Summary
Arteriyel pulmoner dolaşımın vasküler yanıtları intrapulmoner arter (IPA) ve vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler) kullanılarak araştırılabilir. Bu çalışmada IPA'nın izolasyonu ayrıntılı olarak ve fizyolojik uyaranlara yanıt olarak vazogevşemenin araştırılmasında kullanılan protokoller açıklanmaktadır.
Abstract
Sıçan akciğerlerinden izole edilen intrapulmoner arter (IPA) ve vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler), vazokonstriksiyon ve vazogevşemenin altında yatan mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. IPA ve VSMC'ler izole edildikten sonra, fizyolojik ve patolojik durumlarda vasküler yanıtların özellikleri, sinir sinyalleri, hormonlar, sitokinler vb. gibi dışsal faktörlerin yokluğunda değerlendirilebilir. Bu nedenle, IPA ve VSMC'ler, farmakolojik ajanlarla modülasyon, yama-kelepçeli elektrofizyolojik analiz, kalsiyum görüntüleme gibi çeşitli deneysel araştırmalarla birlikte vasküler fizyoloji / patofizyolojiyi incelemek için mükemmel modeller olarak hizmet eder. Burada, bir organ banyosu kurulumunda vasküler yanıtları araştırmak için IPA'yı izole etmek için bir teknik kullandık. IPA segmentleri intraluminal teller vasıtasıyla organ banyosu odasına monte edildi ve çeşitli farmakolojik ajanlarla uyarıldı. IPA vasküler tonusundaki değişiklikler (yani vazokonstriksiyon ve vazogevşeme), izometrik kuvvet dönüştürücü ve fizyolojik veri analizi yazılım programı kullanılarak kaydedildi. Fitokimyasal veya sentetik ilaçların farmakolojik aktivitelerini incelemek için vazogevşeme / vazokonstriksiyon mekanizmalarını araştırmak için uyarlanabilen birkaç deneysel protokol uyguladık. Protokoller, pulmoner arteriyel hipertansiyon da dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların modülasyonunda ilaçların rollerini değerlendirmek için de kullanılabilir. IPA modeli, ilaçların farmakodinamik parametrelerinin değerlendirilmesinde çok önemli olan konsantrasyon-yanıt eğrisini araştırmamıza izin verir.
Introduction
Pulmoner vaskülatür, ana fonksiyonun akciğerlerin gaz değişim alanına oksijensiz kan vermek olduğu düşük basınçlı bir vasküler sistemdir. Akciğerlerdeki pulmoner arterler, bronşiyal ağaca paralel dallar halinde düzenlenir, sonuçta birkaç alveol üzerinde sürekli olan ve son olarak venüller ve damarlar halinde bir araya gelen geniş bir kılcal damar ağı oluşturur. Pulmoner arterin vasküler tonusu, endotel ve vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler) arasındaki etkileşimi içeren çeşitli faktörler tarafından kontrol edilir1.
Bu çalışmada, intrapulmoner arterin (IPA) endotele bağımlı ve bağımsız vazogevşemesi üzerinde durulmuştur. Endotel bağımlı vazogevşeme ile ilgili olarak, endotel hücrelerinin yüzeyinde meydana gelen çeşitli mekanizmalar, hücre içi Ca 2+ konsantrasyonunu artırabilir (örneğin, muskarinik reseptör [M3] ile asetilkolin [ACh] bağlanır), nitrik oksit (NO), prostasiklin (PGl2) ve endotel kaynaklı hiperpolarize edici faktör (EDHF) oluşumuna yol açabilir (Şekil 1 ). NO, endotel nitrik oksit sentaz (eNOS)2 tarafından L-arginin'den sentezlenen ana endotel kaynaklı gevşetici faktördür, daha sonra endotel hücrelerinden VSMC'lere ayrışır (Şekil 1) ve çözünür guanilil siklaz (sGC) enzimini uyarır; Bu enzim guanosin trifosfatı (GTP) protein kinaz G'yi (PKG) aktive eden ve sitozolik Ca2+ seviyelerini azaltan ve böylece vazogevşemeye neden olan siklik guanozin monofosfata (cGMP) dönüştürür (Şekil 1). PGl2, endotel hücreleri tarafından siklo-oksijenaz (COX) yolu 3,4 üzerinden sentezlenir. VSMC'ler üzerindeki prostasiklin reseptörü (IP) ile bağlanır ve adenozin trifosfatı (ATP) siklik adenozin monofosfata (cAMP) dönüştüren adenilil siklaz (AC) enzimini uyarır (Şekil 1)3,4. cAMP, protein kinaz A'yı (PKA) aktive eder, sitozolik Ca2+ seviyelerini azaltır ve vazogevşemeye neden olur5 (Şekil 1). EDHF yolu ayrıca çeşitli endotel mediatörleri ve elektriksel olaylar yoluyla endotele bağımlı vazogevşemeye katılır. EDHF yolunun aktivasyonu, VSMC'lerin hiperpolarizasyonuna yol açar, böylece voltajla çalışan Ca 2 + kanallarını (VOCC'ler) kapatır, hücre içi Ca2 + seviyelerini azaltır ve vazogevşeme6'yı indükler. Endotelden bağımsız vazogevşeme, hücre içi Ca 2+ seviyesinin düşürülmesi, miyozin hafif zincir kinazının (MLCK) inhibisyonu, miyozin hafif zincirli fosfatazın (MLCP) aktivasyonu ve VSMC'lerin kontraktil makinelerine Ca2+ duyarlılığının azaltılması gibi çeşitli mekanizmalar yoluyla doğrudan VSMC'lerde meydana gelir. Bu çalışmada, çeşitli K+ kanallarının açılmasının neden olduğu vazogevşeme, VOCC'lerin blokajı ve sarkoplazmik retikulum7'den Ca 2+ salınımının inhibisyonuna odaklanıyoruz, bu da hücre içi Ca 2+ seviyelerinin azalmasına yol açan, böylece VSMC miyozin hafif zincir fosforilasyonunu ve miyoz-aktin bağlanmasını veya çapraz köprü oluşumunu azaltan, sonuçta vazogevşeme ile sonuçlanır.
İzole IPA'da vazokonstriksiyon ve vazogevşeme ölçümlerini değerlendirme tekniği kemirgenler için iyi kurulmuştur, ancak veriler deneysel protokollere bağlı olarak değişmiştir. Bu çalışmada, sinir sinyalleri, hormonlar, sitokinler, kan basıncı gibi in vivo vasküler yanıtı modüle eden dış faktörlerin yokluğunda yapılan sıçan IPA preparatlarının in vitro vasküler reaktivitelerini değerlendirmek için kullanılan yöntem açıklanmaktadır.
IPA'nın vasküler reaktivitelerini incelemek için bitki ekstraktını örnek olarak kullanan birkaç deneysel protokol kullandık. Bitki ekstresi tarafından indüklenen endotele bağımlı ve bağımsız vazogevşeme mekanizmalarını tanımlamak için çeşitli blokerler (Şekil 1) kullanılmıştır. Bununla birlikte, aynı protokoller, IPA'nın çeşitli pulmoner patolojilerin tedavisinde kullanılan herhangi bir ilaca, ekstrakta veya fitokimyasallara vasküler yanıtlarını değerlendirmek için uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada yapılan deneyler, Naresuan Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (NUACUC) Etik Kurulu tarafından, NU-AE620921 protokol numarasıyla, hayvanların bilimsel amaçlarla bakımı ve kullanımı için onaylanmıştır.
1. Fizyolojik çözeltilerin bileşimi
- Krebs çözeltisini, nihai konsantrasyonları elde etmek için kimyasalları damıtılmış suda çözerek aşağıdaki gibi formüle edin: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaHPO4, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2 ve 11 mM glikoz8. Çözeltinin pH'ını 1 M NaOH ile 7,3'e ayarlayın ve kullanmadan önce 37 °C'ye ısıtın.
- Soğuk Krebs çözeltisini adım 1.1'de belirtildiği gibi hazırlayın. adım 2'de açıklandığı gibi IPA'nın yalıtım ortamı olarak kullanmak için.
2. İntrapulmoner arter (IPA) izolasyonu
- 8 haftalık erkek Wistar sıçanlarını intraperitoneal sodyum tiyopental enjeksiyonu (100 mg/kg)9 ile uyuşturun. Sıçanları, ayaklarına kenetlenmiş forseps kullanarak derin uykuda ağrılı uyaranlara tepkilerini kontrol edin, ardından sıçanların adım 2.2'de ötenazi yapmadan önce ayak geri çekilme reaksiyonu olmadığından emin olun.
- Sıçanın orta toraksını ve kalp terminalini makasla (boyut 14 cm) kesin. Ardından, akciğerin kökünü makasla bulun (boyut 14 cm). Tüm akciğeri makasla keserek toplayın ve soğuk Krebs çözeltisi10,11'e batırın.
- Akciğerin tek bir lobunu makasla (boyut 11 cm) dilimleyin ve akciğerin medial tarafı / kökü yukarı bakacak şekilde bir Petri kabına (boyut 9 cm) yerleştirin (Şekil 2A, B). Damar, bronş ve arterin yukarıdan aşağıya hizalanmasını gözlemleyin ve tanımlayın (Şekil 2B).
- Bronşu makasla uzunlamasına kesin (boyut 11 cm). Ardından, bronşun ucunu tutmak için forsepsleri (boyut 11 cm) kullanın. Bronş ve damarları yavaşça disseke edin ve akciğerden çıkarın. IPA'nın her zaman bronşun altında anatomik olarak hizalandığını unutmayın.
- Bundan sonra, ana IPA görselleştirilebilir (Şekil 2C). IPA'nın ucunu tutmak için forsepsleri (boyut 11 cm) kullanın ve makasla (boyut 11 cm) akciğer dokusundan dikkatlice diseke edin.
- İzole edilmiş IPA'yı, organ banyosu tertibatı kurulana kadar soğuk Krebs çözeltisinde tutun (pH 7,3 ve sıcaklık 4 °C)1 1.
3. Vasküler düz kas hücrelerinin (VSMC'ler) izolasyonu
- IPA'yı daha önce adım 2'de açıklandığı gibi yalıtın. IPA'nın ana dalını makasla uzunlamasına kesin (boyut 11 cm) ve küçük şeritler halinde (2 mm) kesin (Şekil 3A).
- IPA şeritlerini 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO4, 0,5 mMNaH2PO4, 10 mM NaHCO 3, 10 mM HEPES, 0,03 mM fenol kırmızı, 10 mM taurin, 0,5 mM EDTA, 2 mM MgCl 2, 11 mM glikoz ve 0,16 mM CaCl2 içeren bir ayrışma ortamına (DM)daldırın, ve 1 M NaOH ile pH'ı 7,0'a ayarlayın. Şeritleri 1 mg / mL papain,% 0.04 sığır serum albümini (BSA) ve 0.4 mM 1,4- ditiyotreitol (DTT) içeren DM'de 4 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. DM'ye 1 mg / mL kollajenaz tip 1A ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de daha fazla inkübe edin.
NOT: DM, hücre canlılığını korumak için kullanılan bir çözümdür. Papain ve kollajenaz tip 1A, tek hücreleri izole etmek için hücre dışı matriks proteinlerini parçalayan enzimlerdir. BSA, depolama ve enzimatik reaksiyonlar sırasında enzimlerin stabilizasyonu için kullanılan bir serum albümin proteinidir. DTT, hücre izolasyon işlemi sırasında enzimlerin aktivitesini stabilize etmek ve teşvik etmek için kullanılan bir indirgeyici ajandır. Taurin, hücre zarını ve hücre bütünlüğünü stabilize etmek için kullanılan amino sülfürik asittir. - Dokuları taze DM'ye aktarın ve bir cam Pasteur pipet kullanarak nazik tritürasyon ile dağılın (Şekil 3B). İzole VSMC'ler mikroskop altındaki banyo çözeltisinde görünür hale gelene kadar tritürasyona devam edin (Şekil 3C).
NOT: Yeni izole edilmiş VSMC'ler, vasküler fizyoloji / patofizyolojinin incelenmesi için, farmakolojik ajanlarla modülasyon, yama-kelepçeli elektrofizyolojik analiz, kalsiyum görüntüleme vb. gibi çeşitli deneysel araştırmalarla birlikte kullanılabilir. Bununla birlikte, bu çalışma sadece organ banyosu tekniği kullanılarak izole IPA'nın vazogevşemesine odaklanmaktadır.
4. Organ banyosu tekniği
- IPA'yı daha önce adım 2'de açıklandığı gibi yalıtın. IPA'nın ana dalını ~2 mm uzunluğundaki halkalar halinde kesin (Şekil 2D)13.
- IPA halkalarını organ banyosu odalarına (Şekil 4) iki adet 40 μm çapında paslanmaz çelik tel üzerine geçirerek yapıştırın (Şekil 2E)11,13,14.
- IPA halkaları ile monte edilmiş paslanmaz çelik telleri, veri toplama cihazına bağlı izometrik kuvvet dönüştürücülere ve veri kaydı ve analizi için uygun fizyolojik yazılımla kurulan bilgisayar sistemine takın, ardından IPA halkasının gerginliğini yavaşça1 g 11'e yükseltin.
- Gemi segmentlerinin 1 g'lık bir dinlenme geriliminde yaklaşık 45 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Dengeleme süresi boyunca, Krebs çözeltisinin her 15 dakikada bir düzenli olarak değiştirildiğinden emin olun. Bu denge periyodundan sonra, vazokonstriksiyonlarını 47.4 mM NaCl, 80 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.5 mM KH 2 PO 4, 0.5 mM NaHPO4, 1.8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 ve 11mM glikoz10,11 içeren yüksek hücre dışı K + (80 mM) çözeltisine ölçerek damarların yaşayabilirliğini test edin.
- Fenilefrin (PE, 1 x 10−5 M) ile önceden konteke edilmiş halkalarda asetilkoline (1 x 10−5 M) gevşeme yanıtını hesaplayarak endotelin varlığını veya yokluğunu değerlendirin (PE eklendikten sonra vasküler kasılmaların 1 saat boyunca sabit kaldığını unutmayın). Halkaları% 70'ten fazla gevşeme için nicelleştiriyorlarsa, endotel bozulmamış olarak düşünün (Şekil 5A). % 10'dan az gevşeme varsa, halkaları endotel kaynaklı13 olarak düşünün (Şekil 5B). Denudasyonu indüklemek için kabın içine küçük bir telle hafifçe sürtünerek endoteli mekanik olarak çıkarın.
- Test deneylerinin başlamasından önce arteriyel halkaları 30 dakika boyunca tekrar dengeleyin.
5. Bitki ekstraktına vazorelaxant yanıtı
- IPA halkalarını PE (1 x 10−5 M) ile önceden kontonere ederek bitki ekstraktının gevşetici etkisini araştırın.
- Daha sonra, vazogevşemeyi indüklemek (Şekil 6A, B) ve konsantrasyona bağlı bir yanıt eğrisi elde etmek için bitki ekstraktını (1-1.000 μg / mL) endotel bozulmamış halkalara ve endotel reddedilen halkalara kümülatif olarak dikkatlice ekleyin (Şekil 6C).
- Çözücü olarak kullanılan dimetil sülfoksitin (DMSO) etkisinin de negatif kontrol görevi görecek şekilde benzer şekilde değerlendirildiğinden emin olun (Şekil 6C).
6. Endotel yoluyla bitki özü kaynaklı vazogevşeme mekanizması
- Endotel paraziti bozulmamış IPA halkalarını aşağıdaki inhibitörlerle 30 dakika boyunca inkübe ederek bitki ekstraktının endotel nitrik oksit sentaz (eNOS), siklo-oksijenaz (COX)13 ve endotel kaynaklı hiperpolarize edici faktör (EDHF) yolları aracılığıyla vazorelaxant etki mekanizmasını değerlendirin (Şekil 7A): 1 x 10−4 M NG-nitro-L-arginin metil ester (L-NAME, bir eNOS inhibitörü)9, 1 x 10−5 M indometazin (bir COX inhibitörü)9, veya 1 x 10−5 M PE ile IPA kasılmalarını indüklemeden önce 1 x 10−7 M apamin (küçük bir kalsiyum ile aktive potasyum kanal blokeri) ve 1 x 10−7 M charybdotoxin (bir ara ve büyük iletkenlikli kalsiyum ile aktive potasyum kanal blokeri) kombinasyonu.
- Daha sonra, PE stabilize etmek için kasılmalardan sonra, bitki ekstraktının kümülatif konsantrasyonlarını (0.1-1.000 μg / mL) ekleyin.
- Bitki ekstraktının etkilerini, inhibitörlerin varlığında IPA halkalarının inhibitörsüz yanıtına kıyasla IPA halkalarının yüzde gevşemesi olarak sunar (Şekil 7B-D) ve konsantrasyon-yanıt eğrisini oluşturur.
7. Vasküler düz kas K+ kanalları aracılığıyla bitki özü kaynaklı vazogevşeme mekanizması
- Endotel ile infüze edilmiş IPA halkalarını 1 x 10−3 M 4-aminopiridin (4-AP), voltaj kapılı potasyum kanalı blokeri (KV) (Şekil 8A), 1 x 10−5 M glibenklamid, ATP'ye duyarlı potasyum kanalı (KATP) blokeri veya büyük iletkenlik Ca2+-aktive K+ kanallarının (KCa) blokeri olan 1 x 10−7 M iberiotoksin ile 30 dakika boyunca önceden inkübe edin, 1 x 10−5 M PE ile IPA kasılmalarını indüklemeden önce.
- Daha sonra, bitki ekstraktının kümülatif konsantrasyonlarını ekleyin.
- Bitki ekstraktının etkilerini, inhibitörlü IPA halkalarının inhibitörsüz IPA halkalarına kıyasla yüzde gevşemesi olarak sunar (Şekil 8B-D) ve konsantrasyon-yanıt eğrisini oluşturur.
8. VSMC'lerde hücre dışı kalsiyum (Ca2+) akışının inhibisyonu yoluyla bitki ekstraktına bağlı vazogevşeme mekanizması
- Endotelyumla denud edilmiş IPA halkalarını, 1 mM etilen glikol-bis (2-aminoetilet)-N,N,N',N'-tetraasetik asit (EGTA) içeren Ca 2+-free Krebs çözeltisinde 30 dakika boyunca inkübe edin (Şekil 9A).
- Ardından, VSMC'leri depolarize etmek için banyo solüsyonunu 10 dakika boyunca Ca2 + serbest-80 mM K+ çözeltisi ile değiştirin ve ardından VOCC'leri açın (Şekil 9A).
- IPA'nın vazokonstriksiyonunu indüklemek ve konsantrasyon-yanıt eğrisini oluşturmak için kümülatif olarak CaCl2 (0.01-10 mM) ekleyin (Şekil 9A).
- Bu protokolü aynı IPA halkalarında tekrarlayın, ancak bunları 10 dakika boyunca 80 mM K + çözeltisi içeren Ca 2+ 'da bitki özü veya 1 μM nikardipin (L tipi Ca2 + kanal bloker) ile önceden inkübe edin ve ardından CaCl28'in kümülatif ilavesini yapın.
- Son olarak, kontraktil yanıtı daha önce kontrol CaCl2 zorluklarının neden olduğu maksimum kasılma ile karşılaştırın (Şekil 9B).
9. Sarkoplazmik retikulumdan (SR) hücre içi kalsiyum (Ca2+) salınımının inhibisyonu yoluyla bitki ekstraktına bağlı vazogevşeme mekanizması
- Endotel ile doldurulmuş IPA halkalarını yaklaşık 5 dakika boyunca 80 mM K+ çözeltisine maruz bırakın, VSMC'leri depolarize edin, VOCC'leri açın ve sonuçta SR'ye Ca2+ yüklemesini üretin (Şekil 10A).
- Banyo solüsyonunu 10 dakika boyunca 1 mM EGTA içeren Ca2+-free Krebs çözeltisi ile değiştirin (Şekil 10A).
- Daha sonra, fosfolipaz C / IP3 yolunu aktive eden, sonuçta SR'den Ca2 + 'yı serbest bırakan ve IPA'nın geçici bir daralmasını uyandıran 1 x 10−5 M PE ile IPA halkalarına meydan okuyun (Şekil 10A).
- PE'ye benzer şekilde geçici kasılmaları tespit etmek için aynı protokolü tekrarlayın.
- IPA halkalarına yaklaşık 5 dakika boyunca 80 mM K+ çözeltisi ile tekrar meydan okuyun, ardından banyo solüsyonunu 10 dakika boyunca bitki özü olsun veya olmasın 1 mM EGTA içeren Ca2+-free Krebs çözeltisi ile değiştirin.
- Yine, IPA halkalarına 1 x 10−5 M PE ile meydan okuyun.
- PE tarafından indüklenen IPA kasılmalarını, bitki ekstraktlı ve bitkisiz durum arasında karşılaştırın (Şekil 10B).
10. İstatistiksel analiz
- Bu değerleri Öğrencinin t-testini kullanarak karşılaştırın veya uygun istatistiksel yazılımı kullanarak Tukey-Kramer post hoc testi ile takip edilen bir varyans analizi (ANOVA) ile analiz edin.± p < 0.05'teki farkların istatistiksel olarak anlamlı olduğunu düşünün. Burada n=6 sıçan/deney protokolü vardı.
NOT: Vazokonstriksiyon ve vazogevşeme kaydı, bilgisayarda yüklü uygun bir yazılımla değerlendirilebilir. Örneğin, Şekil 5A , kan damarları kasılmaya neden olan PE tarafından uyarıldığında, bunun orijinal izlemenin artan gerginliğinden gözlemlenebileceğini göstermektedir. İzleme, % 100 daralma olarak kabul edilen 20-30 dakika içinde stabilize olacaktır. Bundan sonra, ACh kan damarlarını uyarır ve orijinal izlemenin azalan gerginliğinden gözlemlenebilen gevşemeye neden olur. Böylece, azalan gerilim% 100 daralmaya kıyasla yüzde olarak hesaplanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmadaki protokol, izole IPA preparatlarının vasküler yanıtlarında gözlenen fizyolojik fenomenleri ölçmek için en uygun deneysel koşulları belirlemek için geliştirilmiştir. Pilot deneyler, bitki ekstraktının vazogevşetici etkisinin vasküler etkilerinin ve mekanik temelinin anlaşılmasına yardımcı olan potansiyel sonuçları aşağıdaki gibi tanımlamak için gerçekleştirilmiştir.
Bitki ekstraktının vazorelaxant etkisi
Şekil 6A,B'de gösterildiği gibi, endotel bozulmamış IPA'da (E +), bitki ekstraktı konsantrasyona bağlı vazogevşeme yanıtı ortaya çıkarmıştır (EC50 = 66.88 μg / mL, Şekil 6C). Endotelin (E-) eradikasyonu, EC 50'deki artışın 2.2 kat artmasıyla yansıtıldığı gibi, bitki ekstraktının neden olduğu vazogevşemeyi (p <0.01) derinden azaltmıştır (E-, EC50 = 150.60 μg / mL, Şekil 6C). Araç, DMSO, herhangi bir etkiye sahip değildi. Böylece, bitki ekstresi esas olarak endotele bağımlı bir yol ve kısmen endotelden bağımsız bir yol yoluyla vazogevşeme üretti.
Bitki ekstraktının endotele bağımlı yollar yoluyla vazogevşetici etki mekanizması
Şekil 7'de gösterildiği gibi, eNOS'un inhibisyonu için L-NAME'in kullanılması (Şekil 7B) ve EDHF'yi bloke etmek için apamin artı charybdotoxin kombinasyonu (Şekil 7D), bitki ekstraktına vazorelaxant yanıtını açıkça azaltmıştır. Bu, konsantrasyon-tepki eğrisini sağa kaydırdı ve Emax değerlerini değiştirmeden EC50'yi arttırdı. Aksine, indometazin (bir COX inhibitörü) (Şekil 7C), bitki ekstraktına vazogevşetici yanıt üzerinde hiçbir etki göstermemiştir.
Bitki ekstraktının vazorelaxant etkisinde K + kanallarının rolünün karakterize edilmesi
Endotel ile indüklenen IPA halkalarında, KCa kanal blokeri (iberiotoxin) bitki ekstraktına vazorelaxant yanıtı azaltırken (Şekil 8C), Kv (4-AP) veya KATP (glibenklamid) kanallarının blokerleri bitki ekstraktının neden olduğu vazogevşemeyi değiştirmemiştir (Şekil 8B, D).
Hücre dışı Ca 2+ akı inhibisyonu yoluyla bitki ekstraktının vazorelaxant etki mekanizması
Bitki ekstraktının vazorelaxant etki mekanizmasının hücre dışı Ca2+ inhibisyonunu içerip içermediğini araştırmak için, endotel kaynaklı IPA halkalarının vazokonstriksiyonu, VOCC'leri aktive etmek için 80 mM K + ile birleştirilmiş Ca 2 + içermeyen Krebs çözeltisinde 1 x 10−5-1 x 10−2 M CaCl2 tarafından uyarıldı (Şekil 9A, B). Bitki özü (68 μg/mL, EC50 değeri) ile ön inkübasyon, CaCl2 kaynaklı büzülmeyi inhibe etmiştir (p < 0.001 vs araç).
SR'den hücre içi Ca 2 + salınımının inhibisyonu yoluyla bitki ekstraktının vazorelaxant etkisinin mekanizması
SR'den hücre içi Ca 2 + salınımının vazorelaxant etkide herhangi bir rol oynayıp oynamadığını incelemek için, endotelyumdan yoksun IPA halkaları Ca2 + içermeyen Krebs çözeltisi ile önceden inkübe edildi, ardından PE (1 x 10−5 M) ilavesi ile geçici bir kasılma meydana getirildi (Şekil 10A). Daha sonra, aynı IPA halkasında, bu deney araç veya bitki ekstraktının varlığında çoğaltıldı. Araca kıyasla, bitki ekstraktı PE tarafından indüklenen büzülmeyi önemli ölçüde azaltmıştır (p < 0.001) (Şekil 10B).
Şekil 1: Endotele bağımlı ve bağımsız yollarla vasküler ton regülasyonu. AA = Araşidonik asit, ACh = Asetilkolin, AC = Adenil siklaz , ATP = Adenozin 5'-trifosfat, cAMP = Siklik adenozin monofosfat, cGMP = Siklik guanozin monofosfat, COX = Siklooksijenaz, DAG = Diasilgliserol, EDHF = Endotel kaynaklı hiperpolarize edici faktör, eNOS = Endotelyal nitrik oksit sentaz, G q = G-protein tipiq, G s = G-protein tipleris, GTP = Guanosin trifosfat, IP = Prostasiklin reseptörü, IP 3 = İnositol 1, 4, 5 trisfosfat, IP3 R = IP3 reseptörü, IK Ca = Ara iletkenlik Ca 2+-aktive K+ kanalı, KV = Gerilim kapılı potasyum kanalları, K ATP =ATP'ye duyarlı potasyum kanalları, K Ca = Büyük iletkenlikCa 2+-aktive K+ kanalları, M3 = Muskarinik reseptör, MEGJ = Miyoendotelyal gab bağlantısı, NO = Nitrik oksit, PE = Fenilefrin, PGI 2 = Prostasiklin, PG s = Prostaglandinler, PIP 2 = Fosfatidilinositol 4,5 bisfosfat, PKA = Protein kinaz A, PKG = Protein kinaz G, PLA 2 = Fosfolipaz A2, PLC = Fosfolipaz C, ROCC'ler = Reseptör ile çalışan Ca 2+ kanalları, RYR = Ryanodin reseptörü, sGC = Çözünür guanilil siklaz, SK Ca = Küçük iletkenlik Ca 2+-aktive K+ kanalı, SR = Sarkoplazmik retikulum, VOCC'ler = Gerilimle çalışanCa 2+ kanalları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sıçan intrapulmoner arter (IPA) izolasyonunun temel adımları. (A) Resimde IPA'lı sıçan akciğeri gösterilmektedir. (B) Akciğerin medial tarafının/kökünün yukarı bakacak şekilde diseksiyonu. (C) Damarlar ve bronşlar çıkarıldıktan sonra görselleştirilmiş ana IPA. (D) İzole IPA. (E) IPA halkaları, organ banyosu tekniği kullanılarak vasküler bir yanıt çalışması için bir çift paslanmaz çelik tel üzerine monte edilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: IPA vasküler düz kas hücrelerinin (VSMC'ler) izolasyonunun temel adımları . (A) İzole IPA küçük şeritler halinde kesildi ve ayrışma ortamına (DM) daldırıldı. (B) VSMC'leri izole etmek için vasküler şeritlerin tritürasyonu. (C) Nazik tritürasyondan sonra izole VSMC'ler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Vasküler reaktiviteyi test etmek için kullanılan ekipmanın şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 10 μM PE ile önceden kontrakte edilmiş IPA halkalarının vazogevşemesini gösteren temsili kayıt, 10 μM asetilkolin (ACh). (A) Endotelyum-bozulmamış halka (E +) ve (B) endotelyumdan yoksun (E-) halka. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: IPA'nın bitki ekstraktı tarafından vazoresyonu . (A) Endotel bozulmamış halkalarda (E+) ve (B) endotel kaynaklı (E-) halkalarda 10 μM PE ile önceden büzülmüş bitki ekstresi (1-1.000 μg / mL) tarafından IPA halkalarının vazogevşemesini gösteren temsili kayıt. (C) IPA halkalarındaki bitki ekstraktının neden olduğu vazogevşemenin konsantrasyon-yanıt eğrileri (E +, n = 6 ve E-, n = 6). Vazogevşeme, PE tarafından indüklenen kasılmanın bir yüzdesi olarak ifade edilir. Tüm veriler ortalama SEM ± olarak ifade edilir. **p < 0.01, ***p < 0.001 araç ile karşılaştırıldığında. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7. Endotel bağımlı yol üzerinden bitki ekstraktına bağlı IPA vazogevşemesinin mekanizmaları. (A) L-NAME (eNOS inhibitörü) ile önceden inkübe edilmiş ve 10 μM PE ile önceden kontübe edilmiş endotel bozulmamış IPA halkalarının (E +) bitki ekstraktı (1-1.000 μg / mL) tarafından vazogevşemeyi gösteren temsili kayıt. (B-D) PE ile önceden kontrakte edilmiş ve (B) 100 μM L-NAME, (C) 10 μM indometasin veya (D) 0.1 μM apamin artı 0.1 μM charybdotoxin dahil olmak üzere çeşitli endotel sinyal yollarının inhibitörleri ile önceden inkübe edilmiş endotelyal bozulmamış (E +) IPA halkalarının bitki ekstraktı kaynaklı vazogevşemelerinin konsantrasyon-yanıt eğrileri. Değerler, SEM ± araçlardır (n = 6). **p 0,01 <, ***p 0,001 <. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8. K+ kanal blokerlerinin bitki ekstraktına bağlı IPA vazogevşemesi üzerine etkisi. (A) 4-AP (K V kanal bloker) ile inkübe edilmiş ve 10 μM PE ile önceden kontübe edilmiş endotel denuded (E-) IPA halkalarının bitki ekstraktı (1-1.000μg / mL) tarafından vazogevşemeyi gösteren temsili kayıt. (B-D) PE ile önceden kontekte edilmiş ve (B) 1 mM 4-AP, (C) 10 μM glibenklamid veya (D) 30 nM iberotoksin dahil olmak üzere çeşitli K+ kanal blokerleri ile önceden inkübe edilmiş endotel kaynaklı (E-) IPA halkalarının bitki ekstraktına bağlı vazogevşemesinin konsantrasyon-yanıt eğrileri. Değerler, SEM ± araçlardır (n = 6). p < 0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9. Bitki ekstraktının hücre dışı Ca2 + akışı üzerindeki etkisi. (A) Bitki ekstraktının yokluğunda (kontrolünde) veya varlığında IPA halkalarının CaCl2 kaynaklı büzülmesini gösteren temsili kayıtlar. IPA halkaları, 10 mM EGTA içeren Ca 2+ serbest yüksek K + -çözeltisi (80 mM) ile yıkandı ve kümülatif bir CaCl2 konsantrasyonu ile uyarılan kasılma ölçüldü. Bu protokol daha sonra tek başına (kontrol, n = 6) veya bitki ekstraktının varlığında (n = 6) tekrarlandı. (B) Bitki ekstraktının veya 1 μM nikardipinin (L-tipi Ca2+ kanal bloker) yokluğunda (kontrol) veya varlığında IPA halkalarının CaCl2 kaynaklı büzülmesi için konsantrasyon-yanıt eğrileri. CaCl2 kaynaklı kontraksiyon, ilk CaCl2 uygulamasından kaydedilen maksimum kasılmanın yüzdesi olarak hesaplandı ve ortalama SEM ± olarak ifade edildi. * p < 0.05, ***p < 0.001 ile karşılaştırıldığında. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10. Bitki ekstraktının sarkoplazmik retikulumdan (SR) Ca2 + salınımı üzerine etkisi. (A) DMSO (kontrol) ve 10 μM bitki ekstresi varlığında endotel kaynaklı IPA halkalarının SR'sinden Ca2+ salınımı ile IPA halkalarının fenilefrin (PE) ile indüklenen kontraksiyonunu gösteren temsili kayıt. Veriler, bitki özü olmadan ilk protokol tarafından üretilen kasılmalara kıyasla 10 μM PE kaynaklı kasılmalara yüzde büzülmedir. Değerler SEM ± ortalamadır. **p < 0.01 araçla karşılaştırıldığında. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: Bitki ekstraktının endotele bağımlı ve bağımsız yollarla sıçan intrapulmoner arteri üzerindeki vazodilatör etkisinin önerilen mekanizması AA = Araşidonik asit, ACh = Asetilkolin, AC = Adenilil siklaz , ATP = Adenozin 5'-trifosfat, cAMP = Siklik adenozin monofosfat, cGMP = Siklik guanozin monofosfat, COX = Siklooksijenaz, DAG = Diasilgliserol, EDHF = Endotel kaynaklı hiperpolarize edici faktör, eNOS = Endotel nitrik oksit sentaz, Gq = G-protein tipi q, G s = G-protein tipis, GTP = Guanosin trifosfat, IP = Prostasiklin reseptörü, IP 3 = İnositol 1, 4, 5 trisfosfat, IP 3 R = IP 3 reseptörü, IK Ca = Ara iletkenlik Ca 2+-aktive K+ kanalı, KV = Gerilim kapılı potasyum kanalları, K ATP =ATP'ye duyarlı potasyum kanalları, K Ca = Büyük iletkenlikCa 2+-aktive K+ kanallar, M3 = Muskarinik reseptör, MEGJ = Miyoendotelyal gab birleşimi, NO = Nitrik oksit, PE = Fenilefrin, PGI 2 = Prostasiklin, PGs = Prostaglandinler, PIP 2 = Fosfatidilinositol 4,5 bisfosfat, PKA = Protein kinaz A, PKG = Protein kinaz G, PLA 2 = Fosfolipaz A 2, PLC = Fosfolipaz C, ROCC'ler = Reseptör ile çalışan Ca2+ kanalları, RYR = Ryanodin reseptörü, sGC = Çözünür guanilil siklaz, SK Ca = Küçük iletkenlikCa 2+ aktive K + kanalı, SR = Sarkoplazmik retikulum, VOCC'ler = Voltajla çalışan Ca2+ kanalları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, sıçan IPA ve VSMC'lerinin izolasyon tekniğini açıklayacağız. IPA'nın in vitro vasküler yanıtını araştırmak için, bitki ekstresi tarafından indüklenen IPA vazogevşemesinin farmakolojik etkisini ve mekanik temelini karakterize etmek için kullanılabilecek çeşitli deneysel protokoller kullanılmıştır.
Bitki ekstraktının endotele bağımlı vazodilatör etkisi ile ilgili olarak, L-NAME (eNOS), indometazin (COX) ve apamin + charybdotoxin (EDHF) gibi çeşitli blokerler kullanılmıştır. Temsili veriler hem pozitif sonuçlar (yani, eNOS veya EDHF inhibitörlerinin varlığında vazodilatör yanıtında önemli azalma) hem de negatif sonuçlar (yani, COX inhibitörü varlığında vazodilatör yanıtında herhangi bir değişiklik olmaması) göstermiştir, bu da bitki ekstraktının eNOS ve EDHF endotel yolları aracılığıyla hareket ettiğini düşündürmektedir. Bitki ekstraktının neden olduğu endotelden bağımsız vazorelaxant etki, K + kanallarının, hücre dışı Ca 2+ akışının ve SR'den Ca2 + salınımının katılımı ile değerlendirildi. Sonuçlar, bitki ekstraktına yanıt olarak vazogevşemenin, K Ca kanallarının (iberiotoksin) bir blokeri tarafından azaltıldığını, ancak KV kanallarının (4-AP) bir blokeri veya KATP kanallarının (glibenklamid) bir blokeri tarafından azaltılmadığını, ekstraktın KCa kanallarının açılmasıyla hareket ettiğini göstermiştir. Dahası, CaCl 2 kaynaklı vazokonstriksiyon, bitki ekstraktı tarafından azaltıldı, bu da mekanizmasının VSMC'ler üzerindeki VOCC'lerin inhibisyonunu veya Ca2 + 'nın kontraktil makinelerle etkileşimlerine müdahale etmeyi içerdiğini düşündürmektedir. Ayrıntılı mekanik eylemini daha fazla analiz etmek için tamamlayıcı çalışmalar yapılmalıdır. Ayrıca, Ca 2 + içermeyen Krebs'te PE'ye geçici kasılma azaltıldı, bu da bitki ekstraktının SR'den Ca2 + 'nın salınımını inhibe ettiğini ve vazokonstriksiyonun azaltılmasına yol açtığını gösterdi. Bitki ekstraktının vazogevşetici etkisinin yorumlanan mekanizmasının bir özeti Şekil 11'de gösterilmiştir.
Bu çalışmada önerilen deneysel protokoller teknik olarak uygulanabilir ve iyi bir tekrarlanabilirlik göstermektedir; Bununla birlikte, başarıyı sağlamak için bazı önemli adımlar gereklidir. İlk olarak, prosedürün düzgün çalışmasını sağlamak için fizyolojik çözeltinin bileşimi, hazırlık sırasında tam olarak korunmalıdır. Ayrıca, hazırlık sırasında pulmoner artere dokunmaktan, germekten veya zarar vermekten kaçınmak hayati önem taşır. Pulmoner arter organ banyosu odasına yapıştırıldıktan sonra test ve değerlendirmeyi stabilize etmek için ortam her 15 dakikada bir (3 kez) sürekli olarak değiştirilmelidir. Geminin ön gerilimi, istenen seviyenin biraz üzerine çıkarılmalı ve daha sonra optimum elde edilene kadar kademeli olarak azaltılmalıdır (yani, 1 g).
Kan damarlarının yaşayabilirliği, endotel hücrelerinin varlığı ve bitki ekstraktlarının kan damarlarının gevşemesi üzerindeki etkisi gibi çeşitli deneysel protokoller bu teknikle değerlendirilir. Sıçan IPA'sının izolasyonu için açıklığa kavuşturulmuş prosedür diğer türlere (örneğin, fare, tavşan ve insan) uyarlanabilir. Bununla birlikte, bir organ banyosunun montajı için gereken en uygun koşullar, çeşitli hayvan modelleri arasında farklılık gösterebilir ve buna göre uyarlanabilir. Önemli olarak, deneysel koşullar fizyolojik koşulların tam bir kopyası değildir ve sonuçlar doğrudan in vivo fenomene tahmin edilemez.
Bu IPA izolasyon yöntemi ve vasküler yanıt ölçümleri, vasküler fizyoloji, patoloji ve farmakolojinin değerlendirilmesinde pratik yaklaşımlardır. Araştırmacıların izole ancak iyi kontrol edilen bir ortamda vazokonstriksiyon ve vazogevşemeyi incelemelerini sağlar. Ek olarak, pulmoner arteriyel hipertansiyon gibi pulmoner vasküler patoloji için kullanılan ilaçların terapötik etkisini incelemek için uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Tayland Ulusal Araştırma Konseyi'ne, Kimyada İnovasyon Mükemmeliyet Merkezi'ne (PERCH-CIC) ve Uluslararası Araştırma Ağı'na (IRN61W0005) finansal destek sağladıkları için ve Naresuan Üniversitesi Tıp Bilimleri Fakültesi Fizyoloji Bölümü'ne araştırma tesisi desteği için teşekkür etmek isterler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | - | - | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | - | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | - | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. - |
References
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
- Ruan, K. -H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
- Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
- Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
- Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
- Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
- Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
- Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
- Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
- Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
- Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
- Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).
