rotte intrapulmonal arterie via endotelavhengige og -uavhengige veier AA = Arakidonsyre, ACh = Acetylkolin, AC = Adenylylcyklase, ATP = Adenosin 5'-trifosfat, cAMP = Syklisk adenosinmonofosfat, cGMP = Syklisk guanosinmonofosfat, COX = Cyklooksygenase, DAG = Diacylglycerol, EDHF = Endotelavledet hyperpolariserende faktor, eNOS = Endotelial nitrogenoksidsyntase, Gq = G-protein type q, G s = G-protein types, GTP = Guanosintrifosfat, IP = Prostacyklinreseptor, IP 3 = Inositol 1, 4, 5 trisfosfat, IP 3 R = IP 3 reseptor, IK Ca = Mellomkonduktans Ca 2+-aktivert K+ kanal, KV = Spenningsstyrte kaliumkanaler, K ATP =ATP-sensitive kaliumkanaler, K Ca = Stor konduktansCa 2+-aktivert K+ kanaler, M3 = Muskarinreseptor, MEGJ = Myoendotelial gab-kryss, NO = Nitrogenoksid, PE = Fenylefrin, PGI 2 = Prostacyklin, PGs = Prostaglandiner, PIP 2 = Fosfatidylinositol 4,5 bisfosfat, PKA = Proteinkinase A, PKG = Proteinkinase G, PLA 2 = Fosfolipase A 2, PLC = Fosfolipase C, ROCCs = Reseptoroperert Ca2+ kanaler, RYR = Ryanodinreseptor, sGC = Løselig guanylylsyklase, SK Ca = Liten konduktansCa 2+-aktivert K+-kanal, SR = Sarkoplasmatisk retikulum, VOCC = Spenningsstyrte Ca2+-kanaler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskriptet beskriver vi teknikken for isolering av rotte-IPA og VSMC-er. Flere eksperimentelle protokoller har blitt brukt til å undersøke vaskulær respons av IPA in vitro, som kan brukes til å karakterisere den farmakologiske effekten og mekanistiske grunnlaget for IPA vasorelaxation indusert av planteekstrakt.

Når det gjelder den endotelavhengige vasodilatorvirkningen av planteekstraktet, ble forskjellige blokkere som L-NAME (eNOS), indometacin (COX) og apamin+charybdotoxin (EDHF) benyttet. De representative dataene viste både positive resultater (dvs. signifikant reduksjon av vasodilatorrespons i nærvær av enten eNOS- eller EDHF-hemmere) og negative resultater (dvs. ingen endring i vasodilatorrespons i nærvær av COX-hemmeren), noe som tyder på at planteekstraktet virker via eNOS- og EDHF-endotelveiene. Den endoteluavhengige vasorelaxanteffekten indusert av planteekstraktet ble evaluert via involvering av K + -kanalene, ekstracellulær Ca 2 + -tilstrømning og Ca2 + frigjøring fra SR. Resultatene viste at vasorelaxation som svar på planteekstraktet ble redusert av en blokkering av K Ca-kanaler (iberiotoxin), men ikke av en blokkering av KV-kanaler (4-AP) eller en blokkering av KATP-kanaler (glibenklamid), noe som tyder på at ekstraktet virker via åpningen av KCa-kanaler. Videre ble CaCl 2-indusert vasokonstriksjon redusert av planteekstraktet, noe som tyder på at mekanismen involverte inhibering av VOCCs på VSMCs eller interferens med samspillet mellom Ca2 + med kontraktilt maskineri. Komplementære studier bør utføres for å analysere sin detaljerte mekanistiske handling ytterligere. Videre ble den forbigående sammentrekningen til PE i Ca 2+-fri Krebs redusert, noe som indikerer at planteekstraktet hemmet frigjøringen av Ca2+ fra SR, noe som førte til reduksjon av vasokonstriksjon. Et sammendrag av den tolkede mekanismen for den vasorelaxante virkningen av planteekstraktet er illustrert i figur 11.

De eksperimentelle protokollene som er foreslått i denne studien er teknisk gjennomførbare og viser god reproduserbarhet; Likevel er visse avgjørende skritt avgjørende for å sikre suksess. For det første må sammensetningen av den fysiologiske løsningen opprettholdes nøyaktig under forberedelsen for å sikre at prosedyren fungerer som den skal. Det er også viktig å unngå å berøre, strekke eller skade lungearterien under forberedelsen. Mediet må kontinuerlig skiftes ut hvert 15. minutt (3 ganger) for å stabilisere testing og evaluering når lungearterien er festet i orgelbadkammeret. Forspenningen til fartøyet skal økes til litt over ønsket nivå og deretter gradvis reduseres til det optimale oppnås (dvs. 1 g).

Flere eksperimentelle protokoller, som blodkarets levedyktighet, tilstedeværelsen av endotelceller og effekten av planteekstrakter på avslapping av blodkar, evalueres ved denne teknikken. Den belyste prosedyren for isolering av rotte IPA kan tilpasses andre arter (f.eks. Mus, kanin og menneske). Likevel kan de optimale forholdene som kreves for montering av et orgelbad, variere mellom ulike dyremodeller og kan tilpasses tilsvarende. Det er viktig at de eksperimentelle forholdene ikke er en nøyaktig replikasjon av fysiologiske forhold, og resultatene kan ikke ekstrapoleres direkte til in vivo-fenomenet .

Denne IPA-isolasjonsmetoden og vaskulære responsmålinger er praktiske tilnærminger for å evaluere vaskulær fysiologi, patologi og farmakologi. Det gjør det mulig for forskere å studere vasokonstriksjon og vasorelaxation i et isolert, men godt kontrollert miljø. I tillegg kan den tilpasses for å studere den terapeutiske virkningen av legemidler som brukes til pulmonal vaskulær patologi, som pulmonal arteriell hypertensjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne National Research Council of Thailand, Center of Excellence for innovasjon i kjemi (PERCH-CIC), og International Research Network (IRN61W0005) for å gi økonomisk støtte, og Institutt for fysiologi Fakultet for medisinsk vitenskap, Naresuan University, for forskning anlegget støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632
CAS NO. 348-12-3
4-aminopyridine (4-AP) Aldrich Chemical A78403
CAS NO. 504-24-5
Acetylcholine Sigma-Aldrich A6625
CAS NO. 60-31-1
Apamin Sigma-Aldrich A9459
CAS NO. 24345-16-2
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
CAS NO. 9048-46-8
Calcium choride Ajax Finechem AJA960
CAS NO. 1707055184
Charybdotoxin Sigma-Aldrich C7802
CAS NO. 95751-30-7
Collagenase type 1A Sigma-Aldrich C9891
CAS NO. 9001-12-1		 From Clostridium histolyticum
D(+)-Glucose monohydrate Millipore Corporation K50876942 924
CAS NO. 14431-43-7
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D4540
CAS NO. 67-68-5
Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
CAS NO. 67-42-5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884
CAS NO. 60-00-4
Forceps 11 cm. Rustless Dumoxel -
Forceps 14 cm. Rustless Dumoxel -
Glibenclamide Sigma-Aldrich G6039
CAS NO. 16673-34-0
GraphPad Prism program Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)
HEPES Sigma-Aldrich H3375
CAS NO. 7365-45-9
Iberiotoxin Sigma-Aldrich I5904
CAS NO. 1002546960		 recombinant from Mesobuthus tamulus
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378
CAS NO. 53-86-1
Labchart Program Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).
Magnesium chloride Ajax Finechem 296
CAS NO. 1506254995
Male Wistar rats Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand
NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) Sigma-Aldrich N5751
CAS NO. 51298-62-5
Nicardipine Sigma-Aldrich N7510
CAS NO. 54527-84-3
Organ bath 15 mL. - - Specific order by the researchers
Papain Sigma-Aldrich P4762
CAS NO. 9001-73-4		 FromPapaya Latex
Phenal red Sigma-Aldrich P5530
CAS NO. 34487-61-1
Phenylephrine Sigma-Aldrich P6126
CAS NO. 61-76-7
Potassium chloride Kemaus KA383
CAS NO. 7447-40-7
Potassium dihydrogenphosphate Aldrich Chemical EC231-913-4
CAS NO. 7778-77-0
S+A2:E36odium chloride Kemaus KA465
CAS NO. 7647-14-5
Scissors 11 cm. Spall Stainless -
Scissors 14 cm. Spall Stainless -
Sodium bicarbonate Ajax Finechem 475
CAS NO. 912466
Sodium dihydrogenphosphate Aldrich Chemical 33,198-8
CAS NO. 7558-80-7
Sodium hydroxide Ajax Finechem 482
CAS NO. 1506196602
Sodium thiopental Anesthal JPN3010002
CAS NO. 1C 314/47
Taurine Sigma-Aldrich T0625
CAS NO. 107-35-7
Waterbath WBU 45 Memmert 2766
CAS NO. -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
  2. Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
  3. Ruan, K. -H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
  4. Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
  5. Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
  6. Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
  7. Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
  8. Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
  9. Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
  10. Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
  11. Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
  12. Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
  13. Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
  14. Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).

Tags

Medisin utgave 184
Isolering av arteria intrapulmonal og glatt muskulatur for å undersøke vaskulære responser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

To-on, K., Chatturong, U., Panklai,… More

To-on, K., Chatturong, U., Panklai, T., Palang, I., Inchan, A., Wisutthathum, S., Paracha, T. U., Apaikawee, P., Chootip, K. Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses. J. Vis. Exp. (184), e63686, doi:10.3791/63686 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter