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Developmental Biology

ऊतक समाशोधन के बाद 3 डी पुनर्निर्माण दृष्टिकोण का उपयोग करके माउस छेदक में लेबल-रिटेनिंग कोशिकाओं का पता लगाना और मात्रा निर्धारित करना

Published: June 10, 2022 doi: 10.3791/63721
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Texas A&M School of Dentistry
* These authors contributed equally

Summary

माउस छेदक में इसके स्टेम सेल आला में मूल्यवान लेबल-रिटेनिंग कोशिकाएं होती हैं। हमारे पास लेबल-रिटेनिंग कोशिकाओं का निष्पक्ष रूप से पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने का एक नया तरीका है; हमारे अध्ययन ने जबड़े के पीईजीएएस ऊतक को साफ करने के बाद ईडीयू लेबलिंग और 3 डी पुनर्निर्माण दृष्टिकोण का उपयोग किया।

Abstract

मुराइन छेदक एक अंग है जो माउस के पूरे जीवनकाल में लगातार बढ़ता है। छेदक के समीपस्थ ऊतकों में रहने वाली उपकला और मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं संतान को जन्म देती हैं जो एमेलोब्लास्ट्स, ओडोंटोब्लास्ट्स और लुगदी फाइब्रोब्लास्ट में अंतर करेंगी। ये कोशिकाएं छेदक ऊतकों के निरंतर कारोबार का समर्थन करने में महत्वपूर्ण हैं, जिससे वयस्क स्टेम कोशिकाओं के होमियोस्टैसिस का अध्ययन करने के लिए मुराइन छेदक एक उत्कृष्ट मॉडल बन जाता है। माना जाता है कि स्टेम कोशिकाओं में लंबे समय तक रहने वाली क्विसेंट कोशिकाएं होती हैं जिन्हें न्यूक्लियोटाइड एनालॉग जैसे 5-एथिनाइल -2'-डीऑक्स्यूरिडाइन (ईडीयू) द्वारा लेबल किया जा सकता है। कोशिकाएं समय के साथ इस लेबल को बनाए रखती हैं और तदनुसार लेबल-रिटेनिंग सेल (एलआरसी) नाम दिया जाता है। विवो में एलआरसी की कल्पना करने के लिए दृष्टिकोण स्टेम सेल होमियोस्टेसिस की निगरानी के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करते हैं। इस अध्ययन में, हमने एलआरसी की कल्पना और विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन किया। हमारे अभिनव दृष्टिकोण में ऊतक समाशोधन और पूरे-माउंट ईडीयू धुंधला होने के बाद माउस छेदक में एलआरसी शामिल हैं, जिसके बाद कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ 3-आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण होता है। यह विधि अनुभागित स्लाइडों पर पारंपरिक एलआरसी विश्लेषण की तुलना में 3 डी इमेजिंग अधिग्रहण और गैर-पक्षपाती मात्रा को सक्षम करती है।

Introduction

लगातार बढ़ते माउस छेदक वयस्क स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। उपकला (लैबियल और लिंगुअल ग्रीवा लूप) और मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं (लैबियल और लिंगुअल ग्रीवा लूप के बीच) जो छेदक के समीपस्थ पक्ष पर रहते हैं, एमेलोब्लास्ट्स, ओडोंटोब्लास्ट्स और दंत लुगदी कोशिकाओं में अंतर करते हैं। यह अनूठी प्रक्रिया ऊतक हानि और टर्नओवर 2 के मुआवजे के लिए कोशिकाओं का एक स्रोत प्रदान करतीहै। हालांकि कई स्टेम सेल मार्कर जैसे कि Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1, आदि। माउस छेदक में वयस्क स्टेम कोशिकाओं के उपसमुच्चय के लिए विवो में पहचाना गया है, वे अकेलेउपयोग किए जाने पर स्टेम सेल आबादी का प्रतिनिधित्व करने में अपर्याप्त हैं। न्यूक्लियोटाइड एनालॉग डीएनए लेबलिंग और प्रतिधारण द्वारा लंबे समय तक जीवित रहने वाली क्विसेंट कोशिकाओं की कल्पना वयस्क स्टेम कोशिकाओं के अधिकांश उप-समूहों के लिए निष्पक्ष पहचान प्रदान कर सकतीहै। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण सेल व्यवहार और दंत स्टेम सेल आबादी के होमियोस्टैसिसको समझने के लिए कई स्टेम सेल पहचान विधियों के बीच उपयोगी है। जबकि विभाजित स्टेम कोशिकाएं काफी पीछा करने के बाद अपना डीएनए लेबलिंग खो देंगी, कथित क्विसेंट स्टेम कोशिकाएं अपने डीएनए लेबल को बनाए रखती हैं, उन्हें लेबल-रिटेनिंग सेल (एलआरसी) 6 मानती हैं। गैर-विभाजित स्टेम कोशिकाओं द्वारा डीएनए लेबलिंग और प्रतिधारण उनके आला में कथित वयस्क स्टेम कोशिकाओं को चिह्नित और पता लगाएगा।

पिछले वर्षों में, थाइमिडीन एनालॉग 5-ब्रोमो-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन (बीआरडीयू) लेबलिंग ने सेल प्रसार के लिए बोझिल, समय लेने वाली और उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी असंगत 3एच-थाइमिडीन डीएनए लेबलिंग विधिको बदल दिया। हाल के वर्षों में, 5-एथिनाइल -2'-डीऑक्सीयूरिडाइन (ईडीयू) लेबलिंग तकनीक का बीआरडीयू पर तेजी से उपयोग किया गया है। यह पैटर्न कई कारणों से उभरा। सबसे पहले, बीआरडीयू विधि धीमी और श्रम-गहन है। उपयोगकर्ता की स्थिति परिवर्तनशील है, और यह नमूनों में अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित करने में असमर्थ है (डीएनए विकृतीकरण के कारण)। इसी तरह, बीआरडीयू विधि कोशिकाओं की एंटीजेनिसिटी को खो देती है, इस प्रकार यह डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक विश्लेषण और सह-स्थानीयकरण प्रयोगों और विवो स्टेम सेल प्रत्यारोपण 3,7,9,10,11,12 के लिए अक्षम हो जाती है। बीआरडीयू भी एक टेराटोजेन है, जोभ्रूण के विकास में एलआरसी लेबलिंग के लिए उपयुक्त नहीं है। इसके अलावा, पूरे माउंट नमूनों में उपयोग किए जाने पर बीआरडीयू विधि अक्षम है। नुकसान नमूनों के गहरे हिस्से में एंटीबॉडी का कम प्रवेश या गहरे प्रवेश के लिए एक लंबी एंटीबॉडी इनक्यूबेशन अवधि की आवश्यकताहै। ईडीयू लेबलिंग नमूनों को विकृत करने के चरणों से बचता है, इस प्रकार अल्ट्रास्ट्रक्चर को संरक्षित करता है। यह सुविधा डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक विश्लेषण जैसे सह-स्थानीयकरण प्रयोगों और स्टेम सेल प्रत्यारोपण11,12 के लिए फायदेमंद है। इसके अलावा, ईडीयू लेबलिंग अत्यधिक संवेदनशील और तेज है; क्यू (आई) -उत्प्रेरित [3 + 2] साइक्लोडिशन प्रतिक्रिया ("क्लिक" रसायन विज्ञान) 14 के माध्यम से ईडीयू लेबल का पता लगाने के लिए तेजी से अवशोषित और छोटे आकार के फ्लोरोसेंट एज़ाइड के उपयोग के कारण नमूना प्रवेश अधिक है।

एक और तेजी से लागू डीएनए लेबलिंग विधि इंजीनियर ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग है। ये चूहे हिस्टोन 2 बी ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एच 2 बी-जीएफपी) को टेट्रासाइक्लिन-उत्तरदायी नियामक तत्व 5,14 द्वारा नियंत्रित करते हैं। चूहों को 4 सप्ताह से 4 महीने की पीछा अवधि के लिए टेट्रासाइक्लिन चाउ / पानी के साथ खिलाने के बाद, जीएफपी फ्लोरेसेंस साइकिलिंग कोशिकाओं में कम हो जाएगा और केवल एलआरसी प्रतिदीप्ति6 को बनाए रखते हैं। इस विधि का लाभ यह है कि लेबल किए गए एलआरसी को अलग किया जा सकता है और सेल संस्कृति या डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक विश्लेषण 6,7 के लिए व्यवहार्य रह सकता है। कुछ अध्ययनों ने दीर्घकालिक उपयोग के लिए पीछा किए जाने पर क्विसेंट स्टेम कोशिकाओं के गलत लेबलिंग की सूचना दी। यह परिणाम एच 2 बी-जीएफपी तनाव से लीक पृष्ठभूमि अभिव्यक्ति के कारण था और उपयुक्त टेट्रासाइक्लिन-विनियमित प्रतिक्रिया15 नहीं था।

इसके अलावा, अतीत में अधिकांश साहित्य ने एलआरसी का पता लगाने का उपयोग मुख्य रूप से अनुभागित स्लाइडों पर किया था, जो दो आयामी हैं और अक्सर एलआरसी के सटीक स्थान और संख्या को दिखाने में गलती से पक्षपाती होते हैं। दृष्टिकोण ने जटिल ऊतक संरचनाओं के वर्गों के लिए गलत कोण प्रदर्शितकिए। अन्य विधि सीरियल अनुभागों से 3 डी छवियां प्राप्त करना और पोस्ट-इमेज पुनर्निर्माण करना था। संपीड़ित या विस्तारित अनुभागों के कारण प्रत्येक सीरियल अनुभाग में भिन्नताओं से छवि विरूपण के कारण ये कदम गलत थे, जिसके परिणामस्वरूप जानकारीगायब थी 16,17,18. विधि भी श्रमसाध्य और समय लेने वाली थी।

एलआरसी के पूरे माउंट इमेजिंग को सुविधाजनक बनाने के लिए, नमूनों को स्पष्ट करने की आवश्यकता है, जबकि प्रतिदीप्ति को अच्छी तरह से बनाए रखा जाना चाहिए। वर्तमान ऊतक समाशोधन तकनीकों को तीन प्रमुख श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है: कार्बनिक विलायक-आधारित ऊतक समाशोधन तकनीक, जलीय अभिकर्मक-आधारित ऊतक समाशोधन तकनीक, और हाइड्रोगेल-आधारित ऊतक समाशोधन तकनीक17,19। पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) से जुड़े विलायक प्रणाली (पीईजीएएस) को हाल ही में विकसित किया गया है। यह दृष्टिकोण लगभग सभी प्रकार के ऊतकों को पारदर्शी बनाता है और अंतर्जात प्रतिदीप्ति को संरक्षित करता है, जिसमें हड्डी और दांत जैसे कठोर ऊतकशामिल हैं। पीईजीएएस विधि में अन्य ऊतक समाशोधन विधियों पर फायदे हैं, खासकर दांत और हड्डी सामग्री को साफ करने में। अधिकांश अन्य विधियां केवल आंशिक रूप से कठोर ऊतकों को साफ कर सकती हैं, लंबे प्रसंस्करण समयहो सकते हैं, या महंगे अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, पीईजीएएस विधि अन्य तरीकों पर अंतर्जात प्रतिदीप्ति को कुशलतापूर्वक संरक्षित कर सकती है।

इस साहित्य ने हमें सेल अध्ययन के लिए एक नई विधि बनाने के लिए प्रेरित किया। हमने ऊतक-साफ़ नमूनों के सबसे बेहतर 3 डी होल-माउंट इमेजिंग के साथ ईडीयू लेबलिंग के एलआरसी डिटेक्शन फायदों को जोड़ा; नमूने उन्नत पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल (पीईजी) से जुड़े विलायक प्रणाली (पीईजीओएस) ऊतक समाशोधन तकनीक15 के साथ संसाधित किए गए थे। हार्ड टिशू पारदर्शिता ने हमें दांतों या जबड़े को तोड़ने के बिना विवो में एलआरसी फ्लोरेसेंस के 3 डी सिग्नल का पुनर्निर्माण करने में सक्षम बनाया, जिससे एलआरसी की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने का अधिक सटीक तरीका बन गया।

इस अध्ययन में, हम माउस छेदक में एलआरसी की कल्पना करने के लिए एक अभिनव मार्गदर्शिका प्रदान करते हैं। हमने माउस छेदक स्टेम सेल आला के भीतर एलआरसी के स्थान और मात्रा को निर्धारित करने के लिए एक 3 डी दृश्य दृष्टिकोण बनाया। इस परियोजना में ईडीयू लेबलिंग, पीईजीएएस ऊतक समाशोधन तकनीक और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था। पूरे माउंट ऊतक पर एलआरसी को ईडीयू लेबल करने की हमारी विधि और एक साफ और पारदर्शी नमूने का उपयोग पारंपरिक अनुभागित स्लाइड और अन्य हानिकारक डीएनए लेबलिंग विधियों की सीमाओं दोनों को दूर करता है। इस प्रकार, हमारी तकनीक स्टेम सेल होमियोस्टैसिस पर अध्ययन के लिए उपयुक्त होगी, जिसमें एलआरसी का पता लगाने की आवश्यकता होती है, खासकर कठोर ऊतकों पर। प्रोटोकॉल अन्य ऊतकों और अंगों में स्टेम सेल होमियोस्टैसिस पर ध्यान केंद्रित करने वालों के लिए समान रूप से फायदेमंद हो सकता है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी विधियों को टेक्सास ए एंड एम यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ डेंटिस्ट्री के लिए संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. ईडीयू लेबलिंग कॉकटेल की तैयारी

  1. तालिका 1 में वर्णित कॉकटेल स्टॉक समाधान तैयार करें।
  2. तालिका 1 में वर्णित ईडीयू लेबलिंग कॉकटेल तैयार करें।

2. चूहों और ईडीयू समाधान की तैयारी

  1. ईडीयू समाधान तैयार करें। 20 मिलीग्राम / एमएल पर डीएमएसओ में ईडीयू को भंग करें और -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
    चेतावनी: ईडीयू एक उत्परिवर्तन है। उपयोगकर्ताओं को इस पदार्थ को संभालते समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनना चाहिए।
  2. 5 दिन के C57BL/6J चूहों को तैयार EDU समाधान के साथ 3 μL / g शरीर के वजन पर इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें। चूहों को लगातार 7 दिनों के लिए दिन में एक बार समाधान प्राप्त करना चाहिए। इसके बाद, वे विश्लेषण के लिए काटे जाने से पहले 6 सप्ताह के लिए पीछा अवधि से गुजरते हैं (चित्रा 1)।
    सावधानी: चूहों में ईडीयू इंजेक्शन लगाते समय सुई चुभने से बचने के लिए सावधान रहें। लगातार 7 दिनों तक ईडीयू इंजेक्शन लगाने के बाद, चूहों को एक नए पिंजरे में रखें। चूहों के अपने नए घर में होने के बाद, उचित बायोहाजार्ड नियमों का उपयोग करके पुराने पिंजरे में बिस्तर का निपटान करें।

3. ट्रांस-कार्डियक छिड़काव द्वारा नमूना तैयार करना (6 सप्ताह की पीछा अवधि के बाद प्रसवोत्तर 53-दिन के चूहे)

नोट: सफल ट्रांस-कार्डियक छिड़काव के बाद माउस यकृत पीला हो जाना चाहिए।

  1. इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें। उन्हें ज़ाइलाज़िन और केटामाइन एनेस्थेटिक्स (ज़ाइलज़िन 10-12.5 मिलीग्राम / किग्रा) का संयोजन दिया जाना चाहिए; केटामाइन, 80-100 मिलीग्राम /
  2. ~ 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें जब तक कि माउस अब दर्दनाक उत्तेजनाओं (जैसे पंजा चुटकी सजगता) का जवाब नहीं देता है।
  3. चूहों को प्रत्येक पंजे में सुइयों के साथ स्टायरोफोम समर्थन पर स्थिर लापरवाह स्थिति में रखें।
  4. चिमटी का उपयोग करके और कैंची का विच्छेदन करके ऊपर की त्वचा को खोलकर छाती गुहा को उजागर करें।
  5. तेज कैंची का उपयोग करके डायाफ्राम को काटें। ध्यान रखें कि दिल में छेद न हो।
  6. रिबकेज के माध्यम से काटें, दिल को उजागर करने के लिए क्लैंप कैंची के साथ उरोस्थि के आधार को पकड़ें।
  7. माउस को एक फ्यूम हुड में परिसंचरण पंप के पास छिड़काव चरण में स्थानांतरित करें।
  8. बाएं वेंट्रिकल के शीर्ष में 25 ग्राम सुई (फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस)/4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान से भरी ट्यूबिंग से) डालें। सुई की नोक को वेंट्रिकल के लुमेन में रखने का ध्यान रखें।
    सावधानी: पीएफए मध्यम विषाक्त और एक संभावित कार्सिनोजेन है। पीएफए को संभालने के लिए पीपीई का उपयोग करें और रासायनिक फ्यूम हुड के तहत समाधान तैयार करें। अपशिष्ट पीएफए को संस्थान के दिशानिर्देशों के अनुसार उचित निपटान की आवश्यकता होती है।
  9. बाएं वेंट्रिकल में सुई डालने के तुरंत बाद एक तेज कैंची का उपयोग करके दाएं वेंट्रिकल को काट लें। यह कदम रक्त को माउस से बाहर बहने और एकत्र करने वाले पकवान में निकालने की अनुमति देता है।
  10. नमूने को 7 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर पीबीएस समाधान के 50 एमएल के साथ भरें।
  11. पीबीएस छिड़काव के बाद, स्टॉपकॉक को 5 एमएल / मिनट की समान प्रवाह दर पर 4% पीएफए समाधान के 20 एमएल के प्रवाह की अनुमति देने के लिए स्विच करें।
  12. जबकि परिसंचरण पंप अभी भी चालू है, बाएं वेंट्रिकल से सुई हटा दें।
    नोट: माउस अब ऊतक संग्रह के लिए तय किया गया है। प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने के लिए, पूरे प्रोटोकॉल में जब भी संभव हो प्रकाश जोखिम से बचा जाना चाहिए। जब ऊतक प्रसंस्करण कर रहा है, ऊतक के नमूनों के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जा सकता है।

4. पीईजीएएस तकनीक का उपयोग करके जबड़े की ऊतक सफाई

नोट: ऊतकों की मात्रा के अनुसार एक 15 एमएल या 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग प्रत्येक चरण में उपचार के लिए नमूने तैयार रखने के लिए किया जा सकता है। नमूने चरण 4.2 से 4.7 तक 37 डिग्री सेल्सियस शेकर्स (~ 100 आरपीएम) पर संसाधित किए जाते हैं। प्लास्टिक को पिघलने से बचने के लिए पॉलीप्रोपाइलीन-आधारित प्लास्टिक कंटेनरों का उपयोग करें जो कार्बनिक सॉल्वैंट्स के प्रतिरोधी हैं। वैकल्पिक रूप से, ग्लासवेयर का उपयोग किया जा सकता है।

सावधानी: पीईजीएएस ऊतक समाशोधन तकनीक क्वाड्रोल, पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी), बेंजाइल बेंजोएट (बीबी), एमएमए 500 आदि जैसे विषाक्त समाधानों का उपयोग करती है। संभावित एक्सपोजर से बचने के लिए उपयुक्त पीपीई की आवश्यकता होती है।

  1. जबड़े का विच्छेदन करें और आगे 4% पीएफए में नमूने ठीक करें। उन्हें रात भर कमरे के तापमान पर रखें।
  2. जबड़े से मांसपेशियों को निकालें और उन्हें 0.5 एम ईडीटीए समाधान (पीएच 8.0) में डुबोकर 4 दिनों के लिए डीकैल्सीफाई करें। इस अवधि के दौरान, 37 डिग्री सेल्सियस शेकर पर एक दैनिक मध्यम परिवर्तन करें।
    नोट: जितना संभव हो सके नमूने से मांसपेशियों को हटाना वांछनीय है। यह सावधानी इमेजिंग प्रक्रिया को सरल बनाएगी और मांसपेशियों से ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करेगी।
  3. शेष रक्त हीम को हटाने के लिए एक दिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस शेकर पर25% क्वाड्रोल घोल (v/v in H 2 O) के साथ जबड़े को रंग दें।
  4. पूरा पूरा माउंट ईडीयू धुंधला।
    1. तालिका 1 के अनुसार एक ताजा ईडीयू लेबलिंग कॉकटेल तैयार करें।
      नोट: ईडीयू लेबलिंग कॉकटेल को इष्टतम ईडीयू लेबलिंग परिणाम प्राप्त करने के लिए ताजा तैयार एस्कॉर्बेट समाधान के साथ हर बार ताजा बनाने की आवश्यकता होती है।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस शेकर पर 30 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ जबड़े को धो लें।
    3. हर बार 3 मिनट के लिए पीबीएस के साथ जबड़े को तीन बार धोएं।
    4. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस शेकर पर ताजा बने ईडीयू लेबलिंग कॉकटेल में जबड़े को इनक्यूबेट करें।
    5. हर बार 3 मिनट के लिए पीबीएस के साथ जबड़े को तीन बार धोएं।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए निम्नलिखित समाधानों में से प्रत्येक में सीरियल डी-लिपिडेशन करें:
    30% टर्ट-ब्यूटेनॉल (टीबी) समाधान: 75% v/v H2O, 22% v/v tB, और 3% v/v Quadrol।
    50% tB समाधान: 50% v/v H2O, 47% v/v tB, और 3% v/v Quadrol।
    70% tB समाधान: 30% v/v H2O, 67% v/v tB, और 3% v/v Quadrol
    नोट: डी-लिपिडेशन चरण महत्वपूर्ण है। डी-लिपिडेशन 30% और 50% टीबी समाधान में 4-6 घंटे के बीच और 70% टीबी समाधान में 1 दिन के लिए किया जा सकता है।
  6. टीबी-पीईजी घोल में जबड़े को निम्नलिखित दैनिक मध्यम परिवर्तन के साथ 2 दिनों के लिए निर्जलित करें: 75% टीबी, 22% वी / वी पॉलीथीन ग्लाइकोल मिथाइल-ईथर मेथैक्रिलेट औसत एमएमए 500, और 3% वी / वी क्वाड्रोल 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  7. अपवर्तक सूचकांक मिलान प्राप्त करने के लिए बेंजाइल बेंजोएट (बीबी) -पीईजी समाशोधन माध्यम में जबड़ा साफ करें: पारदर्शिता प्राप्त होने तक 75% वी / वी बीबी, 22% वी / वी पीईजी-एमएमए 500, और 3% क्वाडरोल।
    नोट: हमारे पास अपवर्तक सूचकांक मिलान पर जानकारी है। पानी, लिपिड, प्रोटीन, खनिज, ऑर्गेनेल आदि जैसे ऊतकों में अकार्बनिक और कार्बनिक घटक। 1.33 से 1.55 की सीमा में एक अलग अपवर्तक सूचकांक (आरआई) है। ऊतक घटकों के बीच यह आरआई बेमेल इमेजिंग प्रक्रिया में बाधा डालता है। ऊतक के भीतर आरआई बेमेल को समाप्त करके पारदर्शिता प्राप्त की जा सकती है। बीबी-पीईजी के समाशोधन माध्यम में ऊतक-साफ़ किए गए नमूनों को डुबोने की सलाह दी जाती है। यह कदम पूरे नमूने को ~ 1.54 (जिसे आरआई मिलान कहा जाता है) का एक समान आंतरिक आरआई देगा, जिससे इमेजिंग प्रक्रिया आसान हो जाएगी।
  8. भंडारण और इमेजिंग के लिए कमरे के तापमान पर बीबी-पीईजी ऊतक समाशोधन माध्यम में जबड़े को संरक्षित करें।
    नोट: फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के क्रमिक नुकसान से बचने के लिए इमेजिंग को जल्द से जल्द पूरा करना अच्छा है। हालांकि, पीईजीएएस विधि प्रतिदीप्ति संवाददाताओं को भंडारण20,21 के कई हफ्तों के बाद भी अच्छी तरह से संरक्षित रखेगी। दीर्घकालिक भंडारण के लिए, नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर भी संग्रहीत किया जा सकता है।

5. ऊतक-साफ़ जबड़े की कॉन्फोकल इमेजिंग

  1. बीबी-पीईजी क्लियरिंग माध्यम में ब्रांड कैविटी स्लाइड पर ऊतक साफ किए गए पूरे जबड़े को माउंट करें और ग्लास कवर स्लाइड के साथ कवर करें। किसी भी बुलबुले से बचें।
  2. एक उपयुक्त लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ छवि अधिग्रहण करें। 512 x 512 पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन और 400 हर्ट्ज अधिग्रहण गति पर छवि अधिग्रहण मापदंडों का चयन करें और सेट करें। ये सेटिंग्स माइक्रोस्कोप को नियंत्रित करने वाले सॉफ़्टवेयर के अधिग्रहण मोड मेनू में पाई जाती हैं।
  3. फ्लोरोसेंट उत्तेजना के लिए पैनल में, फ्लोरोफोरेस को बेहतर ढंग से उत्तेजित करने के लिए आवश्यक लेजर (टीआरआईटीसी) को सक्रिय करें (एलआरसी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए हमने जिस जांच का उपयोग किया है, उसमें फ्लोरोसेंट गुण हैं जैसे कि 548 एनएम पर उत्तेजना और 563 एनएम लेजर तरंग दैर्ध्य पर उत्सर्जन के साथ साइ 3)।
  4. फ्लोरोसेंट डिटेक्शन के लिए पैनल में, स्लाइडर को उन तरंग दैर्ध्य का चयन करने के लिए स्थानांतरित करें जिन्हें मापा जाएगा (उदाहरण के लिए, Cy3 जैसे फ्लोरोफोरे के लिए 555 से 625 एनएम के बीच)।
  5. सफेद प्रकाश और कम आवर्धन उद्देश्य (2-10x) का उपयोग करके नमूने की कल्पना करने और खोजने के लिए माइक्रोस्कोप चरण पर माउंटेड जबड़ा रखें।
  6. ग्लास कवरस्लिप और उद्देश्य के अपवर्तक सूचकांक से मेल खाने के लिए कवरस्लिप के शीर्ष पर 1.52 के अपवर्तक सूचकांक के साथ विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें।
    नोट: छवि अधिग्रहण के दौरान ऑप्टिकल विकृतियों की शुरूआत को कम करने के लिए उद्देश्यों, इमेजिंग मीडिया और ऊतक के अपवर्तक सूचकांक का यथासंभव बारीकी से मिलान करें।
  7. फ्लोरोसेंट लैंप चालू करें और रुचि के क्षेत्रों की छवि के लिए एक उपयुक्त आवर्धन उद्देश्य चुनें। हमने 1.95 मिमी की कामकाजी दूरी के साथ 0.9 के संख्यात्मक एपर्चर के साथ 20 एक्स ऑब्जेक्टिव लेंस का उपयोग किया। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में बड़े ऊतक के नमूनों की इमेजिंग करते समय एक लंबी कामकाजी दूरी लेंस की आवश्यकता हो सकती है। वैकल्पिक रूप से, बड़े ऊतक नमूनों के लिए प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेजिंग आसानी से की जा सकती है।
  8. कॉन्फोकल इमेजिंग सॉफ़्टवेयर पर, लाइव-स्कैन मोड शुरू करने के लिए लाइव बटन दबाएं। छवियों की गतिशील सीमा को अधिकतम करने और पिक्सेल संतृप्ति से बचने के लिए, चयनित चैनल के लिए लाभ और लेजर तीव्रता समायोजित करें।
  9. एक्स और वाई आयामों में जबड़े के पूरे क्षेत्र की कल्पना करने के लिए दृश्य क्षेत्र की पहचान करें। ऊपरी और निचले जेड-चरण अधिग्रहण मापदंडों को सेट करें जो चूहों के छेदक में स्टेम सेल आला की मात्रा को सटीक रूप से कवर करते हैं। 2 μm या अपनी आवश्यकताओं के अनुसार Z-step आकार का उपयोग करें। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के नए संस्करणों को विभिन्न अतिव्यापी क्षेत्रों के जेड-स्टैक को स्वचालित रूप से प्राप्त करने में सक्षम होना चाहिए।
  10. .lif स्वरूप में Z-स्टैक छवि फ़ाइलें प्राप्त करें और सहेजें.
    नोट: .lif मक्खियों को .tiff फ़ाइलों में परिवर्तित किया जा सकता है और अन्य 3 डी विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए उपयोग किया जा सकता है।

6. छवि प्रसंस्करण, 3 डी छवि पुनर्निर्माण, और एक सतह बनाकर लेबल-रिटेनिंग कोशिकाओं का परिमाणीकरण, रुचि के क्षेत्र (आरओआई) का विभाजन, आरओआई को मास्क करना और स्पॉट बनाना

नोट: हमने छवि प्रसंस्करण और 3 डी पुनर्निर्माण के लिए इमारिस (बिटप्लेन 9.0.1) का उपयोग किया, लेकिन इसी तरह के छवि प्रसंस्करण चरणों को अन्य सॉफ्टवेयर सूट (जैसे, इमेजजे / फिजी, 3 डी स्लाइसर, एविज़ो, अरिविस, अमीरा, आदि) का उपयोग करके आयोजित किया जा सकता है।

  1. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में, एरिना बटन क्लिक करें, फिर छवि चुनें। मूल .lif फ़ाइल का चयन करें और मर्ज की गई फ़ाइल चुनें, छवियों को इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में आयात किया जाएगा।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, सॉफ़्टवेयर के लिए Z स्टैक छवि फ़ाइल को मूल प्रारूप फ़ाइल प्रकार में परिवर्तित करने के लिए एक इमेजिंग सॉफ़्टवेयर फ़ाइल कनवर्टर का उपयोग करें। उदाहरण के लिए: Imaris फ़ाइल कनवर्टर का उपयोग कर .lif फ़ाइलों को .ims फ़ाइलों में कनवर्ट करें और इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में .ims फ़ाइलें खोलें। सॉफ़्टवेयर के मूल फ़ाइल स्वरूप में डेटा को परिवर्तित करने से फ़ाइल रूपांतरण तेजी से हो जाएगा और त्रुटियों को कम किया जा सकेगा.
  2. छवि डेटा सेट खोलने के लिए आयातित फ़ाइल को डबल क्लिक करें.
  3. प्रदर्शन समायोजन कक्ष पर जाएँ, चैनल का नाम क्लिक करें। यह आमतौर पर डिफ़ॉल्ट मोड में लाल के रूप में लेबल किया जाता है।
    1. छवि गुण विंडो में, मैप किए गए रंग टैब पर क्लिक करें। रंग तालिका फ़ाइल विकल्प में, फायर फ्लो चुनें, और फिर ठीक पर क्लिक करें। डिस्प्ले रंग को आमतौर पर नमूने से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और सकारात्मक प्रतिदीप्ति को अलग करने के लिए चुना जाता है।
  4. दृश्य - गुण फलक में स्क्रीन के ऊपरी बाईं ओर, नई सतह जोड़ें लेबल वाले नीले आइकन पर क्लिक करें। वॉल्यूम आइकन का चयन न करें जो अधिकांश पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को हटा देगा और सकारात्मक प्रतिदीप्ति स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं (चरण 6.4.2 देखें)।
    1. रुचि क्षेत्र (ROI) के मैन्युअल विभाजन की प्रक्रिया बनाएँ टैब पर क्लिक करके और स्किप स्वचालित निर्माण का चयन करके, मैन्युअल रूप से संपादित करें टैब का चयन करें । मैन्युअल सतह निर्माण विज़ार्ड में, ROI को आसानी से समोच्च करने के लिए नमूने के आधार पर अभिविन्यास (XY, या YZ, या XZ) चुनने के लिए कंटूर टैब पर क्लिक करें। यहां, हम एक्सवाई अभिविन्यास चुनते हैं।
    2. इसके बाद, सुनिश्चित करें कि दाएं कोने में पॉइंटर मेनू चयन मोड में है। ऊतक में ROI का पता लगाने के लिए स्लाइस स्थिति समायोजित करें। आप देखेंगे कि अधिकांश पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को चरण 6.4 में उल्लिखित अलग सकारात्मक प्रतिदीप्ति के साथ हटा दिया गया है। ड्रॉ बटन पर क्लिक करें और रुचि का एक अस्थायी क्षेत्र खींचें। ROI के अलावा अन्य क्षेत्रों से हस्तक्षेप से बचने के लिए दृश्यता विकल्प का चयन करें।
    3. चरण 6.4.2 दोहराएँ। रुचि के पूरे क्षेत्र को आकर्षित करने के लिए स्लाइस से स्लाइस करें।
    4. ROI ड्राइंग समाप्त होने के बाद, ROI की 3D ज्यामिति प्राप्त करने के लिए क्रिएट सरफेस पर क्लिक करें।
    5. मैन्युअल सतह निर्माण विज़ार्ड में संपादित करें बटन पर क्लिक करें और मास्क ऑल का चयन करें.
    6. पॉप-आउट मास्क चैनल विंडो में, चैनल चयन विकल्पों में चैनल 1 का चयन करें। बाद में, मास्क लगाने से पहले डुप्लिकेट चैनल का चयन करें। मास्क सेटिंग्स में, कॉन्स्टेंट इनसाइड/आउटसाइड का चयन करें और सतह के बाहर वोक्सेल को 0 पर सेट करें।
    7. दृश्य-गुण फलक में, सरफेस ऑब्जेक्ट का चयन करें और वॉल्यूम ऑब्जेक्ट का चयन करें। प्रदर्शन समायोजन में, मूल "लाल" चैनल का चयन करें और नकाबपोश लाल चैनल का चयन करें और वांछित 3 डी-रेंडर और सकारात्मक रूप से लेबल किए गए फ्लोरेसेंस आरओआई प्राप्त करने के लिए रंग तीव्रता को समायोजित करें।
  5. कोई नया स्पॉट ऑब्जेक्ट बनाएँ. 3D-रेंडर किए गए LRC को निर्धारित करने के लिए ऐड ऑन स्पॉट्स आइकन पर क्लिक करके 3D-रेंडर किए गए LRC की मात्रा निर्धारित करके शुरू करें जो 3D-रेंडर किए गए LRC के साथ तुलनात्मक रूप से ओवरलैप होते हैं। स्पॉट निर्माण विज़ार्ड में चरणों के बीच जाने के लिए निचले तीरों का उपयोग करें।
    1. स्पॉट निर्माण विज़ार्ड में, सॉफ़्टवेयर के साथ स्वचालित रूप से स्पॉट बनाने के लिए निर्देशों के चार अनुक्रमिक चरण होंगे। सुनिश्चित करें कि पहले चरण में सेगमेंट केवल रुचि का क्षेत्र विकल्प चुना गया है। अगला आइकन पर क्लिक करें।
    2. दूसरे चरण में, एक "XYZ 3D बॉक्स" होगा। ROI को कवर करने के लिए XYZ बॉक्स समायोजित करें। अगला आइकन पर क्लिक करें।
    3. तीसरे चरण में, स्रोत चैनल विकल्पों पर जाएँ। नकाबपोश लाल चैनल चुनें; नमूना प्रतिदीप्ति डॉट्स को फिट करने और ओवरलैप करने के लिए अनुमानित एक्सवाई स्पॉट व्यास इनपुट करें। अगला आइकन पर क्लिक करें।
    4. चौथे चरण में, "गुणवत्ता" फ़िल्टर प्रकार जोड़ें और 'गुणवत्ता' हिस्टोग्राम में स्लाइडिंग विंडो को स्थानांतरित करके कम तीव्रता सीमा को समायोजित करें जब तक कि पहचान योग्य एलआरसी के बहुमत को लेबल नहीं किया जाता है।
      नोट: विभाजन और इसलिए सांख्यिकीय रीडआउट (उदाहरण: कोशिकाओं की संख्या) बहुत तीव्रता सीमा मूल्यों पर निर्भर करते हैं। उपयुक्त थ्रेशोल्ड मानों को ठीक से सेट करने के लिए सावधान रहें।
    5. फिनिश बटन पर क्लिक करें और सांख्यिकीय बटन का चयन करें। छवि में स्पॉट की कुल संख्या का मान खोजने के लिए समग्र टैब का चयन करें।
    6. टैब प्रदर्शन से फ़ाइल बटन पर क्लिक करके आंकड़े निर्यात करें और परिणाम किसी .xls फ़ाइल में प्राप्त करें।
    7. परिमाणीकरण परिणाम प्रस्तुत करने के लिए एक उपयुक्त आरेख का उपयोग करें।

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Representative Results

ईडीयू लेबलिंग और पीईजीएएस ऊतक समाशोधन प्रक्रिया (चित्रा 2) के बाद, पारदर्शी जबड़ा प्राप्त किया गया था जैसा कि हमारी छवि (चित्रा 3 बी) में दिखाया गया है। हमने संशोधित नमूने की तुलना ऊतक समाशोधन प्रक्रिया के बिना एक सामान्य जबड़े से की (चित्रा 3 ए)। ईडीयू लेबलिंग के साथ पारदर्शी जबड़ा (चित्रा 3 बी) को कॉन्फोकल इमेजिंग के अधीन किया गया था। हमने स्टेम सेल आला को दिखाने वाले छेदक शीर्ष पर ध्यान केंद्रित किया जैसा कि (पूरक चित्र 1) में दिखाया गया है। छेदक के ऑप्टिकल खंड ने एक्सवाई विमान (चित्रा 4 ए) में छेदक शीर्ष के स्टेम सेल आला में एलआरसी दिखाए। हमने एक छेदक शीर्ष की 3 डी छवि का पुनर्निर्माण किया, जिसमें एपिथेलियल (हरे) और मेसेनकाइमल (लाल) स्टेम सेल आला (चित्रा 4 बी) दोनों में ईडीयू + लेबल-रिटेनिंग क्विसेंट स्टेम कोशिकाओं को दिखाया गया है। ईडीयू + कोशिकाओं को परिमाणीकरण के लिए स्थानों में स्थानांतरित किया गया था जो मेसेनकाइमल एलआरसी (चित्रा 4 सी) के साथ तुलनात्मक रूप से अतिव्यापी थे। चित्र 4D केवल मेसेनकाइमल एलआरसी के लिए बनाए गए धब्बों को दर्शाता है। चित्र 4E केवल उपकला एलआरसी के लिए बनाए गए धब्बे को दर्शाता है। फिर हमने उपकला और मेसेनकाइमल एलआरसी (चित्रा 4 एफ) की मात्रा का ठहराव पूरा किया।

Figure 1
चित्रा 1: एलआरसी को लेबल करने के लिए ईडीयू इंजेक्शन प्रोटोकॉल। जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों को पी 5 से शुरू होने वाले ईडीयू के साथ इंजेक्ट किया गया था। इंजेक्शन पी 11 तक लगातार 7 दिनों तक चले। इसके बाद, चूहों को 6 सप्ताह की पीछा अवधि से गुजरना पड़ा। हमने उन्हें प्रसवोत्तर दिन 53 पर काटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो। चूहों को लगातार 7 दिनों के लिए ईडीयू के साथ इंजेक्ट किया गया था, और फिर 6 सप्ताह के लिए पीछा अवधि में रखा गया था। ट्रांस-कार्डियक छिड़काव के बाद जबड़े को काटा और ठीक किया गया था। इसके बाद, जबड़े को डीकैल्सीफिकेशन, डिकैलाइजेशन, होल-माउंट ईडीयू स्टेनिंग, डी-लिपिडेशन, निर्जलीकरण और अपवर्तक सूचकांक (आरआई) मिलान के ऊतक समाशोधन चरणों के अधीन किया गया था। साफ किए गए जबड़े के लिए इमेजिंग एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत की गई थी, जिसके बाद डेटा विश्लेषण किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ऊतक समाशोधन (ए) से पहले और ऊतक समाशोधन (बी) के बाद प्रसवोत्तर 53 दिन पुराने डब्ल्यूटी माउस जबड़े की छवियां। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एक्सवाई विमान (ए) में छेदक शीर्ष के स्टेम सेल आला में एलआरसी को दिखाने वाले छेदक का एक ऑप्टिकल खंड। "एपेक्स (बी) की ओर माउस मैंडिबुलर छेदक में उपकला और मेसेनकाइमल एलआरसी का एक 3 डी छवि पुनर्निर्माण"। 3 डी स्पॉट (ग्रे) (सी) के साथ अतिव्यापी मेसेनकाइमल एलआरसी (लाल)। धब्बे केवल मेसेनकाइमल एलआरसी (डी) के लिए बनाए गए हैं। धब्बे केवल उपकला एलआरसी (ई) के लिए बनाए गए हैं। उपकला और मेसेनकाइमल एलआरसी (एफ) के लिए परिमाणीकरण परिणाम। बार: ए में 300 μm और B-E में 150 μm। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ईडीयू लेबलिंग कॉकटेल की तैयारी
स्टॉक समाधान (जलीय) की तैयारी
TBS (10x) 1 M, pH 7.6
CuSO4 (100x), 0.4 M
Sulfa-Cyanine 3 Azide (100x), 300 μM in DMSO
सोडियम एस्कॉर्बेट (10x), H 2 O में0.2g/mL
PBST (PBS, v/v में 0.1% Triton X-100)
ईडीयू लेबलिंग कॉकटेल की तैयारी
क्रम में निम्न अभिकर्मकों को जोड़ें:
ट्रिस-बफर्ड खारा (100 एमएम फाइनल, पीएच 7.6)
CuSO4 (4 mM फाइनल)
सुलफा-साइनिन 3 अज़ाइड (3 μM फाइनल)
सोडियम एस्कॉर्बेट (100 mM अंतिम, प्रत्येक उपयोग के लिए ताजा बनाया गया)

तालिका 1: ईडीयू लेबलिंग कॉकटेल की तैयारी

पूरक चित्र: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इंजेक्शन की कई खुराक (बीआरडीयू, ईडीयू) आमतौर पर बढ़ते नवजात चूहों पर उपयोग की जाती हैं ताकि प्रसार कोशिकाओं को यथासंभव लेबल किया जा सके 1,6,13। पीछा करने की अवधि को ऊतकों की नवीकरण दर 6,13 के बारे में एक महत्वपूर्ण कदम माना जाता है। माउस छेदक हर महीने खुद को नवीनीकृत करता है। यह विशेषता शोधकर्ताओं को 4 सप्ताहया उससे अधिक 4,5,22 तक पीछा करने की अवधि निर्धारित करने की अनुमति देती है। हमारी 6 सप्ताह की पीछा अवधि मेसेनकाइमल और उपकला (लैबियल और भाषाई ग्रीवा लूप) डिब्बों में स्टेम कोशिकाओं को लेबल कर सकती है। इस क्षेत्र में उपकला और मेसेनकाइमल दोनों डिब्बों से टीएसी (ट्रांजिट-एम्प्लीफाइंग सेल) में कुछ पूर्वज आबादी शामिल थी। एक लंबी पीछा अवधि वास्तविक लेबल-रिटेनिंग कोशिकाओं को दिखाने में वांछनीय होगी जो विशेष रूप से उपकला और मेसेनकाइमल स्टेम सेल आला में रहते हैं।

इस प्रोटोकॉल के लिए ऊतक प्रसंस्करण और समाशोधन चरणों में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। पहला नोट ऊतक छिड़काव और निर्धारण चरण के लिए है। चूहे के छेदक में लुगदी ऊतक होते हैं जिनमें रक्त वाहिकाओं की समृद्ध आपूर्ति होती है और इसमें रक्त के ऊतकों की उच्च मात्रा होती है। इस प्रकार, चूहों को गहराई से एनेस्थेटाइज्ड और नियंत्रित करने के बाद हेपरिन पीबीएस छिड़काव जल्द से जल्द शुरू किया जाना चाहिए। इसका कारण रक्त के थक्के के गठन से बचना है जो ऑटोफ्लोरेसेंस19 की ओर जाता है। पीएफए के साथ अति-निर्धारण से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, जिससे साफ करने के बाद ऊतक की अपर्याप्त पारदर्शिता और पीले रंग का मलिनकिरण हो सकता है। अत्यधिक मलिनकिरण इमेजिंग19 के दौरान नमूनों में सिग्नल की गुणवत्ता को कम करता है। ऊतकों के निष्क्रिय विसर्जन निर्धारण पर सक्रिय ट्रांस-कार्डियक छिड़काव चरण को प्राथमिकता दी जाती है, जो ऊतक समाशोधन चरणों में अंतर्जात प्रतिदीप्ति के नुकसान से बचने के लिए ऊतकों को तेजी से ठीक करेगा। निष्क्रिय निर्धारण में, ऊतक में गहरे क्षेत्र कम पारदर्शी रह सकते हैं; नमूने में संतोषजनक इमेजिंग परिणाम नहीं होसकते हैं। जबड़े से मांसपेशियों को उचित हटाने से शोधकर्ताओं की रुचि रखने वाली संरचनाओं के उचित विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, प्रभावी निष्कासन ऑटोफ्लोरेसेंस गड़बड़ी को मांसपेशियों के ऊतकों को प्रभावित करने से रोकता है। कठोर ऊतक समाशोधन में उचित डीकैल्सीफिकेशन अपरिहार्य है। नमूनों के आकार और खनिज सामग्री के अनुसार ईडीटीए विसर्जन समय को समायोजित करके ऊतकों को पर्याप्त रूप से विघटित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। ऊतकों के अधिक संकोचन से बचने के लिए ईडीटीए एकाग्रता महत्वपूर्ण है। इसलिए, एकाग्रता को प्रश्न16,19 में नमूने और प्रयोगों के अनुसार चुना जाना चाहिए। इसी तरह, ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने के लिए शेष हीम को पर्याप्त रूप से हटाने के लिए एक डिकलराइजेशन कदम महत्वपूर्ण है। अपर्याप्त डी-लिपिडेशन समय के परिणामस्वरूप कम पारदर्शी ऊतक हो सकता है और इसकी सलाह नहीं दी जाती है। आम तौर पर, चूहों के जबड़े जैसे कठोर ऊतकों के लिए डी-लिपिडेशन 30% और 50% टीबी समाधान में 4-6 घंटे से और 70% टीबी समाधान20 में 1 दिन के लिए किया जा सकता है। इनक्यूबेशन समय नमूने के आकार और इसकी लिपिड सामग्री पर निर्भर करता है। 19,20 का पूर्ण विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए समय बढ़ाया जा सकता है। अलग-अलग प्रयोगशालाएं डी-लिपिडेशन के लिए आवश्यक न्यूनतम समय को कम किए बिना अपनी आवश्यकताओं के अनुसार समय को समायोजित कर सकती हैं।

ऊतक समाशोधन तकनीकों में सबसे आम समस्या अनुचित ऊतक प्रसंस्करण और समाशोधन चरणों के कारण ऊतक की अपर्याप्त पारदर्शिता शामिल है। यह स्थिति स्पष्ट छवियों को प्राप्त करने में कठिनाई की ओर ले जाती है, फ्लोरोसेंट-लेबल सेलुलर या उपकोशिकीय संरचनाओं के उचित विज़ुअलाइज़ेशन में बाधा डालती है। अपर्याप्त रूप से पारदर्शी ऊतकों की समस्या का निवारण यह सुनिश्चित करके किया जाना चाहिए कि प्रत्येक महत्वपूर्ण कदम सही ढंग से किया गया है। यह अभ्यास ऊतक छिड़काव और निर्धारण चरणों से ऊतक समाशोधन चरणों तक शुरू होना चाहिए। प्रत्येक ऊतक या अंग के गुण अलग-अलग होते हैं। इसलिए, संतोषजनक समाशोधन परिणाम प्राप्त करने के लिए ऊतक प्रसंस्करण और समाशोधनचरणों को अनुकूलित किया जाना चाहिए।

स्वीकृत ऊतक नमूनों की इमेजिंग को आवश्यकताओं और प्रयोगात्मक प्रश्न और उपकरण 17 की उपलब्धता के आधार पर एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (सीएलएसएम) या एक लाइट शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (एलएसएफएम) के साथपूरा किया जा सकता है। हमने जबड़े की इमेजिंग के लिए सीएलएसएम का उपयोग किया, जो उच्च आवर्धन पर उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग देता है लेकिन एलएसएफएम17,20 की तुलना में अधिक समय लेता है। जब उच्च रिज़ॉल्यूशन और उच्च आवर्धन एक आवश्यकता नहीं है, तो तेज प्रकाश-शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (एलएसएफएम) वांछनीय हो सकताहै। एलएसएफएम महंगा है और नियमित प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए, सही संख्यात्मक एपर्चर के साथ सही उद्देश्य लेंस चुनना अच्छी इमेजिंग19,20 के लिए महत्वपूर्ण है। बड़े ऊतक नमूनों के लिए, कम आवर्धन उद्देश्य जैसे कि एक छोटे संख्यात्मक एपर्चर के साथ 10x और अधिक कामकाजी दूरी उपयुक्त19,21 हो सकती है। छोटे ऊतक नमूनों के लिए, उच्च आवर्धन उद्देश्य जैसे कि उच्च संख्यात्मक एपर्चर के साथ 20x और एक छोटी कामकाजी दूरी वांछनीय हो सकती है। इसके अलावा, समाशोधन माध्यम और उद्देश्य लेंस के मिलान अपवर्तक सूचकांक के साथ एक विसर्जन तेल का उपयोग छवि विरूपण से बचने और स्पष्टता प्राप्त करने में महत्वपूर्ण है17,19. इमेजिंग के लिए, कई छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर सूट उपलब्ध हैं। जबकि कुछ सॉफ्टवेयर सूट मुफ्त हैं, अन्य महंगे हैं और व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं के लिए अवहनीय हो सकते हैं। ये इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म बड़े पैमाने पर फाइलें (गीगाबाइट में) उत्पन्न करते हैं जिन्हें डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और परिमाणीकरण 17,20,21 के लिए उच्च अंत कंप्यूटर वर्कस्टेशन की आवश्यकता होती है।

हालांकि बीआरडीयू जैसे अन्य डीएनए लेबलिंग विधियों की तुलना में तेज और आसान प्रदर्शन करना आसान है, एच 2 बी-जीएफपी ट्रांसजेनिक चूहों के साथ एलआरसी लेबलिंग की तुलना में विवो में ईडीयू लेबलिंग के माध्यम से एलआरसी का पता लगाने की सीमाएं हैं। सबसे पहले, उपकला मूल या मेसेनकाइमल मूल के एलआरसी को अलग करना मुश्किल है। एच 2 बी-जीएफपी लेबलिंग का उपयोग ऊतक-विशिष्ट, प्रमोटर-संचालित, टेट्रासाइक्लिन एक्टिवेटर में किया जा सकता है जो विशेष रूप से विभिन्न ऊतकों में क्विसेंट स्टेम कोशिकाओं को लेबल कर सकता है। चूहों के छेदक के मामले में, एच 2 बी-जीएफपी विधि विशेष रूप से उपकला या मेसेनकाइमल 4,22 से स्टेम कोशिकाओं को लेबल कर सकती है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में वर्णित ऊतक समाशोधन और 3 डी छवि निर्माण विधियां एच 2 बी-जीएफपी फ्लोरेसेंस-लेबल एलआरसी पर भी लागू होती हैं, जो लचीलापन और विभिन्न प्रकार के विकल्प प्रदान करती हैं। हमारा काम वैज्ञानिक आवश्यकताओं के अनुसार एलआरसी के लेबलिंग और विशेषता को सक्षम बनाता है। एच 2 बी-जीएफपी विधि के लिए ट्रांसजेनिक चूहों के उत्पादन और अन्य उपभेदों के साथ क्रॉस-ब्रीडिंग की आवश्यकता होती है, जो ईडीयू लेबलिंग की तुलना में समय लेने वाला और महंगा है। ऊतक समाशोधन विधि के साथ ईडीयू लेबलिंग की अन्य सीमा यह है कि नमूनों को डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक विश्लेषण के लिए आगे उपयोग नहीं किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल उन जांचकर्ताओं के लिए फायदेमंद है जिन्हें ऊतक-विशिष्ट लेबलिंग की आवश्यकता नहीं होती है और क्विसेंट स्टेम कोशिकाओं को लेबल करने से तेज परिणाम चाहते हैं। इस विधि को सेल वंश अनुरेखण के लिए उपयोग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है; जब स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं के सीआरई-संचालित फ्लोरेसेंस लेबलिंग के साथ शामिल किया जाता है, तो हमारी विधि संतान स्थान और अधिक सटीक मात्रा / योगदान पर अधिक विवरण प्राप्त करतीहै।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के संपादन के लिए मेघन के होल्ट को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को एनआईएच / एनआईडीसीआर अनुदान डीई026461 और डीई028345 और टेक्सास ए एंड एम स्कूल ऑफ डेंटिस्ट्री से डॉ ज़ियाओफांग वांग को स्टार्टअप फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Sigma Aldrcih E9884
20 × Objective/NA 0.9 Leica 507702
50 mL Falcon Centrifuge Tubes Falcon 352070
BD PrecisionGlide Needle BD REF 305111
Bezyl benzoate (BB) Sigma Aldrcih 409529
Bitplane 9.0.1 Imaris
BRAND cavity slides Millipore Sigma BR475505
C57BL/6J mice Jackson Laboratory Strain #:000664
Circulation Pump VWR 23609-170
CuSO4 Sigma Aldrcih 451657
DMSO Sigma Aldrcih D8418
EdU Carboynth NE08701
Heparin Miiilipore Sigma H3149
Imaging System Olympus DP27
LAS X Software Leica
Olympus Stereo Microscope Olympus SZX16
Paraformaldehye Sigma Aldrich P6148
PBS Sigma Aldrich P4417
PEGMMA500 Sigma Aldrich 447943
Quadrol Sigma Aldrich 122262
Sodium Ascorbate Sigma Aldrich 11140
Sulfa-Cyanine 3 Azide Lumiprobe D1330
TBS-10X Cell Signaling Technology 12498
TCS SP8 Confocal Microscope Leica
tert-butanol (tB) Sigma Aldrich 360538
Triton X-100 Sigma Aldrich X100

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 184 स्टेम सेल ऊतक समाशोधन लेबल-रिटेनिंग सेल (एलआरसी) पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) से जुड़े विलायक प्रणाली (पीईजीओएस) 3 डी पुनर्निर्माण माउस छेदक
ऊतक समाशोधन के बाद 3 डी पुनर्निर्माण दृष्टिकोण का उपयोग करके माउस छेदक में लेबल-रिटेनिंग कोशिकाओं का पता लगाना और मात्रा निर्धारित करना
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Dong, C., Lamichhane, B., Zhang, Y., … More

Dong, C., Lamichhane, B., Zhang, Y., Wang, X. Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing. J. Vis. Exp. (184), e63721, doi:10.3791/63721 (2022).

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