Musen incisor inneholder verdifulle etikett-beholde celler i sin stamcelle nisje. Vi har en ny måte å objektivt oppdage og kvantifisere de etikettbeholdende cellene på; vår studie brukte EdU-merking og en 3D-rekonstruksjonstilnærming etter PEGASOS-vevsrydding av kjeven.
Murine incisor er et organ som vokser kontinuerlig gjennom musens levetid. De epitel- og mesenkymale stamcellene som ligger i det proksimale vevet i fortennene, gir opphav til avkom som vil differensiere til ameloblaster, odontoblaster og massefibroblaster. Disse cellene er avgjørende for å støtte den vedvarende omsetningen av snittvev, noe som gjør murine incisor til en utmerket modell for å studere homeostase av voksne stamceller. Stamceller antas å inneholde langlivede hvilende celler som kan merkes av nukleotidanaloger som 5-etynyl-2′-deoksyuridin (EdU). Cellene beholder denne etiketten over tid og kalles følgelig etikettbeholdende celler (LRC). Tilnærminger for visualisering av LRC in vivo gir et robust verktøy for overvåking av stamcellehomeostase. I denne studien beskrev vi en metode for å visualisere og analysere LRC. Vår innovative tilnærming har LRC-er i musefortenner etter vevsrydding og helmontert EdU-farging etterfulgt av konfokalmikroskopi og en 3-dimensjonal (3D) rekonstruksjon med bildebehandlingsprogramvaren. Denne metoden muliggjør 3D-bildeinnsamling og ikke-partisk kvantifisering sammenlignet med tradisjonell LRC-analyse på inndelte lysbilder.
Den kontinuerlig voksende musesnittet er en utmerket modell for å studere voksne stamceller1. Epitelet (labial og lingual cervical loop) og mesenkymale stamceller (mellom labial og lingual cervical loop) som ligger på den proksimale siden av snittet, skiller seg ut i ameloblaster, odontoblaster og tannpulpceller. Denne unike prosessen gir en kilde til celler for kompensasjon av vevstap og omsetning2. Selv om flere stamcellemarkører som Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, etc. har blitt identifisert in vivo for undergrupper av voksne stamceller i musefortenner, er de utilstrekkelige til å representere stamcellepopulasjonene når de brukes alene 1,3,4,5. Visualisering av langlivede hvilende celler ved nukleotidanalog DNA-merking og retensjon kan gi objektiv deteksjon for de fleste undergrupper av voksne stamceller6. Videre er denne tilnærmingen nyttig blant mange stamcelleidentifikasjonsmetoder7 for å forstå celleadferd og homeostase av dental stamcellepopulasjoner 3,8. Mens de delende stamcellene ville miste DNA-merkingen etter en betydelig jakt, beholder de antatte hvilende stamcellene sin DNA-etikett, og anser dem som etikettbeholdende celler (LRC)6. DNA-merking og oppbevaring av ikke-delende stamceller vil markere og lokalisere de antatte voksne stamceller i sine nisjer.
I løpet av de siste årene har tymidinanalog 5-brom-2′-deoksyuridin (BrdU) merking erstattet den tungvinte, tidkrevende og høyoppløselige mikroskopien inkompatibel 3H-tymidin DNA-merkingsmetode for celleproliferasjonsanalyser 6,9. I de senere år har 5-etynyl-2′-deoksyuridin (EdU) merkingsteknikken blitt stadig mer brukt over BrdU. Dette mønsteret oppsto av flere grunner. For det første er BrdU-metoden langsom og arbeidskrevende. Brukerforholdene er varierende, og det er ikke i stand til å bevare ultrastrukturen i prøver (på grunn av DNA-denaturering). På samme måte mister BrdU-metoden cellens antigenisitet, noe som gjør den ineffektiv for nedstrøms funksjonelle analyser og analyser som samlokaliseringseksperimenter og in vivo stamcelletransplantasjon 3,7,9,10,11,12. BrdU er også et teratogen, som ikke er egnet for merking av LRC i embryonal utvikling6. BrdU-metoden er også ineffektiv når den brukes i helmonterte prøver. Ulempene er lav penetrasjon av antistoffer i den dype delen av prøvene eller kravet om en lang antistoffinkubasjonsperiode for dyp penetrasjon13. EdU-merking unnslipper trinnene til denaturerende prøver, og bevarer dermed ultrastrukturen. Denne funksjonen er fordelaktig for nedstrøms funksjonelle analyser som samlokaliseringseksperimenter og stamcelletransplantasjon11,12. EdU-merking er også svært følsom og rask; prøvepenetrasjonen er høy på grunn av bruk av raskt absorberte og mindre fluorescerende azider for påvisning av EdU-etiketter gjennom en Cu(I)-katalysert [3 + 2] cykloaddisjonsreaksjon (“klikk” kjemi)14.
En annen stadig mer anvendt DNA-merkingsmetode er bruken av konstruerte transgene mus. Disse musene uttrykker histon 2B grønt fluorescerende protein (H2B-GFP) kontrollert av et tetracyklin-responsivt regulatorelement 5,14. Etter å ha matet mus med tetracyklin chow / vann i en 4-ukers til 4-måneders jaktperiode, vil GFP-fluorescensen avta i sykkelceller, og bare LRC beholder fluorescensen6. Fordelen med denne metoden er at de merkede LRC-ene kan isoleres og forbli levedyktige for cellekultur eller nedstrøms funksjonelle analyser 6,7. Noen studier rapporterte unøyaktig merking av hvilende stamceller når de ble jaget for langvarig bruk. Dette resultatet skyldtes et lekkende bakgrunnsuttrykk fra H2B-GFP-stammen og ikke den passende tetracyklinregulerte responsen15.
Videre brukte de fleste litteratur tidligere LRC-deteksjonen hovedsakelig på seksjonerte lysbilder, som er todimensjonale og ofte feilaktig partisk når det gjelder å vise nøyaktig plassering og antall LRC-er. Tilnærmingen viste feil vinkler for seksjoner av komplekse vevsstrukturer16. Den andre metoden var å skaffe 3D-bilder fra serielle seksjoner og utføre rekonstruksjoner etter bildet. Disse trinnene var unøyaktige på grunn av bildeforvrengning fra variasjoner i hver serieseksjon på grunn av komprimerte eller strakte seksjoner, noe som resulterte i manglende informasjon16,17,18. Metoden var også arbeidskrevende og tidkrevende.
For å legge til rette for helmontert avbildning av LRC, må prøvene gjøres klare mens fluorescensen er godt vedlikeholdt. Nåværende vevsfjerningsteknikker kan klassifiseres i tre hovedkategorier: organiske løsningsmiddelbaserte vevsfjerningsteknikker, vandige reagensbaserte vevsrensingsteknikker og hydrogelbaserte vevsfjerningsteknikker17,19. Det polyetylenglykol (PEG)-assosierte løsningsmiddelsystemet (PEGASOS) er nylig utviklet. Denne tilnærmingen gjør nesten alle typer vev gjennomsiktige og bevarer endogen fluorescens, inkludert hardt vev som bein og tenner20. PEGASOS-metoden har fordeler i forhold til andre vevsfjerningsmetoder, spesielt når det gjelder å rydde tann- og beinmaterialer. De fleste andre metoder kunne bare delvis fjerne hardt vev, ha lang behandlingstid eller kreve kostbare reagenser21. PEGASOS-metoden kan også effektivt bevare endogen fluorescens over andre metoder.
Denne litteraturen førte oss til å skape en ny metode for cellestudier. Vi kombinerte LRC-deteksjonsfordelene ved EdU-merking med den mest overlegne 3D-helmonterte avbildningen av vevsklarerte prøver; prøvene ble behandlet med avansert polyetylenglykol (PEG)-assosiert løsningsmiddelsystem (PEGASOS) vevsclearing teknikk15. Gjennomsiktighet i hardt vev gjorde det mulig for oss å rekonstruere 3D-signalet til LRCs fluorescens in vivo uten å bryte tennene eller kjeven, noe som skaper en mer nøyaktig måte å visualisere og kvantifisere LRC på.
I denne studien gir vi en innovativ guide for å visualisere LRC i musesnittet. Vi laget en 3D-visuell tilnærming for å bestemme plasseringen og mengden av LRC-er i musens fortennende stamcellenisje. Dette prosjektet brukte EdU-merking, PEGASOS vevsryddingsteknikker og konfokalmikroskopi. Vår metode for EdU-merking av LRC-ene på helmontert vev og bruk av en ryddet og gjennomsiktig prøve overvinner både begrensningene i tradisjonelle seksjonerte lysbilder og andre ufordelaktige DNA-merkingsmetoder. Dermed vil vår teknikk være egnet for studier på stamcellehomeostase som krever LRC-deteksjon, spesielt på hardt vev. Protokollen kan være like fordelaktig for de som fokuserer på stamcellehomeostase i andre vev og organer.
Flere doser injeksjoner (BrdU, EdU) brukes vanligvis på voksende nyfødte mus for å merke prolifererende celler så mye som mulig 1,6,13. Jaktperioden regnes som et kritisk skritt med hensyn til fornyelseshastigheten for vev 6,13. Musesnittet fornyer seg rundt hver måned. Denne egenskapen gjør det mulig for forskere å sette jaktperioden til 4 uker eller lenger <sup …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Meghann K. Holt for redigering av manuskriptet. Denne studien ble støttet av NIH / NIDCR-tilskudd DE026461 og DE028345 og oppstartsfinansieringen fra Texas A &M School of Dentistry til Dr. Xiaofang Wang.
0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
EdU | Carboynth | NE08701 | |
Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
Imaging System | Olympus | DP27 | |
LAS X Software | Leica | ||
Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |