Summary
Mussnittet innehåller värdefulla etiketthållande celler i sin stamcellsnisch. Vi har ett nytt sätt att opartiskt upptäcka och kvantifiera de etiketthållande cellerna; vår studie använde EdU-märkning och en 3D-rekonstruktionsmetod efter PEGASOS vävnadsrensning av underkäken.
Abstract
Murina snittet är ett organ som växer kontinuerligt under musens livslängd. Epitel- och mesenkymala stamceller som finns i framtändernas proximala vävnader ger upphov till avkomma som kommer att differentieras till ameloblaster, odontoblaster och massafibroblaster. Dessa celler är avgörande för att stödja den fortsatta omsättningen av framtänder, vilket gör murina framtänder till en utmärkt modell för att studera homeostas hos vuxna stamceller. Stamceller antas innehålla långlivade vilande celler som kan märkas av nukleotidanaloger såsom 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EdU). Cellerna behåller denna etikett över tid och kallas följaktligen etiketthållande celler (LRC). Metoder för att visualisera LRC in vivo ger ett robust verktyg för övervakning av stamcellshomeostas. I denna studie beskrev vi en metod för att visualisera och analysera LRC. Vårt innovativa tillvägagångssätt har LRC i musframtänder efter vävnadsrensning och helmonterad EdU-färgning följt av konfokalmikroskopi och en 3-dimensionell (3D) rekonstruktion med bildprogramvaran. Denna metod möjliggör 3D-bildinsamling och icke-partisk kvantifiering jämfört med traditionell LRC-analys på snittade objektglas.
Introduction
Den kontinuerligt växande mussnittet är en utmärkt modell för att studera vuxna stamceller1. Epiteliala (labial och lingual cervikal slinga) och mesenkymala stamceller (mellan den labiala och linguala cervikala slingan) som ligger på den proximala sidan av snittet differentieras till ameloblaster, odontoblaster och tandmassaceller. Denna unika process ger en källa till celler för kompensation av vävnadsförlust och omsättning2. Även om flera stamcellsmarkörer som Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, etc. har identifierats in vivo för undergrupper av vuxna stamceller i musframtänder, är de otillräckliga för att representera stamcellspopulationerna när de används ensamma 1,3,4,5. Visualisering av långlivade vilande celler genom nukleotidanalog DNA-märkning och retention kan ge opartisk detektion för de flesta undergrupper av vuxna stamceller6. Vidare är detta tillvägagångssätt användbart bland många stamcellsidentifieringsmetoder7 för att förstå cellbeteende och homeostas hos dentala stamcellspopulationer 3,8. Medan de delande stamcellerna skulle förlora sin DNA-märkning efter en betydande jakt, behåller de förmodade vilande stamcellerna sin DNA-etikett och anser att de är etiketthållande celler (LRC)6. DNA-märkning och retention av icke-delande stamceller kommer att markera och lokalisera de förmodade vuxna stamcellerna i sina nischer.
Under de senaste åren har tymidinanalog 5-brom-2′-deoxiuridin (BrdU) märkning ersatt den besvärliga, tidskrävande och högupplösta mikroskopiinkompatibla 3H-tymidin-DNA-märkningsmetoden för cellproliferationsanalyser 6,9. Under de senaste åren har märkningstekniken 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EdU) använts alltmer över BrdU. Detta mönster uppstod på grund av flera skäl. För det första är BrdU-metoden långsam och arbetsintensiv. Användarvillkoren är varierande och det går inte att bevara ultrastrukturen i prover (på grund av DNA-denaturering). På samma sätt förlorar BrdU-metoden cellernas antigenicitet, vilket gör den ineffektiv för nedströms funktionella analyser och analyser såsom samlokaliseringsexperimenten och in vivo stamcellstransplantation 3,7,9,10,11,12. BrdU är också en teratogen, som inte är lämplig för märkning av LRC i embryonal utveckling6. BrdU-metoden är också ineffektiv när den används i helmonterade prover. Nackdelarna är låg penetration av antikroppar i den djupa delen av proverna eller kravet på en lång antikroppsinkubationsperiod för djup penetration13. EdU-märkning undgår stegen för denaturering av prover, vilket bevarar ultrastrukturen. Denna funktion är fördelaktig för nedströms funktionella analyser såsom samlokaliseringsexperiment och stamcellstransplantation11,12. Dessutom är EdU-märkning mycket känslig och snabb; provpenetrationen är hög på grund av användningen av snabbt absorberade och mindre fluorescerande azider för detektering av EdU-etiketter genom en Cu (I) -katalyserad [3 + 2] cykloadditionsreaktion ("klick" kemi)14.
En annan alltmer tillämpad DNA-märkningsmetod är användningen av konstruerade transgena möss. Dessa möss uttrycker histon 2B grönt fluorescerande protein (H2B-GFP) som styrs av ett tetracyklinresponsivt regulatorelement 5,14. Efter att ha matat möss med tetracyklinsoppa / vatten under en 4-veckors till 4-månaders jaktperiod kommer GFP-fluorescensen att minska i cykelceller och endast LRC behåller fluorescensen6. Fördelen med denna metod är att de märkta LRC:erna kan isoleras och förbli livskraftiga för cellodling eller nedströms funktionella analyser 6,7. Vissa studier rapporterade felaktig märkning av vilande stamceller när de jagas för långvarig användning. Detta resultat berodde på ett läckande bakgrundsuttryck från H2B-GFP-stammen och inte det lämpliga tetracyklinreglerade svaret15.
Dessutom använde de flesta litteratur tidigare LRC-detektering huvudsakligen på snittade objektglas, som är tvådimensionella och ofta felaktigt partiska när det gäller att visa den exakta platsen och antalet LRC. Tillvägagångssättet visade felaktiga vinklar för sektioner av komplexa vävnadsstrukturer16. Den andra metoden var att hämta 3D-bilder från seriella sektioner och utföra rekonstruktioner efter bild. Dessa steg var felaktiga på grund av bildförvrängning från variationer i varje seriell sektion på grund av komprimerade eller utsträckta sektioner, vilket resulterade i saknad information16,17,18. Metoden var också mödosam och tidskrävande.
För att underlätta helmonterad avbildning av LRC måste prover klargöras medan fluorescensen bibehålls väl. Nuvarande vävnadsrensningstekniker kan klassificeras i tre huvudkategorier: organiska lösningsmedelsbaserade vävnadsrensningstekniker, vattenhaltiga reagensbaserade vävnadsrensningstekniker och hydrogelbaserade vävnadsrensningstekniker17,19. PEGASOS (polyetylenglykol) associerade lösningsmedelssystem (PEGASOS) har nyligen utvecklats. Detta tillvägagångssätt gör nästan alla typer av vävnader transparenta och bevarar endogen fluorescens, inklusive hårda vävnader som ben och tänder20. PEGASOS-metoden har fördelar jämfört med andra vävnadsrensningsmetoder, särskilt vid rensning av tand- och benmaterial. De flesta andra metoder kan endast delvis rensa hårda vävnader, ha långa bearbetningstider eller kräva kostsamma reagens21. PEGASOS-metoden kan också effektivt bevara endogen fluorescens över andra metoder.
Denna litteratur ledde oss till att skapa en ny metod för cellstudier. Vi kombinerade LRC: s detektionsfördelar med EdU-märkning med den mest överlägsna 3D-helmonterade avbildningen av vävnadsrensade prover; Proverna bearbetades med PEGASOS (Advanced Polyethylene glycol (PEG)-associated solvent system (PEGASOS) vävnadsrensningsteknik15. Hårdvävnadstransparens gjorde det möjligt för oss att rekonstruera 3D-signalen för LRC-fluorescens in vivo utan att bryta tänderna eller underkäken, vilket skapade ett mer exakt sätt att visualisera och kvantifiera LRC.
I denna studie tillhandahåller vi en innovativ guide för att visualisera LRC i musframtänderna. Vi gjorde ett 3D-visuellt tillvägagångssätt för att bestämma platsen och kvantiteten av LRC inom musframtändernas stamcellsnisch. Detta projekt använde EdU-märkning, PEGASOS vävnadsrensningstekniker och konfokalmikroskopi. Vår metod för EdU-märkning av LRC på helmonterad vävnad och användningen av ett rensat och transparent prov övervinner både begränsningarna hos traditionella snittade glas och andra ofördelaktiga DNA-märkningsmetoder. Således kommer vår teknik att vara lämplig för studier på stamcellshomeostas som kräver LRC-detektion, särskilt på hårda vävnader. Protokollet kan vara lika fördelaktigt för dem som fokuserar på stamcellshomeostas i andra vävnader och organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) för Texas A&M University College of Dentistry.
1. Beredning av EdU-märkningscocktail
- Bered cocktaillösningarna enligt beskrivningen i tabell 1.
- Förbered EdU-märkningscocktailen enligt beskrivningen i tabell 1.
2. Beredning av möss och EdU-lösning
- Förbered EdU-lösningen. Lös upp EdU i DMSO vid 20 mg/ml och förvara i en frys på -20 °C.
VARNING: EdU är ett mutagent. Användare ska bära lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) vid hantering av detta ämne. - Injicera 5 dagar gamla C57BL/6J-möss med den beredda EdU-lösningen intraperitonealt vid 3 μl/g kroppsvikt. Möss måste få lösningen en gång om dagen i 7 dagar i följd. Därefter genomgår de en jaktperiod i 6 veckor innan de skördas för analys (figur 1).
VARNING: Var försiktig så att du inte sticker i nålen när du injicerar EdU i mössen. Efter injektion av EdU i 7 dagar i följd, placera mössen i en ny bur. När mössen är i sitt nya hem, kassera sängkläderna i den gamla buren med lämpliga biologiska riskregler.
3. Provberedning genom transkardiell perfusion (postnatala 53 dagar gamla möss efter 6-veckors jaktperioden)
OBS: Muslevern ska bli blek efter framgångsrik transkardiell perfusion.
- Bedövar möss med en intraperitoneal injektion. De måste ges en kombination av xylazin- och ketaminanestetika (Xylazin 10-12,5 mg/kg; Ketamin, 80-100 mg/kg kroppsvikt).
- Vänta i ~ 10 minuter tills musen inte längre svarar på smärtsamma stimuli (t.ex. tassklämreflexer).
- Placera mössen i ryggläge stabiliserat på frigolitstöd med nålar i varje tass.
- Exponera bröstkaviteten genom att öppna upp den överliggande huden med pincett och dissekera sax.
- Klipp upp membranet med en vass sax. Var försiktig så att du inte tränger igenom hjärtat.
- Skär genom bröstkorgen, ta tag i bröstbenets botten med klämsax för att exponera hjärtat.
- Överför musen till perfusionssteget nära cirkulationspumpen i en dragskåp.
- För in 25 G nålen (från slangen fylld med fosfatbuffrad saltlösning (PBS)/4% paraformaldehyd (PFA)) i toppen av vänster kammare. Var noga med att hålla nålspetsen i ventrikelns lumen.
VARNING: PFA är måttligt giftigt och sannolikt cancerframkallande. Använd personlig skyddsutrustning för att hantera PFA och förbered lösningen under en kemisk dragskåp. PFA för avfall kräver korrekt bortskaffande enligt institutionens riktlinjer. - Skär höger kammare med en vass sax omedelbart efter att nålen har satts in i vänster kammare. Detta steg gör det möjligt för blod att strömma ut ur musen och dränera in i uppsamlingsskålen.
- Perfusera proverna med 50 ml PBS-lösning med en flödeshastighet på 7 ml/min.
- Efter PBS-perfusion, byt kranen för att tillåta ett flöde på 20 ml 4% PFA-lösning vid samma flödeshastighet på 5 ml / min.
- Medan cirkulationspumpen fortfarande är på, ta bort nålen från vänster kammare.
Musen är nu fixerad för vävnadsinsamling. För att bevara fluorescensen bör ljusexponering undvikas när det är möjligt under hela protokollet. Medan vävnaden bearbetas kan det 50 ml koniska röret med vävnadsproverna täckas med aluminiumfolie.
4. Vävnadsrensning av underkäken med PEGASOS-teknik
OBS: Ett 15 ml eller 50 ml koniskt rör enligt vävnadsvolymen kan användas för att hålla proverna redo för behandling i varje steg. Proverna bearbetas vid 37 °C shakers (~100 rpm) från steg 4.2 till 4.7. Använd polypropenbaserade plastbehållare som är resistenta mot organiska lösningsmedel för att undvika att smälta plasten. Alternativt kan glas användas.
VARNING: PEGASOS vävnadsrensningsteknik använder giftiga lösningar som Quadrol, polyetylenglykol (PEG), bensylbensoat (BB), MMA500, etc. Lämplig personlig skyddsutrustning krävs för att undvika potentiell exponering.
- Dissekera mandiblar och fixera prover ytterligare i 4% PFA. Förvara dem vid rumstemperatur över natten.
- Ta bort musklerna från mandiblarna och fördjupa dem i 0,5 M EDTA-lösning (pH 8,0) för att avkalka i 4 dagar. Under denna period utförs en daglig medelstor förändring på en 37 °C shaker.
OBS: Det är önskvärt att ta bort musklerna från provet så mycket som möjligt. Denna försiktighetsåtgärd kommer att förenkla avbildningsprocessen och minska autofluorescensen från musklerna. - Avfärga underkäken med en 25 % kvadrollösning (v/v iH2O) på en 37 °C shaker under en dag för att avlägsna det återstående blodhemmet.
- Komplett helmonterad EdU-färgning.
- Förbered en ny EdU-märkningscocktail enligt tabell 1.
OBS: EdU-märkningscocktailen måste göras färsk varje gång med nyberedd askorbatlösning tillsatt för att uppnå optimala EdU-märkningsresultat. - Skölj underkäken med PBST i 30 minuter i en 37 °C skakapparat.
- Skölj mandiblarna med PBS tre gånger i 3 min varje gång.
- Inkubera mandiblarna i en nygjord EdU-märkningscocktail på en 37 ° C shaker över natten.
- Skölj mandiblarna med PBS tre gånger i 3 min varje gång.
- Förbered en ny EdU-märkningscocktail enligt tabell 1.
- Utför seriell fettavlipidering i var och en av följande lösningar under 6 timmar vid 37 °C:
30% tert-butanol (tB) lösning: 75% v/v H2O, 22% v/v tB och 3% v/v Quadrol.
50% tB lösning: 50% v/v H2O, 47% v/v tB och 3% v/v Quadrol.
70% tB lösning: 30% v/v H2O, 67% v/v tB och 3% v/v Quadrol
OBS: De-lipideringssteget är kritiskt. De-lipidering kan göras mellan 4-6 h i 30% och 50% tB lösning och i 1 dag i 70% tB lösning. - Dehydrera mandiblarna i tB-PEG-lösning i 2 dagar med följande dagliga medieförändring: 75% tB, 22% v/v polyetylenglykolmetyletermetakrylat genomsnittligt MMA500 och 3% v/v Quadrol vid 37 °C.
- Rensa underkäken i bensylbensoat (BB)-PEG-rensningsmedium för att erhålla brytningsindexmatchning: 75% v/v BB, 22% v/v PEG-MMA500 och 3% Quadrol tills transparens uppnås.
OBS: Vi har information om brytningsindexmatchning. De oorganiska och organiska komponenterna i vävnader som vatten, lipider, proteiner, mineraler, organeller etc. har ett annat brytningsindex (RI) i intervallet 1,33 till 1,55. Denna RI-obalans mellan vävnadskomponenterna hindrar avbildningsprocessen. Transparens kan uppnås genom att eliminera RI-matchning i vävnaden. Nedsänkning av vävnadsrensade prover i rensningsmediet av BB-PEG rekommenderas. Detta steg kommer att ge den enhetliga interna RI på ~ 1,54 (kallad RI-matchning) till hela provet, vilket underlättar bildprocessen. - Förvara mandiblarna i BB-PEG-vävnadsrensningsmediet vid rumstemperatur för förvaring och avbildning.
OBS: Det är bra att slutföra bildbehandlingen så snart som möjligt för att undvika gradvis förlust av fluorescerande reportrar. PEGASOS-metoden kommer dock att hålla fluorescensreportrar väl bevarade även efter flera veckors lagring20,21. För långtidsförvaring kan proverna också förvaras vid 4 °C.
5. Konfokal avbildning av den vävnadsrensade underkäken
- Montera den vävnadsrensade hela underkäken på märkeshålrumsglas i BB-PEG-röjmediet och täck med glaslock. Undvik bubblor.
- Utför bildinsamling med ett lämpligt laserskanningskonfokalmikroskop. Välj Hämta och ställ in bildinsamlingsparametrarna på 512 x 512 pixlars upplösning och 400 Hz förvärvshastighet. Dessa inställningar finns i förvärvslägesmenyn för programvaran som styr mikroskopet.
- I panelen för fluorescerande excitation, aktivera den laser som krävs (TRITC) för att optimalt excitera fluoroforer (sonden vi använde för LRC-visualisering har fluorescerande egenskaper som Cy3 med excitation vid 548 nm och emission vid 563 nm laservåglängd).
- I panelen för fluorescerande detektering, flytta skjutreglaget för att välja de våglängder som ska mätas (till exempel mellan 555 och 625 nm för en Cy3-liknande fluorofor).
- Placera den monterade underkäken på mikroskopsteget för att visualisera och hitta provet med vitt ljus och ett lägre förstoringsmål (2-10x).
- Tillsätt en droppe doppolja med ett brytningsindex på 1,52 ovanpå täckglaset för att matcha brytningsindex för glastäcket och objektivet.
OBS: Matcha brytningsindex för mål, bildmedier och vävnad så nära som möjligt för att minimera införandet av optiska snedvridningar under bildförvärv. - Slå på lysrören och välj ett lämpligt förstoringsmål för att avbilda intressanta områden. Vi använde en 20x objektivlins med en numerisk bländare på 0,9 med ett arbetsavstånd på 1,95 mm. En längre arbetsdistanslins kan krävas vid avbildning av större vävnadsprover i konfokalmikroskopet. Alternativt kan avbildning enkelt göras med hjälp av ett ljusarkmikroskop för större vävnadsprover.
- På programvaran för konfokal avbildning trycker du på Live-knappen för att starta live-scan-läget. För att maximera bildens dynamiska omfång och undvika pixelmättnad, justera förstärkningen och laserintensiteten för den valda kanalen.
- Identifiera synfältet för att visualisera hela underkäkens område i X- och Y-dimensionerna. Ställ in de övre och nedre Z-stegsförvärvsparametrarna som exakt täcker volymen av stamcellsnischen i mösssnittet. Använd en Z-stegsstorlek på 2 μm eller enligt dina krav. De nyare versionerna av konfokalmikroskop bör automatiskt kunna förvärva z-staplar av de olika överlappande regionerna.
- Hämta och spara Z-stack-bildfiler i .lif-format.
.lif-flugorna kan konverteras till .tiff filer och användas för andra 3D-analysprogram.
6. Bildbehandling, 3D-bildrekonstruktion och kvantifiering av etiketthållande celler genom att skapa en yta, segmentering av intresseregionen (ROI), maskera avkastningen och skapa fläckar
OBS: Vi använde Imaris (Bitplane 9.0.1) för bildbehandling och 3D-rekonstruktion, men liknande bildbehandlingssteg kan utföras med andra programvarusviter (t.ex. ImageJ / Fiji, 3D-skärare, Avizo, Arivis, Amira, etc.).
- I bildhanteringsprogrammet klickar du på knappen Arena och väljer Bild. Välj den ursprungliga .lif-filen och välj sammanslagen fil, bilderna importeras till bildprogramvaran.
OBS: Alternativt kan du använda en bildhanteringsprogramvarufilkonverterare för att konvertera Z-stackbildfilen till programvarans ursprungliga formatfiltyp. Till exempel: konvertera .lif-filerna till .ims-filer med hjälp av Imaris File Converter och öppna .ims-filerna i bildhanteringsprogrammet. Konvertera data till programvarans ursprungliga filformat möjliggör snabb filkonvertering och minimerar fel. - Dubbelklicka på den importerade filen för att öppna bilddatauppsättningen.
- Besök panelen Skärmjustering , klicka på kanalens namn. Det är vanligtvis märkt som rött i standardläge.
- I fönstret Bildegenskaper klickar du på fliken Mappad färg . I alternativet Färgtabellfil väljer du Brandflöde och klickar sedan på OK. Displayfärgen väljs normalt för att skilja bakgrundsfluorescensen och den positiva fluorescensen från provet.
- På skärmens övre vänstra sida i rutan Scen – Egenskaper klickar du på den blå ikonen märkt Lägg till ny yta. Avmarkera volymikonen som tar bort det mesta av bakgrundsfluorescensen och den positiva fluorescensen är tydligt synliga (se steg 6.4.2).
- Starta processen med manuell segmentering av intresseregion (ROI) genom att klicka på fliken Skapa och välja fliken Hoppa över automatisk generering, Redigera manuellt . I guiden för att skapa ytor manuellt klickar du på fliken Kontur för att välja orientering (XY, YZ eller XZ) baserat på exemplen för att enkelt konturera ROI. Här väljer vi XY-orientering.
- Kontrollera sedan att pekarmenyn i det högra hörnet är i Select-läge . Justera segmentpositionen för att hitta avkastningen i vävnaden. Du kommer att märka att det mesta av bakgrundsfluorescensen har tagits bort med distinkt positiv fluorescens som nämns i steg 6.4. Klicka på knappen Rita och rita en preliminär region av intresse. Välj alternativet Synlighet till ingen för att undvika störningar från andra områden än ROI.
- Upprepa steg 6.4.2. Segment för segment för att rita hela regionen av intresse.
- När ROI-ritningen är klar klickar du på Skapa yta för att få en 3D-geometri för avkastningen.
- Klicka på knappen Redigera i guiden för att skapa ytor manuellt och välj Maskera alla.
- I fönstret Maskera kanal väljer du Kanal 1 i kanalvalsalternativen. Välj sedan Duplicera kanal innan du applicerar masken. I maskinställningarna väljer du Konstant insida/ utsida och ställer in voxelytans utsida på 0.
- I rutan Scenegenskaper avmarkerar du ytobjektet och markerar volymobjektet. I Skärmjustering avmarkerar du den ursprungliga "Röda" kanalen och väljer kanalen Maskerad röd och justerar färgintensiteterna för att få önskad 3D-renderad och positivt märkt fluorescens-ROI.
- Skapa ett nytt dekorobjekt. Börja med att klicka på ikonen Lägg till på fläckar för att kvantifiera de 3D-renderade LRC: erna genom att skapa 3D-fläckar som jämförbart överlappar med 3D-renderade LRC: er. Använd de nedre pilarna för att flytta mellan stegen i guiden för att skapa fläckar.
- I guiden för att skapa platser kommer det att finnas fyra sekventiella steg med instruktioner för att skapa fläckar automatiskt med programvaran. Kontrollera att alternativet Segmentera endast en region av intresse är markerat i det första steget. Klicka på ikonen Nästa .
- I det andra steget kommer det att finnas en "XYZ 3D-låda". Justera XYZ-rutan för att täcka avkastningen. Klicka på ikonen Nästa .
- I det tredje steget, gå till Källkanal alternativ. Välj den maskerade röda kanalen; mata in den uppskattade XY-punktdiametern som är jämförbar med passformen och överlappa provets fluorescensprickar. Klicka på ikonen Nästa .
- I det fjärde steget lägger du till filtertypen "Kvalitet" och justerar tröskeln för lägre intensitet genom att flytta skjutfönstret över histogrammet "Kvalitet" tills majoriteten av identifierbara LRC: er är märkta.
OBS: Segmenteringen och därmed statistiska avläsningar (exempel: antal celler) beror mycket på tröskelvärdena för intensitet. Var noga med att exakt ange lämpliga tröskelvärden. - Klicka på knappen Slutför och välj knappen Statistik . Välj fliken Övergripande för att hitta värdet för det totala antalet fläckar i bilden.
- Exportera statistik genom att klicka på knappen Flik Visa till fil och få resultaten i en .xls fil.
- Använd ett lämpligt diagram för att presentera kvantifieringsresultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter EdU-märkning och PEGASOS vävnadsrensningsprocess (figur 2) erhölls den transparenta underkäken som visas i vår bild (figur 3B). Vi jämförde det modifierade provet med en normal underkäke utan vävnadsrensningsprocess (figur 3A). Den transparenta underkäken (figur 3B) med EdU-märkning utsattes för konfokal avbildning. Vi fokuserade på framkanten som visar stamcellsnischen som visas i (kompletterande figur 1). Den optiska sektionen av framtänderna visade LRC i stamcellsnischen på framtänderna i XY-planet (figur 4A). Vi rekonstruerade en 3D-bild av en framtand apex som visar EdU + etiketthållande vilande stamceller i både epitelial (grön) och mesenkymal (röd) stamcellsnisch (figur 4B). EdU + -celler överfördes till fläckar för kvantifiering som jämförbart överlappade med mesenkymala LRC (figur 4C). Figur 4D visar de fläckar som endast skapats för mesenkymala LRC. Figur 4E visar de fläckar som endast skapats för epiteliala LRC. Vi slutförde sedan kvantifieringen av epitel- och mesenkymala LRC (figur 4F).
Figur 1: EdU-injektionsprotokoll för märkning av LRC. Vildtypsmöss (WT) injicerades med EdU med början vid P5. Injektionerna varade i 7 dagar i följd fram till P11. Därefter genomgick mössen en jaktperiod på 6 veckor. Vi skördade dem på postnatal dag 53. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Arbetsflöde för protokollet. Möss injicerades med EdU i 7 dagar i följd och placerades sedan i en jaktperiod i 6 veckor. Mandiblarna skördades och fixerades efter transkardiell perfusion. Därefter avkalkades mandiblarna och utsattes för vävnadsrensningsstegen för avkalkning, avfärgning, helmonterad EdU-färgning, delipidering, dehydrering och brytningsindex (RI) matchning. Avbildningen av de rensade mandiblarna utfördes under ett konfokalmikroskop följt av dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bilder av en postnatal 53 dagar gammal WT-musunderkäke före vävnadsrensning (A) och efter vävnadsrensning (B). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: En optisk sektion av framtänderna som visar LRC i stamcellsnischen på framtänderna i XY-planet (A). En 3D-bildrekonstruktion av epitelial och mesenkymal LRC i musunderkäksframtänder mot toppen (B). Överlappande mesenkymala LRC (röd) med skapade 3D-fläckar (grå) (C). Fläckar skapade endast för mesenkymala LRC (D). Fläckar skapade endast för epitelial LRC (E). Kvantifieringsresultat för epitelial och mesenkymal LRC (F). Bar: 300 μm i A och 150 μm i B-E. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Beredning av EdU-märkningscocktail |
| Beredning av stamlösningar (vattenhaltiga) |
| TBS (10x) 1 M, pH 7,6 |
| CuSO 4 (100x),0,4 m |
| Sulfa-cyanin 3-azid (100x), 300 μM i DMSO |
| Natriumaskorbat (10x), 0,2 g / ml iH2O |
| PBST (0,1% Triton X-100 i PBS, v/v) |
| Beredning av EdU-märkningscocktail |
| Lägg till följande reagenser i ordning: |
| Trisbuffrad saltlösning (100 mM final, pH 7,6) |
| CuSO 4 (4 mM final) |
| Sulfacyanin 3azid (3 μM slutlig) |
| Natriumaskorbat (100 mM final, nygjord för varje användning) |
Tabell 1: Beredning av EdU-märkningscocktail
Kompletterande figur: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera doser av injektioner (BrdU, EdU) används vanligtvis på växande neonatala möss för att märka prolifererande celler så mycket som möjligt 1,6,13. Jaktperioden anses vara ett kritiskt steg när det gäller förnyelsehastigheten för vävnader 6,13. Mussnittet förnyar sig varje månad. Denna egenskap gör det möjligt för forskare att ställa in jaktperioden till 4 veckor eller längre 4,5,22. Vår 6-veckors jaktperiod kan märka stamcellerna i mesenkymala och epiteliala (labial och lingual cervical loop) fack. Detta område inkluderade några av stampopulationerna i TAC (transitförstärkande celler) från både epitel- och mesenkymala fack. En längre jaktperiod skulle vara önskvärd för att visa sanna etiketthållande celler som uteslutande finns i epitel- och mesenkymala stamcellsnischer.
Det finns flera kritiska steg i vävnadsbearbetnings- och clearingstadierna för detta protokoll. Den första anteckningen är för vävnadsperfusions- och fixeringssteget. Möss snedställningar innehåller massavävnader som har ett rikt utbud av blodkärl och innehåller en hög mängd blodvävnader. Således bör heparin PBS-perfusion startas så snart som möjligt efter att mössen är djupt bedövade och fasthållna. Anledningen är att undvika blodproppsbildning som leder till autofluorescens19. Försiktighet bör iakttas för att undvika överfixering med PFA, vilket kan leda till otillräcklig transparens och gulaktig missfärgning av vävnaden efter läktning. Överdriven missfärgning sänker signalkvaliteten i proverna under avbildning19. Det aktiva transkardiella perfusionssteget är att föredra framför passiv nedsänkningsfixering av organ/vävnader, vilket snabbt fixerar vävnaderna för att undvika förlust av endogen fluorescens i vävnadsrensningsstegen. Vid passiv fixering kan områdena djupare i vävnaden förbli mindre transparenta; Proverna kanske inte har tillfredsställande bildresultat19. Korrekt avlägsnande av muskler från mandiblarna möjliggör korrekt visualisering av strukturer som intresserar forskare. Vidare förhindrar effektivt avlägsnande autofluorescensstörningar från att påverka muskelvävnader. Korrekt avkalkning är oumbärlig vid rensning av hårdvävnad. Försiktighet bör iakttas för att på lämpligt sätt avkalka vävnader genom att justera EDTA-nedsänkningstiden enligt provernas storlek och mineralinnehåll. EDTA-koncentrationen är avgörande för att undvika överkrympning av vävnaderna. Därför bör koncentrationen väljas enligt proverna och experimenten i fråga16,19. På samma sätt är ett avfärgningssteg avgörande för att på ett adekvat sätt ta bort det återstående hemmet för att minska autofluorescensen. Otillräcklig de-lipideringstid kan resultera i mindre transparent vävnad och rekommenderas inte. I allmänhet kan de-lipidering för hårda vävnader såsom möss mandiblar göras från 4-6 h i 30% och 50% tB lösning och i 1 dag i 70% tB lösning20. Inkubationstiden beror på provets storlek och dess lipidinnehåll. Tiden kan förlängas för att säkerställa fullständig delipidering19,20. Enskilda laboratorier kan justera tidpunkten enligt deras krav utan att minska den minsta tid som krävs för de-lipidering.
Det vanligaste problemet i vävnadsrensningstekniker innebär otillräcklig transparens av vävnad orsakad av felaktig vävnadsbehandling och rensningssteg. Denna situation leder till svårigheter att få tydliga bilder, vilket hindrar korrekt visualisering av de fluorescerande märkta cellulära eller subcellulära strukturerna. Felsökning av otillräckligt transparenta vävnader bör göras genom att säkerställa att varje kritiskt steg görs korrekt. Denna praxis bör börja från vävnadsperfusion och fixeringssteg till vävnadsrensningsstegen. Egenskaperna hos varje vävnad eller organ är olika. Därför bör vävnadsbearbetnings- och rensningsstegen optimeras för att uppnå tillfredsställande clearingresultat19.
Avbildning av rensade vävnadsprover kan kompletteras med ett konfokalt laserskanningsmikroskop (CLSM) eller ett ljusplåtfluorescensmikroskop (LSFM) beroende på kraven och experimentell fråga och utrustningens tillgänglighet17. Vi använde CLSM för att avbilda underkäken, vilket ger högre upplösning vid högre förstoring men tar längre tid jämfört med LSFM17,20. När hög upplösning och högre förstoring inte är ett krav kan det snabba ljusplåtsfluorescensmikroskopet (LSFM) vara önskvärt19. LSFM är dyrt och kanske inte lätt tillgängligt för vanliga laboratorier. För konfokalmikroskopi är det avgörande att välja rätt objektivlinser med rätt numerisk bländare för bra bildbehandling19,20. För stora vävnadsprover kan lägre förstoringsmål såsom 10x med en liten numerisk bländare och ett större arbetsavstånd vara lämpliga19,21. För mindre vävnadsprover kan högre förstoringsmål som 20x med hög numerisk bländare och mindre arbetsavstånd vara önskvärt. Att använda en nedsänkningsolja med ett matchande brytningsindex till clearingmediet och en mållins är också avgörande för att undvika bildförvrängning och få klarhet17,19. För avbildning finns flera programsviter för bildbehandling och analys tillgängliga. Medan vissa av programvarusviterna är gratis, är andra dyra och kan vara överkomliga för enskilda laboratorier. Dessa bildplattformar genererar massiva filer (i gigabyte) som kräver avancerade datorarbetsstationer för datavisualisering och kvantifiering 17,20,21.
Även om det är snabbare och enklare att utföra än andra DNA-märkningsmetoder som BrdU, finns det begränsningar för att upptäcka LRC genom EdU-märkning in vivo jämfört med märkning av LRC med H2B-GFP-transgena möss. För det första är det svårt att skilja LRC av epitelial ursprung eller mesenkymalt ursprung. H2B-GFP-märkning kan användas i en vävnadsspecifik, promotordriven, tetracyklinaktivator som specifikt kan märka vilande stamceller i olika vävnader. När det gäller möss kan H2B-GFP-metoden specifikt märka stamcellerna från epitelet eller mesenkymet 4,22. De vävnadsrensnings- och 3D-bildkonstruktionsmetoder som beskrivs i detta protokoll gäller dock även för H2B-GFP-fluorescensmärkta LRC, vilket ger flexibilitet och en mängd olika alternativ. Vårt arbete möjliggör märkning och karakterisering av LRC enligt vetenskapliga behov. H2B-GFP-metoden kräver transgen produktion av möss och korsning med andra stammar, vilket är tidskrävande och dyrare än EdU-märkning. Den andra begränsningen med EdU-märkning med vävnadsrensningsmetoden är att proverna inte kan användas vidare för funktionsanalyser nedströms.
Detta protokoll är fördelaktigt för utredare som inte kräver vävnadsspecifik märkning och vill ha snabbare resultat från märkning av vilande stamceller. Denna metod kan modifieras för att användas för spårning av cellinjer; när den införlivas med Cre-driven fluorescensmärkning av stam- / stamceller får vår metod mer information om avkommans plats och mer exakt kvantifiering / bidrag23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Meghann K. Holt för redigeringen av manuskriptet. Denna studie stöddes av NIH / NIDCR-bidrag DE026461 och DE028345 och startfinansieringen från Texas A &M School of Dentistry till Dr. Xiaofang Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. eLife. 6, 24712 (2017).
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
- Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).
- Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
- Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. Label retaining cells and cutaneous stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).
- de Miguel-Gomez, L., et al. Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models. Cells. 10 (3), 595 (2021).
- Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling. Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).
- Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).
- Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview. The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).
- Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).
- Lin, G., et al. Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU. Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Challen, G. A., Goodell, M. A. Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells. PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).
- Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy. Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging. BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).
