Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Yüksek Verimli Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Kontrollü Kalınlığa Sahip Mikro Desenli Çip İmalatı

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63739
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,4, 3,4,5,6
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

Summary

Grafen oksit pencereli yeni geliştirilen mikro desenli çip, mikroelektromekanik sistem teknikleri uygulanarak üretilir ve çeşitli biyomoleküllerin ve nanomalzemelerin verimli ve yüksek verimli kriyojenik elektron mikroskopisi görüntülemesini sağlar.

Abstract

Kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM) kullanılarak biyomoleküllerin verimli ve yüksek verimli yapı analizi için önemli bir sınırlama, nano ölçekte kontrollü buz kalınlığına sahip kriyo-EM numunelerinin hazırlanmasının zorluğudur. Kalınlığı kontrol edilen silikon nitrür (SixNy) filmi üzerine desenli grafen oksit (GO) pencereli düzenli bir mikro delik dizisine sahip olan silikon (Si) bazlı çip, mikroelektromekanik sistem (MEMS) teknikleri uygulanarak geliştirilmiştir. UV fotolitografisi, kimyasal buhar birikimi, ince filmin ıslak ve kuru aşındırılması ve 2D nanosheet malzemelerin damla dökümü, GO pencereli mikro desenli çiplerin seri üretimi için kullanılmıştır. Mikro deliklerin derinliği, kriyo-EM analizi için numunenin boyutuna bağlı olarak, talep üzerine buz kalınlığını kontrol etmek için düzenlenir. GO'nun biyomoleküllere olan olumlu afinitesi, kriyo-EM numune hazırlama sırasında ilgilenilen biyomolekülleri mikro delik içinde yoğunlaştırır. GO pencereli mikro desenli çip, çeşitli biyolojik moleküllerin yanı sıra inorganik nanomalzemelerin yüksek verimli kriyo-EM görüntülemesini sağlar.

Introduction

Kriyojenik elektron mikroskobu (kriyo-EM), proteinlerin üç boyutlu (3D) yapısını doğal hallerinde 1,2,3,4 olarak çözmek için geliştirilmiştir. Teknik, proteinleri ince bir vitreus buzu tabakasına (10-100 nm) sabitlemeyi ve bir iletim elektron mikroskobu (TEM) kullanarak rastgele yönlendirilmiş proteinlerin projeksiyon görüntülerini elde etmeyi içerir. Binlerce ila milyonlarca projeksiyon görüntüsü elde edilir ve hesaplama algoritmaları ile proteinin 3B yapısını yeniden yapılandırmak için kullanılır 5,6. Cryo-EM ile başarılı bir analiz için, kriyo-numune hazırlama, lekelenme koşullarını, nemi ve sıcaklığı kontrol eden ekipmanın daldırılması-dondurulmasıyla otomatikleştirilmiştir. Numune çözeltisi, delikli bir karbon membranlı bir TEM ızgarasına yüklenir, fazla çözeltiyi gidermek için art arda lekelenir ve daha sonra ince, vitreus buz 1,5,6 üretmek için sıvı etan ile dondurularak dondurulur. Kriyo-EM'deki gelişmeler ve numune hazırlama7'nin otomasyonu ile kriyo-EM, virüsler için zarf proteinleri ve hücre zarındaki iyon kanalı proteinleri de dahil olmak üzere proteinlerin yapısını çözmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır 8,9,10. Patojenik viral partiküllerin zarf proteinlerinin yapısı, viral enfeksiyon patolojisini anlamanın yanı sıra,COVID-19 pandemisine neden olan SARS-CoV-2 11 gibi tanı sistemini ve aşıları geliştirmek için önemlidir. Ayrıca, kriyo-EM teknikleri son zamanlarda pil12,13,14 ve katalitiksistemler 14,15'te kullanılan ışına duyarlı malzemelerin görüntülenmesi ve inorganik malzemelerin 16 çözelti halindeki yapısının analiz edilmesi gibi malzeme bilimlerine uygulanmıştır.

Kriyo-EM ve ilgili tekniklerdeki gözle görülür gelişmelere rağmen, kriyo-numune hazırlamada sınırlamalar vardır ve bu da yüksek verimli 3D yapı analizini engellemektedir. Optimum kalınlığa sahip bir vitreus buz filmi hazırlamak, biyolojik malzemelerin atomik çözünürlüğe sahip 3D yapısını elde etmek için özellikle önemlidir. Buz, buz tarafından dağılan elektronlardan gelen arka plan gürültüsünü en aza indirecek ve elektron ışını yolu1,17 boyunca biyomoleküllerin üst üste binmesini yasaklamak için yeterince ince olmalıdır. Bununla birlikte, buz çok inceyse, protein moleküllerinin tercih edilen yönlerde hizalanmasına veya 18,19,20'yi denatüre etmesine neden olabilir. Bu nedenle, vitreus buzunun kalınlığı, ilgilenilen malzemenin boyutuna bağlı olarak optimize edilmelidir. Ayrıca, numune hazırlanması ve hazırlanan TEM ızgaralarında buz ve protein bütünlüğünün manuel olarak taranması için tipik olarak kapsamlı çaba gereklidir. Bu süreç son derece zaman alıcıdır ve bu da yüksek verimli 3D yapı analizi için verimliliğini engeller. Bu nedenle, kriyo-EM numune hazırlamanın güvenilirliği ve tekrarlanabilirliğindeki gelişmeler, kriyo-EM'nin yapısal biyoloji ve ticari ilaç keşfinde ve ayrıca malzeme biliminde kullanımını artıracaktır.

Burada, kontrollü buz kalınlığı21 ile yüksek verimli kriyo-EM için tasarlanmış grafen oksit (GO) pencereli mikro desenli bir çip yapmak için mikrofabrikasyon süreçlerini tanıtıyoruz. Mikro desenli çip, görüntüleme amaçlarına bağlı olarak çipin yapısını ve boyutlarını manipüle edebilen mikroelektromekanik sistem (MEMS) teknikleri kullanılarak üretilmiştir. GO pencereli mikro desenli çip, numune çözeltisi ile doldurulabilen bir mikro kuyucuk yapısına sahiptir ve vitreus buzunun kalınlığını kontrol etmek için mikro kuyucuğun derinliği düzenlenebilir. GO'nun biyomoleküller için güçlü afinitesi, görselleştirme için biyomoleküllerin konsantrasyonunu arttırır ve yapı analizinin verimliliğini arttırır. Ayrıca, mikro desenli çip, ızgara19 için yüksek mekanik stabilite sağlayan bir Si çerçevesinden oluşur ve bu da numune hazırlama prosedürleri ve kriyo-EM görüntüleme sırasında çipin işlenmesi için idealdir. Bu nedenle, MEMS teknikleri tarafından üretilen GO pencereli mikro desenli bir çip, kriyo-EM numune hazırlamanın güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlar, bu da kriyo-EM'ye dayalı verimli ve yüksek verimli yapı analizini mümkün kılar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. GO pencereli mikro desenli çip imalatı (Şekil 1)

  1. Silisyum nitrürü biriktirin.
    1. 830 ° C'de düşük basınçlı kimyasal buhar biriktirme (LPCVD) ve 150 mTorr basınç kullanarak, 170 sccm diklorosilane (SiH2Cl2, DCS) ve 38 sccm amonyak (NH3) akışı altında Si gofretin her iki tarafında (4 inç çapında ve 100 μm kalınlıkta) düşük gerilimli silikon nitrür (SixNy) biriktirin.
    2. ~30 Å/dak biriktirme hızı kullanarak, biriktirme süresini değiştirerek SixNy kalınlığını 25-100 nm aralığında olacak şekilde kontrol edin.
      NOT: Si gofret kullanılırken çok dikkatli olunmalıdır çünkü gofret çok ince ve kırılgandır. Gofretin taşınması veya ekipmana yüklenmesi sırasında bükülmemesine dikkat edin.
  2. Fotodirenci desenleyin.
    1. Gofretin tüm yüzeyini kaplayacak kadar hacimli SixN y-birikmiş Si gofret üzerine bir hekzametildikolayaz (HMDS) çözeltisi uygulayın, 30 s için 3.000 rpm'de bir spin kaplayıcı ile spin kaplama yapın ve gofret yüzeyini hidrofobik hale getirmek ve böylece fotodirenç (PR) ile iyi bir kaplama performansı sağlamak için bir sıcak plaka üzerinde 30 sn için 95 ° C'de pişirin.
    2. Gofretin tüm yüzeyini kaplayacak kadar hacimli pozitif PR (Malzeme Tablosu) uygulayın, 30 sn için 3.000 rpm'de spin kat yapın ve bir sıcak plaka üzerinde 90 s boyunca 100 °C'de pişirin. Spin kaplı PR 500 nm kalınlığa sahiptir.
    3. PR kaplı gofreti, bir hizalayıcı kullanarak bir krom maskesi (Şekil 2A-D) aracılığıyla 5 s boyunca ultraviyole ışıkla (365 nm dalga boyu ve 20 mW/cm2 yoğunlukta) pozlayın.
    4. Bir geliştirici (Malzeme Tablosu) kullanarak PR'ı 1 dakika boyunca geliştirin ve gofreti 2x deiyonize (DI) suya batırarak durulayın. PR desenli gofreti, N2 gazını gofret yüzeyine üfleyerek tamamen kurutun.
      NOT: Gofret çok ince ve kırılgan olduğu için Si gofrete N2 gazı üflenirken çok dikkatli olunmalıdır. N2 gazını gofrete dik bir yönde yüksek basınçla üflemeyin, çünkü bu gofretin kırılmasına neden olabilir.
  3. SixN y deseniniyapın.
    1. PR'nin modellenmesini takiben, 50 W'lık bir radyofrekans (RF) gücünde 3 sccm kükürt hekzaflorür (SF6) gazı ile laboratuar yapımı bir reaktif iyon kazıyıcı (RIE) kullanarak maruz kalan SixNy'yi aşındırın. Bu ayarlarla aşındırma hızı ~6 Å/s'dir. Kazıma süresini, biriken SixNy tabakasının kalınlığına bağlı olarak ayarlayın.
      NOT: Aşındırma oranı, kullanılan RIE ekipmanının özelliklerine bağlı olarak değişebilir ve laboratuvar içi optimizasyona ihtiyaç duyabilir.
    2. SixNy desenli gofreti oda sıcaklığında 30 dakika boyunca asetona batırarak PR'ı ortadan kaldırın, ardından gofreti 2x DI suya batırarak durulayın. Gofret yüzeyine N2 gazı üfleyerek gofreti tamamen kurutun.
      NOT: Gofret daldırılırken veya çözeltilerden çıkarılırken çok dikkatli olunmalıdır, çünkü gofret çözeltinin yüzey gerilimi ile kırılabilir. Gofreti çözeltinin yüzeyine paralel olarak batırmayın veya çıkarmayın. Karbon fiber uçlu hassas gofret taşıma cımbızları kullanın. Gofreti cıvıl cıvıl ile kuvvetlice tutmayın; Gofret çözeltiden çıkarılabileceği bir açıya eğilene kadar gofretin bir tarafını kaldırın. Gofret, kaldırma sırasında sıkı kavrama nedeniyle büküldüğünde kırılabilir.
  4. Si'yi kazıyın.
    1. KOH tozunu 80 °C'de DI suda çözerek 1,5 M potasyum hidroksit (KOH) çözeltisi hazırlayın.
    2. Açıkta kalan Si'yi kazımak için Si x N y desenli gofreti KOH çözeltisine batırın. Desenli Six Ny'nin karşı tarafında bağımsız duran SixNy pencereleri gözlemlenene kadar gofreti karıştırarak çözeltinin içinde bırakın.
      NOT: Islak aşındırma süresi, Si'nin kalınlığına bağlı olarak değişebilir; 100 μm kalınlığında bir gofret için, ıslak aşındırma normalde birkaç saat sürer. Si aşındırma sırasında karıştırma hızını çok yükseğe ayarlamayın, çünkü bağımsız SixNy pencereleri çok incedir ve sıvının akışıyla kırılabilir. Bu deneyde, karıştırma hızı 250 rpm'ye ayarlandı.
    3. Aşındırma kalıntılarını ortadan kaldırmak için kazınmış gofreti bir DI su banyosuna birkaç kez batırarak temizleyin. Gofreti havada kurutun.
      NOT: Si desenli gofreti çözeltilerden daldırırken veya çıkarırken çok dikkatli olunmalıdır, çünkü bağımsız SixNy pencereleri çok ince ve kırılgandır ve çözeltinin yüzey gerilimi ile kırılabilir. Gofret, gofret kenarı önce çözeltiye girip çıkacak şekilde bir açıyla daldırılmalı veya çıkarılmalıdır.
  5. KOH aşındırma kalıntılarını ortadan kaldırın.
    1. Mikro desenli olacak bir çip dizisi elde etmek için çip dizisinin sınırlarını bir cımbızla hafifçe bastırın (Şekil 1B).
    2. Karıştırarak 80 °C'de 1,5 M KOH çözeltisi hazırlayın.
    3. Talaş dizisini 30 s boyunca KOH çözeltisine batırın ve 2x DI suya batırarak durulayın. N2 gazı üfleyerek talaşları tamamen kurulayın.
      NOT: Talaşları çözeltilere batırırken ve N 2 gazı ile üfleyerek kuruturken çok dikkatli olunmalıdır, çünkü bağımsız SixNy pencereleri çok ince ve kırılgandır. Talaş KOH çözeltisine daldırılırken, karıştırma durdurulmalıdır. Talaşlar önce kenarları çözeltiye dik yönde daldırılmalı ve paralel yöndeN2 gazı ile üflenmelidir.
    4. Talaş dizisini havada en az 1 saat boyunca tamamen kurutun.
  6. PR'yi desenleyin.
    1. Sağlam destek olarak boş bir 525 μm Si gofret hazırlayın. Yukarıda açıklandığı gibi Si gofretini HMDS ve pozitif PR ile döndürün, ancak PR'yi pişirmeden önce çip dizisini (serbest duran SixNy pencere tarafı yukarı doğru) Si gofrete takın. PR, gofret ve çip dizisi arasında bir yapıştırıcı görevi görür. Talaş dizisine bağlı Si gofreti, sıcak bir plaka üzerinde 90 s boyunca 100 ° C'de pişirin.
    2. Yukarıda açıklandığı gibi çip setini HMDS ve pozitif PR ile kaplayın.
    3. Çip setini ultraviyole ışıkla (365 nm dalga boyu; 20 mW/cm2 yoğunluk) bir hizalayıcı kullanarak bir krom maskesi (Şekil 2E,F) aracılığıyla 5 s boyunca pozlayın.
    4. PR'yi 15 sn için bir geliştirici kullanarak geliştirin, çip setini DI suya 2x batırarak durulayın ve PR desenli çip setiniN2 gazı üfleyerek tamamen kurutun.
  7. Mikro desenli SixNy'yi hazırlayın.
    1. Etch SixNy, laboratuvar yapımı bir RIE kullanarak PR desenlemesini takiben, 50 W'lık RF gücünde 3 sccm SF6 gazı ile.
  8. PR'ı ortadan kaldırın.
    1. Desenli çip setini 60 ° C'de 1-metil-2-pirolidinon (NMP) çözeltisine batırarak ve gece boyunca bırakarak PR'yi ortadan kaldırın. Talaş setini 2x DI suya batırarak durulayın ve Desenli talaş setiniN2 gazı üfleyerek tamamen kurulayın.
    2. Laboratuvarda üretilen Rie ile 150 W RF gücünde 100 sccm O2 gazı kullanarak 1 dakika boyunca PR kalıntılarını birO2 plazma prosesi ile ortadan kaldırın.
  9. Mikro desenli çipi durulayın.
    1. 80 °C'de 1,5 M KOH çözeltisi hazırlayın.
    2. PR kalıntılarını tamamen ortadan kaldırmak için mikro desenli cipsleri 30 sn boyunca KOH çözeltisine batırın ve cipsleri 2x DI suya batırarak durulayın. N2 gazı üfleyerek talaşları tamamen kurulayın.
    3. Talaşları havada en az 1 saat boyunca tamamen kurutun.
  10. Grafen oksidi (GO) damla döküm yöntemiyle aktarın.
    1. GO çözeltisini (2 mg / mL) DI su ile 0.2 mg / L'ye seyreltin ve GO tabakalarının agregalarını parçalamak için 10 dakika boyunca sonikasyon yapın. Seyreltilmiş GO çözeltisini 30 s için 300 x g'de santrifüj edin.
    2. Kızdırma, mikro desenli çipin Si kazınmış tarafını boşaltarak çip yüzeyini 1 dakika boyunca 15 mA'da bir kızdırma boşaltıcısı (Malzeme Tablosu) kullanarak pozitif şarjla oluşturur.
    3. GO çözeltisinin 3 μL'sini mikro desenli çipin parıltılı boşaltılmış tarafına bırakın ve damlayı çip üzerinde 1 dakika bekletin. 1 dakika sonra, çip üzerindeki fazla GO solüsyonunu filtre kağıdı ile temizleyin.
    4. GO ile aktarılan çipi parafin film üzerinde hazırlanan DI su damlacıkları ile yıkayın ve çip üzerindeki DI suyunu filtre kağıdı ile temizleyin. Bu prosedürü GO aktarılan tarafında 2x ve karşı tarafta 1x tekrarlayın. GO ile aktarılan çipi gece boyunca oda sıcaklığında kurutun.
    5. Mikro desenli çipi DI suyuna batırarak GO pencerelerle yıkayın ve çipi N2 gazı ile fön ile kurulayın.

2. Cryo-EM görüntüleme

  1. Kriyo-numuneyi hazırlayın.
    1. Kriyo numunesini, sıcaklığı, nemi, lekelenme süresini ve kuvveti kontrol eden mekanik bir kriyo-daldırma makinesi (Malzeme Tablosu) kullanarak hazırlayın. Leke pedi blöflere yüklendikten sonra, odadaki nemin ve sıcaklığın sırasıyla% 100 ve 15 ° C'de tutulduğundan emin olun.
    2. Mikro desenli çipi tipik bir kriyo-cımbızla alın ve cımbızı kriyo-dalma makinesine yükleyin. Pipet 3 μL numune çözeltisi, delik desenli taraftaki mikro desenli çip üzerine, altta GO pencereleri ile. Numune çözeltisine bağlı olarak lekelenme süresini ve kuvvetini kontrol edin.
      NOT: Burada, kriyo-EM görüntülemesi için insan immün yetmezlik virüsü (HIV-1), ferritin, proteazom 26S, groEL, apoferritin protein parçacıkları ve tau filament proteinleri gibi biyolojik örnekler kullanılmıştır. Ek olarak, kriyo-EM görüntüleme için Fe2O3 nanopartikülleri (NP), Au nanopartikülleri, Au nanorodları ve silika nanopartikülleri gibi çeşitli inorganik malzemeler kullanılmıştır. İstenilen lekelenme süresi ve kuvveti, farklı numune tipleri için kriyo pistonunda ayarlandı.
    3. Lekeleme işleminden sonra, numune yüklü çipi hemen sıvı etan içinde daldırarak dondurun. Çipi sıvı azot (LN 2) içindeki ızgara kutusuna aktarın ve kriyo-EM görüntülemeden önce LN2'de saklayın.
  2. Kriyo-EM görüntüleme yapın.
    1. Kriyo-numuneyi, sıcaklık -180 °C'de tutulacak şekilde bir kriyo-EM tutucuya yükleyin.
    2. Kriyo-EM tutucuyu bir TEM'e yükleyin ve numuneleri minimum doz sistemi (MDS) modunda gözlemleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GO pencereli mikro desenli bir çip, MEMS üretimi ve 2D GO nanosheet transferi ile üretildi. Mikro modelleme için çipler seri olarak üretildi ve gofretteki bir 4'ten yaklaşık 500 çip üretildi (Şekil 1B ve Şekil 2A, B). Mikro desenli çiplerin tasarımları, fotolitografi prosedürü sırasında krom maskesinin farklı tasarımları kullanılarak manipüle edilebilir (Şekil 2). Fabrikasyon mikro desenli çipler, bağımsız SixNy membranlarının sayılarını ve boyutlarını kontrol ediyordu. Serbest duran Si x Ny membranlarının sayıları 48 (6 x 8) ila 50 (5 x 10) arasında ve boyutları 50 x 40 μm 2 ila250 x40 μm2 arasında kontrol edildi (Şekil 3A, B, F, G). Her bağımsız SixNy membranı, farklı delik aralıklarına sahip 2-3 μm arasında değişen özelleştirilebilir çaplara sahip onlarca ila yüzlerce mikro deliğe sahip olabilir. Fabrikasyon mikro desenli çipler ~ 25.000'e kadar GO asılı deliğe sahipken, deliklerin sayısı da kontrol edilebilir (Şekil 3B-D ve Şekil 3G-I). Delikteki ince GO tabakasının varlığı, Raman spektroskopisi ve elektron kırınımı ile doğrulandı. GO penceresindeki Raman spektrumu, GO'nun temsili zirvelerini, yani sırasıyla 1360 cm-1 ve 1590 cm-1'de D ve G bantlarını,22'yi gösterdi (Şekil 3E). Çarpma yönelimli altıgen kırınım desenleri, pencerelerin çok katmanlı GO'dan oluştuğunu göstermektedir (Şekil 3J).

GO pencereli mikro desenli çip, mikro deliklerin derinliğini düzenlemenin fizibilitesini doğrulamak için LPCVD işlemi sırasında Sigofretüzerindeki Si x Ny'nin biriktirme kalınlığını kontrol ederek üç temsili hedef derinlikte (25 nm, 50 nm ve 100 nm) üretildi. GO pencereli mikro deliklerin yapısını ve kalınlığını değerlendirmek için GO pencereli mikro desenli çipin 40° eğimli ve kesitsel taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüleri elde edilmiştir. Bir GO pencereli mikro deliğin kuyu tipi yapısı, mikro deliğin derinliğinin hedeflenen derinliğe karşılık gelmesiyle açıkça gözlenmiştir (Şekil 4). Sonuçlar, mikro desenli çipin sayısını ve tasarımını GO pencereleri ile kontrol etmenin mümkün olduğunu doğrulamaktadır.

Kriyo-EM görüntüleme için mikro desenli çipin kullanımını göstermek için, mikro desenli çip kullanılarak biyomoleküllerin ve inorganik NP'lerin çeşitli kriyo-örnekleri hazırlanmıştır. Biyolojik örnekler için, HIV-1, ferritin, proteazom 26S, groEL, apoferritin protein parçacıkları ve tau filament proteinleri, GO pencereli mikro desenli çip kullanılarak kriyo-EM ile görüntülendi (Şekil 5A-F). Biyomoleküllerin yanı sıra, Fe2O3 NP'ler, Au NP'ler, Au nanorodlar ve silika NP'ler gibi inorganik malzemeler de mikro desenli çipler kullanılarak kriyo-EM tarafından gözlenmiştir (Şekil 5G-J).

Figure 1
Resim 1: Kriyo-EM için GO pencereli yeni geliştirilen mikro desenli çipin üretim prosedürünün şemaları ve görüntüleri. (A) İmalat sürecinin şemaları ve imalat işlemi sırasında GO pencereli mikro desenli çipin enine kesitleri. (B) Her imalat adımındaki imalat ürünlerinin görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Fotolitografi işlemi için kullanılan krom maskelerinin kısa bir gösterimi. (A,B) 4 in Si gofret (24 x 24 çip dizisi) için çiplerin seri üretimi için maske tasarımı, (C,D) 2 x 2 çip dizisi tasarımları ve (E,F) mikro delik desenlerinin tasarımları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: GO pencereli mikro desenli çiplerin yapısı. (A,F) BÜTÜN MIKRO DESENLI ÇIPLERIN optik mikroskopi görüntüleri, (B,G) Tek mikro desenli SixNy membranların SEM görüntüleri, (C,H) mikro desenlerin SEM görüntüleri ve (D,I) GO pencereli tek mikro deliklerin SEM görüntüleri. (E,J) (E) Raman spektrumu ve (J) GO penceresinin seçilen alan elektron kırınımı (SAED) paterni aracılığıyla mikro delikte GO'nun doğrulanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: GO pencereli mikro deliğin iyi yapısı ve derinliği. (A-C) GO pencereli tek bir mikro deliğin 40° eğimli SEM görüntüleri ve (D-F) farklı derinliklerde (25 nm, 50 nm ve 100 nm) GO pencereli mikro desenli çipin kesitsel SEM görüntüsü. (G) Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) 3D render görüntüsü, (H) AFM saptırma görüntüsü ve (I) kırmızı çizgi boyunca çizgi profili, (H) 100 nm SixNy membran ile imal edilmiş GO pencereli mikro desenli çipin derinliğini gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: GO pencereli mikro desenli çip kullanılarak çeşitli boyutlarda biyomalzemelerin ve inorganik nanomalzemelerin kriyo-EM görüntüleri . (A) HIV-1 virüs parçacığı, (B) ferritin, (C) proteazom 26S, (D) groEL, (E) apoferritin, (F) tau proteini (fibrilize tau proteinini gösteren oklar), (G) Fe2O3 NP, (H) Au NP, (I) Au nanorod ve (J) silika NP. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GO pencereli mikro desenli çipler üretmek için mikrofabrikasyon süreçleri burada tanıtılmaktadır. Fabrikasyon mikro desenli çip, analiz edilecek malzemenin boyutuna bağlı olarak mikro deliğin derinliğini GO pencereleri ile kontrol ederek vitreus buz tabakasının kalınlığını düzenlemek için tasarlanmıştır. GO pencereli mikro desenli bir çip, bir dizi MEMS tekniği ve bir 2D nanosheet transfer yöntemi kullanılarak üretildi (Şekil 1). MEMS imalat tekniğini kullanmanın en büyük avantajı, seri üretim kabiliyeti ve fotolitografi sırasında krom maskesinin farklı tasarımlarını kullanarak mikroçipin yapısını ve boyutlarını manipüle etme fizibilitesidir (Şekil 2). Düşük gerilimli LPCVD ile birikmiş Si x N y tabakası, onlarca nanometre kalınlığındaki serbest duran SixNy23,24,25,26'nın stabilitesini sağlar. Bununla birlikte, nanometre ölçeğinde serbest duran SixNy tabakası, dikey yön27'deki kuvvetlere karşı hala savunmasızdır. Bu nedenle, mikro desenli çipi tutarken, örneğin çözeltiye daldırma veya üflemeli kurutma sırasında çok dikkatli olunması gerekir. Ek olarak, mikro desenli çip için üretim süreci, çoğu kriyo-EM numune tutucu ve otomatik yükleyici ile uyumluluk sağlayan 100 μm Si gofret kullanır. Bununla birlikte, kırılgan gofretin kırılmasını önlemek için imalat işlemleri sırasında dikkatli olunması gerekir.

GO pencereli kuyu tipi yapıların mikron ölçeğindeki düzenli dizisi optik mikroskop ve SEM ile doğrulandı (Şekil 3 ve Şekil 4). Ayrıca, GO transferi için damla döküm yöntemi, yüksek düzlükte ve gözle görülür kırışıklıklar olmadan GO birikimini sağlar (Şekil 3D, E, I, J). Mikro desenli çip, kriyo-EM otomatik yükleyiciye yükleme için uygundur ve düzenli bir dizideki on binlerce mikron ölçekli delik, tek parçacık analizi için büyük görüntü verilerinin otomatik olarak toplanmasını sağlar. Ayrıca, SixNy membranların ve GO destekli mikro deliklerin sayısı ve morfolojisi, MEMS üretim sürecinde kolayca manipüle edilebilir ve araştırma amaçlarına bağlı olarak yüksek verimli tek parçacık analizi ve diğer kriyo-EM görüntüleme deneylerine izin verir. Ayrıca, kontrollü kalınlığa sahip mikro desenli çiplerin genişletilmiş uygulamaları, nanometre ölçeğinde desenli deliklere sahip çiplerin imalatı ile kolaylaştırılabilir. Yarı iletken endüstrisinde geliştirilen nano-desenleme teknikleri, bu çiplerin imalatında benimsenebilir28,29,30.

Mikro deliklerin derinliğini düzenleme yeteneği, burada üç temsili hedef derinlikte GO pencereli mikro desenli çipler imal edilerek gösterilmiştir: 25 nm, 50 nm ve 100 nm. Si gofret üzerindeki SixNy tabakasının biriktirme süresi kontrol edilerek mikrowell yapısının farklı derinliklerine ulaşılmıştır (Şekil 4). GO pencereleri ile mikro desenli çipin morfolojisinin ve kalınlığının değerlendirilmesi için odaklanmış iyon ışını (FIB) kesitlerinden elde edilen cihazların kesitleri SEM ile, derinlik profili AFM ile ölçülmüştür (Şekil 4). GO pencereli mikro deliğin iyi tip yapısı, SEM ve AFM görüntülerinde açıkça gösterildi ve SixNy mikro deliğinin derinliğinin ve GO penceresinin transferinin başarılı bir şekilde kontrol edildiğini doğruladı. GO pencereli özelleştirilebilir mikro desenli çipin kullanılmasının, kriyo-EM görüntüleme için optimum buz kalınlığına sahip bölgeler üretmede yüksek bir başarı oranı sağlaması muhtemeldir.

Kriyo-EM ile gözlemlenecek malzemeler farklı boyutlara sahip olduklarından, uygun kalınlıkta vitreus buzu üretmek, kriyo-EM görüntüleme sırasında gelişmiş kontrast çözünürlüğü, geniş bir oryantasyon kapsamı ve yapının daha az denatürasyonunu sağlayabilir. Kriyo-EM görüntüleme işleminin biyolojik uygulamalar için kullanımını göstermek için, HIV-1, ferritin, proteazom 26S, groEL, apoferritin ve tau proteini dahil olmak üzere farklı boyutlarda çeşitli biyolojik örnekler, GO pencereli mikro desenli çip kullanılarak görüntülendi. Biyomoleküller, GO pencereli mikro desenli çip kullanılarak açıkça gözlemlendi (Şekil 5A-F). Biyomoleküllerin yanı sıra, Fe2O3 NP'ler, Au NP'ler, Au nanoçubuklar ve silika NP'ler gibi çeşitli inorganik nanomalzeme türleri de GO pencereli mikro desenli çip kullanılarak gözlemlenmiştir (Şekil 5G-J). Mikro desenli çip ve imalat yöntemi, çeşitli malzemelerin kriyo-görüntülemesi için uyumluluk gösterir. Böylece, yeni geliştirilen GO pencereli mikro desenli çip, kriyo-EM ile verimli ve yüksek verimli yapı analizi için güvenilir ve tekrarlanabilir bir numune hazırlama stratejisi sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

M.-H.K., S.K., M.L. ve J.P., Temel Bilimler Enstitüsü'nün mali desteğini kabul etmektedir (Hibe No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. ve J.P., Seul Ulusal Üniversitesi (2021) aracılığıyla Yaratıcı-Öncü Araştırmacılar Programı'nın finansal desteğini ve Kore hükümeti tarafından finanse edilen NRF hibesini (MSIT; Hibe No. NMG-2020R1A2C2101871 ve NMG-2021M3A9I4022936). M.L. ve J.P., POSCO TJ Park Vakfı'nın POSCO Bilim Bursu'nun mali desteğini ve Kore hükümeti tarafından finanse edilen NMK hibesini (MSIT; Hibe No. NMG-2017R1A5A1015365). J.P., Kore hükümeti (MSIT; Hibe No. NMK-2020R1A6C101A183) ve Seul Ulusal Üniversitesi Mühendislik Fakültesi ve Tıp Fakültesi tarafından Disiplinlerarası Araştırma Girişimleri Programları (2021). M.-H.K., Kore hükümeti (MSIT; Hibe No. NMG-2020R1I1A1A0107416612). Yazarlar, Seul Ulusal Üniversitesi Makromoleküler ve Hücre Görüntüleme Merkezi (SNU CMCI) personeline ve ekibine, kriyo-EM deneyleri ile yorulmak bilmeyen çabaları ve azimleri için teşekkür eder. Yazarlar, FIB-SEM deneylerine yardım için Ulusal Üniversitelerarası Araştırma Tesisleri Merkezi'nden S. J. Kim'e teşekkür ediyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma Aldrich, USA 443778
Acetone
AFM Park Systems, South Korea NX-10
Aligner Midas System, South Korea MDA-600S
AZ 300 MIF developer AZ Electronic Materials USA Corp., USA 184411
Cryo-EM holder Gatan, USA 626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) FEI Company, USA Helios NanoLab 650
Glow discharger Ted Pella Inc., USA PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution Sigma Aldrich, USA 763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% Alfa Aesar, USA 10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) Centrotherm, Germany LPCVD E1200
maP1205 positive PR Micro resist technology, Germany A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea 6597-4400
Raman Spectrometer NOST, South Korea Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE) Scientific Engineering, South Korea Lab-built
SEM Carl Zeiss, Germany SUPRA 55VP
Si wafer JP COMMERCE, South Korea 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater Dong Ah Trade Corp., South Korea ACE-200
TEM JEOL, Japan JEM-2100F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
  2. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
  3. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  4. Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
  5. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
  6. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  7. Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
  8. Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
  9. Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
  10. Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
  11. Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
  12. Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
  13. Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
  14. Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  15. Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
  16. Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
  17. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
  18. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
  19. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
  20. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
  22. Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
  23. Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
  24. Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
  25. Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
  26. Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
  27. Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
  28. Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
  29. Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
  30. Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).

Tags

Mühendislik Sayı 182 Kriyojenik-elektron mikroskobu mikroelektromekanik sistemler grafen oksit vitreus buz kalınlığı virüs protein nanomalzemeler
Yüksek Verimli Kriyojenik Elektron Mikroskobu için Kontrollü Kalınlığa Sahip Mikro Desenli Çip İmalatı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S.,… More

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (182), e63739, doi:10.3791/63739 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter