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Engineering

उच्च थ्रूपुट क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नियंत्रित मोटाई के साथ माइक्रो-पैटर्न वाली चिप का निर्माण

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63739
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,4, 3,4,5,6
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

Summary

ग्राफीन ऑक्साइड खिड़कियों के साथ एक नव विकसित माइक्रो-पैटर्न वाली चिप को माइक्रोइलेक्ट्रोमैकेनिकल सिस्टम तकनीकों को लागू करके बनाया जाता है, जो विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स और नैनोमैटेरियल्स के कुशल और उच्च-थ्रूपुट क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग को सक्षम करता है।

Abstract

क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) का उपयोग करके बायोमोलेक्यूल्स के कुशल और उच्च-थ्रूपुट संरचना विश्लेषण के लिए एक प्रमुख सीमा नैनोस्केल पर नियंत्रित बर्फ की मोटाई के साथ क्रायो-ईएम नमूने तैयार करने में कठिनाई है। सिलिकॉन (एसआई) आधारित चिप, जिसमें मोटाई-नियंत्रित सिलिकॉन नाइट्राइड (एसआईएक्सएन वाई) फिल्म पर पैटर्न वाले ग्राफीन ऑक्साइड (जीओ) विंडो के साथ सूक्ष्म-छेदकी एक नियमित सरणी है, माइक्रोइलेक्ट्रोमैकेनिकल सिस्टम (एमईएमएस) तकनीकों को लागू करके विकसित किया गया है। यूवी फोटोलिथोग्राफी, रासायनिक वाष्प जमाव, पतली फिल्म की गीली और सूखी नक़्क़ाशी, और 2 डी नैनोशीट सामग्री की ड्रॉप-कास्टिंग का उपयोग जीओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाले चिप्स के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए किया गया था। क्रायो-ईएम विश्लेषण के लिए नमूने के आकार के आधार पर, सूक्ष्म-छेद की गहराई को मांग पर बर्फ की मोटाई को नियंत्रित करने के लिए विनियमित किया जाता है। बायोमोलेक्यूल्स की ओर जीओ की अनुकूल आत्मीयता क्रायो-ईएम नमूना तैयारी के दौरान माइक्रो-होल के भीतर ब्याज के बायोमोलेक्यूल्स को केंद्रित करती है। जीओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप विभिन्न जैविक अणुओं के साथ-साथ अकार्बनिक नैनोमैटेरियल्स के उच्च-थ्रूपुट क्रायो-ईएम इमेजिंग को सक्षम बनाती है।

Introduction

क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) को उनके मूल राज्य 1,2,3,4 में प्रोटीन की त्रि-आयामी (3 डी) संरचना को हल करने के लिए विकसित किया गया है। तकनीक में कांच की बर्फ की एक पतली परत (10-100 एनएम) में प्रोटीन को ठीक करना और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) का उपयोग करके यादृच्छिक रूप से उन्मुख प्रोटीन की प्रक्षेपण छवियों को प्राप्त करना शामिल है, जिसमें नमूना तरल नाइट्रोजन तापमान पर बनाए रखा जाता है। हजारों से लाखों प्रक्षेपण छवियों का अधिग्रहण किया जाता है और कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम 5,6 द्वारा प्रोटीन की 3 डी संरचना के पुनर्निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है। क्रायो-ईएम के साथ सफल विश्लेषण के लिए, क्रायो-नमूना तैयारी को सोख्ता की स्थिति, आर्द्रता और तापमान को नियंत्रित करने वाले उपकरणों को डुबकी-फ्रीज करके स्वचालित किया गया है। नमूना समाधान एक छेद कार्बन झिल्ली के साथ एक टेम ग्रिड पर लोड किया जाता है, अतिरिक्त समाधान को हटाने के लिए क्रमिक रूप से धब्बा लगाया जाता है, और फिर पतली, कांच की बर्फ 1,5,6 का उत्पादन करने के लिए तरल ईथेन के साथ डुबकी-जमे हुए। क्रायो-ईएम में प्रगति और नमूना तैयारी7 के स्वचालन के साथ, क्रायो-ईएम का उपयोग प्रोटीन की संरचना को हल करने के लिए तेजी से किया गया है, जिसमें कोशिका झिल्ली 8,9,10 में वायरस और आयन चैनल प्रोटीन के लिए लिफाफा प्रोटीन शामिल हैं। रोगजनक वायरल कणों के लिफाफा प्रोटीन की संरचना वायरल संक्रमण विकृति को समझने के साथ-साथ निदान प्रणाली और टीकों जैसे सार्स-सीओवी-211 को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है, जो कोविड-19 महामारी का कारण बनी। इसके अलावा, क्रायो-ईएम तकनीकों को हाल ही में सामग्री विज्ञान पर लागू किया गया है, जैसे कि बैटरी 12,13,14 और उत्प्रेरक प्रणालियों 14,15 में उपयोग की जाने वाली इमेजिंग बीम-संवेदनशील सामग्रियों के लिए और समाधान-राज्य16 में अकार्बनिक सामग्रियों की संरचना का विश्लेषण करना।

क्रायो-ईएम और प्रासंगिक तकनीकों में ध्यान देने योग्य विकास के बावजूद, क्रायो-नमूना तैयारी में सीमाएं मौजूद हैं, जो उच्च-थ्रूपुट 3 डी संरचना विश्लेषण में बाधा डालती हैं। परमाणु संकल्प के साथ जैविक सामग्रियों की 3 डी संरचना प्राप्त करने के लिए इष्टतम मोटाई के साथ एक कांच की बर्फ की फिल्म तैयार करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। बर्फ द्वारा बिखरे हुए इलेक्ट्रॉनों से पृष्ठभूमि शोर को कम करने और इलेक्ट्रॉन बीम पथ1,17 के साथ बायोमोलेक्यूल्स के ओवरलैप को प्रतिबंधित करने के लिए बर्फ पर्याप्त पतली होनी चाहिए। हालांकि, यदि बर्फ बहुत पतली है, तो यह प्रोटीन अणुओं को पसंदीदा झुकाव याविकृत 18,19,20 में संरेखित करने का कारण बन सकता है। इसलिए, कांच की बर्फ की मोटाई को ब्याज की सामग्री के आकार के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, तैयार टीईएम ग्रिड पर बर्फ और प्रोटीन अखंडता के नमूना तैयार करने और मैनुअल स्क्रीनिंग के लिए आमतौर पर व्यापक प्रयास की आवश्यकता होती है। यह प्रक्रिया बेहद समय लेने वाली है, जो उच्च-थ्रूपुट 3 डी संरचना विश्लेषण के लिए इसकी दक्षता में बाधा डालती है। इसलिए, क्रायो-ईएम नमूना तैयारी की विश्वसनीयता और प्रजनन क्षमता में सुधार संरचनात्मक जीव विज्ञान और वाणिज्यिक दवा की खोज के साथ-साथ सामग्री विज्ञान के लिए क्रायो-ईएम के उपयोग को बढ़ाएगा।

इसमें, हम नियंत्रित बर्फ मोटाई21 के साथ उच्च-थ्रूपुट क्रायो-ईएम के लिए डिज़ाइन की गई ग्राफीन ऑक्साइड (जीओ) खिड़कियों के साथ एक सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप बनाने के लिए माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रियाओं को पेश करते हैं। माइक्रो-पैटर्न वाली चिप को माइक्रोइलेक्ट्रोमैकेनिकल सिस्टम (एमईएमएस) तकनीकों का उपयोग करके बनाया गया था, जो इमेजिंग उद्देश्यों के आधार पर चिप की संरचना और आयामों में हेरफेर कर सकता है। जीओ खिड़कियों के साथ माइक्रो-पैटर्न वाली चिप में एक माइक्रोवेल संरचना होती है जिसे नमूना समाधान से भरा जा सकता है, और कांच की बर्फ की मोटाई को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोवेल की गहराई को विनियमित किया जा सकता है। बायोमोलेक्यूल्स के लिए जीओ की मजबूत आत्मीयता विज़ुअलाइज़ेशन के लिए बायोमोलेक्यूल्स की एकाग्रता को बढ़ाती है, जिससे संरचना विश्लेषण की दक्षता में सुधार होता है। इसके अलावा, माइक्रो-पैटर्न वाली चिप एक सी फ्रेम से बना है, जो ग्रिड19 के लिए उच्च यांत्रिक स्थिरता प्रदान करता है, जिससे यह नमूना तैयारी प्रक्रियाओं और क्रायो-ईएम इमेजिंग के दौरान चिप को संभालने के लिए आदर्श है। इसलिए, एमईएमएस तकनीकों द्वारा गढ़ी गई जीओ खिड़कियों के साथ एक सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप क्रायो-ईएम नमूना तैयारी की विश्वसनीयता और प्रजनन क्षमता प्रदान करती है, जो क्रायो-ईएम के आधार पर कुशल और उच्च-थ्रूपुट संरचना विश्लेषण को सक्षम कर सकती है।

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Protocol

1. जाओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म पैटर्न चिप का निर्माण (चित्रा 1)

  1. सिलिकॉन नाइट्राइड जमा करें।
    1. 830 डिग्री सेल्सियस पर कम दबाव रासायनिक वाष्प जमाव (एलपीसीवीडी) का उपयोग करके सी वेफर (4 इंच व्यास और 100 μm मोटाई) के दोनों किनारों पर कम तनाव सिलिकॉन नाइट्राइड (सीएक्सएनवाई) जमा करें और 150 मीटर के दबाव, 170 एससीसीएम डाइक्लोरोसिलेन (एसआईएच2सीएल2, डीसीएस) और 38 एससीसीएम अमोनिया (एनएच 3) के प्रवाहके तहत।
    2. मिनट की जमाव दर का उपयोग करके, जमाव समय को बदलकर 25-100 एनएम के भीतर होने के लिए सीएक्सएनवाई मोटाई को नियंत्रित करें।
      नोट: सी वेफर को संभालते समय अत्यधिक देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि वेफर बहुत पतला और नाजुक है। ध्यान रखें कि उपकरण में इसकी हैंडलिंग या लोडिंग के दौरान वेफर को मोड़ना न पड़े।
  2. फोटोरेसिस्ट को पैटर्न करें।
    1. वेफर की पूरी सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ सीएक्सएनवाई-जमा सी वेफर पर एक हेक्सामेथिलडिसिलाज़ेन (एचएमडीएस) समाधान लागू करें, 30 एस के लिए 3,000 आरपीएम पर स्पिन कोटर के साथ स्पिन कोट, और वेफर सतह हाइड्रोफोबिक को प्रस्तुत करने के लिए गर्म प्लेट पर 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना और इस प्रकार फोटोरेसिस्ट (पीआर) के साथ एक अच्छा कोटिंग प्रदर्शन सुनिश्चित करें।
    2. वेफर की पूरी सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ सकारात्मक पीआर (सामग्री की तालिका) लागू करें, 30 एस के लिए 3,000 आरपीएम पर स्पिन कोट, और गर्म प्लेट पर 90 एस के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना। स्पिन-लेपित पीआर की मोटाई 500 एनएम है।
    3. एक संरेखक का उपयोग करके क्रोमियम मुखौटा (चित्रा 2 ए-डी) के माध्यम से 5 एस के लिए पराबैंगनी प्रकाश (365 एनएम तरंग दैर्ध्य और 20 मेगावाट/ सेमी 2 तीव्रता) के साथ पीआर-लेपित वेफर का पर्दाफाश करें।
    4. एक डेवलपर (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर 1 मिनट के लिए पीआर विकसित करें और विआयनीकृत (डीआई) पानी 2x में विसर्जित करके वेफर कुल्ला। वेफर सतह पर एन2 गैस उड़ाकर पीआर-पैटर्न वाले वेफर को पूरी तरह से सूखाएं।
      नोट: सी वेफर पर एन2 गैस उड़ाते समय अत्यधिक देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि वेफर बहुत पतला और नाजुक है। वेफर के लंबवत दिशा में उच्च दबाव के साथ एन2 गैस को न उड़ाएं, क्योंकि इससे वेफर फ्रैक्चर हो सकता है।
  3. पैटर्न सीएक्सएनवाई।
    1. 50 डब्ल्यू की रेडियोफ्रीक्वेंसी (आरएफ) शक्ति पर 3 एससीसीएम सल्फर हेक्साफ्लोराइड (एसएफ 6) गैस के साथ प्रयोगशाला-निर्मित प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी (आरआईई) का उपयोग करके पीआर के पैटर्निंग के बाद उजागर एसआईएक्सएनवाई खोदें। इन सेटिंग्स के साथ नक़्क़ाशी दर ~ 6 ए / जमा की गई सीएक्सएनवाई परत की मोटाई के आधार पर नक़्क़ाशी समय सेट करें।
      नोट: नक़्क़ाशी दर भिन्न हो सकती है और उपयोग किए गए आरआईई उपकरणों के विनिर्देशों के आधार पर इन-लैब अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
    2. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एसीटोन में सीएक्सएनवाई पैटर्न वाले वेफर को डुबोकर पीआर को खत्म करें, इसके बाद डीआई पानी 2 एक्स में डुबोकर वेफर को कुल्ला करें। वेफर सतह पर एन2 गैस उड़ाकर वेफर को पूरी तरह से सूखाएं।
      नोट: समाधान से वेफर को विसर्जित या बाहर निकालते समय अत्यधिक देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि समाधान की सतह के तनाव से वेफर को फ्रैक्चर किया जा सकता है। घोल की सतह के समानांतर वेफर को विसर्जित या बाहर न निकालें। कार्बन फाइबर युक्तियों के साथ सटीक वेफर हैंडलिंग चिमटी का उपयोग करें। चिमटी के साथ वेफर को दृढ़ता से न पकड़ें; वेफर के एक तरफ उठाएं जब तक कि वेफर एक कोण पर झुक न जाए, जहां इसे समाधान से बाहर निकाला जा सकता है। उठाने के दौरान फर्म पकड़ के कारण झुकने पर वेफर फ्रैक्चर हो सकता है।
  4. सी खोदना।
    1. 80 डिग्री सेल्सियस पर डीआई पानी में केओएच पाउडर को भंग करके 1.5 एम पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड (केओएच) समाधान तैयार करें।
    2. उजागर सी खोदने के लिए केओएच समाधान में सीएक्सएनवाई पैटर्न वाले वेफर को विसर्जित करें सी एक्स एन वाई पैटर्न वाले सी एक्स एन वाई के विपरीत तरफ फ्री-स्टैंडिंग सीएक्सएनवाई खिड़कियों को सरगर्मी के साथ समाधान में छोड़दें।
      नोट: गीला नक़्क़ाशी समय सी की मोटाई के आधार पर भिन्न हो सकता है; 100 μm मोटी वेफर के लिए, गीले नक़्क़ाशी में आमतौर पर कई घंटे लगते हैं। सी नक़्क़ाशी के दौरान सरगर्मी की गति बहुत अधिक सेट न करें क्योंकि फ्री-स्टैंडिंग सीएक्सएनवाई खिड़कियां बहुत पतली हैं और तरल पदार्थ के प्रवाह से खंडित हो सकती हैं। इस प्रयोग में, सरगर्मी दर 250 आरपीएम पर सेट की गई थी।
    3. नक़्क़ाशी अवशेषों को खत्म करने के लिए डीआई पानी के स्नान में कई बार डुबोकर नक़्क़ाशीदार वेफर को साफ करें। वेफर को हवा में सुखाएं।
      नोट: समाधान से सी पैटर्न वाले वेफर को विसर्जित या बाहर निकालते समय अत्यधिक देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि फ्री-स्टैंडिंग सीएक्सएनवाई खिड़कियां बहुत पतली और नाजुक हैं और समाधान की सतह के तनाव से खंडित हो सकती हैं। वेफर को एक कोण पर विसर्जित या बाहर निकाला जाना चाहिए, जैसे कि वेफर का किनारा पहले समाधान में प्रवेश करता है और बाहर निकलता है।
  5. केओएच नक़्क़ाशी अवशेषों को हटा दें।
    1. चिप्स की एक सरणी प्राप्त करने के लिए एक चिमटी के साथ चिप सरणी की सीमाओं को हल्के ढंग से दबाएं जो सूक्ष्म पैटर्न (चित्रा 1 बी) होगा।
    2. सरगर्मी के साथ 80 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 एम केओएच समाधान तैयार करें।
    3. 30 एस के लिए केओएच समाधान में चिप सरणी विसर्जित करें और इसे डीआई पानी 2 एक्स में डुबोकर कुल्लाएं। एन2 गैस उड़ाकर चिप्स को पूरी तरह से सुखाएं।
      नोट: समाधान में चिप्स को डुबोते समय अत्यधिक देखभाल की जानी चाहिए और उन्हें एन2 गैस के साथ झटका-सुखाने चाहिए क्योंकि फ्री-स्टैंडिंग सीएक्सएनवाई खिड़कियां बहुत पतली और नाजुक हैं। जबकि चिप को केओएच समाधान में डूबा हुआ है, सरगर्मी को रोक दिया जाना चाहिए। चिप्स को उनके किनारों के साथ पहले समाधान के लंबवत दिशा में डुबोया जाना चाहिए और समानांतर दिशा में एन2 गैस के साथ उड़ाया जाना चाहिए।
    4. कम से कम 1 घंटे के लिए हवा में चिप सरणी को पूरी तरह से सूखा दें।
  6. पैटर्न पीआर।
    1. ठोस समर्थन के रूप में एक रिक्त 525 μm सी वेफर तैयार करें। एचएमडीएस और सकारात्मक पीआर के साथ सी वेफर को स्पिन करें, जैसा कि ऊपर वर्णित है, लेकिन पीआर को बेक करने से पहले सी वेफर पर चिप सरणी (फ्री-स्टैंडिंग सीएक्सएनवाई विंडो साइड के साथ ऊपर की ओर) संलग्न करें। पीआर वेफर और चिप सरणी के बीच एक चिपकने वाला के रूप में कार्य करता है। एक गर्म प्लेट पर 90 एस के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर चिप सरणी के साथ जुड़े सी वेफर सेंकना।
    2. एचएमडीएस और सकारात्मक पीआर के साथ चिप सेट को स्पिन करें, जैसा कि ऊपर वर्णित है।
    3. एक संरेखक का उपयोग कर क्रोमियम मुखौटा (चित्रा 2 ई, एफ) के माध्यम से 5 एस के लिए पराबैंगनी प्रकाश (365 एनएम तरंग दैर्ध्य; 20 मेगावाट /
    4. 15 एस के लिए एक डेवलपर का उपयोग करके पीआर विकसित करें, चिप सेट को डीआई पानी 2 एक्स में डुबोकर कुल्लाएं, और एन2 गैस उड़ाकर पीआर पैटर्न वाली चिप सेट को पूरी तरह से सूखा दें।
  7. सूक्ष्म पैटर्न वाले सीएक्सएनवाई तैयार करें।
    1. 50 डब्ल्यूकी आरएफ शक्ति पर 3 एससीसीएम एसएफ6 गैस के साथ प्रयोगशाला निर्मित आरआईई का उपयोग करके पीआर पैटर्निंग के बादखोदना सी एक्सएनवाई सी एक्स एन वाई परत की मोटाई के आधार पर नक़्क़ाशी समयको नियंत्रित करें।
  8. पीआर को हटा दें।
    1. 60 डिग्री सेल्सियस पर 1-मिथाइल-2-पाइरोलिडिनोन (एनएमपी) समाधान में सेट पैटर्न चिप को डुबोकर और इसे रात भर छोड़कर पीआर को समाप्त करें। चिप सेट को डीआई पानी 2x में डुबोकर कुल्ला, और एन2 गैस उड़ाकर सेट पैटर्न वाली चिप को पूरी तरह से सूखा दें।
    2. प्रयोगशाला निर्मित आरआईई के साथ 1 मिनट के लिए 150 डब्ल्यू की आरएफ शक्ति पर 100 एससीसीएम ओ 2 गैस का उपयोग करके ओ2 प्लाज्मा प्रक्रिया के साथ पीआर अवशेषों को समाप्त करें।
  9. सूक्ष्म पैटर्न चिप कुल्ला।
    1. 80 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 एम केओएच समाधान तैयार करें।
    2. पीआर अवशेषों को पूरी तरह से खत्म करने के लिए 30 एस के लिए केओएच समाधान में सूक्ष्म पैटर्न वाले चिप्स विसर्जित करें और चिप्स को डीआई पानी 2 एक्स में डुबोकर कुल्लाएं। एन2 गैस उड़ाकर चिप्स को पूरी तरह से सुखाएं।
    3. चिप्स को कम से कम 1 घंटे के लिए हवा में पूरी तरह से सुखाएं।
  10. ड्रॉप-कास्टिंग विधि द्वारा ग्राफीन ऑक्साइड (जीओ) स्थानांतरित करें।
    1. डीआई पानी के साथ 0.2 मिलीग्राम / एल के लिए पतला जाओ समाधान (2 मिलीग्राम / एमएल) और जीओ शीट के समुच्चय को तोड़ने के लिए 10 मिनट के लिए सोनिकेट करें। 30 एस के लिए 300 एक्स जी पर पतला जाओ समाधान अपकेंद्रित्र।
    2. चमक 1 मिनट के लिए 15 एमए पर एक चमक निर्वहन (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर सकारात्मक चार्ज के साथ चिप सतह प्रस्तुत करने के लिए सूक्ष्म पैटर्न चिप के सी नक़्क़ाशीदार पक्ष निर्वहन।
    3. सूक्ष्म पैटर्न चिप की चमक छुट्टी की तरफ जाओ समाधान के 3 μL ड्रॉप और 1 मिनट के लिए चिप पर ड्रॉप छोड़ दें। 1 मिनट के बाद, फिल्टर पेपर के साथ चिप पर अतिरिक्त जाओ समाधान को दूर करें।
    4. पैराफिन फिल्म पर तैयार डीआई पानी की बूंदों के साथ जीओ-ट्रांसफर चिप को धो लें और फिल्टर पेपर के साथ चिप पर डीआई पानी को धब्बा दें। इस प्रक्रिया को जीओ ट्रांसफर साइड पर 2एक्स और विपरीत तरफ 1एक्स दोहराएं। रात भर कमरे के तापमान पर जीओ-ट्रांसफर चिप को सुखाएं।
    5. माइक्रो-पैटर्न वाली चिप को डीआई पानी में डुबोकर जीओ खिड़कियों के साथ धो लें और चिप को एन2 गैस के साथ ब्लो-ड्राई करें।

2. क्रायो-ईएम इमेजिंग

  1. क्रायो-नमूना तैयार करें।
    1. एक यांत्रिक क्रायो-प्लंजिंग मशीन (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके क्रायो-नमूना तैयार करें, जो तापमान, आर्द्रता, सोख्ता समय और बल को नियंत्रित करता है। ब्लॉटिंग पैड को ब्लॉटर्स पर लोड करने के बाद, सुनिश्चित करें कि कक्ष में आर्द्रता और तापमान क्रमशः 100% और 15 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है।
    2. एक ठेठ क्रायो-चिमटी के साथ माइक्रो-पैटर्न वाली चिप उठाएं और चिमटी को क्रायो-प्लंजिंग मशीन में लोड करें। छेद-पैटर्न वाली तरफ सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप पर नमूना समाधान के पिपेट 3 μL, तल पर जाओ खिड़कियों के साथ। नमूना समाधान के आधार पर सोख्ता समय और बल को नियंत्रित करें।
      नोट: यहां, जैविक नमूने, अर्थात् मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी -1), फेरिटिन, प्रोटीसोम 26 एस, ग्रोएल, एपोफेरिटिन प्रोटीन कणों और ताऊ फिलामेंट प्रोटीन का उपयोग क्रायो-ईएम इमेजिंग के लिए किया गया था। इसके अलावा, क्रायो-ईएम इमेजिंग के लिए विभिन्न प्रकार के अकार्बनिक पदार्थों, जैसे फे2ओ3 नैनोकणों (एनपी), एयू नैनोकणों, एयू नैनोरोड्स और सिलिका नैनोकणों का उपयोग किया गया था। वांछित सोख्ता समय और बल विभिन्न प्रकार के नमूनों के लिए क्रायो सवार पर सेट किए गए थे।
    3. सोख्ता प्रक्रिया के बाद, तरल ईथेन में तुरंत नमूना-लोडेड चिप को डुबोएं-फ्रीज करें। तरल नाइट्रोजन (एलएन2) में ग्रिड बॉक्स में चिप को स्थानांतरित करें और क्रायो-ईएम इमेजिंग से पहले इसे एलएन2 में स्टोर करें।
  2. क्रायो-ईएम इमेजिंग करें।
    1. -180 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा तापमान के साथ एक क्रायो-ईएम धारक के लिए क्रायो-नमूना लोड करें।
    2. क्रायो-ईएम धारक को टीईएम में लोड करें और न्यूनतम खुराक प्रणाली (एमडीएस) मोड के साथ नमूनों का निरीक्षण करें।

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Representative Results

जीओ खिड़कियों के साथ एक माइक्रो-पैटर्न चिप एमईएमएस निर्माण और 2 डी गो नैनोशीट ट्रांसफर द्वारा गढ़ी गई थी। माइक्रो-पैटर्निंग के लिए चिप्स बड़े पैमाने पर उत्पादित किए गए थे, जिसमें वेफर (चित्रा 1 बी और चित्रा 2 ए, बी) में एक 4 से उत्पादित लगभग 500 चिप्स थे। फोटोलिथोग्राफी प्रक्रिया के दौरान क्रोमियम मास्क (चित्रा 2) के विभिन्न डिजाइनों का उपयोग करके सूक्ष्म पैटर्न वाले चिप्स के डिजाइनों में हेरफेर किया जा सकता है। गढ़े गए सूक्ष्म पैटर्न वाले चिप्स में मुक्त खड़े सीएक्सएनवाई झिल्ली की संख्या और आयाम नियंत्रित थे। मुक्त खड़े सीएक्सएनवाई झिल्ली की संख्या 48 (6 एक्स 8) से 50 (5 एक्स 10) और 50 एक्स 40 μm2 से 250 x 40 μm2 (चित्रा 3 ए, बी, एफ, जी) से नियंत्रित की गई थी। प्रत्येक मुक्त खड़े सीएक्सएनवाई झिल्ली में अलग-अलग छेद रिक्ति के साथ 2-3 μm से लेकर अनुकूलन योग्य व्यास के साथ दसियों से सैकड़ों सूक्ष्म छेद हो सकते हैं। गढ़े गए सूक्ष्म पैटर्न वाले चिप्स में ~ 25,000 जीओ-निलंबित छेद होते हैं, जबकि छेद की संख्या भी नियंत्रणीय होती है (चित्रा 3 बी-डी और चित्रा 3 जी-आई)। छेद के पार पतली जीओ परत के अस्तित्व की पुष्टि रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी और इलेक्ट्रॉन विवर्तन द्वारा की गई थी। जीओ विंडो पर रमन स्पेक्ट्रम ने जीओ की प्रतिनिधि चोटियों को दिखाया, अर्थात् डी और जी बैंड क्रमशः 1360 सेमी -1 और 1590 सेमी -1,क्रमशः 22 (चित्रा 3 ई)। गुणा उन्मुख हेक्सागोनल विवर्तन पैटर्न इंगित करते हैं कि खिड़कियों में बहुपरत जीओ (चित्रा 3 जे) शामिल हैं।

जीओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप को सूक्ष्म छेद की गहराई को विनियमित करने की व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए एलपीसीवीडी प्रक्रिया के दौरान सी वेफर पर सीएक्सएन वाई की जमाव मोटाई को नियंत्रित करके तीन प्रतिनिधि लक्ष्य गहराई (25 एनएम, 50 एनएम और 100 एनएम) मेंगढ़ा गया था। जीओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म-छेद की संरचना और मोटाई का मूल्यांकन करने के लिए, जीओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप की 40 डिग्री-झुका हुआ और क्रॉस-सेक्शनल स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) छवियां और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) छवियां प्राप्त की गईं। एक जीओ खिड़की के साथ सूक्ष्म छेद की अच्छी तरह से प्रकार की संरचना स्पष्ट रूप से देखा गया था, लक्षित गहराई (चित्रा 4) के अनुरूप सूक्ष्म छेद की गहराई के साथ। परिणाम पुष्टि करते हैं कि जीओ खिड़कियों के साथ माइक्रो-पैटर्न चिप की संख्या और डिजाइन को नियंत्रित करना संभव है।

क्रायो-ईएम इमेजिंग के लिए माइक्रो-पैटर्न चिप के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, माइक्रो-पैटर्न चिप का उपयोग करके बायोमोलेक्यूल्स और अकार्बनिक एनपी के विभिन्न क्रायो-नमूने तैयार किए गए थे। जैविक नमूनों के लिए, एचआईवी -1, फेरिटिन, प्रोटियासोम 26 एस, ग्रोएल, एपोफेरिटिन प्रोटीन कणों और ताऊ फिलामेंट प्रोटीन को जीओ खिड़कियों (चित्रा 5 ए-एफ) के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप का उपयोग करके क्रायो-ईएम के साथ चित्रित किया गया था। बायोमोलेक्यूलस के अलावा, अकार्बनिक सामग्री जैसे कि फे2ओ3 एनपी, एयू एनपी, एयू नैनोरोड्स और सिलिका एनपी को भी क्रायो-ईएम द्वारा माइक्रो-पैटर्न वाले चिप्स (चित्रा 5 जी-जे) का उपयोग करके देखा गया था।

Figure 1
चित्रा 1: क्रायो-ईएम के लिए जीओ खिड़कियों के साथ नव विकसित सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप की निर्माण प्रक्रिया की योजनाबद्धता और छवियां। (ए) निर्माण प्रक्रिया के दौरान जीओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप के निर्माण प्रक्रिया और क्रॉस-सेक्शन की योजनाबद्धता। (बी) प्रत्येक निर्माण चरण में निर्माण उत्पादों की छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: फोटोलिथोग्राफी प्रक्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले क्रोमियम मास्क का संक्षिप्त चित्रण( ए, बी) सी वेफर (चिप्स की 24 x 24 सरणी), (सी, डी) चिप्स के 2 एक्स 2 सरणी के डिजाइन, और माइक्रो-होल पैटर्न के (ई, एफ) डिजाइन में 4 के लिए चिप्स के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए मास्क डिजाइन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
(ए, एफ) पूरे माइक्रो-पैटर्न वाले चिप्स की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी छवियां, (बी, जी) एकल माइक्रो-पैटर्न वाले सीएक्सएनवाई झिल्ली की एसईएम छवियां, (सी, एच) माइक्रो-पैटर्न की एसईएम छवियां, और (डी, आई) जीओ खिड़कियों के साथ एकल माइक्रो-होल की एसईएम छवियां। (ई, जे) (ई) रमन स्पेक्ट्रम और (जे) जीओ विंडो के चयनित क्षेत्र इलेक्ट्रॉन विवर्तन (एसएईडी) पैटर्न के माध्यम से माइक्रो-होल पर जीओ की पुष्टि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
(ए-सी) एक जीओ विंडो के साथ एक लघु-छेद की 40 ° झुका हुआ एसईएम छवियां, और (डी-एफ) विभिन्न गहराई (25 एनएम, 50 एनएम, और 100 एनएम) में जीओ खिड़कियों के साथ माइक्रो-पैटर्न वाली चिप की क्रॉस-सेक्शनल एसईएम छवि। (जी) परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) 3 डी रेंडरिंग छवि, (एच) एएफएम विक्षेपण छवि, और (आई) लाल रेखा के साथ लाइन प्रोफाइल (एच) 100 एनएम सीएक्सएन वाई झिल्ली के साथ गढ़ी गई जीओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाली चिपकी गहराई दिखा रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: जीओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप का उपयोग करके विभिन्न आकार के बायोमैटेरियल्स और अकार्बनिक नैनोमैटेरियल्स की क्रायो-ईएम छवियां( ए) एचआईवी -1 वायरस कण, (बी) फेरिटिन, (सी) प्रोटियासोम 26 एस, (डी) ग्रोएल, (ई) एपोफेरिटिन, (एफ) ताऊ प्रोटीन (फाइब्रिलाइज्ड ताऊ प्रोटीन का संकेत देने वाले तीर), (जी) फे2ओ3 एनपी, (एच) एयू एनपी, (आई) एयू कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जीओ खिड़कियों के साथ माइक्रो-पैटर्न वाले चिप्स के उत्पादन के लिए माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रियाएं यहां पेश की जाती हैं। गढ़े हुए सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप को विश्लेषण की जाने वाली सामग्री के आकार के आधार पर जीओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म छेद की गहराई को नियंत्रित करके कांच की बर्फ की परत की मोटाई को विनियमित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। जीओ खिड़कियों के साथ एक सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप एमईएमएस तकनीकों की एक श्रृंखला और 2 डी नैनोशीट स्थानांतरण विधि (चित्रा 1) का उपयोग करके बनाई गई थी। एमईएमएस निर्माण तकनीक का उपयोग करने का प्रमुख लाभ बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए इसकी क्षमता और फोटोलिथोग्राफी (चित्रा 2) के दौरान क्रोमियम मास्क के विभिन्न डिजाइनों का उपयोग करके माइक्रोचिप की संरचना और आयामों में हेरफेर करने की व्यवहार्यता है। कम तनाव के साथ एलपीसीवीडी-जमा सीएक्सएनवाई परत नैनोमीटर मोटी मुक्त खड़े सीएक्सएनवाई23,24,25,26 के दसियों की स्थिरता सुनिश्चित करती है। हालांकि, नैनोमीटर-स्केल फ्री-स्टैंडिंग सीएक्सएनवाई परत अभी भी लंबवत दिशा27 में बलों के लिए कमजोर है। इसलिए, सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप को संभालते समय अत्यधिक सावधानी की आवश्यकता होती है, जैसे कि समाधान में डुबकी या झटका-सुखाने। इसके अलावा, माइक्रो-पैटर्न चिप के लिए निर्माण प्रक्रिया 100 μm सी वेफर का उपयोग करती है, जो अधिकांश क्रायो-ईएम नमूना धारकों और ऑटोलोडर के साथ संगतता सुनिश्चित करती है। हालांकि, नाजुक वेफर को फ्रैक्चरिंग से रोकने के लिए निर्माण प्रक्रियाओं के दौरान सावधानी की आवश्यकता होती है।

जीओ खिड़कियों के साथ अच्छी तरह से प्रकार की संरचनाओं के माइक्रोन-स्केल नियमित सरणी की पुष्टि एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप और एक एसईएम (चित्रा 3 और चित्रा 4) के साथ की गई थी। इसके अलावा, जीओ को स्थानांतरित करने के लिए ड्रॉप कास्टिंग विधि उच्च समतलता के साथ और ध्यान देने योग्य झुर्रियों (चित्रा 3 डी, ई, आई, जे) के बिना जीओ जमाव को सक्षम बनाती है। माइक्रो-पैटर्न वाली चिप क्रायो-ईएम ऑटोलोडर में लोड करने के लिए उपयुक्त है, और एक नियमित सरणी में हजारों माइक्रोन-स्केल छेद एकल कण विश्लेषण के लिए बड़ी छवि डेटा के स्वचालित संग्रह की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, एसआईएक्सएनवाई झिल्ली और जीओ-समर्थित माइक्रो-होल की संख्या और आकृति विज्ञान को एमईएमएस निर्माण प्रक्रिया में आसानी से हेरफेर किया जा सकता है, जिससे अनुसंधान उद्देश्यों के आधार पर उच्च-थ्रूपुट एकल कण विश्लेषण और अन्य क्रायो-ईएम इमेजिंग प्रयोगों की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, नियंत्रित मोटाई के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाले चिप्स के विस्तारित अनुप्रयोगों को चिप्स के निर्माण द्वारा सुविधाजनक बनाया जा सकता है जिनमें नैनोमीटर पैमाने पर पैटर्न वाले छेद होते हैं। सेमीकंडक्टर उद्योग में विकसित नैनो-पैटर्निंग तकनीकों को उन चिप्स 28,29,30 के निर्माण में अपनाया जा सकता है।

सूक्ष्म छेद की गहराई को विनियमित करने की क्षमता को तीन प्रतिनिधि लक्ष्य गहराई में जीओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाले चिप्स बनाकर यहां प्रदर्शित किया गया है: 25 एनएम, 50 एनएम और 100 एनएम। माइक्रोवेल संरचना की विभिन्न गहराई सी वेफर (चित्रा 4) पर सीएक्सएनवाई परत के जमाव समय को नियंत्रित करके प्राप्त की गई थी। आकृति विज्ञान और जीओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप की मोटाई का मूल्यांकन करने के लिए, केंद्रित आयन बीम (एफआईबी) सेक्शनिंग से प्राप्त उपकरणों के क्रॉस-सेक्शन एसईएम के साथ देखे गए थे, और गहराई प्रोफ़ाइल को एएफएम (चित्रा 4) के साथ मापा गया था। जीओ विंडो के साथ माइक्रो-होल की अच्छी तरह से प्रकार की संरचना एसईएम और एएफएम छवियों में स्पष्ट रूप से दिखाई गई थी, जो सीएक्सएनवाई माइक्रो-होल की गहराई के सफल नियंत्रण और जीओ विंडो के हस्तांतरण की पुष्टि करती है। जीओ खिड़कियों के साथ अनुकूलन योग्य सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप का उपयोग क्रायो-ईएम इमेजिंग के लिए इष्टतम बर्फ मोटाई के उत्पादन क्षेत्रों में उच्च सफलता दर सुनिश्चित करने की संभावना है।

चूंकि क्रायो-ईएम के साथ देखी जाने वाली सामग्रियों में अलग-अलग आकार होते हैं, इसलिए उपयुक्त मोटाई के साथ कांच की बर्फ का उत्पादन बढ़ाया विपरीत रिज़ॉल्यूशन, एक विस्तृत अभिविन्यास कवरेज और क्रायो-ईएम इमेजिंग के दौरान संरचना के कम विकृतीकरण को सुनिश्चित कर सकता है। जैविक अनुप्रयोगों के लिए क्रायो-ईएम इमेजिंग प्रक्रिया के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए, एचआईवी -1, फेरिटिन, प्रोटीसोम 26 एस, ग्रोएल, एपोफेरिटिन और ताऊ प्रोटीन सहित विभिन्न आकारों के विभिन्न जैविक नमूनों को जीओ खिड़कियों के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। जीओ खिड़कियों (चित्रा 5 ए-एफ) के साथ सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप का उपयोग करके बायोमोलेक्यूल्स स्पष्ट रूप से देखे गए थे। बायोमोलेक्यूल्स के अलावा, विभिन्न प्रकार के अकार्बनिक नैनोमैटेरियल्स, जैसे कि फे2ओ3 एनपी, एयू एनपी, एयू नैनोरोड्स और सिलिका एनपी, जीओ विंडोज (चित्रा 5 जी-जे) के साथ माइक्रो-पैटर्न चिप का उपयोग करके भी देखे गए थे। सूक्ष्म पैटर्न चिप और निर्माण विधि विभिन्न सामग्रियों के क्रायो-इमेजिंग के लिए संगतता दिखाती है। इस प्रकार, जीओ खिड़कियों के साथ नव विकसित सूक्ष्म पैटर्न वाली चिप क्रायो-ईएम के साथ कुशल और उच्च-थ्रूपुट संरचना विश्लेषण के लिए एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नमूना तैयारी रणनीति प्रदान करती है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एम-एचके, एसके, एमएल, और जेपी बुनियादी विज्ञान संस्थान से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं (अनुदान सं। आईबीएस-आर 006-डी 1)। एसके, एमएल, और जेपी सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी (2021) के माध्यम से क्रिएटिव-पायनियरिंग रिसर्चर्स प्रोग्राम से वित्तीय सहायता और कोरियाई सरकार (एमएसआईटी) द्वारा वित्त पोषित एनआरएफ अनुदान को स्वीकार करते हैं; अनुदान नं. एनआरएफ -2020 आर 1 ए 2 सी 2101871, और एनआरएफ -2021 एम 3 ए 9 आई 4022 9 36)। एमएल और जेपी पोस्को टीजे पार्क फाउंडेशन की पोस्को साइंस फैलोशिप और कोरियाई सरकार (एमएसआईटी) द्वारा वित्त पोषित एनआरएफ अनुदान से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं; अनुदान नं. एनआरएफ -2017 आर 1 ए 5 ए 1015365)। जेपी कोरियाई सरकार (एमएसआईटी) द्वारा वित्त पोषित एनआरएफ अनुदान से वित्तीय सहायता को स्वीकार करता है; अनुदान नं. एनआरएफ -2020 आर 1 ए 6 सी 101 ए 183), और कॉलेज ऑफ इंजीनियरिंग और कॉलेज ऑफ मेडिसिन, सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी (2021) द्वारा अंतःविषय अनुसंधान पहल कार्यक्रम। एम-एचके कोरियाई सरकार (एमएसआईटी) द्वारा वित्त पोषित एनआरएफ अनुदान से वित्तीय सहायता को स्वीकार करता है; अनुदान नं. एनआरएफ-2020आर1आई1ए1ए0107416612)। लेखक सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी सेंटर फॉर मैक्रोमोलेक्यूलर एंड सेल इमेजिंग (एसएनयू सीएमसीआई) के कर्मचारियों और चालक दल को क्रायो-ईएम प्रयोगों के साथ उनके अथक प्रयासों और दृढ़ता के लिए धन्यवाद देते हैं। लेखक एफआईबी-एसईएम प्रयोगों के साथ सहायता के लिए नेशनल सेंटर फॉर इंटर-यूनिवर्सिटी रिसर्च फैसिलिटीज के एसजे किम को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma Aldrich, USA 443778
Acetone
AFM Park Systems, South Korea NX-10
Aligner Midas System, South Korea MDA-600S
AZ 300 MIF developer AZ Electronic Materials USA Corp., USA 184411
Cryo-EM holder Gatan, USA 626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) FEI Company, USA Helios NanoLab 650
Glow discharger Ted Pella Inc., USA PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution Sigma Aldrich, USA 763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% Alfa Aesar, USA 10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) Centrotherm, Germany LPCVD E1200
maP1205 positive PR Micro resist technology, Germany A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea 6597-4400
Raman Spectrometer NOST, South Korea Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE) Scientific Engineering, South Korea Lab-built
SEM Carl Zeiss, Germany SUPRA 55VP
Si wafer JP COMMERCE, South Korea 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater Dong Ah Trade Corp., South Korea ACE-200
TEM JEOL, Japan JEM-2100F

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References

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इंजीनियरिंग अंक 182 क्रायोजेनिक-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप माइक्रोइलेक्ट्रोमैकेनिकल सिस्टम ग्राफीन ऑक्साइड कांच की बर्फ की मोटाई वायरस प्रोटीन नैनोमैटेरियल्स
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Kang, M. H., Lee, M., Kang, S.,… More

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (182), e63739, doi:10.3791/63739 (2022).

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