Summary
Vaskulära svar på arteriell lungcirkulation kan utforskas med hjälp av intrapulmonell artär (IPA) och vaskulära glattmuskelceller (VSMCs). Den aktuella studien beskriver isoleringen av IPA i detalj och de protokoll som används för att undersöka vasorelaxation som svar på fysiologiska stimuli.
Abstract
Den intrapulmonella artären (IPA) och vaskulära glattmuskelceller (VSMCs) isolerade från råtta lungor kan användas för att studera de underliggande mekanismerna för vasokonstriktion och vasorelaxation. Efter isolering av IPA och VSMC kan egenskaperna hos vaskulära svar vid fysiologiska och patologiska tillstånd bedömas i frånvaro av yttre faktorer såsom nervsignaler, hormoner, cytokiner etc. Således fungerar IPA och VSMC som utmärkta modeller för att studera vaskulär fysiologi / patofysiologi, tillsammans med olika experimentella undersökningar, såsom modulering av farmakologiska medel, patch-clamp elektrofysiologisk analys, kalciumavbildning etc. Här har vi använt en teknik för att isolera IPA för att undersöka vaskulära svar i ett organbad. IPA-segment monterades på orgelbadkammaren via intraluminala ledningar och stimulerades av olika farmakologiska medel. Förändringarna i IPA-vaskulär ton (dvs. vasokonstriktion och vasorelaxation) registrerades med hjälp av en isometrisk kraftgivare och ett fysiologiskt dataanalysprogram. Vi implementerade flera experimentella protokoll, som kan anpassas för att undersöka mekanismerna för vasorelaxation / vasokonstriktion för att studera de farmakologiska aktiviteterna hos fytokemiska eller syntetiska droger. Protokollen kan också användas för att utvärdera läkemedels roller för att modulera olika sjukdomar, inklusive pulmonell arteriell hypertension. IPA-modellen gör det möjligt för oss att undersöka koncentrations-responskurvan, vilket är avgörande för att bedöma läkemedels farmakodynamiska parametrar.
Introduction
Lungkärlen är ett lågtryckskärlsystem där huvudfunktionen är att leverera deoxygenerat blod till gasutbytesområdet i lungorna. Lungartärerna i lungorna är ordnade i grenar parallellt med bronkialträdet, vilket i slutändan bildar ett omfattande nätverk av kapillärer som är kontinuerliga över flera alveoler och slutligen kommer samman i venules och vener. Den vaskulära tonen i lungartären styrs av flera faktorer, som involverar interaktionen mellan endotel och vaskulära glattmuskelceller (VSMCs)1.
I denna studie fokuserar vi på endotelberoende och -oberoende vasorelaxation av den intrapulmonella artären (IPA). När det gäller endotelberoende vasorelaxation kan olika mekanismer som förekommer på ytan av endotelceller öka intracellulär Ca2+ koncentration (t.ex. acetylkolin [ACh] binder med muskarinreceptor [M3]), vilket leder till bildandet av kväveoxid (NO), prostacyklin (PGl 2) och endotel-härledd hyperpolariserande faktor (EDHF) (Figur 1 ). NO är den huvudsakliga endotel-härledda avslappnande faktorn syntetiserad från L-arginin av endotelialt kväveoxidsyntas (eNOS)2, som sedan dissocierar ut ur endotelcellerna till VSMC (Figur 1) och stimulerar det lösliga guanylylylcyklaset (sGC) enzymet; detta enzym förändrar guanosintrifosfat (GTP) till cykliskt guanosinmonofosfat (cGMP), vilket aktiverar proteinkinas G (PKG) och minskar cytosoliska Ca2+ -nivåer, vilket orsakar vasorelaxation (Figur 1). PGl2 syntetiseras av endotelceller via cyklo-oxygenas (COX) väg 3,4. Det binder till prostacyklinreceptorn (IP) på VSMC och stimulerar enzymet adenylylcyklas (AC), som sedan omvandlar adenosintrifosfat (ATP) till cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) (figur 1)3,4. cAMP aktiverar proteinkinas A (PKA), vilket minskar cytosoliska Ca2+ nivåer och orsakar vasorelaxation5 (figur 1). EDHF-vägen deltar också i endotelberoende vasorelaxation via olika endotelmediatorer och elektriska händelser. Aktiveringen av EDHF-vägen leder till hyperpolarisering av VSMCs, vilket stänger spänningsdrivna Ca 2+ -kanaler (VOCC), minskar intracellulära Ca 2+ -nivåer och inducerar vasorelaxation 6. Den endoteloberoende vasorelaxationen sker direkt på VSMC via flera mekanismer, såsom reduktionen av intracellulär Ca 2+ -nivå, hämningen av myosinljuskedjekinas (MLCK), aktiveringen av myosinljuskedjefosfatas (MLCP) och minskningen av Ca2+ känslighet för kontraktilmaskineriet hos VSMCs. I denna studie fokuserar vi på vasorelaxation orsakad av öppningen av olika K + -kanaler, blockaden av VOCC och hämningen av Ca 2+ frisättning från sarkoplasmatisk retikulum7, vilket leder till minskning av intracellulära Ca2+ nivåer, vilket minskar VSMC-myosinljuskedjefosforylering respektive myosin-aktinbindning eller korsbrobildning, vilket resulterar i vasorelaxation.
Tekniken för att utvärdera vasokonstriktions- och vasorelaxationsmätningar i isolerad IPA är väl etablerad för gnagare, men data varierade beroende på experimentella protokoll. Den aktuella studien beskriver metoden som används för att utvärdera de vaskulära reaktiviteterna hos råtta IPA-preparat in vitro, som gjordes i frånvaro av yttre faktorer som modulerar vaskulärt svar in vivo, såsom nervsignaler, hormoner, cytokiner, blodtryck etc.
Vi använde flera experimentella protokoll med växtextraktet som ett exempel för att studera de vaskulära reaktiviteterna hos IPA. Olika blockerare (figur 1) användes för att identifiera mekanismerna för endotelberoende och -oberoende vasorelaxation inducerad av växtextraktet. Ändå kan samma protokoll anpassas för att utvärdera IPA: s vaskulära svar på alla läkemedel, extrakt eller fytokemikalier som används för behandling av olika lungpatologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten som utfördes i denna studie godkändes av etikkommittén för Naresuan University Animal Care and Use Committee (NUACUC), protokollnummer NU-AE620921, för vård och användning av djur för vetenskapliga ändamål.
1. Sammansättning av fysiologiska lösningar
- Formulera Krebs-lösning genom att lösa kemikalier i destillerat vatten för att uppnå de slutliga koncentrationerna enligt följande: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaHPO4, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2 och 11 mM glukos8. Justera lösningens pH till 7,3 med 1 M NaOH och förvärm det till 37 °C före användning.
- Förbered kall Krebs-lösning på samma sätt som nämns i steg 1.1. för användning som isoleringsmedium för IPA, enligt beskrivningen i steg 2.
2. Isolering av intrapulmonell artär (IPA)
- Bedöva 8 veckor gamla Wistar-hanråttor med en intraperitoneal injektion av natriumtiopental (100 mg/kg)9. Kontrollera råttorna för deras reaktion på smärtsamma stimuli i djup sömn genom att använda pincett fastspända på fötterna, se sedan till att råttorna inte har en fotdragningsreaktion innan de avlivas i steg 2.2.
- Skär upp råttans mellersta bröstkorg och hjärtterminalen med sax (storlek 14 cm). Leta sedan upp lungans rot med sax (storlek 14 cm). Skörda hela lungan genom att klippa med sax och sänk ner den i kall Krebs-lösning10,11.
- Skiva en enda lob av lungan med sax (storlek 11 cm) och placera på en petriskål (storlek 9 cm) med den mediala sidan/roten av lungan uppåt (figur 2A, B). Observera och identifiera inriktningen av venen, bronkierna och artären från topp till botten (figur 2B).
- Skär upp bronchus i längdriktningen med sax (storlek 11 cm). Använd sedan pincetten (storlek 11 cm) för att ta tag i bronkusens spets. Dissekera försiktigt och ta bort bronkus och vener ur lungan. Observera att IPA alltid är anatomiskt inriktad under bronkusen.
- Därefter kan huvud-IPA visualiseras (figur 2C). Använd tången (storlek 11 cm) för att ta tag i spetsen på IPA och dissekera den försiktigt ur lungvävnaden med sax (storlek 11 cm).
- Förvara den isolerade IPA:n i kall Krebs-lösning tills organbadenheten har ställts in (pH 7,3 och temperatur 4 °C)1 1.
3. Isolering av vaskulära glattmuskelceller (VSMCs)
- Isolera IPA enligt tidigare beskrivet i steg 2. Skär upp IPA:s huvudgren i längdriktningen med sax (storlek 11 cm) och skär i små remsor (2 mm) (figur 3A).
- Sänk ned IPA-remsorna i ett dissociationsmedium (DM)10,12 innehållande 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaH 2 PO4, 10 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,03 mM fenolrött, 10 mM taurin, 0,5 mM EDTA, 2 mM MgCl 2, 11 mM glukos och 0,16 mM CaCl 2, och justera pH-värdet till 7,0 med 1 M NaOH. Inkubera remsorna i 1 timme vid 4 °C i DM som innehåller 1 mg/ml papain, 0,04 % bovint serumalbumin (BSA) och 0,4 mM 1,4-ditiotreitol (DTT) och inkubera ytterligare vid 37 °C i 15 minuter. Tillsätt 1 mg/ml kollagenas typ 1A i DM och inkubera ytterligare vid 37 °C i 5 minuter.
OBS: DM är en lösning som används för att bevara cellviabiliteten. Papain och kollagenas typ 1A är enzymer som bryter ner de extracellulära matrisproteinerna för att isolera enskilda celler. BSA är ett serumalbuminprotein som används för stabilisering av enzymer under lagring och enzymatiska reaktioner. DTT är ett reduktionsmedel som används för att stabilisera och främja enzymernas aktivitet under cellisoleringsprocessen. Taurin är aminosvavelsyra som används för att stabilisera cellmembranet och cellintegriteten. - Överför vävnaderna till färsk DM och sprid genom försiktig triturering med pasteurpipett av glas (figur 3B). Fortsätt att triturera tills isolerade VSMC blir synliga i badlösningen under mikroskopet (figur 3C).
OBS: Nyisolerade VSMC kan användas för att studera vaskulär fysiologi / patofysiologi, tillsammans med olika experimentella undersökningar, såsom modulering av farmakologiska medel, patch-clamp elektrofysiologisk analys, kalciumavbildning, etc. Den aktuella studien fokuserar dock endast på vasorelaxering av isolerad IPA med hjälp av orgelbadtekniken.
4. Orgelbadteknik
- Isolera IPA enligt tidigare beskrivet i steg 2. Skär IPA:s huvudgren i ringar med en längd på ~2 mm (figur 2D)13.
- Anbringa IPA-ringarna i organbadkammare (figur 4) genom att gänga dem på två rostfria ståltrådar med en diameter på 40 μm (figur 2E)11,13,14.
- Fäst ledningar av rostfritt stål monterade med IPA-ringar på de isometriska kraftgivarna som är anslutna till datainsamlingsanordningen och datorsystemet installerat med lämplig fysiologisk programvara för dataregistrering och analys och höj sedan försiktigt spänningen i IPA-ringen till 1 g11.
- Låt kärlsegmenten balansera i ca 45 min vid en vilospänning på 1 g. Under jämviktsperioden, se till att Krebs-lösningen byts regelbundet var 15: e minut. Efter denna jämviktsperiod, testa kärlens viabilitet genom att mäta deras vasokonstriktion till hög extracellulär K + (80 mM) lösning innehållande 47,4 mM NaCl, 80 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaHPO4, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 och 11 mM glukos10,11.
- Bedöm närvaron eller frånvaron av endotel genom att beräkna avslappningssvaret på acetylkolin (1 x 10-5 M) i ringar som är kontrakterade med fenylefrin (PE, 1 x 10-5 M) (Observera att vaskulära sammandragningar förblir stabila i 1 h efter tillsats av PE). Betrakta ringarna som endotelintakta om de kvantifierar för mer än 70% avslappning (figur 5A). Om de har mindre än 10% avslappning, betrakta ringarna som endotel-denuded13 (Figur 5B). Ta bort endotelet mekaniskt genom att försiktigt gnugga inuti kärlet med en liten tråd för att inducera denudation.
- Återigen balansera artärringarna i 30 minuter innan testexperimenten börjar.
5. Vasorelaxant svar på växtextrakt
- Undersök den avslappnande effekten av växtextraktet genom att prekontraktera IPA-ringar med PE (1 x 10−5 M).
- Tillsätt sedan försiktigt växtextraktet (1-1 000 μg/ml) kumulativt till endotelintakta ringar och endotel-denuderade ringar för att inducera vasorelaxation (figur 6A, B) och för att få en koncentrationsberoende responskurva (figur 6C).
- Se till att effekten av dimetylsulfoxid (DMSO) som används som lösningsmedel också utvärderas på liknande sätt för att fungera som en negativ kontroll (figur 6C).
6. Mekanism för växtextraktinducerad vasorelaxation via endotelet
- Utvärdera växtextraktets vasorelaxanta verkningsmekanism via endotelialt kväveoxidsyntas (eNOS), cyklo-oxygenas (COX)13 och endotel-härledda hyperpolariserande faktor (EDHF) vägar genom att inkubera endotel-intakta IPA-ringar i 30 minuter med följande hämmare (Figur 7A): 1 x 10−4 M NG-nitro-L-argininmetylester (L-NAME, en eNOS-hämmare)9, 1 x 10−5 M indometacin (en COX-hämmare)9, eller en kombination av 1 x 10−7 M apamin (en liten kalciumaktiverad kaliumkanalblockerare) och 1 x 10−7 M charybdotoxin (en mellanliggande och stor konduktans kalciumaktiverad kaliumkanalblockerare), innan sammandragningar av IPA induceras med 1 x 10-5 M PE.
- Sedan, efter att sammandragningarna till PE stabiliserats, tillsätt kumulativa koncentrationer (0,1-1,000 μg / ml) av växtextraktet.
- Presentera effekterna av växtextrakt som procentuell avslappning av IPA-ringarna i närvaro av hämmare jämfört med svaret från IPA-ringarna utan hämmare (figur 7B-D) och konstruera koncentrations-responskurvan.
7. Mekanism för växtextrakt-inducerad vasorelaxation via vaskulär glatt muskulatur K + kanaler
- Förinkubera endotel-denuderade IPA-ringar i 30 minuter med 1 x 10−3 M 4-aminopyridin (4-AP), en blockerare av spänningsstyrd kaliumkanal (KV) (figur 8A), 1 x 10−5 M glibenklamid, en blockerare av ATP-känslig kaliumkanal (KATP) eller 1 x 10−7 M iberiotoxin, en blockerare av stora konduktans Ca 2+-aktiverade K+-kanaler (KCa), före inducering av sammandragningar av IPA med 1 x 10-5 M PE.
- Lägg sedan till kumulativa koncentrationer av växtextraktet.
- Presentera effekterna av växtextrakt som procentuell avslappning av IPA-ringarna med hämmare jämfört med IPA-ringarna utan hämmare (figur 8B-D) och konstruera koncentrations-responskurvan.
8. Mekanism för växtextrakt-inducerad vasorelaxation via hämning av extracellulärt kalcium (Ca2+) tillströmning i VSMCs
- Förinkubera endoteldenuderade IPA-ringar i 30 minuter i Ca2+-fri Krebs-lösning innehållande 1 mM etylenglykol-bis (2-aminoetyleter)-N,N,N',N'-tetraättiksyra (EGTA) (figur 9A).
- Byt sedan ut badlösningen mot Ca2 + fri-80 mM K+ lösning i 10 minuter för att depolarisera VSMC: erna, som sedan öppnar VOCC: erna (figur 9A).
- Lägg kumulativt till CaCl2 (0,01-10 mM) för att inducera vasokonstriktion av IPA och konstruera koncentrations-responskurvan(figur 9A).
- Upprepa detta protokoll i samma IPA-ringar men inkubera dem med växtextrakt eller 1 μM nikardipin (L-typ Ca 2+ kanalblockerare) i Ca2+ innehållande 80 mM K+ lösning i 10 minuter följt av kumulativ tillsats av CaCl2 8.
- Slutligen, jämför kontraktilsvaret med den maximala sammandragning som tidigare framkallats av kontroll CaCl2-utmaningar (figur 9B).
9. Mekanism för växtextraktinducerad vasorelaxation via hämning av intracellulärt kalcium (Ca2+) frisättning från sarkoplasmatisk retikulum (SR)
- Exponera endoteldenuderade IPA-ringar till 80 mM K + -lösning i cirka 5 minuter, depolarisera VSMC: erna, öppna VOCC: erna och slutligen generera Ca2+ -belastningen i SR (figur 10A).
- Byt ut badlösningen i 10 min mot Ca2+-fri Krebs-lösning innehållande 1 mM EGTA (figur 10A).
- Utmana sedan IPA-ringarna med 1 x 10−5 M PE, som aktiverar fosfolipas C/IP3-vägen , vilket i slutändan frigör Ca2+ från SR och framkallar en övergående sammandragning av IPA (figur 10A).
- Upprepa samma protokoll för att fastställa likaledes övergående sammandragningar till PE.
- Utmana IPA-ringarna igen med 80 mM K+ lösning i ca 5 min och ersätt sedan badlösningen med Ca2+-fri Krebs-lösning innehållande 1 mM EGTA med eller utan växtextraktet i 10 min.
- Återigen, utmana IPA-ringarna med 1 x 10−5 M PE.
- Jämför de IPA-sammandragningar som induceras av PE mellan tillståndet med och utan växtextraktet (figur 10B).
10. Statistisk analys
- Uttryck resultaten som medelvärde ± SEM. Jämför dessa värden med hjälp av studentens t-test eller analysera med en variansanalys (ANOVA) följt av Tukey-Kramer post hoc-testet med lämplig statistisk programvara. Betrakta skillnaderna vid p < 0,05 som statistiskt signifikanta. Här fanns n = 6 råttor/experimentellt protokoll.
OBS: Inspelningen av vasokonstriktion och vasorelaxation kan bedömas med lämplig programvara installerad på datorn. Till exempel visar figur 5A att när blodkärlen stimuleras av PE som orsakar sammandragning, kan detta observeras från den ökade spänningen i den ursprungliga spårningen. Spårningen stabiliseras på 20-30 minuter, vilket anses vara en 100% sammandragning. Därefter stimulerar ACh blodkärlen och orsakar avkoppling, vilket kan observeras från den minskade spänningen i den ursprungliga spårningen. Således beräknas den reducerade spänningen som procentandelen jämfört med 100% sammandragning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet i denna studie har utvecklats för att bestämma de optimala experimentella betingelserna för att mäta fysiologiska fenomen som observerats i vaskulära svar från isolerade IPA-preparat. Pilotexperimenten utfördes för att beskriva de potentiella resultaten som hjälper till att förstå de vaskulära effekterna och den mekanistiska grunden för växtextraktets vasorelaxanta verkan, enligt följande.
Vasorelaxant effekt av växtextraktet
Som visas i figur 6A,B, i endotelintakt IPA (E+), framkallade växtextraktet ett koncentrationsberoende svar av vasorelaxation (EC50 = 66,88 μg/ml, figur 6C). Utrotning av endotel (E-) minskade djupt vasorelaxationen inducerad av växtextraktet (p < 0,01), vilket återspeglas av ökningen av EC 50 med 2,2 gånger (E-, EC50 = 150,60 μg / ml, figur 6C). Fordonet, DMSO, hade ingen effekt. Således producerade växtextraktet vasorelaxation huvudsakligen via en endotelberoende väg och delvis via en endoteloberoende väg.
Mekanism för vasorelaxant verkan av växtextraktet via endotelberoende vägar
Som visas i figur 7 minskade användningen av L-NAME för hämning av eNOS (figur 7B) och kombinationen av apamin plus charybdotoxin för att blockera EDHF (figur 7D) uppenbarligen det vasorelaxanta svaret på växtextraktet. Detta flyttade koncentrations-responskurvan åt höger och ökade EC50 utan att ändraE-maxvärdena. Tvärtom visade indometacin (en COX-hämmare) (figur 7C) ingen effekt på det vasorelaxanta svaret på växtextraktet.
Karakteriserar rollen av K + -kanaler i vasorelaxant verkan av växtextraktet
I de endotelförnekade IPA-ringarna minskade K Ca-kanalblockeraren (iberiotoxin) det vasorelaxanta svaret på växtextraktet (figur 8C), medan blockerare avKv (4-AP) eller KATP (glibenklamid) kanaler inte modifierade vasorelaxationen inducerad av växtextraktet (figur 8B,D).
Mekanism för vasorelaxant verkan av växtextraktet via extracellulär Ca2+ tillströmningshämning
För att undersöka om mekanismen för vasorelaxant verkan av växtextraktet involverade extracellulär Ca 2+ tillströmningshämning, framkallades vasokonstriktionen av endotel-denuderade IPA-ringar av 1 x 10-5-1 x 10-2 M CaCl2 i Ca2+-fri Krebs-lösning införlivad med 80 mM K + för att aktivera VOCC (Figur 9A, B). Förinkubation med växtextraktet (68 μg/ml, EC50-värde) hämmade CaCl 2-inducerad sammandragning (p < 0,001 jämfört med vehikel).
Mekanism för vasorelaxant verkan av växtextraktet via hämning av intracellulär Ca2+ frisättning från SR
För att undersöka om frisättningen av intracellulär Ca 2+ från SR spelade någon roll i den vasorelaxanta effekten, förinkuberades de endotel-denuderade IPA-ringarna med Ca2+-fri Krebs-lösning, följt av tillsats av PE (1 x 10−5 M), vilket gav en övergående sammandragning (figur 10A). Sedan, i samma IPA-ring, replikerades detta experiment i närvaro av antingen fordons- eller växtextrakt. I jämförelse med vehikeln minskade växtextraktet signifikant (p < 0,001) den sammandragning som inducerades av PE (figur 10B).
Figur 1: Vaskulär tonreglering via endotelberoende och -oberoende vägar. AA = Arakidonsyra, ACh = Acetylkolin, AC = Adenylylcyklas, ATP = Adenosin 5'-trifosfat, cAMP = Cykliskt adenosinmonofosfat, cGMP = Cykliskt guanosinmonofosfat, COX = Cyklooxygenas, DAG = Diacylglycerol, EDHF = Endotelhärledd hyperpolariserande faktor, eNOS = Endotelialt kväveoxidsyntas, G q = G-proteintypq, Gs = G-proteintyp s, GTP = Guanosintrifosfat, IP = Prostacyklinreceptor, IP 3 = Inositol 1, 4, 5 trisfosfat, IP3 R = IP3-receptor, IK Ca = Mellanliggande konduktans Ca 2+-aktiverad K+-kanal, KV = Spänningsstyrda kaliumkanaler, K ATP = ATP-känsliga kaliumkanaler, K Ca = Stor konduktansCa 2+-aktiverade K+ kanaler, M3 = Muskarinreceptor, MEGJ = Myoendotelial gab-korsning, NO = Kväveoxid, PE = Fenylefrin, SGB 2 = Prostacyklin, PGs = Prostaglandiner,PIP 2 = Fosfatidylinositol 4,5 bisfosfat, PKA = Proteinkinas A, PKG = Proteinkinas G, PLA 2 = Fosfolipas A2, PLC = Fosfolipas C, ROCC = Receptordrivna Ca 2+ kanaler, RYR = Ryanodinreceptor, sGC = Lösligt guanylylylcyklas, SK Ca = Liten konduktans Ca 2+-aktiverad K+ kanal, SR = Sarkoplasmatisk retikulum, VOCC = SpänningsdrivnaCa 2+ kanaler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Viktiga steg i råttans intrapulmonala artär (IPA) isolering. (A) Bilden visar råttlunga med IPA. (B) Dissektion av den mediala sidan/roten av lungan uppåt. (C) Visualiserad huvud-IPA efter avlägsnande av vener och bronkier. d) Isolerad IPA. (E) IPA-ringarna monterades på ett par rostfria ståltrådar för en vaskulär responsstudie med hjälp av organbadtekniken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Viktiga steg i IPA-isoleringen av vaskulära glattmuskelceller (VSMC). (A) Isolerad IPA skars i små remsor och nedsänktes i dissociationsmedium (DM). (B) Triturering av kärlremsor för att isolera VSMC. (C) Isolerade VSMC efter mild trituration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Schematisk illustration av utrustningen som används för att testa den vaskulära reaktiviteten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Representativt register som visar vasorelaxering av IPA-ringar som kontrakterats med 10 μM PE med 10 μM acetylkolin (ACh). (A) Endotelintakt ring (E+) och (B) endoteldenuderad (E-) ring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Vasorelaxation av IPA av växtextraktet. (A) Representativt register som visar vasorelaxation av IPA-ringar av växtextraktet (1–1 000 μg/ml) som kontrakterats med 10 μM PE i endotelintakta ringar (E+) och (B) endotelförnekade (E-) ringar. (C) Koncentrations-responskurvor för vasorelaxation inducerad av växtextraktet i IPA-ringar (E+, n = 6 och E-, n = 6). Vasorelaxation uttrycks som en procentandel av den sammandragning som induceras av PE. Alla data uttrycks som medelvärde ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001 jämfört med fordon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Mekanismerna för växtextraktinducerad IPA-vasorelaxation via den endotelberoende vägen. A) Representativt register som visar vasorelaxation med växtextraktet (1–1 000 μg/ml) av endotelintakta IPA-ringar (E+) som förinkuberats med L-NAME (eNOS-hämmare) och kontrakterats med 10 μM PE. (B–D) Koncentrations-responskurvor för växtextraktinducerade vasorelaxationer av endotelintakta (E+) IPA-ringar som är kontrakterade med PE och förinkuberade med hämmare av olika endotelsignalvägar, inklusive (B) 100 μM L-NAME, (C) 10 μM indometacin eller (D) 0,1 μM apamin plus 0,1 μM charybdotoxin. Värden betyder ± SEM. (n = 6). **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Effekten av K + kanalblockerare på växtextraktinducerad IPA-vasorelaxation. (A) Representativt register som visar vasorelaxation med växtextraktet (1–1 000 μg/ml) av endoteldenuderade (E-) IPA-ringar inkuberade med 4-AP (K V-kanalblockerare) och kontrakterade med 10 μM PE. (B–D) Koncentrations-responskurvor för växtextraktinducerad vasorelaxation av endoteldenuderade (E-) IPA-ringar som är prekontrakterade med PE och förinkuberade med olika K+-kanalblockerare, inklusive (B) 1 mM 4-AP, (C) 10 μM glibenklamid eller (D) 30 nM iberiotoxin. Värden betyder ± SEM. (n = 6). p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. Effekt av växtextraktet på extracellulär Ca2+ tillströmning. A) Representativa register som visar CaCl2-inducerad sammandragning av IPA-ringar i frånvaro (kontroll) eller närvaro av växtextraktet. IPA-ringar badades i Ca2+fri hög K+-lösning (80 mM) innehållande 10 mM EGTA och den sammandragning som framkallades av en kumulativ koncentration av CaCl2 mättes. Detta protokoll upprepades sedan ensamt (kontroll, n = 6) eller i närvaro av växtextraktet (n = 6). (B) Koncentrations-responskurvor för CaCl2-inducerad sammandragning av IPA-ringar i frånvaro (kontroll) eller närvaro av växtextraktet eller 1 μM nikardipin (L-typ Ca2+ kanalblockerare). Den CaCl 2-inducerade kontraktionen beräknades som procentandel av den maximala sammandragningen som registrerades från den första CaCl 2-applikationen och uttrycktes som medelvärde ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001 jämfört med nikardipin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10. Effekt av växtextraktet på Ca2+ frisättning från sarkoplasmatisk retikulum (SR). (A) Representativt register som visar fenylefrin (PE)-inducerad sammandragning av IPA-ringar genom Ca2+ frisättning från SR av endoteldenuderade IPA-ringar i närvaro av DMSO (kontroll) och 10 μM växtextrakt. Data är procentuell sammandragning till 10 μM PE-inducerade sammandragningar jämfört med sammandragningar som produceras av det ursprungliga protokollet utan växtextraktet. Värden betyder ± SEM. **p < 0,01 jämfört med fordon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: Föreslagen mekanism för vasodilatorverkan av växtextraktet på råtta intrapulmonell artär via endotelberoende och -oberoende vägar AA = Arakidonsyra, ACh = Acetylkolin, AC = Adenylylcyklas, ATP = Adenosin 5'-trifosfat, cAMP = Cykliskt adenosinmonofosfat, cGMP = Cykliskt guanosinmonofosfat, COX = Cyklooxygenas, DAG = Diacylglycerol, EDHF = Endotel-härledd hyperpolariserande faktor, eNOS = Endotelial kväveoxidsyntas, Gq = G-protein typ q, G s = G-protein typs, GTP = Guanosin trifosfat, IP = Prostacyklinreceptor, IP 3 = Inositol 1, 4, 5 trisfosfat, IP 3 R = IP 3 receptor,IK Ca = Mellanliggande konduktans Ca 2+-aktiverad K + kanal, KV = Spänningsstyrda kaliumkanaler, K ATP =ATP-känsliga kaliumkanaler, K Ca = Stor konduktansCa 2+-aktiverad K+ kanaler, M3 = Muscarinreceptor, MEGJ = Myoendotelial gab-korsning, NO = Kväveoxid, PE = Fenylefrin, SGB 2 = Prostacyklin, PGs = Prostaglandiner, PIP 2 = Fosfatidylinositol 4,5 bisfosfat, PKA = Proteinkinas A, PKG = Proteinkinas G, PLA 2 = FosfolipasA 2, PLC = Fosfolipas C, ROCCs = Receptordrivna Ca2+ kanaler, RYR = Ryanodinreceptor, sGC = Lösligt guanylylylcyklas, SK Ca = Liten konduktansCa 2+-aktiverad K+ kanal, SR = Sarkoplasmatisk retikulum, VOCC = Spänningsdrivna Ca2+ kanaler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript beskriver vi tekniken för isolering av råtta IPA och VSMCs. Flera experimentella protokoll har använts för att undersöka det vaskulära svaret av IPA in vitro, som kan användas för att karakterisera den farmakologiska effekten och den mekanistiska grunden för IPA-vasorelaxation inducerad av växtextrakt.
När det gäller endotelberoende vasodilator verkan av växtextraktet, olika blockerare såsom L-NAME (eNOS), indometacin (COX), och apamin+charybdotoxin (EDHF) användes. De representativa data visade både positiva resultat (dvs. signifikant minskning av vasodilatorsvaret i närvaro av antingen eNOS- eller EDHF-hämmare) och negativa resultat (dvs. ingen förändring i vasodilatorrespons i närvaro av COX-hämmaren), vilket tyder på att växtextraktet verkar via eNOS- och EDHF-endotelvägarna. Den endoteloberoende vasorelaxanta effekten inducerad av växtextraktet utvärderades via involvering av K + -kanalerna, extracellulär Ca 2+ tillströmning och Ca2+ frisättning från SR. Resultaten visade att vasorelaxation som svar på växtextraktet reducerades av en blockerare av K Ca-kanaler (iberiotoxin) men inte av en blockerare av KV-kanaler (4-AP) eller en blockerare av KATP-kanaler (glibenklamid), vilket tyder på att extraktet verkar via öppningen av KCa-kanaler. Dessutom reducerades den CaCl2-inducerade vasokonstriktionen av växtextraktet, vilket tyder på att dess mekanism involverade hämning av VOCC på VSMC eller interferens med interaktionerna mellan Ca2+ och kontraktila maskiner. Kompletterande studier bör utföras för att ytterligare analysera dess detaljerade mekanistiska verkan. Dessutom reducerades den övergående sammandragningen till PE i Ca 2+-fri Krebs, vilket indikerar att växtextraktet hämmade frisättningen av Ca2+ från SR, vilket ledde till minskning av vasokonstriktion. En sammanfattning av den tolkade mekanismen för växtextraktets vasorelaxanta verkan illustreras i figur 11.
De experimentella protokoll som föreslås i denna studie är tekniskt genomförbara och visar god reproducerbarhet; Vissa viktiga steg är dock nödvändiga för att säkerställa framgång. För det första måste sammansättningen av den fysiologiska lösningen bibehållas exakt under beredningen för att säkerställa att proceduren fungerar korrekt. Det är också viktigt att undvika att röra, sträcka eller skada lungartären under beredningen. Mediet måste bytas ut kontinuerligt var 15: e minut (3 gånger) för att stabilisera testning och utvärdering när lungartären är fäst i organbadkammaren. Kärlets förspänning bör ökas till något över den önskade nivån och sedan gradvis minskas tills det optimala uppnås (dvs. 1 g).
Flera experimentella protokoll, såsom blodkärlens livskraft, närvaron av endotelceller och effekten av växtextrakt på avslappning av blodkärl, utvärderas med denna teknik. Det belysta förfarandet för isolering av råtta IPA kan anpassas till andra arter (t.ex. mus, kanin och människa). De optimala förhållanden som krävs för montering av ett organbad kan dock skilja sig åt mellan olika djurmodeller och kan anpassas därefter. Viktigt är att de experimentella förhållandena inte är en exakt replikation av fysiologiska förhållanden, och resultaten kan inte direkt extrapoleras till in vivo-fenomenet.
Denna IPA-isoleringsmetod och vaskulära responsmätningar är praktiska metoder för att utvärdera vaskulär fysiologi, patologi och farmakologi. Det gör det möjligt för forskare att studera vasokonstriktion och vasorelaxation i en isolerad men ändå välkontrollerad miljö. Dessutom kan den anpassas för att studera den terapeutiska verkan av läkemedel som används för lungkärlspatologi, såsom pulmonell arteriell hypertoni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna National Research Council of Thailand, Center of Excellence for Innovation in Chemistry (PERCH-CIC) och International Research Network (IRN61W0005) för att ge ekonomiskt stöd, och Institutionen för fysiologi fakulteten för medicinsk vetenskap, Naresuan University, för stöd till forskningsanläggningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | - | - | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | - | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | - | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. - |
References
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
- Ruan, K. -H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
- Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
- Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
- Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
- Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
- Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
- Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
- Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
- Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
- Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
- Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).
