Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

تصنيع رقاقة ذات نقوش دقيقة بسماكة يتم التحكم فيها للفحص المجهري الإلكتروني المبرد عالي الإنتاجية

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63739
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,4, 3,4,5,6
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

Summary

يتم تصنيع رقاقة صغيرة منقوشة تم تطويرها حديثا مع نوافذ أكسيد الجرافين من خلال تطبيق تقنيات النظام الكهروميكانيكي الدقيق ، مما يتيح التصوير المجهري الإلكتروني المبرد الفعال وعالي الإنتاجية لمختلف الجزيئات الحيوية والمواد النانوية.

Abstract

أحد القيود الرئيسية على تحليل بنية الجزيئات الحيوية بكفاءة وإنتاجية عالية باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) هو صعوبة إعداد عينات cryo-EM بسماكة جليد خاضعة للرقابة على المستوى النانوي. تم تطوير الشريحة القائمة على السيليكون (Si) ، والتي تحتوي على مجموعة منتظمة من الثقوب الدقيقة مع نافذة أكسيد الجرافين (GO) المنقوشة على فيلم نيتريد السيليكون الذي يتم التحكم فيه بسماكة (SixNy) ، من خلال تطبيق تقنيات النظام الكهروميكانيكي الدقيق (MEMS). تم استخدام الطباعة الحجرية الضوئية للأشعة فوق البنفسجية ، وترسب البخار الكيميائي ، والنقش الرطب والجاف للفيلم الرقيق ، وصب الصفائح النانوية 2D للإنتاج الضخم للرقائق ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO. يتم تنظيم عمق الثقوب الدقيقة للتحكم في سمك الجليد عند الطلب ، اعتمادا على حجم العينة لتحليل cryo-EM. يركز التقارب الإيجابي ل GO تجاه الجزيئات الحيوية على الجزيئات الحيوية ذات الأهمية داخل الثقب الصغير أثناء إعداد عينة cryo-EM. تتيح الشريحة ذات النقوش الدقيقة المزودة بنوافذ GO التصوير بالتبريد EM عالي الإنتاجية لمختلف الجزيئات البيولوجية ، بالإضافة إلى المواد النانوية غير العضوية.

Introduction

تم تطوير المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) لحل البنية ثلاثية الأبعاد (3D) للبروتينات في حالتها الأصلية1،2،3،4. تتضمن هذه التقنية تثبيت البروتينات في طبقة رقيقة (10-100 نانومتر) من الجليد الزجاجي والحصول على صور إسقاط للبروتينات الموجهة عشوائيا باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) ، مع الحفاظ على العينة عند درجة حرارة النيتروجين السائل. يتم الحصول على الآلاف إلى الملايين من صور الإسقاط واستخدامها لإعادة بناء بنية ثلاثية الأبعاد للبروتين بواسطة خوارزميات حسابية 5,6. للحصول على تحليل ناجح باستخدام cryo-EM ، تم أتمتة إعداد عينات التبريد عن طريق تجميد المعدات التي تتحكم في ظروف النشاف والرطوبة ودرجة الحرارة. يتم تحميل محلول العينة على شبكة TEM بغشاء كربوني هولي ، ويتم لطخه على التوالي لإزالة المحلول الزائد ، ثم يتم تجميده بالإيثان السائل لإنتاج جليد زجاجي رقيق 1,5,6. مع التقدم في cryo-EM وأتمتة إعداد العينات7 ، تم استخدام cryo-EM بشكل متزايد لحل بنية البروتينات ، بما في ذلك البروتينات المغلفة للفيروسات وبروتينات القناة الأيونية في غشاء الخلية 8,9,10. يعد هيكل البروتينات المغلفة للجسيمات الفيروسية المسببة للأمراض أمرا مهما لفهم أمراض العدوى الفيروسية ، وكذلك تطوير نظام التشخيص واللقاحات على سبيل المثال ، SARS-CoV-2 11 ، الذي تسبب في جائحةCOVID-19. علاوة على ذلك ، تم تطبيق تقنيات cryo-EM مؤخرا على علوم المواد ، مثل تصوير المواد الحساسة للشعاع المستخدمة في البطارية12،13،14 والأنظمة التحفيزية14،15 وتحليل بنية المواد غير العضوية في حالة الحل 16.

على الرغم من التطورات الملحوظة في cryo-EM والتقنيات ذات الصلة ، توجد قيود في إعداد عينات التبريد ، مما يعوق تحليل بنية 3D عالية الإنتاجية. يعد إعداد فيلم ثلج زجاجي بسماكة مثالية أمرا مهما بشكل خاص للحصول على بنية 3D للمواد البيولوجية بدقة ذرية. يجب أن يكون الجليد رقيقا بما يكفي لتقليل ضوضاء الخلفية من الإلكترونات المتناثرة بواسطة الجليد ولمنع تداخل الجزيئات الحيوية على طول مسار شعاع الإلكترون 1,17. ومع ذلك ، إذا كان الجليد رقيقا جدا ، فقد يتسبب في محاذاة جزيئات البروتين في الاتجاهات المفضلة أو تشويه18،19،20. لذلك ، يجب تحسين سمك الجليد الزجاجي اعتمادا على حجم المادة ذات الاهتمام. علاوة على ذلك ، عادة ما تكون هناك حاجة إلى جهد مكثف لإعداد العينات والفحص اليدوي لسلامة الجليد والبروتين على شبكات TEM المعدة. هذه العملية تستغرق وقتا طويلا للغاية ، مما يعوق كفاءتها لتحليل هيكل 3D عالي الإنتاجية. ولذلك، فإن التحسينات في موثوقية وقابلية استنساخ إعداد عينات التبريد EM من شأنها أن تعزز استخدام cryo-EM في البيولوجيا الهيكلية واكتشاف الأدوية التجارية، وكذلك لعلوم المواد.

هنا ، نقدم عمليات التصنيع الدقيق لصنع شريحة ذات نقوش دقيقة مع نوافذ أكسيد الجرافين (GO) المصممة ل cryo-EM عالي الإنتاجية مع سمك الجليد المتحكم فيه21. تم تصنيع الشريحة ذات النقوش الدقيقة باستخدام تقنيات النظام الكهروميكانيكي الدقيق (MEMS) ، والتي يمكنها التعامل مع بنية وأبعاد الشريحة اعتمادا على أغراض التصوير. تحتوي الشريحة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO على بنية microwell يمكن ملؤها بمحلول العينة ، ويمكن تنظيم عمق البئر الصغير للتحكم في سمك الجليد الزجاجي. يعزز التقارب القوي ل GO للجزيئات الحيوية تركيز الجزيئات الحيوية للتصور ، مما يحسن كفاءة تحليل الهيكل. علاوة على ذلك ، تتكون الشريحة ذات النقوش الدقيقة من إطار Si ، والذي يوفر استقرارا ميكانيكيا عاليا للشبكة19 ، مما يجعلها مثالية للتعامل مع الشريحة أثناء إجراءات إعداد العينات والتصوير بالتبريد EM. لذلك ، توفر الشريحة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO المصنعة بواسطة تقنيات MEMS الموثوقية والتكرار لإعداد عينات cryo-EM ، والتي يمكن أن تمكن من تحليل هيكل فعال وعالي الإنتاجية استنادا إلى cryo-EM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصنيع رقاقة صغيرة مع نوافذ GO (الشكل 1)

  1. إيداع نيتريد السيليكون.
    1. ترسب نيتريد السيليكون منخفض الضغط (SixN y) على جانبي رقاقة Si (قطرها 4 بوصاتوسماكة 100 ميكرومتر) باستخدام ترسب بخار كيميائي منخفض الضغط (LPCVD) عند 830 درجة مئوية وضغط 150 mTorr ، تحت تدفق 170 sccm dichlorosilane (SiH2Cl2 ، DCS) و 38 sccm الأمونيا (NH3).
    2. باستخدام معدل ترسيب ~ 30 Å / min ، تحكم في سمك SixNy ليكون في حدود 25-100 نانومتر عن طريق تغيير وقت الترسب.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد عند التعامل مع رقاقة Si لأن الرقاقة رقيقة جدا وهشة. احرص على عدم ثني الرقاقة أثناء مناولتها أو تحميلها في المعدات.
  2. نمط مقاومة الضوء.
    1. ضع محلول سداسي ميثيل ديسيلازان (HMDS) على رقاقة SixNy المودعة بحجم كاف لتغطية كامل سطح الرقاقة ، وقم بتدوير المعطف بطبقة دوارة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية ، واخبز عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية على صفيحة ساخنة لجعل سطح الرقاقة كارها للماء وبالتالي ضمان أداء طلاء جيد مع مقاومة للضوء (PR).
    2. ضع PR (جدول المواد) الإيجابي بحجم كاف لتغطية كامل سطح الرقاقة ، وقم بتدوير الطبقة عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية ، واخبزها على درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 90 ثانية على صفيحة ساخنة. العلاقات العامة المغلفة بالدوران يبلغ سمكها 500 نانومتر.
    3. قم بتعريض الرقاقة المغلفة بالأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي 365 نانومتر وكثافة20 ميجاوات / سم 2) لمدة 5 ثوان من خلال قناع الكروم (الشكل 2A-D) باستخدام محاذاة.
    4. قم بتطوير العلاقات العامة لمدة 1 دقيقة باستخدام مطور (جدول المواد) وشطف الرقاقة عن طريق غمرها في ماء منزوع الأيونات (DI) 2x. جفف الرقاقة المزخرفة بنمط PR بالكامل عن طريق نفخ غاز N2 على سطح الرقاقة.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد أثناء نفخ غاز N2 على رقاقة Si لأن الرقاقة رقيقة جدا وهشة. لا تهب غاز N2 بضغط عال في اتجاه عمودي على الرقاقة ، لأن هذا قد يتسبب في كسر الرقاقة.
  3. نمط SixNy.
    1. حفر SixNy المكشوف بعد نقش العلاقات العامة باستخدام محفور أيون تفاعلي (RIE) تم بناؤه في المختبر ، مع غاز 3 سم سادس فلوريد الكبريت (SF6) عند طاقة ترددات راديوية (RF) تبلغ 50 واط. معدل النقش مع هذه الإعدادات هو ~ 6 Å / s. اضبط وقت الحفر اعتمادا على سمك طبقة SixNy المودعة.
      ملاحظة: قد يختلف معدل النقش ويحتاج إلى تحسين داخل المختبر وفقا لمواصفات معدات RIE المستخدمة.
    2. تخلص من العلاقات العامة عن طريق غمر رقاقة SixN y المنقوشة في الأسيتون في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، تليها شطف الرقاقة عن طريق غمرها في ماء DI 2x. جفف الرقاقة بالكامل عن طريق نفخ غاز N2 على سطح الرقاقة.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد أثناء غمر أو إخراج الرقاقة من المحاليل لأن الرقاقة يمكن كسرها بسبب التوتر السطحي للمحلول. لا تغمر أو تخرج الرقاقة الموازية لسطح المحلول. استخدم ملاقط مناولة الرقاقة الدقيقة مع أطراف ألياف الكربون. لا تمسك الرقاقة بقوة باستخدام الملقط. ارفع جانبا واحدا من الرقاقة حتى تميل الرقاقة إلى زاوية ، حيث يمكن إخراجها من المحلول. قد تنكسر الرقاقة عندما تنحني بسبب القبضة القوية أثناء الرفع.
  4. حفر سي.
    1. تحضير محلول هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) 1.5 متر عن طريق إذابة مسحوق KOH في الماء DI عند 80 درجة مئوية.
    2. اغمررقاقة Si x N y المنقوشة في محلول KOH لحفر Si. اترك الرقاقة في المحلول مع التحريك حتى يمكن ملاحظة نوافذ Si x N y القائمة بذاتها على الجانب الآخر من SixNy المنقوشة.
      ملاحظة: قد يختلف وقت النقش الرطب اعتمادا على سمك Si ؛ بالنسبة لرقاقة بسمك 100 ميكرومتر ، يستغرق النقش الرطب عادة عدة ساعات. لا تقم بتعيين سرعة التحريك عالية جدا أثناء حفر Si لأن نوافذ SixN y القائمةبذاتها رقيقة جدا ويمكن كسرها بواسطة تدفق السائل. في هذه التجربة ، تم تعيين معدل التحريك إلى 250 دورة في الدقيقة.
    3. نظف الرقاقة المحفورة عن طريق غمسها عدة مرات في حمام مائي DI للقضاء على بقايا الحفر. جفف الرقاقة في الهواء.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد أثناء غمر أو إخراج رقاقة Si المنقوشة من المحاليل لأن نوافذ SixNy القائمة بذاتها رقيقة جدا وهشة ويمكن كسرها بسبب التوتر السطحي للمحلول. يجب غمر الرقاقة أو إخراجها بزاوية ، بحيث تدخل حافة الرقاقة وتخرج من الحل أولا.
  5. القضاء على بقايا النقش KOH.
    1. اضغط برفق على حدود صفيف الشرائح باستخدام ملاقط للحصول على مجموعة من الرقائق التي ستكون ذات نقوش دقيقة (الشكل 1B).
    2. تحضير محلول 1.5 M KOH على درجة حرارة 80 درجة مئوية مع التحريك.
    3. اغمر صفيف الرقائق في محلول KOH لمدة 30 ثانية وشطفها عن طريق غمسها في ماء DI 2x. جفف الرقائق بالكامل عن طريق نفخ غاز N2 .
      ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد أثناء غمس الرقائق في المحاليل وتجفيفها بغاز N2 لأن نوافذ SixNy القائمة بذاتها رقيقة جدا وهشة. بينما يتم غمر الشريحة في محلول KOH ، يجب إيقاف التحريك. يجب غمس الرقائق بحوافها أولا في الاتجاه العمودي على المحلول ونفخها بغاز N2 في الاتجاه الموازي.
    4. جفف صفيف الرقائق بالكامل في الهواء لمدة 1 ساعة على الأقل.
  6. نمط العلاقات العامة.
    1. قم بإعداد رقاقة Si فارغة سعة 525 ميكرومتر كدعم صلب. قم بتدوير رقاقة Si ب HMDS والعلاقات العامة الإيجابية ، كما هو موضح أعلاه ، ولكن قم بإرفاق صفيف الرقاقة (مع جانب نافذة SixN y القائمة بذاتها لأعلى) علىرقاقة Si قبل خبز PR. تعمل العلاقات العامة كمادة لاصقة بين الرقاقة وصفيف الرقاقة. اخبز رقاقة Si المرفقة بصفيف الرقائق عند 100 درجة مئوية لمدة 90 ثانية على صفيحة ساخنة.
    2. قم بتغطية مجموعة الشرائح ب HMDS والعلاقات العامة الإيجابية ، كما هو موضح أعلاه.
    3. قم بتعريض مجموعة الشرائح بالأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي 365 نانومتر؛ 20 ميجاوات/سم2 كثافة) لمدة 5 ثوان من خلال قناع الكروم (الشكل 2E، F) باستخدام مصفف.
    4. قم بتطوير العلاقات العامة باستخدام مطور لمدة 15 ثانية ، وشطف مجموعة الشرائح عن طريق غمسها في ماء DI 2x ، وتجفيف مجموعة الشريحة المنقوشة PR بالكامل عن طريق نفخ غاز N2 .
  7. تحضير SixNy ذو النقوش الدقيقة.
    1. Etch Si x Ny بعد نقش العلاقات العامة باستخدام RIE المصنوع في المختبر ، مع 3 sccm SF6 غاز بقوة RF تبلغ 50 واط. تحكم في وقت الحفر اعتمادا على سمك طبقة SixNy.
  8. القضاء على العلاقات العامة.
    1. تخلص من العلاقات العامة عن طريق غمر الشريحة المنقوشة في محلول 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) عند 60 درجة مئوية وتركها طوال الليل. شطف مجموعة الشرائح عن طريق غمسها في ماء DI 2x ، وتجفيف الشريحة المنقوشة بالكامل عن طريق نفخ غاز N2 .
    2. تخلص من بقايا العلاقات العامة باستخدام عملية بلازما O 2 باستخدام غاز 100 sccm O2 بقوة RF تبلغ 150 واط لمدة دقيقة واحدة باستخدام RIE المصنوع في المختبر.
  9. شطف رقاقة منقوشة دقيقة.
    1. تحضير محلول 1.5 M KOH عند 80 درجة مئوية.
    2. اغمر الرقائق ذات النقوش الدقيقة في محلول KOH لمدة 30 ثانية للقضاء التام على بقايا العلاقات العامة وشطف الرقائق عن طريق غمرها في ماء DI 2x. جفف الرقائق بالكامل عن طريق نفخ غاز N2 .
    3. جفف الرقائق بالكامل في الهواء لمدة 1 ساعة على الأقل.
  10. نقل أكسيد الجرافين (GO) بطريقة صب السقوط.
    1. قم بتخفيف محلول GO (2 مجم / مل) إلى 0.2 مجم / لتر بماء DI وسونيكات لمدة 10 دقائق لتفتيت مجاميع صفائح GO. الطرد المركزي محلول GO المخفف عند 300 × g لمدة 30 ثانية.
    2. قم بتفريغ الجانب المحفور Si من الشريحة ذات النقوش الدقيقة لجعل سطح الشريحة بشحنة موجبة باستخدام مفرغ توهج (جدول المواد) عند 15 مللي أمبير لمدة 1 دقيقة.
    3. أسقط 3 ميكرولتر من محلول GO على جانب تفريغ التوهج من الشريحة ذات النقوش الدقيقة واترك السقوط على الشريحة لمدة 1 دقيقة. بعد 1 دقيقة ، قم بمسح محلول GO الزائد على الشريحة باستخدام ورق التصفية.
    4. اغسل الشريحة المنقولة بواسطة GO بقطرات ماء DI المحضرة على فيلم البارافين وامسح ماء DI على الشريحة بورق التصفية. كرر هذا الإجراء 2x على الجانب المنقول GO و 1x على الجانب الآخر. جفف الشريحة المنقولة بواسطة GO في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
    5. اغسل الشريحة ذات النقوش الدقيقة بنوافذ GO عن طريق غمرها في ماء DI وتجفيف الشريحة بغاز N2 .

2. التصوير بالتبريد EM

  1. تحضير عينة التبريد.
    1. قم بإعداد عينة التبريد باستخدام آلة ميكانيكية للغطس بالتبريد (جدول المواد) ، والتي تتحكم في درجة الحرارة والرطوبة ووقت النشاف والقوة. بعد تحميل وسادة النشاف على النشافات ، تأكد من الحفاظ على الرطوبة ودرجة الحرارة في الغرفة عند 100٪ و 15 درجة مئوية ، على التوالي.
    2. التقط الشريحة ذات النقوش الدقيقة باستخدام ملاقط تبريد نموذجية وقم بتحميل الملقط إلى آلة الغطس بالتبريد. Pipet 3 ميكرولتر من محلول العينة على الشريحة ذات النقوش الدقيقة في الجانب المزخرف بالثقب ، مع نوافذ GO في الأسفل. تحكم في وقت النشاف والقوة اعتمادا على محلول العينة.
      ملاحظة: هنا ، تم استخدام العينات البيولوجية ، وهي فيروس نقص المناعة البشرية (HIV-1) ، والفيريتين ، والبروتيازوم 26S ، و groEL ، وجزيئات بروتين الأبوفيريتين ، وبروتينات خيوط تاو للتصوير بالتبريد EM. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام أنواع متنوعة من المواد غير العضوية ، مثل الجسيمات النانوية Fe2O3 (NP) ، والجسيمات النانوية Au ، وقضبان Au النانوية ، والجسيمات النانوية السيليكا ، للتصوير بالتبريد EM. تم تعيين وقت النشاف المطلوب والقوة على مكبس التبريد لأنواع مختلفة من العينات.
    3. بعد عملية النشاف ، قم بتجميد الشريحة المحملة بالعينة على الفور في الإيثان السائل. انقل الشريحة إلى صندوق الشبكة في النيتروجين السائل (LN 2) وقم بتخزينها في LN2 قبل التصوير بالتبريد EM.
  2. قم بإجراء التصوير بالتبريد EM.
    1. قم بتحميل عينة التبريد إلى حامل cryo-EM مع الحفاظ على درجة الحرارة عند -180 درجة مئوية.
    2. قم بتحميل حامل cryo-EM في TEM وراقب العينات باستخدام وضع نظام الحد الأدنى للجرعة (MDS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تصنيع رقاقة صغيرة مع نوافذ GO بواسطة تصنيع MEMS ونقل ورقة نانوية 2D GO. تم إنتاج رقائق الأنماط الدقيقة بكميات كبيرة ، مع إنتاج حوالي 500 رقاقة من رقاقة واحدة 4 في رقاقة (الشكل 1B والشكل 2A ، B). يمكن التلاعب بتصميمات الرقائق ذات النقوش الدقيقة باستخدام تصميمات مختلفة لقناع الكروم (الشكل 2) أثناء إجراء الطباعة الحجرية الضوئية. كانت الرقائق المصنعة ذات النقوش الدقيقة تتحكم في أعداد وأبعاد أغشية SixNy القائمة بذاتها. تم التحكم في أعداد أغشية SixN y القائمةبذاتها من 48 (6 × 8) إلى 50 (5 × 10) والأبعاد من 50 × 40 ميكرومتر 2 إلى 250 × 40 ميكرومتر2 (الشكل 3A و B و F و G). يمكن أن يحتوي كل غشاء SixNy قائم بذاته على عشرات إلى مئات الثقوب الدقيقة بأقطار قابلة للتخصيص تتراوح من 2-3 ميكرومتر مع تباعد مختلف بين الثقوب. تحتوي الرقائق المصنعة ذات النقوش الدقيقة على ما يصل إلى ~ 25000 ثقب معلق من GO ، في حين أن عدد الثقوب يمكن التحكم فيه أيضا (الشكل 3B-D والشكل 3G-I). تم تأكيد وجود طبقة GO الرقيقة عبر الثقب بواسطة التحليل الطيفي ورامان وحيود الإلكترون. وأظهر طيف رامان في نافذة GO قمم تمثيلية ل GO، أي النطاقين D وG عند 1360 سم-1 و1590 سم-1، على التوالي22 (الشكل 3E). تشير أنماط الحيود السداسي الموجه نحو الضرب إلى أن النوافذ تتكون من GO متعدد الطبقات (الشكل 3J).

تم تصنيع الشريحة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO في ثلاثة أعماق مستهدفة تمثيلية (25 نانومتر و 50 نانومتر و 100 نانومتر) من خلال التحكم في سمك ترسب SixN y علىرقاقة Si أثناء عملية LPCVD لتأكيد جدوى تنظيم عمق الثقوب الصغيرة. لتقييم بنية وسماكة الثقوب الدقيقة مع نوافذ GO ، تم الحصول على صور المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) المائلة بزاوية 40 درجة والمقطع العرضي وصور مجهر القوة الذرية (AFM) للرقاقة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO. وقد لوحظ بوضوح الهيكل الجيد للثقب الصغير مع نافذة GO ، مع عمق الثقب الصغير المقابل للعمق المستهدف (الشكل 4). تؤكد النتائج أن التحكم في عدد وتصميم الشريحة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO أمر ممكن.

لإثبات استخدام الشريحة ذات النقوش الدقيقة للتصوير بالتبريد EM ، تم إعداد عينات مختلفة من الجزيئات الحيوية و NPs غير العضوية باستخدام الشريحة ذات النمط الدقيق. بالنسبة للعينات البيولوجية ، تم تصوير فيروس نقص المناعة البشرية-1 ، والفيريتين ، والبروتيازوم 26S ، و groEL ، وجزيئات بروتين الأبوفيريتين ، وبروتينات خيوط تاو باستخدام cryo-EM باستخدام رقاقة صغيرة مع نوافذ GO (الشكل 5A-F). إلى جانب الجزيئات الحيوية ، لوحظت أيضا مواد غير عضوية مثل Fe2O3 NPs و Au NPs و Au nanorods و silica NPs بواسطة cryo-EM باستخدام رقائق دقيقة النقوش (الشكل 5G-J).

Figure 1
الشكل 1: مخططات وصور لإجراء تصنيع الشريحة ذات النقوش الدقيقة المطورة حديثا مع نوافذ GO ل cryo-EM. (أ) مخططات عملية التصنيع والمقاطع العرضية للرقاقة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO أثناء عملية التصنيع. (ب) صور لمنتجات التصنيع في كل خطوة تصنيع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: رسم توضيحي موجز لأقنعة الكروم المستخدمة في عملية الطباعة الحجرية الضوئية. (A,B) تصميم قناع للإنتاج الضخم للرقائق ل 4 في رقاقة Si (24 × 24 مجموعة من الرقائق) ، (C ، D) تصاميم 2 × 2 صفيف من الرقائق ، و (E ، F) تصاميم أنماط الثقوب الصغيرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: هيكل الرقائق ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO. (A ، F) صور المجهر الضوئي للرقائق المجهرية الكاملة ، (B ، G) صور SEM لأغشية SixN y ذات النقوش الدقيقةالمفردة ، (C ، H) صور SEM للأنماط الدقيقة ، و (D ، I) صور SEM للثقوب الدقيقة المفردة مع نوافذ GO. (E,J) تأكيد GO في الثقب الصغير من خلال (E) طيف Raman و (J) نمط حيود الإلكترون (SAED) للمنطقة المحددة لنافذة GO. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: بنية البئر وعمق الثقب الصغير مع نوافذ GO. (A-C) 40 درجة مائلة صور SEM لثقب صغير واحد مع نافذة GO ، و (D-F) صورة SEM مقطعية عرضية للرقاقة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO في أعماق مختلفة (25 نانومتر ، 50 نانومتر ، و 100 نانومتر). (G) مجهر القوة الذرية (AFM) صورة تقديم 3D ، (H) صورة انحراف AFM ، و (I) ملف تعريف الخط على طول الخط الأحمر في (H) يوضح عمق الشريحة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO ملفقة بغشاء SixN y 100نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: صور Cryo-EM لمختلف الأحجام والمواد النانوية غير العضوية باستخدام رقاقة صغيرة منقوشة مع نوافذ GO . (A) جسيم فيروس نقص المناعة البشرية-1 ، (B) الفيريتين ، (C) البروتيازوم 26S ، (D) groEL ، (E) apoferritin ، (F) بروتين تاو (الأسهم التي تشير إلى بروتين تاو الليفي) ، (G) Fe2O3 NP ، (H) Au NP ، (I) Au nanorod ، و (J) السيليكا NP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتم تقديم عمليات التصنيع الدقيق لإنتاج رقائق صغيرة مع نوافذ GO هنا. تم تصميم الشريحة الدقيقة المصنعة لتنظيم سمك طبقة الجليد الزجاجية من خلال التحكم في عمق الثقب الصغير باستخدام نوافذ GO اعتمادا على حجم المادة المراد تحليلها. تم تصنيع شريحة صغيرة النقوش مع نوافذ GO باستخدام سلسلة من تقنيات MEMS وطريقة نقل ورقة نانوية ثنائية الأبعاد (الشكل 1). الميزة الرئيسية لاستخدام تقنية تصنيع MEMS هي قدرتها على الإنتاج الضخم وجدوى التلاعب بهيكل وأبعاد الرقاقة الدقيقة باستخدام تصميمات مختلفة لقناع الكروم أثناء الطباعة الحجرية الضوئية (الشكل 2). تضمن طبقة Si x N y المودعة فيLPCVD مع الضغط المنخفض استقرار عشرات النانومترات القائمة بذاتها SixNy23,24,25,26. ومع ذلك ، فإن طبقة SixN y القائمةبذاتها على مقياس النانومتر لا تزال عرضة للقوى في الاتجاه العمودي27. لذلك ، هناك حاجة إلى توخي الحذر الشديد أثناء التعامل مع الشريحة ذات النقوش الدقيقة ، كما هو الحال عند الغمس في المحلول أو التجفيف. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم عملية تصنيع الشريحة ذات النقوش الدقيقة رقاقة Si 100 ميكرومتر ، والتي تضمن التوافق مع معظم حاملات العينات cryo-EM والرافعات التلقائية. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى توخي الحذر أثناء عمليات التصنيع لمنع الرقاقة الهشة من التكسير.

تم تأكيد المجموعة المنتظمة على نطاق ميكرون من الهياكل من النوع الجيد مع نوافذ GO باستخدام المجهر الضوئي و SEM (الشكل 3 والشكل 4). إلى جانب ذلك ، فإن طريقة صب الإسقاط لنقل GO تمكن من ترسيب GO مع تسطيح عال وبدون تجاعيد ملحوظة (الشكل 3D ، E ، I ، J). الشريحة ذات النقوش الدقيقة مناسبة للتحميل في المحمل التلقائي cryo-EM ، وعشرات الآلاف من الثقوب على نطاق ميكرون في صفيف منتظم تسمح بالجمع الآلي لبيانات الصور الكبيرة لتحليل الجسيمات المفردة. علاوة على ذلك ، يمكن التلاعب بعدد ومورفولوجيا أغشية SixNy والثقوب الدقيقة المدعومة من GO بسهولة في عملية تصنيع MEMS ، مما يسمح بتحليل الجسيمات المفردة عالية الإنتاجية وغيرها من تجارب التصوير بالتبريد EM اعتمادا على أغراض البحث. علاوة على ذلك ، يمكن تسهيل التطبيقات الموسعة للرقائق ذات النقوش الدقيقة ذات السماكة التي يتم التحكم فيها من خلال تصنيع الرقائق التي تحتوي على ثقوب منقوشة على مقياس النانومتر. يمكن اعتماد تقنيات النقش النانوية التي تم تطويرها في صناعة أشباه الموصلات في تصنيع تلك الرقائق28،29،30.

تم إثبات القدرة على تنظيم عمق الثقوب الدقيقة هنا من خلال تصنيع رقائق صغيرة النقوش مع نوافذ GO في ثلاثة أعماق مستهدفة تمثيلية: 25 نانومتر و 50 نانومتر و 100 نانومتر. تم تحقيق أعماق مختلفة من بنية البئر الدقيقة من خلال التحكم في وقت ترسب طبقة SixNy على رقاقة Si (الشكل 4). لتقييم مورفولوجيا وسماكة الشريحة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO ، لوحظت مقاطع عرضية للأجهزة التي تم الحصول عليها من تقسيم شعاع الأيونات المركزة (FIB) باستخدام SEM ، وتم قياس ملف تعريف العمق باستخدام AFM (الشكل 4). تم عرض الهيكل الجيد للثقب الصغير مع نافذة GO بوضوح في صور SEM و AFM ، مما يؤكد التحكم الناجح في عمق الثقب الصغير SixNy ونقل نافذة GO. من المرجح أن يضمن استخدام الشريحة ذات النقوش الدقيقة القابلة للتخصيص مع نوافذ GO معدل نجاح مرتفع في إنتاج مناطق ذات سمك ثلج مثالي للتصوير بالتبريد EM.

نظرا لأن المواد التي يجب ملاحظتها باستخدام cryo-EM لها أحجام مختلفة ، فإن إنتاج الجليد الزجاجي بسماكة مناسبة يمكن أن يضمن دقة تباين محسنة ، وتغطية واسعة الاتجاه ، وتقليل تمسخ الهيكل أثناء التصوير بالتبريد EM. لإثبات استخدام عملية التصوير بالتبريد EM للتطبيقات البيولوجية ، تم تصوير عينات بيولوجية مختلفة من أحجام مختلفة ، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية-1 ، والفيريتين ، والبروتيازوم 26S ، و groEL ، و apoferritin ، وبروتين تاو ، باستخدام رقاقة ذات أنماط دقيقة مع نوافذ GO. وقد لوحظت الجزيئات الحيوية بوضوح باستخدام الشريحة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO (الشكل 5A-F). وإلى جانب الجزيئات الحيوية، لوحظت أيضا أنواع متنوعة من المواد النانوية غير العضوية، مثل Fe2O3 NPs، وAu NPs، وAu nanorods، وNPs السيليكا، باستخدام الشريحة ذات النقوش الدقيقة مع نوافذ GO (الشكل 5G-J). تظهر طريقة تصنيع الرقائق والتصنيع ذات النقوش الدقيقة توافقا مع التصوير بالتبريد للمواد المختلفة. وبالتالي ، فإن الشريحة ذات النقوش الدقيقة المطورة حديثا مع نوافذ GO توفر استراتيجية موثوقة وقابلة للتكرار لإعداد العينات لتحليل هيكل فعال وعالي الإنتاجية باستخدام cryo-EM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يقر M.-H.K.، S.K.، M.L.، و J.P. بالدعم المالي المقدم من معهد العلوم الأساسية (رقم المنحة. IBS-R006-D1). تعترف S.K. ، M.L. ، و J.P. بالدعم المالي المقدم من برنامج الباحثين المبدعين الرائدين من خلال جامعة سيول الوطنية (2021) ومنحة NRF الممولة من الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة. NRF-2020R1A2C2101871 ، و NRF-2021M3A9I4022936). M.L. و J.P. يقترفان بالدعم المالي المقدم من زمالة POSCO للعلوم التابعة لمؤسسة POSCO TJ Park ومنحة NRF التي تمولها الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة NRF-2017R1A5A1015365). يقر J.P. بالدعم المالي المقدم من منحة NRF التي تمولها الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة NRF-2020R1A6C101A183)، وبرامج المبادرات البحثية متعددة التخصصات من قبل كلية الهندسة وكلية الطب، جامعة سيول الوطنية (2021). يقر M.-H.K. بالدعم المالي المقدم من منحة NRF التي تمولها الحكومة الكورية (MSIT; رقم المنحة NRF-2020R1I1A1A0107416612). يشكر المؤلفون موظفي وطاقم مركز جامعة سيول الوطنية للتصوير الجزيئي والخلوي (SNU CMCI) على جهودهم الدؤوبة ومثابرتهم في تجارب cryo-EM. يشكر المؤلفون S. J. Kim من المركز الوطني لمرافق البحوث المشتركة بين الجامعات للمساعدة في تجارب FIB-SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma Aldrich, USA 443778
Acetone
AFM Park Systems, South Korea NX-10
Aligner Midas System, South Korea MDA-600S
AZ 300 MIF developer AZ Electronic Materials USA Corp., USA 184411
Cryo-EM holder Gatan, USA 626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) FEI Company, USA Helios NanoLab 650
Glow discharger Ted Pella Inc., USA PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution Sigma Aldrich, USA 763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% Alfa Aesar, USA 10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) Centrotherm, Germany LPCVD E1200
maP1205 positive PR Micro resist technology, Germany A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea 6597-4400
Raman Spectrometer NOST, South Korea Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE) Scientific Engineering, South Korea Lab-built
SEM Carl Zeiss, Germany SUPRA 55VP
Si wafer JP COMMERCE, South Korea 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater Dong Ah Trade Corp., South Korea ACE-200
TEM JEOL, Japan JEM-2100F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
  2. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
  3. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  4. Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
  5. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
  6. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  7. Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
  8. Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
  9. Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
  10. Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
  11. Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
  12. Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
  13. Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
  14. Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  15. Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
  16. Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
  17. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
  18. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
  19. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
  20. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
  22. Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
  23. Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
  24. Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
  25. Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
  26. Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
  27. Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
  28. Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
  29. Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
  30. Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).

Tags

الهندسة، العدد 182، المجهر الإلكتروني المبرد، الأنظمة الكهروميكانيكية المجهرية، أكسيد الجرافين، سمك الجليد الزجاجي، فيروس، بروتين، مواد نانوية
تصنيع رقاقة ذات نقوش دقيقة بسماكة يتم التحكم فيها للفحص المجهري الإلكتروني المبرد عالي الإنتاجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S.,… More

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (182), e63739, doi:10.3791/63739 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter