Summary
L’incisive de souris contient de précieuses cellules retenant le marquage dans sa niche de cellules souches. Nous avons une nouvelle façon de détecter et de quantifier de manière impartiale les cellules qui retiennent le marquage; notre étude a utilisé le marquage EdU et une approche de reconstruction 3D après le nettoyage tissulaire PEGASOS de la mandibule.
Abstract
L’incisive murine est un organe qui se développe continuellement tout au long de la vie de la souris. Les cellules souches épithéliales et mésenchymateuses résidant dans les tissus proximaux des incisives donnent naissance à une descendance qui se différenciera en améloblastes, odontoblastes et fibroblastes pulpaires. Ces cellules sont cruciales pour soutenir le renouvellement soutenu des tissus incisifs, faisant de l’incisive murine un excellent modèle pour étudier l’homéostasie des cellules souches adultes. On pense que les cellules souches contiennent des cellules quiescentes à longue durée de vie qui peuvent être marquées par des analogues nucléotidiques tels que la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU). Les cellules conservent cette étiquette au fil du temps et sont donc appelées cellules de rétention de marquage (LRC). Les approches de visualisation des CRL in vivo fournissent un outil robuste pour surveiller l’homéostasie des cellules souches. Dans cette étude, nous avons décrit une méthode de visualisation et d’analyse des CRL. Notre approche innovante comprend des LRC dans des incisives de souris après nettoyage des tissus et une coloration EdU à montage entier suivie d’une microscopie confocale et d’une reconstruction en 3 dimensions (3D) avec le logiciel d’imagerie. Cette méthode permet l’acquisition d’images 3D et la quantification non biaisée par rapport à l’analyse traditionnelle LRC sur des lames sectionnées.
Introduction
L’incisive de souris en croissance continue est un excellent modèle pour étudier les cellules souches adultes1. Les cellules souches épithéliales (boucle cervicale labiale et linguale) et mésenchymateuses (entre la boucle cervicale labiale et linguale) qui résident sur la face proximale de l’incisive se différencient en améloblastes, odontoblastes et cellules pulpaires dentaires. Ce processus unique fournit une source de cellules pour compenser la perte tissulaire et le renouvellement2. Bien que plusieurs marqueurs de cellules souches tels que Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, etc. ont été identifiés in vivo pour les sous-ensembles de cellules souches adultes dans des incisives de souris, ils sont inadéquats pour représenter les populations de cellules souches lorsqu’ils sont utilisés seuls 1,3,4,5. La visualisation de cellules quiescentes à longue durée de vie par marquage et rétention d’ADN analogue nucléotidique pourrait fournir une détection impartiale pour la plupart des sous-ensembles de cellules souches adultes6. De plus, cette approche est utile parmi de nombreuses méthodes d’identification des cellules souches7 pour comprendre le comportement cellulaire et l’homéostasie des populations de cellules souches dentaires 3,8. Alors que les cellules souches en division perdraient leur marquage ADN après une poursuite considérable, les cellules souches supposées quiescentes conservent leur marquage ADN, les considérant comme des cellules retenant le marquage (LRC)6. Le marquage et la rétention de l’ADN par des cellules souches non divisées marqueront et localiseront les cellules souches adultes présumées dans leurs niches.
Au cours des dernières années, le marquage analogue de la 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU) analogue à la thymidine a remplacé la méthode de marquage de l’ADN 3H-thymidine incompatible, fastidieuse, longue et à haute résolution, pour les tests de prolifération cellulaire 6,9. Ces dernières années, la technique de marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) a été de plus en plus utilisée par rapport au BrdU. Cette tendance est apparue pour plusieurs raisons. Premièrement, la méthode BrdU est lente et nécessite beaucoup de main-d’œuvre. Les conditions de l’utilisateur sont variables et il est incapable de préserver l’ultrastructure des échantillons (en raison de la dénaturation de l’ADN). De même, la méthode BrdU perd l’antigénicité des cellules, ce qui la rend inefficace pour les analyses fonctionnelles en aval et les essais tels que les expériences de colocalisation et la transplantation in vivo de cellules souches 3,7,9,10,11,12. BrdU est également un tératogène, qui ne convient pas pour étiqueter les CRL dans le développement embryonnaire6. En outre, la méthode BrdU est inefficace lorsqu’elle est utilisée dans les spécimens à montage entier. Les inconvénients sont une faible pénétration des anticorps dans la partie profonde des échantillons ou la nécessité d’une longue période d’incubation des anticorps pour une pénétration profonde13. Le marquage EdU échappe aux étapes de dénaturation des échantillons, préservant ainsi l’ultrastructure. Cette caractéristique est avantageuse pour les analyses fonctionnelles en aval telles que les expériences de colocalisation et la transplantation de cellules souches11,12. De plus, l’étiquetage EdU est très sensible et rapide; La pénétration des échantillons est élevée en raison de l’utilisation d’azotures fluorescents rapidement absorbés et de plus petite taille pour détecter les marqueurs EdU par une réaction de cycloaddition catalysée par Cu(I [3 + 2] (chimie « clic »)14.
Une autre méthode de marquage ADN de plus en plus appliquée est l’utilisation de souris transgéniques modifiées. Ces souris expriment la protéine fluorescente verte histone 2B (H2B-GFP) contrôlée par un élément régulateur sensible à la tétracycline 5,14. Après avoir nourri des souris avec de la tétracycline chow/eau pendant une période de chasse de 4 semaines à 4 mois, la fluorescence GFP diminuera dans les cellules cycliques et seuls les LRC conserveront la fluorescence6. L’avantage de cette méthode est que les CRL marqués peuvent être isolés et restent viables pour la culture cellulaire ou les analyses fonctionnelles en aval 6,7. Certaines études ont rapporté un étiquetage inexact des cellules souches quiescentes lorsqu’elles sont poursuivies pour une utilisation à long terme. Ce résultat était dû à une expression de fond fuyante de la souche H2B-GFP et non à la réponse appropriée régulée par la tétracycline15.
De plus, la plupart de la littérature dans le passé utilisait la détection des LRC principalement sur des diapositives sectionnées, qui sont bidimensionnelles et souvent biaisées à tort pour montrer l’emplacement précis et le nombre de LRC. L’approche présentait des angles incorrects pour les sections de structures tissulaires complexes16. L’autre méthode consistait à obtenir des images 3D à partir de sections en série et à effectuer des reconstructions post-image. Ces étapes étaient imprécises en raison de la distorsion de l’image due aux variations dans chaque section de série dues aux sections compressées ou étirées, ce qui entraînait des informations manquantes16,17,18. La méthode était également laborieuse et prenait beaucoup de temps.
Pour faciliter l’imagerie à montage complet des LRC, les échantillons doivent être clairs tout en maintenant la fluorescence. Les techniques actuelles de nettoyage tissulaire peuvent être classées en trois grandes catégories : les techniques de nettoyage tissulaire à base de solvants organiques, les techniques de nettoyage tissulaire à base de réactifs aqueux et les techniques de nettoyage tissulaire à base d’hydrogel17,19. Le système de solvant associé au polyéthylène glycol (PEG) (PEGASOS) a été récemment développé. Cette approche rend presque tous les types de tissus transparents et préserve la fluorescence endogène, y compris les tissus durs tels que les os et les dents20. La méthode PEGASOS présente des avantages par rapport aux autres méthodes de nettoyage des tissus, en particulier dans le nettoyage des dents et des os. La plupart des autres méthodes ne pouvaient dégager que partiellement les tissus durs, avoir de longs temps de traitement ou nécessiter des réactifs coûteux21. En outre, la méthode PEGASOS peut préserver efficacement la fluorescence endogène par rapport aux autres méthodes.
Cette littérature nous a amenés à créer une nouvelle méthode d’étude cellulaire. Nous avons combiné les avantages de détection LRC du marquage EdU avec l’imagerie 3D à montage entier la plus supérieure des échantillons nettoyés par les tissus; Les échantillons ont été traités avec la technique avancée de nettoyage des tissus associée au système de solvant associé au polyéthylène glycol (PEG) (PEGASOS)15. La transparence des tissus durs nous a permis de reconstruire le signal 3D de la fluorescence des LRC in vivo sans casser les dents ou la mandibule, créant ainsi un moyen plus précis de visualiser et de quantifier les LRC.
Dans cette étude, nous fournissons un guide innovant pour visualiser les LRC dans l’incisive de souris. Nous avons fait une approche visuelle 3D pour déterminer l’emplacement et la quantité de LRC dans la niche des cellules souches incisives de souris. Ce projet a utilisé le marquage EdU, les techniques de nettoyage tissulaire PEGASOS et la microscopie confocale. Notre méthode de marquage EdU des LRC sur des tissus entiers et l’utilisation d’un échantillon dégagé et transparent surmontent à la fois les limites des lames sectionnées traditionnelles et d’autres méthodes de marquage ADN désavantageuses. Ainsi, notre technique sera adaptée aux études sur l’homéostasie des cellules souches nécessitant la détection des LRC, notamment sur les tissus durs. Le protocole peut être tout aussi avantageux pour ceux qui se concentrent sur l’homéostasie des cellules souches dans d’autres tissus et organes.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Texas A&M University College of Dentistry.
1. Préparation du cocktail labellisant EdU
- Préparez les solutions de bouillon de cocktail comme décrit dans le tableau 1.
- Préparez le cocktail d’étiquetage EdU comme décrit dans le tableau 1.
2. Préparation des souris et de la solution EdU
- Préparez la solution EdU. Dissoudre l’EdU dans du DMSO à 20 mg/mL et conserver dans un congélateur à -20 °C.
ATTENTION : EdU est un mutagène. Les utilisateurs doivent porter un équipement de protection individuelle (EPI) approprié lorsqu’ils manipulent cette substance. - Injecter des souris C57BL/6J âgées de 5 jours avec la solution d’EdU préparée par voie intrapéritonéale à 3 μL/g de poids corporel. Les souris doivent recevoir la solution une fois par jour pendant 7 jours consécutifs. Ensuite, ils subissent une période de chasse de 6 semaines avant d’être récoltés pour analyse (Figure 1).
ATTENTION : Veillez à éviter de piquer l’aiguille lors de l’injection d’EdU chez la souris. Après avoir injecté EdU pendant 7 jours consécutifs, placez les souris dans une nouvelle cage. Une fois que les souris sont dans leur nouvelle maison, jetez la litière dans l’ancienne cage en utilisant les règles appropriées de risque biologique.
3. Préparation de l’échantillon par perfusion transcardiaque (souris postnatales de 53 jours après la période de poursuite de 6 semaines)
REMARQUE: Le foie de souris devrait pâlir après une perfusion transcardiaque réussie.
- Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale. Ils doivent recevoir une combinaison d’anesthésiques à base de xylazine et de kétamine (Xylazine 10-12,5 mg/kg; Kétamine, 80-100 mg/kg de poids corporel).
- Attendez ~10 minutes jusqu’à ce que la souris ne réponde plus aux stimuli douloureux (tels que les réflexes de pincement des pattes).
- Placez les souris en décubitus dorsal stabilisé sur un support en polystyrène expansé avec des aiguilles dans chaque patte.
- Exposez la cavité thoracique en ouvrant la peau sus-jacente à l’aide d’une pince à épiler et de ciseaux disséquants.
- Coupez le diaphragme à l’aide de ciseaux tranchants. Veillez à ne pas percer le cœur.
- Coupez à travers la cage thoracique, en saisissant la base du sternum avec des ciseaux à pince pour exposer le cœur.
- Transférer la souris à l’étape de perfusion près de la pompe de circulation dans une hotte.
- Insérez l’aiguille de 25 G (provenant de la tubulure remplie de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)/4 % de paraformaldéhyde (PFA)) dans l’apex du ventricule gauche. Prenez soin de garder le bout de l’aiguille dans la lumière du ventricule.
ATTENTION : Le PFA est modérément toxique et probablement cancérogène. Utilisez un EPI pour manipuler le PFA et préparez la solution sous une hotte chimique. Les déchets d’APF nécessitent une élimination appropriée conformément aux lignes directrices de l’institution. - Coupez le ventricule droit à l’aide d’un ciseau tranchant immédiatement après l’insertion de l’aiguille dans le ventricule gauche. Cette étape permet au sang de s’écouler de la souris et de s’écouler dans le plat collecteur.
- Perfuser les échantillons avec 50 mL de solution PBS à un débit de 7 mL/min.
- Après la perfusion de PBS, changer le robinet d’arrêt pour permettre un débit de 20 mL de solution de PFA à 4 % au même débit de 5 mL/min.
- Pendant que la pompe de circulation est toujours allumée, retirez l’aiguille du ventricule gauche.
REMARQUE: La souris est maintenant fixée pour le prélèvement de tissu. Pour préserver la fluorescence, l’exposition à la lumière doit être évitée autant que possible tout au long du protocole. Pendant le traitement du tissu, le tube conique de 50 ml contenant les échantillons de tissus peut être recouvert d’une feuille d’aluminium.
4. Nettoyage tissulaire de la mandibule à l’aide de la technique PEGASOS
REMARQUE: Un tube conique de 15 mL ou 50 mL selon le volume de tissus peut être utilisé pour garder les échantillons prêts pour le traitement à chaque étape. Les échantillons sont traités à des agitateurs à 37 °C (~100 tr/min) des étapes 4.2 à 4.7. Utilisez des contenants en plastique à base de polypropylène qui résistent aux solvants organiques pour éviter de faire fondre le plastique. Alternativement, la verrerie peut être utilisée.
ATTENTION : La technique de nettoyage tissulaire PEGASOS utilise des solutions toxiques telles que le Quadrol, le polyéthylèneglycol (PEG), le benzoate de benzyle (BB), le MMA500, etc. Un EPI approprié est nécessaire pour éviter les expositions potentielles.
- Disséquer les mandibules et fixer davantage les échantillons dans du PFA à 4 %. Conservez-les à température ambiante pendant la nuit.
- Retirez les muscles des mandibules et plongez-les dans une solution d’EDTA 0,5 M (pH 8,0) pour décalcifier pendant 4 jours. Pendant cette période, effectuer un changement de milieu quotidien sur un agitateur à 37 °C.
REMARQUE: Il est souhaitable de retirer les muscles de l’échantillon autant que possible. Cette précaution simplifiera le processus d’imagerie et réduira l’autofluorescence des muscles. - Décolorer les mandibules avec une solution de Quadrol à 25% (v/v dansH2O) sur un agitateur à 37 °C pendant une journée pour éliminer le reste de l’hème sanguin.
- Coloration complète de la monture EdU.
- Préparez un cocktail d’étiquetage EdU frais conformément au tableau 1.
REMARQUE: Le cocktail d’étiquetage EdU doit être renouvelé à chaque fois avec une solution d’ascorbate fraîchement préparée ajoutée pour obtenir des résultats optimaux d’étiquetage EdU. - Rincer les mandibules avec du PBST pendant 30 min sur un agitateur à 37 °C.
- Rincer les mandibules avec du PBS trois fois pendant 3 minutes à chaque fois.
- Incuber les mandibules dans un cocktail d’étiquetage EdU fraîchement préparé sur un shaker à 37 °C pendant la nuit.
- Rincer les mandibules avec du PBS trois fois pendant 3 minutes à chaque fois.
- Préparez un cocktail d’étiquetage EdU frais conformément au tableau 1.
- Effectuer une délipidation en série dans chacune des solutions suivantes pendant 6 h à 37 °C :
Solution de tert-butanol (tB) à 30 % : 75 % v/vH2O, 22 % v/v tB et 3 % v/v Quadrol.
Solution à 50 % de tuberculose : 50 % v/v H2O, 47 % v/v tB et 3 % v/v Quadrol.
Solution à 70 % de tuberculose : 30 % v/vH2O, 67 % v/v tB et 3 % v/v Quadrol
REMARQUE: L’étape de délipidation est critique. La délipidation peut être effectuée entre 4-6 h dans une solution à 30% et 50% tB et pendant 1 jour dans une solution à 70% tB. - Déshydrater les mandibules dans une solution de tB-PEG pendant 2 jours avec le changement de milieu quotidien suivant : 75 % tB, 22 % v/v polyéthylèneglycol méthyléther méthacrylate MMA500 en moyenne et 3 % v/v Quadrol à 37 °C.
- Effacer la mandibule dans le milieu de compensation du benzoate de benzyle (BB)-PEG pour obtenir une correspondance de l’indice de réfraction : 75 % v/v BB, 22 % v/v PEG-MMA500 et 3 % Quadrol jusqu’à ce que la transparence soit atteinte.
NOTE: Nous avons des informations sur l’appariement de l’indice de réfraction. Les composants inorganiques et organiques dans les tissus tels que l’eau, les lipides, les protéines, les minéraux, les organites, etc. ont un indice de réfraction (IR) différent dans la plage de 1,33 à 1,55. Cette incompatibilité IR entre les composants tissulaires entrave le processus d’imagerie. La transparence peut être obtenue en éliminant le décalage IR dans le tissu. Il est conseillé d’immerger les échantillons de tissus clairs dans le milieu de nettoyage du BB-PEG. Cette étape donnera l’IR interne uniforme de ~1,54 (appelé correspondance RI) à l’ensemble de l’échantillon, facilitant ainsi le processus d’imagerie. - Conservez les mandibules dans le milieu d’élimination des tissus BB-PEG à température ambiante pour le stockage et l’imagerie.
REMARQUE: Il est bon de compléter l’imagerie dès que possible pour éviter la perte progressive de rapporteurs fluorescents. Cependant, la méthode PEGASOS permettra de conserver les rapporteurs de fluorescence bien conservés même après plusieurs semaines de stockage20,21. Pour un stockage à long terme, les échantillons peuvent également être conservés à 4 ° C.
5. Imagerie confocale de la mandibule dégagée par les tissus
- Montez la mandibule entière nettoyée sur des lames de cavité de marque dans le milieu de nettoyage BB-PEG et recouvrez avec des lames de couvercle en verre. Évitez les bulles.
- Effectuez l’acquisition d’images avec un microscope confocal à balayage laser approprié. Sélectionnez Acquérir et définissez les paramètres d’acquisition d’image sur une résolution de 512 x 512 pixels et une vitesse d’acquisition de 400 Hz. Ces paramètres se trouvent dans le menu du mode d’acquisition du logiciel qui contrôle le microscope.
- Dans le panneau pour l’excitation fluorescente, activez le laser requis (TRITC) pour exciter de manière optimale les fluorophores (la sonde que nous avons utilisée pour la visualisation des LRC a des propriétés fluorescentes telles que Cy3 avec excitation à 548 nm et émission à 563 nm de longueur d’onde laser).
- Dans le panneau de détection fluorescente, déplacez le curseur pour sélectionner les longueurs d’onde qui seront mesurées (par exemple, entre 555 et 625 nm pour un fluorophore de type Cy3).
- Placez la mandibule montée sur la platine du microscope pour visualiser et trouver l’échantillon en utilisant la lumière blanche et un objectif de grossissement inférieur (2-10x).
- Ajouter une goutte d’huile d’immersion avec un indice de réfraction de 1,52 sur le dessus de la lamelle de couverture pour correspondre à l’indice de réfraction de la lamelle de couverture en verre et de l’objectif.
REMARQUE: Faites correspondre l’indice de réfraction des objectifs, des supports d’imagerie et des tissus aussi étroitement que possible pour minimiser l’introduction de distorsions optiques lors de l’acquisition d’image. - Allumez les lampes fluorescentes et choisissez un objectif de grossissement approprié pour imager les régions d’intérêt. Nous avons utilisé un objectif 20x avec une ouverture numérique de 0,9 avec une distance de travail de 1,95 mm. Une lentille à distance de travail plus longue peut être nécessaire lors de l’imagerie d’échantillons de tissus plus grands au microscope confocal. Alternativement, l’imagerie peut être effectuée facilement à l’aide d’un microscope à feuille de lumière pour des échantillons de tissus plus grands.
- Sur le logiciel d’imagerie confocale, appuyez sur le bouton Live pour démarrer le mode de balayage en direct. Pour maximiser la plage dynamique des images et éviter la saturation des pixels, réglez le gain et l’intensité laser pour le canal sélectionné.
- Identifiez le champ de vision pour visualiser toute la région de la mandibule dans les dimensions X et Y. Définissez les paramètres d’acquisition des stades Z supérieur et inférieur qui couvrent avec précision le volume de la niche des cellules souches dans l’incisive des souris. Utilisez une taille de pas Z de 2 μm ou selon vos besoins. Les nouvelles versions des microscopes confocaux devraient être capables d’acquérir automatiquement des piles z des différentes régions qui se chevauchent.
- Acquérir et enregistrer des fichiers image Z-stack au format .lif.
REMARQUE: Les mouches .lif peuvent être converties en fichiers .tiff et utilisées pour d’autres logiciels d’analyse 3D.
6. Traitement d’images, reconstruction d’images 3D et quantification des cellules de rétention d’étiquettes par la création d’une surface, la segmentation de la région d’intérêt (ROI), le masquage du ROI et la création de taches
REMARQUE: Nous avons utilisé Imaris (Bitplane 9.0.1) pour le traitement d’image et la reconstruction 3D, mais des étapes de traitement d’image similaires peuvent être effectuées en utilisant d’autres suites logicielles (par exemple, ImageJ / Fiji, 3D slicer, Avizo, Arivis, Amira, etc.).
- Dans le logiciel d’imagerie, cliquez sur le bouton Arène , puis choisissez Image. Sélectionnez le fichier . lif original et choisissez le fichier fusionné, les images seront importées dans le logiciel d’imagerie.
Remarque : Vous pouvez également utiliser un convertisseur de fichier de logiciel d’imagerie pour convertir le fichier image de pile Z au type de fichier au format natif pour le logiciel. Par exemple: convertissez les fichiers .lif en fichiers .ims à l’aide du convertisseur de fichiers Imaris et ouvrez les fichiers .ims dans le logiciel d’imagerie. La conversion des données au format de fichier natif du logiciel permettra une conversion rapide des fichiers et minimisera les erreurs. - Double-cliquez sur le fichier importé pour ouvrir l’ensemble de données d’image.
- Accédez au panneau Réglage de l’affichage , cliquez sur le nom de la chaîne. Il est généralement étiqueté comme rouge en mode par défaut.
- Dans la fenêtre Propriétés de l’image , cliquez sur l’onglet Couleur mappée . Dans l’option Fichier de table de couleurs , choisissez Fire Flow, puis cliquez sur OK. La couleur d’affichage est normalement choisie pour distinguer la fluorescence de fond et la fluorescence positive de l’échantillon.
- Dans le coin supérieur gauche de l’écran, dans le volet Scène – Propriétés , cliquez sur l’icône bleue intitulée Ajouter une nouvelle surface. Désélectionnez l’icône Volume qui supprimera la majeure partie de la fluorescence de fond et la fluorescence positive sont nettement visibles (voir l’étape 6.4.2).
- Démarrez le processus de segmentation manuelle de la région d’intérêt (ROI) en cliquant sur l’onglet Créer et en sélectionnant l’onglet Ignorer la création automatique, Modifier manuellement . Dans l’assistant de création manuelle de surface, cliquez sur l’onglet Contour pour choisir l’orientation (XY, YZ ou XZ) en fonction des échantillons afin de définir facilement le contour du retour sur investissement. Ici, nous choisissons l’orientation XY.
- Ensuite, assurez-vous que le menu du pointeur dans le coin droit est en mode Sélection . Ajustez la position de la tranche pour localiser le retour sur investissement dans le tissu. Vous remarquerez que la plupart de la fluorescence de fond a été éliminée avec une fluorescence positive distincte comme mentionné à l’étape 6.4. Cliquez sur le bouton Dessiner et dessinez une zone d’intérêt provisoire. Sélectionnez l’option Visibilité sur aucune pour éviter les interférences provenant d’autres domaines que le retour sur investissement.
- Répétez l’étape 6.4.2. tranche par tranche pour dessiner toute la région d’intérêt.
- Une fois le dessin ROI terminé, cliquez sur Créer une surface pour obtenir une géométrie 3D du ROI.
- Cliquez sur le bouton Modifier dans l’assistant de création manuelle de surface et sélectionnez Masquer tout.
- Dans la fenêtre contextuelle Masque de canal, sélectionnez Canal 1 dans les options de sélection de canal. Ensuite, sélectionnez Dupliquer le canal avant d’appliquer le masque. Dans les paramètres du masque, sélectionnez Constant Inside/Outside et définissez la surface extérieure du voxel sur 0.
- Dans le volet Propriétés de la scène, désélectionnez l’objet Surface et sélectionnez l’objet volume. Dans le réglage de l’affichage, désélectionnez le canal « Rouge » d’origine et sélectionnez le canal Rouge masqué et ajustez les intensités de couleur pour obtenir le retour sur investissement de fluorescence 3D et marqué positivement souhaité.
- Créez un objet Spot. Commencez par cliquer sur l’icône Ajouter des spots pour quantifier les LRC rendus en 3D en créant des spots 3D qui se chevauchent de manière comparable avec les LRC rendus en 3D. Utilisez les flèches du bas pour passer d’une étape à l’autre de l’assistant de création de spots.
- Dans l’assistant de création de spots, il y aura quatre étapes séquentielles d’instructions pour créer des spots automatiquement avec le logiciel. Assurez-vous que l’option Segmenter uniquement une région d’intérêt est sélectionnée à la première étape. Cliquez sur l’icône Suivant .
- Dans la deuxième étape, il y aura une « boîte 3D XYZ ». Ajustez la boîte XYZ pour couvrir le retour sur investissement. Cliquez sur l’icône Suivant .
- Dans la troisième étape, accédez aux options Canal source . Choisissez le canal rouge masqué; entrez le diamètre du point XY estimé comparable à l’ajustement et au chevauchement des points de fluorescence de l’échantillon. Cliquez sur l’icône Suivant .
- Dans la quatrième étape, ajoutez le type de filtre « Qualité » et ajustez le seuil d’intensité inférieur en déplaçant la fenêtre coulissante sur l’histogramme « Qualité » jusqu’à ce que la majorité des LRC identifiables soient étiquetées.
REMARQUE: La segmentation et donc les lectures statistiques (exemple: nombre de cellules) dépendent beaucoup des valeurs du seuil d’intensité. Veillez à définir précisément les valeurs seuils appropriées. - Cliquez sur le bouton Terminer et sélectionnez le bouton Statistique . Sélectionnez l’onglet Globale pour rechercher la valeur du nombre total de points dans l’image.
- Exportez les statistiques en cliquant sur le bouton Tab Display to File et recevez les résultats dans un fichier .xls.
- Utilisez un diagramme approprié pour présenter les résultats de quantification.
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Representative Results
Après le marquage EdU et le processus de nettoyage des tissus PEGASOS (Figure 2), la mandibule transparente a été obtenue comme le montre notre image (Figure 3B). Nous avons comparé l’échantillon modifié à une mandibule normale sans processus de nettoyage tissulaire (Figure 3A). La mandibule transparente (Figure 3B) avec marquage EdU a été soumise à une imagerie confocale. Nous nous sommes concentrés sur l’apex de l’incisive montrant la niche des cellules souches comme indiqué dans (Figure supplémentaire 1). La coupe optique de l’incisive montrait des CRL dans la niche des cellules souches de l’apex de l’incisive dans le plan XY (Figure 4A). Nous avons reconstruit une image 3D d’un apex incisif montrant des cellules souches quiescentes retenant le marquage EdU+ dans la niche épithéliale (verte) et mésenchymateuse (rouge) des cellules souches (Figure 4B). Les cellules EdU+ ont été transférées dans des taches pour la quantification qui chevauchaient de manière comparable les CRL mésenchymateuses (Figure 4C). La figure 4D montre les taches créées uniquement pour les CRL mésenchymateuses. La figure 4E montre les taches créées uniquement pour les CRL épithéliales. Nous avons ensuite complété la quantification des CRL épithéliales et mésenchymateuses (Figure 4F).
Figure 1 : Protocole d’injection d’EdU pour marquer les LRC. Des souris de type sauvage (WT) ont reçu une injection d’EdU à partir de P5. Les injections ont duré 7 jours consécutifs jusqu’à P11. Ensuite, les souris ont subi une période de poursuite de 6 semaines. Nous les avons récoltés le 53e jour postnatal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Flux de travail du protocole. Des souris ont été injectées avec EdU pendant 7 jours consécutifs, puis placées dans une période de poursuite pendant 6 semaines. Les mandibules ont été récoltées et fixées après perfusion transcardiaque. Ensuite, les mandibules ont été décalcifiées et soumises aux étapes de décalcification, de décoloration, de coloration de l’EdU à montage entier, de délipidation, de déshydratation et d’appariement de l’indice de réfraction (IR). L’imagerie des mandibules dégagées a été réalisée au microscope confocal suivi d’une analyse des données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images d’une mandibule postnatale de souris WT âgée de 53 jours avant le nettoyage tissulaire (A) et après le nettoyage tissulaire (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Coupe optique de l’incisive montrant les CRL dans la niche des cellules souches de l’apex de l’incisive dans le plan XY (A). Une reconstruction d’image 3D des CRL épithéliaux et mésenchymateux dans des incisives mandibulaires de souris vers l’apex (B). Chevauchement des CRL mésenchymateux (rouge) avec des taches 3D créées (gris) (C). Taches créées uniquement pour les CRL mésenchymateuses (D). Taches créées uniquement pour les CRL épithéliaux (E). Résultats de quantification pour les CRL épithéliales et mésenchymateuses (F). Bar : 300 μm en A et 150 μm en B-E. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Préparation du cocktail d’étiquetage EdU |
| Préparation de solutions mères (aqueuses) |
| SCT (10x) 1 M, pH 7,6 |
| CuSO4 (100x), 0,4 M |
| Sulfa-cyanine 3 azoture (100x), 300 μM dans le DMSO |
| Ascorbate de sodium (10x), 0,2 g/mL dansH2O |
| PBST (0,1 % Triton X-100 dans PBS, v/v) |
| Préparation du cocktail d’étiquetage EdU |
| Ajouter les réactifs suivants dans l’ordre: |
| Solution saline tamponnée à la tris (100 mM final, pH 7,6) |
| CuSO4 (finale 4 mM) |
| Sulfa-cyanine 3 Azoture (3 μM final) |
| Ascorbate de sodium (100 mM final, fraîchement préparé pour chaque utilisation) |
Tableau 1 : Préparation du cocktail labellisé EdU
Figure supplémentaire: Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Des doses multiples d’injections (BrdU, EdU) sont généralement utilisées sur des souris néonatales en croissance pour marquer autant que possible les cellules proliférantes 1,6,13. La période de chasse est considérée comme une étape critique en ce qui concerne le taux de renouvellement des tissus 6,13. L’incisive de souris se renouvelle tous les mois. Ce trait permet aux chercheurs de fixer la période de poursuite à 4 semaines ou plus 4,5,22. Notre période de chasse de 6 semaines pourrait marquer les cellules souches dans les compartiments mésenchymateux et épithéliaux (boucle cervicale labiale et linguale). Cette zone comprenait certaines des populations progénitrices dans les TAC (cellules amplificatrices de transit) des compartiments épithéliaux et mésenchymateux. Une période de chasse plus longue serait souhaitable pour montrer de véritables cellules retenant le marquage qui résident exclusivement dans les niches épithéliales et mésenchymateuses des cellules souches.
Il y a plusieurs étapes critiques dans les étapes de traitement et de nettoyage des tissus pour ce protocole. La première note concerne l’étape de perfusion et de fixation des tissus. Les incisives de souris contiennent des tissus pulpaires qui ont une riche réserve de vaisseaux sanguins et contiennent une grande quantité de tissus sanguins. Ainsi, la perfusion PBS à l’héparine doit être commencée dès que possible après que les souris ont été profondément anesthésiées et retenues. La raison en est d’éviter la formation de caillots sanguins qui conduit à l’autofluorescence19. Des précautions doivent être prises pour éviter une fixation excessive avec PFA, ce qui peut entraîner une transparence insuffisante et une décoloration jaunâtre du tissu après l’éclaircissement. Une décoloration excessive diminue la qualité du signal dans les échantillons pendant l’imagerie19. L’étape de perfusion transcardiaque active est préférée à la fixation par immersion passive des organes/tissus, qui fixera rapidement les tissus pour éviter la perte de fluorescence endogène dans les étapes de nettoyage tissulaire. Dans la fixation passive, les zones plus profondes dans le tissu peuvent rester moins transparentes; Les échantillons peuvent ne pas avoir de résultats d’imagerie satisfaisants19. L’élimination appropriée des muscles des mandibules permet une visualisation adéquate des structures qui intéressent les chercheurs. De plus, l’élimination efficace empêche les perturbations de l’autofluorescence d’avoir un impact sur les tissus musculaires. Une décalcification adéquate est indispensable pour le nettoyage des tissus durs. Il faut prendre soin de décalcifier adéquatement les tissus en ajustant le temps d’immersion de l’EDTA en fonction de la taille et de la teneur en minéraux des échantillons. La concentration d’EDTA est essentielle pour éviter le rétrécissement excessif des tissus. Par conséquent, la concentration doit être choisie en fonction des échantillons et des expériences de la question16,19. De même, une étape de décoloration est essentielle pour éliminer adéquatement l’hème restant afin de réduire l’autofluorescence. Un temps de délipidation insuffisant peut entraîner une perte de transparence des tissus et n’est pas conseillé. Généralement, la délipidation des tissus durs tels que les mandibules des souris peut être effectuée de 4 à 6 h dans une solution à 30 % et 50 % de tB et pendant 1 jour dans une solution à 70 % de tB20. Le temps d’incubation dépend de la taille de l’échantillon et de sa teneur en lipides. Le temps peut être prolongé pour assurer une délipidation complète19,20. Les laboratoires individuels peuvent ajuster le calendrier selon leurs besoins sans réduire le temps minimum requis pour la délipidation.
Le problème le plus courant dans les techniques de nettoyage des tissus implique la transparence insuffisante des tissus causée par des étapes de traitement et de nettoyage des tissus inadéquates. Cette situation entraîne des difficultés à obtenir des images claires, ce qui entrave la visualisation correcte des structures cellulaires ou subcellulaires marquées par fluorescence. Le dépannage des tissus insuffisamment transparents doit être effectué en s’assurant que chaque étape critique est effectuée correctement. Cette pratique devrait commencer par les étapes de perfusion et de fixation des tissus jusqu’aux étapes de nettoyage des tissus. Les propriétés de chaque tissu ou organe sont différentes. Par conséquent, les étapes de traitement et de nettoyage des tissus doivent être optimisées pour obtenir des résultats de nettoyage satisfaisants19.
L’imagerie d’échantillons de tissus clairs peut être réalisée avec un microscope confocal à balayage laser (CLSM) ou un microscope à fluorescence à feuille de lumière (LSFM) en fonction des exigences et de la question expérimentale et de la disponibilité de l’équipement17. Nous avons utilisé CLSM pour l’imagerie de la mandibule, ce qui donne une imagerie à plus haute résolution à un grossissement plus élevé, mais prend plus de temps que LSFM17,20. Lorsque la haute résolution et un grossissement plus élevé ne sont pas requis, le microscope à fluorescence à feuille de lumière rapide (LSFM) peut être souhaitable19. LSFM est coûteux et peut ne pas être facilement disponible pour les laboratoires réguliers. Pour la microscopie confocale, choisir les bonnes lentilles d’objectif avec la bonne ouverture numérique est essentiel pour une bonne imagerie19,20. Pour les grands échantillons de tissus, des objectifs de grossissement plus faibles tels que 10x avec une petite ouverture numérique et une plus grande distance de travail peuvent être appropriés19,21. Pour les échantillons de tissus plus petits, des objectifs de grossissement plus élevés tels que 20x avec une ouverture numérique élevée et une distance de travail plus petite peuvent être souhaitables. De plus, l’utilisation d’une huile d’immersion avec un indice de réfraction correspondant au milieu de compensation et une lentille d’objectif est essentielle pour éviter la distorsion de l’image et gagner en clarté17,19. Pour l’imagerie, plusieurs suites logicielles de traitement et d’analyse d’images sont disponibles. Alors que certaines des suites logicielles sont gratuites, d’autres sont chères et peuvent être inabordables pour les laboratoires individuels. Ces plates-formes d’imagerie génèrent des fichiers volumineux (en gigaoctets) qui nécessitent des postes de travail informatiques haut de gamme pour la visualisation et la quantification des données 17,20,21.
Bien que plus rapide et plus facile à réaliser que d’autres méthodes de marquage ADN telles que BrdU, il existe des limites à la détection des LRC par marquage EdU in vivo par rapport au marquage des LRC avec des souris transgéniques H2B-GFP. Tout d’abord, il est difficile de distinguer les CRL d’origine épithéliale ou mésenchymateuse. Le marquage H2B-GFP peut être utilisé dans un activateur de tétracycline spécifique aux tissus, piloté par un promoteur, qui peut marquer spécifiquement les cellules souches quiescentes dans divers tissus. Dans le cas des incisives de souris, la méthode H2B-GFP permet de marquer spécifiquement les cellules souches de l’épithélium ou du mésenchyme 4,22. Cependant, les méthodes de nettoyage tissulaire et de construction d’images 3D décrites dans ce protocole s’appliquent également aux LRC marqués par fluorescence H2B-GFP, offrant une flexibilité et une variété d’options. Nos travaux permettent l’étiquetage et la caractérisation des CRL en fonction des besoins scientifiques. La méthode H2B-GFP nécessite la production de souris transgéniques et le croisement avec d’autres souches, ce qui prend du temps et coûte plus cher que l’étiquetage EdU. L’autre limite du marquage EdU avec la méthode de nettoyage des tissus est que les échantillons ne peuvent pas être utilisés davantage pour les analyses fonctionnelles en aval.
Ce protocole est avantageux pour les chercheurs qui n’ont pas besoin d’étiquetage spécifique aux tissus et qui veulent des résultats plus rapides du marquage des cellules souches quiescentes. Cette méthode peut être modifiée pour être utilisée pour le traçage de la lignée cellulaire; lorsqu’elle est incorporée avec le marquage par fluorescence Cre-driven des cellules souches / progénitrices, notre méthode permet d’obtenir plus de détails sur l’emplacement de la descendance et une quantification / contributions plus précises23.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Meghann K. Holt d’avoir révisé le manuscrit. Cette étude a été soutenue par les subventions DE026461 et DE028345 des NIH / NIDCR et le financement de démarrage de la Texas A & M School of Dentistry au Dr Xiaofang Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
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