Summary
Musen incisor inneholder verdifulle etikett-beholde celler i sin stamcelle nisje. Vi har en ny måte å objektivt oppdage og kvantifisere de etikettbeholdende cellene på; vår studie brukte EdU-merking og en 3D-rekonstruksjonstilnærming etter PEGASOS-vevsrydding av kjeven.
Abstract
Murine incisor er et organ som vokser kontinuerlig gjennom musens levetid. De epitel- og mesenkymale stamcellene som ligger i det proksimale vevet i fortennene, gir opphav til avkom som vil differensiere til ameloblaster, odontoblaster og massefibroblaster. Disse cellene er avgjørende for å støtte den vedvarende omsetningen av snittvev, noe som gjør murine incisor til en utmerket modell for å studere homeostase av voksne stamceller. Stamceller antas å inneholde langlivede hvilende celler som kan merkes av nukleotidanaloger som 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU). Cellene beholder denne etiketten over tid og kalles følgelig etikettbeholdende celler (LRC). Tilnærminger for visualisering av LRC in vivo gir et robust verktøy for overvåking av stamcellehomeostase. I denne studien beskrev vi en metode for å visualisere og analysere LRC. Vår innovative tilnærming har LRC-er i musefortenner etter vevsrydding og helmontert EdU-farging etterfulgt av konfokalmikroskopi og en 3-dimensjonal (3D) rekonstruksjon med bildebehandlingsprogramvaren. Denne metoden muliggjør 3D-bildeinnsamling og ikke-partisk kvantifisering sammenlignet med tradisjonell LRC-analyse på inndelte lysbilder.
Introduction
Den kontinuerlig voksende musesnittet er en utmerket modell for å studere voksne stamceller1. Epitelet (labial og lingual cervical loop) og mesenkymale stamceller (mellom labial og lingual cervical loop) som ligger på den proksimale siden av snittet, skiller seg ut i ameloblaster, odontoblaster og tannpulpceller. Denne unike prosessen gir en kilde til celler for kompensasjon av vevstap og omsetning2. Selv om flere stamcellemarkører som Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, etc. har blitt identifisert in vivo for undergrupper av voksne stamceller i musefortenner, er de utilstrekkelige til å representere stamcellepopulasjonene når de brukes alene 1,3,4,5. Visualisering av langlivede hvilende celler ved nukleotidanalog DNA-merking og retensjon kan gi objektiv deteksjon for de fleste undergrupper av voksne stamceller6. Videre er denne tilnærmingen nyttig blant mange stamcelleidentifikasjonsmetoder7 for å forstå celleadferd og homeostase av dental stamcellepopulasjoner 3,8. Mens de delende stamcellene ville miste DNA-merkingen etter en betydelig jakt, beholder de antatte hvilende stamcellene sin DNA-etikett, og anser dem som etikettbeholdende celler (LRC)6. DNA-merking og oppbevaring av ikke-delende stamceller vil markere og lokalisere de antatte voksne stamceller i sine nisjer.
I løpet av de siste årene har tymidinanalog 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU) merking erstattet den tungvinte, tidkrevende og høyoppløselige mikroskopien inkompatibel 3H-tymidin DNA-merkingsmetode for celleproliferasjonsanalyser 6,9. I de senere år har 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) merkingsteknikken blitt stadig mer brukt over BrdU. Dette mønsteret oppsto av flere grunner. For det første er BrdU-metoden langsom og arbeidskrevende. Brukerforholdene er varierende, og det er ikke i stand til å bevare ultrastrukturen i prøver (på grunn av DNA-denaturering). På samme måte mister BrdU-metoden cellens antigenisitet, noe som gjør den ineffektiv for nedstrøms funksjonelle analyser og analyser som samlokaliseringseksperimenter og in vivo stamcelletransplantasjon 3,7,9,10,11,12. BrdU er også et teratogen, som ikke er egnet for merking av LRC i embryonal utvikling6. BrdU-metoden er også ineffektiv når den brukes i helmonterte prøver. Ulempene er lav penetrasjon av antistoffer i den dype delen av prøvene eller kravet om en lang antistoffinkubasjonsperiode for dyp penetrasjon13. EdU-merking unnslipper trinnene til denaturerende prøver, og bevarer dermed ultrastrukturen. Denne funksjonen er fordelaktig for nedstrøms funksjonelle analyser som samlokaliseringseksperimenter og stamcelletransplantasjon11,12. EdU-merking er også svært følsom og rask; prøvepenetrasjonen er høy på grunn av bruk av raskt absorberte og mindre fluorescerende azider for påvisning av EdU-etiketter gjennom en Cu(I)-katalysert [3 + 2] cykloaddisjonsreaksjon ("klikk" kjemi)14.
En annen stadig mer anvendt DNA-merkingsmetode er bruken av konstruerte transgene mus. Disse musene uttrykker histon 2B grønt fluorescerende protein (H2B-GFP) kontrollert av et tetracyklin-responsivt regulatorelement 5,14. Etter å ha matet mus med tetracyklin chow / vann i en 4-ukers til 4-måneders jaktperiode, vil GFP-fluorescensen avta i sykkelceller, og bare LRC beholder fluorescensen6. Fordelen med denne metoden er at de merkede LRC-ene kan isoleres og forbli levedyktige for cellekultur eller nedstrøms funksjonelle analyser 6,7. Noen studier rapporterte unøyaktig merking av hvilende stamceller når de ble jaget for langvarig bruk. Dette resultatet skyldtes et lekkende bakgrunnsuttrykk fra H2B-GFP-stammen og ikke den passende tetracyklinregulerte responsen15.
Videre brukte de fleste litteratur tidligere LRC-deteksjonen hovedsakelig på seksjonerte lysbilder, som er todimensjonale og ofte feilaktig partisk når det gjelder å vise nøyaktig plassering og antall LRC-er. Tilnærmingen viste feil vinkler for seksjoner av komplekse vevsstrukturer16. Den andre metoden var å skaffe 3D-bilder fra serielle seksjoner og utføre rekonstruksjoner etter bildet. Disse trinnene var unøyaktige på grunn av bildeforvrengning fra variasjoner i hver serieseksjon på grunn av komprimerte eller strakte seksjoner, noe som resulterte i manglende informasjon16,17,18. Metoden var også arbeidskrevende og tidkrevende.
For å legge til rette for helmontert avbildning av LRC, må prøvene gjøres klare mens fluorescensen er godt vedlikeholdt. Nåværende vevsfjerningsteknikker kan klassifiseres i tre hovedkategorier: organiske løsningsmiddelbaserte vevsfjerningsteknikker, vandige reagensbaserte vevsrensingsteknikker og hydrogelbaserte vevsfjerningsteknikker17,19. Det polyetylenglykol (PEG)-assosierte løsningsmiddelsystemet (PEGASOS) er nylig utviklet. Denne tilnærmingen gjør nesten alle typer vev gjennomsiktige og bevarer endogen fluorescens, inkludert hardt vev som bein og tenner20. PEGASOS-metoden har fordeler i forhold til andre vevsfjerningsmetoder, spesielt når det gjelder å rydde tann- og beinmaterialer. De fleste andre metoder kunne bare delvis fjerne hardt vev, ha lang behandlingstid eller kreve kostbare reagenser21. PEGASOS-metoden kan også effektivt bevare endogen fluorescens over andre metoder.
Denne litteraturen førte oss til å skape en ny metode for cellestudier. Vi kombinerte LRC-deteksjonsfordelene ved EdU-merking med den mest overlegne 3D-helmonterte avbildningen av vevsklarerte prøver; prøvene ble behandlet med avansert polyetylenglykol (PEG)-assosiert løsningsmiddelsystem (PEGASOS) vevsclearing teknikk15. Gjennomsiktighet i hardt vev gjorde det mulig for oss å rekonstruere 3D-signalet til LRCs fluorescens in vivo uten å bryte tennene eller kjeven, noe som skaper en mer nøyaktig måte å visualisere og kvantifisere LRC på.
I denne studien gir vi en innovativ guide for å visualisere LRC i musesnittet. Vi laget en 3D-visuell tilnærming for å bestemme plasseringen og mengden av LRC-er i musens fortennende stamcellenisje. Dette prosjektet brukte EdU-merking, PEGASOS vevsryddingsteknikker og konfokalmikroskopi. Vår metode for EdU-merking av LRC-ene på helmontert vev og bruk av en ryddet og gjennomsiktig prøve overvinner både begrensningene i tradisjonelle seksjonerte lysbilder og andre ufordelaktige DNA-merkingsmetoder. Dermed vil vår teknikk være egnet for studier på stamcellehomeostase som krever LRC-deteksjon, spesielt på hardt vev. Protokollen kan være like fordelaktig for de som fokuserer på stamcellehomeostase i andre vev og organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) for Texas A &M University College of Dentistry.
1. Tilberedning av EdU-merkingscocktailen
- Forbered cocktaillagerløsningene som beskrevet i tabell 1.
- Forbered EdU-merkingscocktailen som beskrevet i tabell 1.
2. Fremstilling av musene og EdU-løsningen
- Forbered EdU-løsningen. Løs opp EdU i DMSO ved 20 mg/ml og oppbevares i -20 °C fryser.
FORSIKTIG: EdU er en mutagen. Brukere bør bruke egnet personlig verneutstyr (PPE) ved håndtering av dette stoffet. - Injiser 5 dager gamle C57BL/6J mus med den tilberedte EdU-oppløsningen intraperitonealt ved 3 μL/g kroppsvekt. Mus må motta løsningen en gang daglig i 7 påfølgende dager. Deretter gjennomgår de en jaktperiode i 6 uker før de høstes for analyse (figur 1).
FORSIKTIG: Vær forsiktig så du unngår nålestikk når du injiserer EdU i musene. Etter å ha injisert EdU i 7 påfølgende dager, plasser musene i et nytt bur. Etter at musene er i sitt nye hjem, kast sengetøyet i det gamle buret ved hjelp av passende biohazard-regler.
3. Prøvepreparering ved transkardial perfusjon (postnatal 53 dager gamle mus etter 6-ukers jaktperiode)
MERK: Museleveren skal bli blek etter vellykket trans-kardial perfusjon.
- Bedøv mus med en intraperitoneal injeksjon. De må gis en kombinasjon av xylazin og ketamin anestetika (Xylazin 10-12,5 mg / kg; Ketamin, 80-100 mg/kg kroppsvekt).
- Vent i ~ 10 min til musen ikke lenger reagerer på smertefulle stimuli (for eksempel pote klemme reflekser).
- Plasser musene i en liggende stilling stabilisert på Styrofoam-støtte med nåler i hver pote.
- Utsett brysthulen ved å åpne opp den overliggende huden ved hjelp av pinsett og dissekere saks.
- Klipp opp membranen med skarp saks. Pass på at du ikke stikker hull i hjertet.
- Skjær gjennom brystkassen, ta tak i bunnen av brystbenet med klemmesaks for å avsløre hjertet.
- Overfør musen til perfusjonstrinnet nær sirkulasjonspumpen i en avtrekkshette.
- Stikk 25 G kanylen (fra slangen fylt med fosfatbufret saltvann (PBS) / 4% paraformaldehyd (PFA) oppløsning) inn i toppunktet av venstre ventrikkel. Pass på å holde spissen av nålen i lumen i ventrikkelen.
FORSIKTIG: PFA er moderat giftig og et sannsynlig kreftfremkallende middel. Bruk personlig verneutstyr til å håndtere PFA og klargjøre løsningen under en kjemisk avtrekkshette. Avfall PFA krever forsvarlig deponering i henhold til institusjonens retningslinjer. - Klipp høyre ventrikkel med en skarp saks umiddelbart etter at nålen er satt inn i venstre ventrikkel. Dette trinnet gjør det mulig for blodet å strømme ut av musen og renne ned i oppsamlingsfatet.
- Perfus prøvene med 50 ml PBS-oppløsning med en strømningshastighet på 7 ml/min.
- Etter PBS-perfusjon, bytt stoppekran for å tillate en strømning på 20 ml 4 % PFA-oppløsning ved samme strømningshastighet på 5 ml/min.
- Mens sirkulasjonspumpen fortsatt er på, fjern nålen fra venstre ventrikkel.
MERK: Musen er nå festet for vevsoppsamling. For å bevare fluorescensen bør lyseksponering unngås når det er mulig gjennom hele protokollen. Mens vevet behandler, kan det 50 ml koniske røret med vevsprøvene dekkes med aluminiumsfolie.
4. Vevsrydding av kjeven ved hjelp av PEGASOS-teknikken
MERK: Et konisk rør på 15 ml eller 50 ml i henhold til volumet av vev kan brukes til å holde prøvene klare til behandling i hvert trinn. Prøvene behandles ved 37 °C shakere (~100 rpm) fra trinn 4,2 til 4,7. Bruk polypropylenbaserte plastbeholdere som er motstandsdyktige mot organiske løsemidler for å unngå å smelte plasten. Alternativt kan glass brukes.
FORSIKTIG: PEGASOS vevsfjerningsteknikk bruker giftige løsninger som Quadrol, polyetylenglykol (PEG), benzylbenzoat (BB), MMA500, etc. Passende PPE er nødvendig for å unngå potensielle eksponeringer.
- Dissekere mandibler og videre fikse prøver i 4% PFA. Oppbevar dem i romtemperatur over natten.
- Fjern musklene fra mandiblene og senk dem i 0,5 M EDTA-løsning (pH 8,0) for å avkalke i 4 dager. I løpet av denne perioden, utfør en daglig middels forandring på en 37 ° C shaker.
MERK: Det er ønskelig å fjerne musklene fra prøven så mye som mulig. Denne forholdsregelen vil forenkle bildebehandlingsprosessen og redusere autofluorescensen fra musklene. - Decolorize mandiblene med en 25% Quadrol løsning (v / v i H2O) på en 37 ° C shaker i en dag for å fjerne gjenværende blodheme.
- Komplett hele mount EdU farging.
- Forbered en fersk EdU-merkingscocktail i henhold til tabell 1.
MERK: EdU-merkingscocktailen må gjøres fersk hver gang med nytilberedt askorbatoppløsning tilsatt for å oppnå optimale EdU-merkingsresultater. - Skyll mandiblene med PBST i 30 min på en 37 °C shaker.
- Skyll mandiblene med PBS tre ganger i 3 min hver gang.
- Inkuber mandiblene i en nylaget EdU-merkingscocktail på en 37 °C shaker over natten.
- Skyll mandiblene med PBS tre ganger i 3 min hver gang.
- Forbered en fersk EdU-merkingscocktail i henhold til tabell 1.
- Utfør seriell delipidering i hver av følgende oppløsninger i 6 timer ved 37 °C:
30% tert-butanol (tB) løsning: 75% v / v H2O, 22% v / v tB og 3% v / v Quadrol.
50 % tB løsning: 50 % v/vH2O, 47 % v/v tB og 3 % v/v Quadrol.
70 % tB løsning: 30 % v/vH2O, 67 % v/v tB og 3 % v/v Quadrol
MERK: De-lipideringstrinnet er kritisk. De-lipidering kan gjøres mellom 4-6 timer i 30% og 50% tB løsning og i 1 dag i 70% tB løsning. - Dehydrer mandiblene i tB-PEG-oppløsning i 2 dager med følgende daglige mediumendring: 75 % tB, 22 % v/v polyetylenglykolmetyletermetakrylat gjennomsnittlig MMA500 og 3 % v/v Quadrol ved 37 °C.
- Fjern kjeven i benzylbenzoat (BB)-PEG-clearingmedium for å oppnå samsvar mellom brytningsindeks: 75 % v/v BB, 22 % v/v PEG-MMA500 og 3 % Quadrol inntil transparens oppnås.
MERK: Vi har informasjon om matching av brytningsindeks. De uorganiske og organiske komponentene i vev som vann, lipider, proteiner, mineraler, organeller, etc. har en annen brytningsindeks (RI) i området 1,33 til 1,55. Denne RI-feilpasningen mellom vevskomponentene hindrer avbildningsprosessen. Transparens kan oppnås ved å eliminere RI-misforhold i vevet. Det anbefales å senke de vevsryddede prøvene i clearingmediet for BB-PEG. Dette trinnet vil gi den ensartede interne RI på ~ 1,54 (kalt RI-matching) til hele prøven, noe som letter bildeprosessen. - Bevar mandiblene i BB-PEG-vevsryddemediet ved romtemperatur for lagring og avbildning.
MERK: Det er godt å fullføre bildebehandlingen så snart som mulig for å unngå gradvis tap av fluorescerende reportere. PEGASOS-metoden vil imidlertid holde fluorescensreportere godt bevart selv etter flere ukers lagring20,21. For langtidslagring kan prøvene også oppbevares ved 4 °C.
5. Konfokal avbildning av vevsryddet mandibel
- Monter vevet ryddet hele mandibelen på merkehulrom i BB-PEG-ryddemediet og deksel med glassdekselglass. Unngå bobler.
- Utfør bildeopptak med et egnet laserskanning konfokalmikroskop. Velg Hent , og angi parameterne for bildeopptak med 512 x 512 pikslers oppløsning og 400 Hz anskaffelseshastighet. Disse innstillingene finnes i oppkjøpsmodusmenyen til programvaren som styrer mikroskopet.
- I panelet for fluorescerende eksitasjon, aktiver laseren som kreves (TRITC) for å eksitere fluoroforer optimalt (sonden vi brukte til LRC-visualisering har fluorescerende egenskaper som Cy3 med eksitasjon ved 548 nm og utslipp ved 563 nm laserbølgelengde).
- I panelet for fluorescerende deteksjon, flytt glidebryteren for å velge bølgelengdene som skal måles (for eksempel mellom 555 og 625 nm for en Cy3-lignende fluorofor).
- Plasser den monterte kjeven på mikroskopstadiet for å visualisere og finne prøven ved hjelp av hvitt lys og et lavere forstørrelsesmål (2-10x).
- Legg til en dråpe nedsenkningsolje med en brytningsindeks på 1,52 på toppen av dekselet for å matche brytningsindeksen til glassdekselet og objektivet.
MERK: Tilpass brytningsindeksen for mål, bildemedier og vev så nært som mulig for å minimere innføringen av optiske forvrengninger under bildeopptak. - Slå på lysrørene, og velg et passende forstørrelsesmål for å vise interessante områder. Vi brukte et 20x objektivobjektiv med en numerisk blenderåpning på 0,9 med en arbeidsavstand på 1,95 mm. En lengre arbeidsavstandslinse kan være nødvendig når du avbilder større vevsprøver i konfokalmikroskopet. Alternativt kan avbildning gjøres enkelt ved hjelp av et lysarkmikroskop for større vevsprøver.
- På konfokal bildebehandlingsprogramvaren trykker du på Live-knappen for å starte live-scan-modus. Hvis du vil maksimere det dynamiske området til bildene og unngå bildepunktmetning, justerer du forsterkningen og laserintensiteten for den valgte kanalen.
- Identifiser synsfeltet for å visualisere hele regionen av mandibelen i X- og Y-dimensjonene. Sett de øvre og nedre Z-trinns oppkjøpsparametrene som nøyaktig dekker volumet av stamcellenisjen i mussnittet. Bruk en Z-trinnstørrelse på 2 μm eller i henhold til dine krav. De nyere versjonene av konfokalmikroskoper skal automatisk kunne skaffe seg z-stabler av de forskjellige overlappende regionene.
- Skaff og lagre Z-stack-bildefiler i LIF-format.
MERK: LIF-fluene kan konverteres til .tiff filer og brukes til annen 3D-analyseprogramvare.
6. Bildebehandling, rekonstruksjon av 3D-bilder og kvantifisering av etikettbeholdende celler ved å lage en overflate, segmentering av interesseområdet (ROI), maskere avkastningen og lage flekker
MERK: Vi brukte Imaris (Bitplane 9.0.1) for bildebehandling og 3D-rekonstruksjon, men lignende bildebehandlingstrinn kan utføres ved hjelp av andre programvarepakker (f.eks. ImageJ / Fiji, 3D slicer, Avizo, Arivis, Amira, etc.).
- I bildebehandlingsprogramvaren klikker du på Arena-knappen og velger deretter Bilde. Velg den originale .lif-filen og velg sammenslått fil, bildene blir importert til bildebehandlingsprogramvaren.
MERK: Alternativt kan du bruke en bildebehandlingsprogramvarefilkonverterer til å konvertere Z-stakkbildefilen til den opprinnelige formatfiltypen for programvaren. For eksempel: konvertere .lif filer til .ims-filer ved hjelp av Imaris File Converter og åpne .ims-filer i bildebehandling. Konvertering av data til det opprinnelige filformatet til programvaren vil tillate rask filkonvertering og minimere feil. - Dobbeltklikk på den importerte filen for å åpne bildedatasettet.
- Gå til skjermjusteringspanelet , klikk på navnet på kanalen. Det er vanligvis merket som rødt i standardmodus.
- I vinduet Bildeegenskaper klikker du på kategorien Kartlagt farge . I alternativet Fargetabellfil velger du Fire Flow, og klikker deretter på OK. Skjermfargen velges normalt for å skille bakgrunnsfluorescensen og den positive fluorescensen fra prøven.
- Øverst til venstre på skjermen i ruten Scene – Egenskaper klikker du på det blå ikonet merket Legg til ny overflate. Fjern merket for volumikonet som vil fjerne det meste av bakgrunnsfluorescensen og den positive fluorescensen er tydelig synlig (se trinn 6.4.2).
- Start prosessen med manuell segmentering av interesseregion (ROI) ved å klikke på Opprett-fanen og velge kategorien Hopp over automatisk oppretting, rediger manuelt . I veiviseren for manuell overflateoppretting klikker du på kategorien Kontur for å velge retning (XY, YZ eller XZ) basert på prøvene for enkelt å konturere avkastningen. Her velger vi XY-orientering.
- Deretter må du kontrollere at pekermenyen i høyre hjørne er i valgmodus . Juster stykkeposisjonen for å finne avkastningen i vevet. Du vil legge merke til at det meste av bakgrunnsfluorescensen er fjernet med tydelig positiv fluorescens som nevnt i trinn 6.4. Klikk på Tegn-knappen og tegn et foreløpig interesseområde. Velg alternativet Synlighet til ingen for å unngå forstyrrelser fra andre områder enn ROI.
- Gjenta trinn 6.4.2. Del for stykke for å tegne hele interesseområdet.
- Etter at ROI-tegningen er ferdig, klikker du på Opprett overflate for å få en 3D-geometri av avkastningen.
- Klikk på Rediger-knappen i veiviseren for manuell overflateoppretting og velg Masker alle.
- I vinduet Mask Channel (maskekanal ) velger du Kanal 1 i alternativene for kanalvalg. Etterpå velger du Dupliser kanal før du bruker masken. I maskeinnstillingene velger du Konstant innvendig/utvendig og setter voxelens utvendige overflate til 0.
- I ruten Sceneegenskaper fjerner du merket for Overflateobjekt og velger Volum-objektet. I skjermjusteringen fjerner du merket for den opprinnelige "Røde" kanalen og velger den maskerte røde kanalen og justerer fargeintensitetene for å få ønsket 3D-gjengitt og positivt merket fluorescensavkastning.
- Opprett et nytt spotobjekt. Begynn med å klikke på Legg til spots-ikonet for å kvantifisere de 3D-gjengitte LRC-ene ved å opprette 3D-punkter som sammenlignbart overlapper med 3D-gjengitte LRC-er. Bruk de nederste pilene til å flytte mellom trinnene i veiviseren for oppretting av punkt.
- I veiviseren for oppretting av flekker vil det være fire sekvensielle trinn med instruksjoner for å opprette flekker automatisk med programvaren. Kontroller at alternativet Segmenter bare et interesseområde er valgt i det første trinnet. Klikk på Neste-ikonet .
- I det andre trinnet vil det være en "XYZ 3D-boks". Juster XYZ-boksen for å dekke avkastningen. Klikk på Neste-ikonet .
- I det tredje trinnet går du til alternativene for kildekanal . Velg den maskerte røde kanalen; angi den estimerte XY-punktdiameteren som kan sammenlignes med å tilpasse og overlappe fluorescenspunktene i prøven. Klikk på Neste-ikonet .
- I det fjerde trinnet legger du til filtertypen "Kvalitet" og justerer terskelen for lavere intensitet ved å flytte skyvevinduet over "Kvalitet"-histogrammet til flertallet av identifiserbare LRC-er er merket.
MERK: Segmenteringen og derfor statistiske avlesninger (eksempel: antall celler) avhenger i stor grad av intensitetsterskelverdiene. Vær nøye med å angi de riktige terskelverdiene nøyaktig. - Klikk på Fullfør-knappen og velg Statistikk-knappen . Velg kategorien Generelt for å finne verdien for totalt antall flekker i bildet.
- Eksporter statistikk ved å klikke på Tab Vis til fil-knappen og motta resultatene i en .xls-fil.
- Bruk et egnet diagram for å presentere kvantifiseringsresultatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter EdU-merking og PEGASOS-vevsclearingprosessen (figur 2) ble den gjennomsiktige kjeven oppnådd som vist på vårt bilde (figur 3B). Vi sammenliknet den modifiserte prøven med en normal kjeve uten vevsryddingsprosess (figur 3A). Den gjennomsiktige kjeven (figur 3B) med EdU-merking ble utsatt for konfokal avbildning. Vi fokuserte på fortennspissen som viser stamcellenisjen som vist i (tilleggsfigur 1). Den optiske delen av fortennen viste LRC i stamcellenisjen i fortennspissen i XY-planet (figur 4A). Vi rekonstruerte et 3D-bilde av en fortennspiss som viser EdU + etikettbeholdende hvilende stamceller i både epitel (grønn) og mesenkymal (rød) stamcellenisje (figur 4B). EdU + -celler ble overført til flekker for kvantifisering som sammenlignbart overlappet med mesenkymale LRC (figur 4C). Figur 4D viser flekkene som bare er opprettet for mesenkymale LRC. Figur 4E viser flekkene som bare er opprettet for epitelial LRC. Deretter fullførte vi kvantifiseringen av epitel- og mesenkymale LRC-er (figur 4F).
Figur 1: EdU-injeksjonsprotokoll for å merke LRC. Villtype (WT) mus ble injisert med EdU fra P5. Injeksjonene varte i 7 sammenhengende dager til P11. Deretter gjennomgikk musene en jaktperiode på 6 uker. Vi høstet dem på barseldagen 53. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsflyt for protokollen. Mus ble injisert med EdU i 7 påfølgende dager, og deretter plassert i en jaktperiode i 6 uker. Mandiblene ble høstet og fikset etter trans-kardial perfusjon. Deretter ble mandiblene avkalket og utsatt for vevsryddingstrinnene for avkalkning, avfarging, helmontert EdU-farging, delipidering, dehydrering og brytningsindeks (RI) matching. Avbildningen av de ryddede mandiblene ble utført under et konfokalmikroskop etterfulgt av dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bilder av en postnatal 53 dager gammel WT-musemandible før vevsutskillelse (A) og etter vevsfjerning (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Et optisk snitt av fortennen som viser LRC i stamcellenisjen til fortennspissen i XY-planet (A). En 3D-bilderekonstruksjon av epitel- og mesenkymale LRC-er i mandibulære fortenner mot toppunktet (B). Overlappende mesenkymale LRC-er (rød) med opprettede 3D-flekker (grå) (C). Flekker opprettet bare for mesenkymale LRC (D). Flekker opprettet bare for epitelial LRC (E). Kvantifiseringsresultater for epitel- og mesenkymale LRC (F). Bar: 300 μm i A og 150 μm i B-E. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tilberedning av EdU Labeling Cocktail |
| Fremstilling av stamløsninger (vandig) |
| TBS (10x) 1 M, pH 7,6 |
| CuSO 4 (100x),0,4 m |
| Sulfa-cyanin 3 azid (100x), 300 μM i DMSO |
| Natriumaskorbat (10x), 0,2 g/ml ved H2O |
| PBST (0,1 % Triton X-100 i PBS, v/v) |
| Tilberedning av EdU Labeling Cocktail |
| Legg til følgende reagenser i rekkefølge: |
| Tris-bufret saltvann (100 mM final, pH 7,6) |
| CuSO 4 (4 mM finalen) |
| Sulfa-cyanin 3 azid (3 μM finale) |
| Natriumaskorbat (100 mM endelig, nylaget til eget bruk) |
Tabell 1: Tilberedning av EdU-merkingscocktailen
Tilleggsfigur: Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere doser injeksjoner (BrdU, EdU) brukes vanligvis på voksende nyfødte mus for å merke prolifererende celler så mye som mulig 1,6,13. Jaktperioden regnes som et kritisk skritt med hensyn til fornyelseshastigheten for vev 6,13. Musesnittet fornyer seg rundt hver måned. Denne egenskapen gjør det mulig for forskere å sette jaktperioden til 4 uker eller lenger 4,5,22. Vår 6-ukers jaktperiode kunne merke stamceller i mesenkymale og epiteliale (labial og lingual cervical loop) rom. Dette området inkluderte noen av stampopulasjonene i TACs (Transit-Amplifying Cells) fra både epitel- og mesenkymale rom. En lengre jaktperiode ville være ønskelig for å vise ekte etikettbeholdende celler som utelukkende ligger i epitel- og mesenkymale stamcellenisjer.
Det er flere kritiske trinn i vevsbehandlings- og clearingstadiene for denne protokollen. Det første notatet er for vevsperfusjons- og fikseringstrinnet. Mus snitt inneholder massevev som har en rik tilførsel av blodkar og inneholder en høy mengde blodvev. Dermed bør heparin PBS-perfusjonen startes så snart som mulig etter at musene er dypt bedøvet og begrenset. Årsaken er å unngå blodproppdannelse som fører til autofluorescens19. Forsiktighet bør utvises for å unngå overfiksering med PFA, noe som kan føre til utilstrekkelig gjennomsiktighet og gulaktig misfarging av vevet etter rydding. Overdreven misfarging senker signalkvaliteten i prøvene under avbildning19. Det aktive transkardiale perfusjonstrinnet foretrekkes fremfor passiv nedsenkningsfiksering av organer/vev, noe som raskt vil korrigere vevet for å unngå tap av endogen fluorescens i vevsfjerningstrinnene. Ved passiv fiksering kan områdene dypere i vevet forbli mindre gjennomsiktige; Prøvene kan ikke ha tilfredsstillende bildebehandlingsresultater19. Riktig fjerning av muskler fra mandiblene muliggjør riktig visualisering av strukturer som interesserer forskere. Videre forhindrer effektiv fjerning autofluorescensforstyrrelser fra å påvirke muskelvev. Riktig avkalkning er uunnværlig ved rydding av hardt vev. Det bør utvises forsiktighet for å avkalke vev tilstrekkelig ved å justere EDTA-nedsenkingstiden i henhold til prøvenes størrelse og mineralinnhold. EDTA-konsentrasjon er avgjørende for å unngå overkrymping av vevet. Derfor bør konsentrasjonen velges i henhold til prøvene og forsøkene i spørsmålet16,19. På samme måte er et avfargingstrinn avgjørende for å tilstrekkelig fjerne gjenværende heme for å redusere autofluorescens. Utilstrekkelig de-lipideringstid kan resultere i mindre gjennomsiktig vev og anbefales ikke. Generelt kan de-lipidering for hardt vev som musmandibler gjøres fra 4-6 timer i 30% og 50% tB løsning og i 1 dag i 70% tB løsning20. Inkubasjonstiden avhenger av størrelsen på prøven og dens lipidinnhold. Tiden kan forlenges for å sikre fullstendig delipidering 19,20. Individuelle laboratorier kan justere timingen i henhold til deres krav uten å redusere minimumstiden som kreves for de-lipidering.
Det vanligste problemet i vevsryddingsteknikker innebærer utilstrekkelig gjennomsiktighet av vev forårsaket av feil vevsbehandling og ryddingstrinn. Denne situasjonen fører til vanskeligheter med å skaffe klare bilder, noe som hindrer riktig visualisering av fluorescerende merkede cellulære eller subcellulære strukturer. Feilsøking av utilstrekkelig gjennomsiktig vev bør gjøres ved å sikre at hvert kritisk trinn er gjort riktig. Denne praksisen bør starte fra vevsperfusjon og fikseringstrinn til vevsryddingstrinnene. Egenskapene til hvert vev eller organ er forskjellige. Derfor bør vevsbehandlings- og clearingtrinnene optimaliseres for å oppnå tilfredsstillende clearingresultater19.
Avbildningen av ryddede vevsprøver kan fullføres med et konfokal laserskanningsmikroskop (CLSM) eller et lysarkfluorescensmikroskop (LSFM), avhengig av kravene og eksperimentelle spørsmål og tilgjengelighet av utstyret17. Vi brukte CLSM til avbildning av kjeven, noe som gir høyere oppløsning ved høyere forstørrelse, men tar lengre tid sammenlignet med LSFM17,20. Når høy oppløsning og høyere forstørrelse ikke er et krav, kan hurtiglysarkfluorescensmikroskopet (LSFM) være ønskelig19. LSFM er dyrt og kan ikke være lett tilgjengelig for vanlige laboratorier. For konfokalmikroskopi er valg av riktige objektivlinser med riktig numerisk blenderåpning avgjørende for god avbildning19,20. For store vevsprøver kan lavere forstørrelsesmål som 10x med liten numerisk blenderåpning og større arbeidsavstand være hensiktsmessig19,21. For mindre vevsprøver kan høyere forstørrelsesmål som 20x med høy numerisk blenderåpning og mindre arbeidsavstand være ønskelig. Bruk av en nedsenkningsolje med en matchende brytningsindeks til clearingmediet og et objektivobjektiv er også avgjørende for å unngå bildeforvrengning og få klarhet17,19. For bildebehandling er flere programvarepakker for bildebehandling og analyse tilgjengelige. Mens noen av programvarepakkene er gratis, er andre dyre og kan være uoverkommelige for individuelle laboratorier. Disse bildebehandlingsplattformene genererer massive filer (i gigabyte) som krever avanserte arbeidsstasjoner for datavisualisering og kvantifisering 17,20,21.
Selv om det er raskere og enklere å utføre enn andre DNA-merkingsmetoder som BrdU, er det begrensninger for å oppdage LRC gjennom EdU-merking in vivo sammenlignet med merking av LRC med H2B-GFP transgene mus. For det første er det vanskelig å skille LRCene av epitelopprinnelsen eller mesenkymal opprinnelse. H2B-GFP-merking kan brukes i en vevsspesifikk, promotordrevet, tetracyklinaktivator som spesifikt kan merke de hvilende stamceller i forskjellige vev. Når det gjelder musfortenner, kan H2B-GFP-metoden spesifikt merke stamceller fra epitelet eller mesenkymet 4,22. Imidlertid gjelder vevsclearing og 3D-bildekonstruksjonsmetodene beskrevet i denne protokollen også for H2B-GFP-fluorescensmerkede LRC-er, noe som gir fleksibilitet og en rekke alternativer. Vårt arbeid muliggjør merking og karakterisering av LRC i henhold til vitenskapelige behov. H2B-GFP-metoden krever transgen musproduksjon og kryssavl med andre stammer, noe som er tidkrevende og dyrere enn EdU-merking. Den andre begrensningen ved EdU-merking med vevsclearingmetoden er at prøvene ikke kan brukes videre til nedstrøms funksjonelle analyser.
Denne protokollen er fordelaktig for etterforskere som ikke krever vevsspesifikk merking og ønsker raskere resultater fra merking av hvilende stamceller. Denne metoden kan modifiseres for å brukes til sporing av celleavstamning; når den inkorporeres med Cre-drevet fluorescensmerking av stam-/stamceller, får vår metode flere detaljer om avkoms lokalisering og mer nøyaktig kvantifisering/bidrag23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Meghann K. Holt for redigering av manuskriptet. Denne studien ble støttet av NIH / NIDCR-tilskudd DE026461 og DE028345 og oppstartsfinansieringen fra Texas A &M School of Dentistry til Dr. Xiaofang Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. eLife. 6, 24712 (2017).
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
- Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).
- Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
- Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. Label retaining cells and cutaneous stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).
- de Miguel-Gomez, L., et al. Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models. Cells. 10 (3), 595 (2021).
- Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling. Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).
- Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).
- Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview. The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).
- Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).
- Lin, G., et al. Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU. Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Challen, G. A., Goodell, M. A. Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells. PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).
- Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy. Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging. BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).
