Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Fabricage van micro-patroonchip met gecontroleerde dikte voor cryogene elektronenmicroscopie met hoge doorvoer

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63739
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,4, 3,4,5,6
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

Summary

Een nieuw ontwikkelde chip met micropatroon met grafeenoxidevensters wordt vervaardigd door micro-elektromechanische systeemtechnieken toe te passen, waardoor efficiënte en high-throughput cryogene elektronenmicroscopiebeeldvorming van verschillende biomoleculen en nanomaterialen mogelijk wordt.

Abstract

Een belangrijke beperking voor de efficiënte en high-throughput structuuranalyse van biomoleculen met behulp van cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) is de moeilijkheid om cryo-EM-monsters met gecontroleerde ijsdikte op nanoschaal voor te bereiden. De op silicium (Si) gebaseerde chip, die een regelmatige reeks microgaten met grafeenoxide (GO) venster heeft met een patroon op een dikte-gecontroleerde siliciumnitride (SixNy) film, is ontwikkeld door micro-elektromechanische systeem (MEMS) technieken toe te passen. UV-fotolithografie, chemische dampafzetting, nat en droog etsen van de dunne film en drop-casting van 2D nanosheet-materialen werden gebruikt voor massaproductie van de micro-patroonchips met GO-vensters. De diepte van de microgaten wordt geregeld om de ijsdikte op aanvraag te regelen, afhankelijk van de grootte van het monster voor cryo-EM-analyse. De gunstige affiniteit van GO voor biomoleculen concentreert de biomoleculen van belang in het microgat tijdens cryo-EM-monstervoorbereiding. De chip met micropatroon met GO-vensters maakt cryo-EM-beeldvorming met hoge doorvoer van verschillende biologische moleculen mogelijk, evenals anorganische nanomaterialen.

Introduction

Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) is ontwikkeld om de driedimensionale (3D) structuur van eiwitten in hun oorspronkelijke toestand op te lossen 1,2,3,4. De techniek omvat het fixeren van eiwitten in een dunne laag (10-100 nm) glasachtig ijs en het verkrijgen van projectiebeelden van willekeurig georiënteerde eiwitten met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM), waarbij het monster op vloeibare stikstoftemperatuur wordt gehouden. Duizenden tot miljoenen projectiebeelden worden verkregen en gebruikt om een 3D-structuur van het eiwit te reconstrueren door computationele algoritmen 5,6. Voor een succesvolle analyse met cryo-EM is de voorbereiding van cryomonsters geautomatiseerd door de apparatuur die de blottingcondities, vochtigheid en temperatuur regelt, te dopen. De monsteroplossing wordt op een TEM-rooster geladen met een gatvormig koolstofmembraan, achtereenvolgens uitgeveegd om de overtollige oplossing te verwijderen en vervolgens ingevroren met vloeibaar ethaan om dun, glasachtig ijs te produceren 1,5,6. Met de vooruitgang in cryo-EM en de automatisering van monstervoorbereiding7, is cryo-EM steeds vaker gebruikt om de structuur van eiwitten op te lossen, inclusief envelopeiwitten voor virussen en ionkanaaleiwitten in het celmembraan 8,9,10. De structuur van enveloppe-eiwitten van pathogene virale deeltjes is belangrijk voor het begrijpen van virale infectiepathologie, evenals het ontwikkelen van het diagnosesysteem en vaccins, bijvoorbeeld SARS-CoV-211, die de COVID-19-pandemie hebben veroorzaakt. Bovendien zijn cryo-EM-technieken onlangs toegepast op materiaalwetenschappen, zoals voor het afbeelden van bundelgevoelige materialen die worden gebruikt in batterij 12,13,14 en katalytische systemen 14,15 en het analyseren van de structuur van anorganische materialen in oplossingstoestand16.

Ondanks merkbare ontwikkelingen in cryo-EM en relevante technieken, zijn er beperkingen in cryo-monstervoorbereiding, waardoor high-throughput 3D-structuuranalyse wordt belemmerd. Het bereiden van een glasachtige ijsfilm met optimale dikte is vooral belangrijk voor het verkrijgen van de 3D-structuur van biologische materialen met atomaire resolutie. Het ijs moet dun genoeg zijn om de achtergrondruis van elektronen die door het ijs worden verstrooid te minimaliseren en overlappingen van biomoleculen langs het elektronenbundelpad te voorkomen 1,17. Als het ijs echter te dun is, kan dit ervoor zorgen dat eiwitmoleculen in voorkeursoriëntaties uitlijnen of 18,19,20 denatureren. Daarom moet de dikte van glasachtig ijs worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de grootte van het materiaal van belang. Bovendien is meestal uitgebreide inspanning nodig voor de monstervoorbereiding en handmatige screening van ijs- en eiwitintegriteit op de voorbereide TEM-roosters. Dit proces is extreem tijdrovend, wat de efficiëntie ervan voor 3D-structuuranalyse met hoge doorvoer belemmert. Daarom zouden verbeteringen in de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van cryo-EM-monstervoorbereiding het gebruik van cryo-EM in de structurele biologie en commerciële geneesmiddelenontdekking verbeteren, evenals voor materiaalwetenschap.

Hierin introduceren we microfabricageprocessen voor het maken van een chip met micropatroon met grafeenoxide (GO) ramen die zijn ontworpen voor cryo-EM met hoge doorvoer met gecontroleerde ijsdikte21. De chip met micro-patroon werd vervaardigd met behulp van micro-elektromechanische systeem (MEMS) technieken, die de structuur en afmetingen van de chip kunnen manipuleren, afhankelijk van de beeldvormingsdoeleinden. De chip met micropatroon met GO-vensters heeft een microwellstructuur die kan worden gevuld met de monsteroplossing en de diepte van de microwell kan worden geregeld om de dikte van het glasvochtijs te regelen. De sterke affiniteit van GO voor biomoleculen verbetert de concentratie van biomoleculen voor visualisatie, waardoor de efficiëntie van de structuuranalyse wordt verbeterd. Bovendien bestaat de chip met micropatroon uit een Si-frame, dat een hoge mechanische stabiliteit biedt voor het raster19, waardoor het ideaal is voor het hanteren van de chip tijdens monstervoorbereidingsprocedures en cryo-EM-beeldvorming. Daarom biedt een chip met micropatroon met GO-vensters vervaardigd door MEMS-technieken betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van cryo-EM-monstervoorbereiding, wat een efficiënte en high-throughput structuuranalyse op basis van cryo-EM mogelijk kan maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fabricage van chip met micropatroon met GO-vensters (figuur 1)

  1. Deponeer het siliciumnitride.
    1. Zet laagspanning siliciumnitride (SixNy) af aan beide zijden van de Si-wafer (4 inch diameter en 100 μm dikte) met behulp van lagedruk chemische dampafzetting (LPCVD) bij 830 °C en een druk van 150 mTorr, onder een stroom van 170 sccm dichloorsilaan (SiH2Cl2, DCS) en 38 sccm ammoniak (NH3).
    2. Gebruik een depositiesnelheid van ~ 30 Å / min, controleer de SixNy-dikte om binnen 25-100 nm te zijn door de afzettingstijd te variëren.
      OPMERKING: Uiterste voorzichtigheid is geboden bij het hanteren van de Si-wafer, omdat de wafer erg dun en breekbaar is. Zorg ervoor dat u de wafer niet buigt tijdens het hanteren of laden in de apparatuur.
  2. Patroon de fotoresist.
    1. Breng een hexamethyldisilazane (HMDS) oplossing aan op de SixNy-deposited Si wafer met voldoende volume om het hele oppervlak van de wafer te bedekken, spinlaag met een spin coater bij 3.000 rpm gedurende 30 s, en bak op 95 °C gedurende 30 s op een hete plaat om het waferoppervlak hydrofoob te maken en zo een goede coatingprestatie met fotoresist (PR) te garanderen.
    2. Breng positieve PR (Table of Materials) aan met voldoende volume om het hele oppervlak van de wafer te bedekken, draailaag bij 3.000 tpm gedurende 30 s en bak op 100 °C gedurende 90 s op een hete plaat. Spin-coated PR heeft een dikte van 500 nm.
    3. Stel de PR-gecoate wafer bloot met ultraviolet licht (365 nm golflengte en 20 mW/cm2 intensiteit) gedurende 5 s door een chroommasker (figuur 2A-D) met behulp van een aligner.
    4. Ontwikkel de PR gedurende 1 minuut met behulp van een ontwikkelaar (Table of Materials) en spoel de wafer door deze 2x onder te dompelen in gedeïoniseerd (DI) water. Droog de PR-patroonwafer volledig door N2-gas op het waferoppervlak te blazen.
      OPMERKING: Uiterste voorzichtigheid is geboden bij het blazen van N2-gas op de Si-wafer, omdat de wafer erg dun en breekbaar is. Blaas N2-gas met hoge druk niet in een richting loodrecht op de wafer, omdat dit ertoe kan leiden dat de wafer breekt.
  3. Patroon de SixNy.
    1. Etst de blootgestelde SixNy volgens de patroonvorming van de PR met behulp van een in het laboratorium gebouwde reactieve ionenetser (RIE), met 3 sccm zwavelhexafluoride (SF6) gas bij een radiofrequentie (RF) vermogen van 50 W. De etssnelheid met deze instellingen is ~6 Å/s. Stel de etstijd in afhankelijk van de dikte van de sixny laag die is afgezet.
      OPMERKING: De etssnelheid kan variëren en moet in het laboratorium worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de specificaties van de gebruikte RIE-apparatuur.
    2. Elimineer de PR door de SixN y-patroonwafer gedurende 30 minuten onder te dompelen in aceton bij kamertemperatuur, gevolgd door de wafer te spoelen door deze 2x in DI-water onder te dompelen. Droog de wafer volledig door N2-gas op het waferoppervlak te blazen.
      OPMERKING: Uiterste zorg moet worden besteed aan het onderdompelen of verwijderen van de wafer uit de oplossingen, omdat de wafer kan worden gebroken door de oppervlaktespanning van de oplossing. Dompel de wafer niet evenwijdig aan het oppervlak van de oplossing onder of haal er niet uit. Gebruik een precisie wafer handling pincet met koolstofvezel tips. Pak de wafel niet sterk vast met het pincet; til één kant van de wafer op totdat de wafer naar een hoek kantelt, waar deze uit de oplossing kan worden gehaald. De wafer kan breken wanneer deze buigt als gevolg van de stevige grip tijdens het tillen.
  4. Ets de Si.
    1. Bereid een 1,5 M kaliumhydroxide (KOH) oplossing door KOH-poeder op te lossen in DI-water bij 80 °C.
    2. Dompel de SixN y-patroonwafer onder in KOH-oplossing om de blootgestelde Si te etsen. Laat de wafer in de oplossing met roeren totdat de vrijstaande SixNy-vensters aan de andere kant van het patroon SixNy kunnen worden waargenomen.
      OPMERKING: De natte etstijd kan verschillen afhankelijk van de dikte van de Si; voor een 100 μm dikke wafer duurt nat etsen normaal gesproken enkele uren. Stel de roersnelheid niet te hoog in tijdens het Si-etsen, omdat de vrijstaande SixNy-ramen erg dun zijn en kunnen worden gebroken door de stroom van de vloeistof. In dit experiment werd de roersnelheid ingesteld op 250 tpm.
    3. Reinig de geëtste wafel door deze meerdere keren in een DI-waterbad te dopen om etsresten te elimineren. Droog de wafel in de lucht.
      OPMERKING: Uiterste zorg moet worden besteed aan het onderdompelen of verwijderen van de Si-patroonwafer uit de oplossingen, omdat de vrijstaande SixNy-ramen erg dun en fragiel zijn en kunnen worden gebroken door de oppervlaktespanning van de oplossing. De wafer moet onder een hoek worden ondergedompeld of verwijderd, zodat de rand van de wafer eerst de oplossing in- en uitgaat.
  5. Verwijder de KOH-etsresten.
    1. Druk lichtjes op de grenzen van de chiparray met een pincet om een reeks chips te verkrijgen die een micropatroon hebben (figuur 1B).
    2. Bereid 1,5 M KOH-oplossing bij 80 °C onder roeren.
    3. Dompel de chip array onder in KOH-oplossing gedurende 30 s en spoel deze af door deze 2x in DI-water te dopen. Droog de spaanders volledig door N2 gas te blazen.
      OPMERKING: Uiterste zorg moet worden besteed aan het onderdompelen van de chips in oplossingen en het föhnen met N2-gas , omdat de vrijstaande SixNy-ramen erg dun en fragiel zijn. Terwijl de chip wordt ondergedompeld in KOH-oplossing, moet het roeren worden gestopt. De chips moeten eerst met hun randen in de richting loodrecht op de oplossing worden gedompeld en met N2-gas in de parallelle richting worden geblazen.
    4. Droog de chip array volledig in de lucht gedurende ten minste 1 uur.
  6. Patroon de PR.
    1. Bereid een blanco 525 μm Si wafer als vaste ondersteuning. Spin coat de Si wafer met HMDS en positieve PR, zoals hierboven beschreven, maar bevestig de chip array (met de vrijstaande SixNy vensterzijde naar boven) op de Si wafer voordat u de PR bakt. De PR fungeert als een lijm tussen de wafer en de chip array. Bak de Si-wafel bevestigd met de chip array op 100 °C gedurende 90 s op een hete plaat.
    2. Spin coat de chipset met HMDS en positieve PR, zoals hierboven beschreven.
    3. Stel de chipset bloot met ultraviolet licht (365 nm golflengte; 20 mW/cm2 intensiteit) gedurende 5 s door een chroommasker (figuur 2E, F) met behulp van een aligner.
    4. Ontwikkel de PR met behulp van een ontwikkelaar gedurende 15 s, spoel de chipset af door deze 2x in DI-water te dopen en droog de PR-patroonchipset volledig door N2-gas te blazen.
  7. Bereid de sixNy met micropatroon.
    1. Etch SixNy volgens het PR-patroon met behulp van een in het laboratorium gebouwde RIE, met 3 sccm SF6 gas bij RF-vermogen van 50 W. Regel de etstijd afhankelijk van de dikte van de SixNy-laag .
  8. Elimineer de PR.
    1. Elimineer de PR door de patroonchipset onder te dompelen in 1-methyl-2-pyrrolidinon (NMP) -oplossing bij 60 °C en deze een nacht te laten staan. Spoel de chipset af door deze 2x in DI-water te dopen en droog de chipset volledig door N2-gas te blazen.
    2. Elimineer de PR-residuen met een O2 plasmaproces met behulp van 100 sccm O2 gas bij RF-vermogen van 150 W gedurende 1 minuut met de in het laboratorium gebouwde RIE.
  9. Spoel de chip met micropatroon af.
    1. Bereid 1,5 M KOH-oplossing bij 80 °C.
    2. Dompel de chips met micropatroon gedurende 30 s onder in KOH-oplossing om de PR-resten volledig te elimineren en spoel de chips af door ze 2x onder te dompelen in DI-water. Droog de spaanders volledig door N2 gas te blazen.
    3. Droog de chips volledig in de lucht gedurende ten minste 1 uur.
  10. Breng grafeenoxide (GO) over volgens de drop-casting methode.
    1. Verdun GO-oplossing (2 mg/ml) tot 0,2 mg/l met DI-water en soniceer gedurende 10 minuten om aggregaten van GO-vellen te breken. Centrifugeer de verdunde GO-oplossing bij 300 x g gedurende 30 s.
    2. Gloei ontlaad de Si-geëtste kant van de chip met micropatroon om het chipoppervlak met positieve lading weer te geven met behulp van een gloeiontlading (Tabel van Materialen) bij 15 mA gedurende 1 minuut.
    3. Laat 3 μL van de GO-oplossing op de gloeiende kant van de chip met micropatroon vallen en laat de druppel gedurende 1 minuut op de chip vallen. Veeg na 1 min de overtollige GO-oplossing op de chip weg met filterpapier.
    4. Was de GO-overgebrachte chip met DI-waterdruppels bereid op paraffinefilm en veeg het DI-water op de chip weg met filterpapier. Herhaal deze procedure 2x aan de GO-kant en 1x aan de andere kant. Droog de GO-overgedragen chip een nacht op kamertemperatuur.
    5. Was de chip met micropatroon met GO-ramen door deze onder te dompelen in het DI-water en föhn de chip met N2-gas .

2. Cryo-EM beeldvorming

  1. Bereid het cryo-monster voor.
    1. Bereid het cryo-monster voor met behulp van een mechanische cryo-plompmachine (Table of Materials), die de temperatuur, vochtigheid, blotting-tijd en kracht regelt. Nadat u de vloeipad op de blotters hebt geladen, moet u ervoor zorgen dat de luchtvochtigheid en de temperatuur in de kamer op respectievelijk 100% en 15 °C worden gehouden.
    2. Pak de chip met micropatroon op met een typisch cryo-pincet en laad het pincet op de cryo-plunging machine. Pipetteer 3 μL monsteroplossing op de chip met micropatroon aan de kant met gatenpatroon, met GO-vensters aan de onderkant. Controleer de blottingtijd en -kracht, afhankelijk van de monsteroplossing.
      OPMERKING: Hier werden biologische monsters, namelijk humaan immunodeficiëntievirus (HIV-1), ferritine, proteasoom 26S, groEL, apoferritine-eiwitdeeltjes en tau-filamenteiwitten gebruikt voor cryo-EM-beeldvorming. Daarnaast werden verschillende soorten anorganische materialen, zoals Fe2O3 nanodeeltjes (NP), Au nanodeeltjes, Au nanostaafjes en silica nanodeeltjes, gebruikt voor cryo-EM beeldvorming. De gewenste blotting tijd en kracht werden ingesteld op de cryo plunjer voor verschillende soorten monsters.
    3. Na het blotting-proces, dompel de monster-geladen chip onmiddellijk in vloeibare ethaan. Breng de chip over naar de roosterdoos in vloeibare stikstof (LN2) en bewaar deze in LN2 voor cryo-EM-beeldvorming.
  2. Voer cryo-EM-beeldvorming uit.
    1. Laad het cryo-monster op een cryo-EM houder met een temperatuur van -180 °C.
    2. Laad de cryo-EM-houder in een TEM en observeer de monsters met de mds-modus (minimum dose dose system).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een chip met micropatroon met GO-vensters werd vervaardigd door MEMS-fabricage en 2D GO-nanosheetoverdracht. Chips voor micro-patterning werden in massa geproduceerd, met ongeveer 500 chips geproduceerd uit één 4 in wafer (figuur 1B en figuur 2A, B). De ontwerpen van de chips met micropatronen kunnen worden gemanipuleerd met behulp van verschillende ontwerpen van het chroommasker (figuur 2) tijdens de fotolithografieprocedure. De gefabriceerde chips met micropatronen hadden gecontroleerde aantallen en afmetingen van vrijstaande SixNy-membranen. De aantallen van de vrijstaande SixNy membranen werden geregeld van 48 (6 x 8) tot 50 (5 x 10) en de afmetingen van 50 x 40 μm2 tot 250 x 40 μm2 (Figuur 3A,B,F,G). Elk vrijstaand SixNy-membraan kan tientallen tot honderden microgaten hebben met aanpasbare diameters variërend van 2-3 μm met verschillende gatafstanden. Gefabriceerde chips met micropatronen hebben tot ~ 25.000 GO-zwevende gaten, terwijl het aantal gaten ook controleerbaar is (figuur 3B-D en figuur 3G-I). Het bestaan van de dunne GO-laag over het gat werd bevestigd door Raman-spectroscopie en elektronendiffractie. Het Raman-spectrum bij het GO-venster toonde representatieve pieken van GO, namelijk D- en G-banden op 1360 cm-1 en 1590 cm-1, respectievelijk22 (figuur 3E). De vermenigvuldigingsgeoriënteerde zeshoekige diffractiepatronen geven aan dat de vensters bestaan uit meerlagige GO (figuur 3J).

De chip met micropatroon met GO-vensters werd vervaardigd in drie representatieve doeldiepten (25 nm, 50 nm en 100 nm) door de afzettingsdikte van de SixNy op de Si-wafer tijdens het LPCVD-proces te regelen om de haalbaarheid van het reguleren van de diepte van de microgaten te bevestigen. Om de structuur en de dikte van de microgaten met GO-vensters te evalueren, werden 40 ° -gekantelde en cross-sectionele scanning elektronenmicroscoop (SEM) beelden en atomic force microscopie (AFM) beelden van de micro-patroon chip met GO-vensters verkregen. De structuur van het puttype van het microgat met een GO-venster werd duidelijk waargenomen, waarbij de diepte van het microgat overeenkomt met de beoogde diepte (figuur 4). De resultaten bevestigen dat het regelen van het aantal en het ontwerp van de chip met micropatroon met GO-vensters mogelijk is.

Om het gebruik van de micro-patroonchip voor cryo-EM-beeldvorming te demonstreren, werden verschillende cryo-monsters van biomoleculen en anorganische NP's voorbereid met behulp van de micro-patroonchip. Voor biologische monsters werden HIV-1, ferritine, proteasoom 26S, groEL, apoferritine-eiwitdeeltjes en tau-filamenteiwitten in beeld gebracht met cryo-EM met behulp van de chip met micropatroon met GO-vensters (figuur 5A-F). Naast biomoleculen werden ook anorganische materialen zoals Fe2O3 NP's, Au NP's, Au nanostaafjes en silica NP's waargenomen door cryo-EM met behulp van micro-patroonchips (figuur 5G-J).

Figure 1
Figuur 1: Schema's en afbeeldingen van de fabricageprocedure van de nieuw ontwikkelde micro-patroonchip met GO-vensters voor cryo-EM. (A) Schema's van het fabricageproces en doorsneden van de chip met micropatroon met GO-vensters tijdens het fabricageproces. (B) Afbeeldingen van de fabricageproducten bij elke fabricagestap. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Korte illustratie van de chroommaskers die worden gebruikt voor het fotolithografieproces. (A, B) Maskerontwerp voor massaproductie van chips voor een 4 in Si-wafer (24 x 24 array chips), (C, D) ontwerpen van 2 x 2 array van chips en (E, F) ontwerpen van micro-gatpatronen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Structuur van de chips met micropatronen met GO-vensters. (A, F) Optische microscopiebeelden van hele chips met micropatronen, (B, G) SEM-afbeeldingen van sixN y-membranen met enkel micropatroon, (C, H) SEM-afbeeldingen van micropatronen en (D, I) SEM-afbeeldingen van afzonderlijke microgaten met GO-vensters. (E,J) Bevestiging van GO bij het microgat door (E) het Raman-spectrum en (J) het geselecteerde gebiedselektronendiffractiepatroon (SAED) van het GO-venster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Putstructuur en diepte van het microgat met GO-vensters. (A-C) 40 ° gekantelde SEM-beelden van een enkel microgat met een GO-venster, en (D-F) dwarsdoorsnede SEM-afbeelding van de micro-patroonchip met GO-vensters in verschillende diepten (25 nm, 50 nm en 100 nm). (G) Atomic force microscopy (AFM) 3D rendering image, (H) AFM deflection image, en (I) lijnprofiel langs de rode lijn in (H) die de diepte van de micro-patroonchip toont met GO-vensters vervaardigd met 100 nm SixNy membraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Cryo-EM-beelden van biomaterialen en anorganische nanomaterialen van verschillende grootte met behulp van de chip met micropatroon met GO-vensters. (A) HIV-1-virusdeeltje, (B) ferritine, (C) proteasoom 26S, (D) groEL, (E) apoferritine, (F) tau-eiwit (pijlen die fibrillized tau-eiwit aangeven), (G) Fe2O3 NP, (H) Au NP, (I) Au nanorod en (J) silica NP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De microfabricageprocessen voor het produceren van micro-patroonchips met GO-vensters worden hier geïntroduceerd. De gefabriceerde chip met micropatroon is ontworpen om de dikte van de glasachtige ijslaag te regelen door de diepte van het microgat met GO-ramen te regelen, afhankelijk van de grootte van het te analyseren materiaal. Een chip met micropatroon met GO-vensters werd vervaardigd met behulp van een reeks MEMS-technieken en een 2D-nanosheet-overdrachtsmethode (figuur 1). Het grote voordeel van het gebruik van de MEMS-fabricagetechniek is de mogelijkheid voor massaproductie en de haalbaarheid van het manipuleren van de structuur en afmetingen van de microchip door verschillende ontwerpen van het chroommasker te gebruiken tijdens fotolithografie (figuur 2). De LPCVD-gedeponeerde SixNy laag met lage spanning zorgt voor de stabiliteit van de tientallen nanometers dikke vrijstaande SixNy 23,24,25,26. De vrijstaande SixNy-laag op nanometerschaal is echter nog steeds kwetsbaar voor krachten in de loodrechte richting27. Daarom is uiterste voorzichtigheid geboden bij het hanteren van de chip met micropatroon, zoals bij het onderdompelen in oplossing of föhnen. Bovendien maakt het fabricageproces voor de chip met micropatroon gebruik van de Si-wafer van 100 μm, die compatibiliteit met de meeste cryo-EM-monsterhouders en autoloaders garandeert. Voorzichtigheid is echter geboden tijdens de fabricageprocessen om te voorkomen dat de fragiele wafer breekt.

De regelmatige array op micronschaal van well-type structuren met GO-vensters werd bevestigd met een optische microscoop en een SEM (figuur 3 en figuur 4). Bovendien maakt de druppelgietmethode voor het overbrengen van GO GO-afzetting met hoge vlakheid en zonder merkbare rimpels mogelijk (figuur 3D, E, I, J). De chip met micropatroon is geschikt voor het laden in de cryo-EM autoloader en tienduizenden gaten op micronschaal in een reguliere array maken het mogelijk om automatisch grote beeldgegevens te verzamelen voor analyse van afzonderlijke deeltjes. Bovendien kunnen het aantal en de morfologie van SixNy-membranen en GO-ondersteunde microgaten gemakkelijk worden gemanipuleerd in het MEMS-fabricageproces, waardoor analyse van enkele deeltjes met hoge doorvoer en andere cryo-EM-beeldvormingsexperimenten mogelijk zijn, afhankelijk van de onderzoeksdoeleinden. Bovendien kunnen uitgebreide toepassingen van chips met micropatronen met gecontroleerde dikte worden vergemakkelijkt door de fabricage van chips met gaten op nanometerschaal. Nano-patroontechnieken ontwikkeld in de halfgeleiderindustrie kunnen worden toegepast bij de fabricage van die chips 28,29,30.

Het vermogen om de diepte van de microgaten te reguleren is hier aangetoond door het fabriceren van micro-patroonchips met GO-vensters in drie representatieve doeldiepten: 25 nm, 50 nm en 100 nm. Verschillende diepten van de microwellstructuur werden bereikt door de depositietijd van de SixNy-laag op de Si-wafer te regelen (figuur 4). Voor het evalueren van de morfologie en de dikte van de chip met micropatroon met GO-vensters, werden doorsneden van de apparaten verkregen uit gefocusseerde ionenbundel (FIB) secties waargenomen met SEM en het diepteprofiel werd gemeten met AFM (figuur 4). De putachtige structuur van het microgat met GO-venster werd duidelijk weergegeven in de SEM- en AFM-afbeeldingen, wat een succesvolle controle van de diepte van het SixNy-microgat en de overdracht van het GO-venster bevestigt. Het gebruik van de aanpasbare chip met micropatroon met GO-vensters zal waarschijnlijk zorgen voor een hoog slagingspercentage in het produceren van regio's met een optimale ijsdikte voor cryo-EM-beeldvorming.

Omdat de materialen die met cryo-EM moeten worden waargenomen verschillende afmetingen hebben, kan het produceren van glasachtig ijs met een geschikte dikte zorgen voor een verbeterde contrastresolutie, een brede oriëntatiedekking en verminderde denaturatie van de structuur tijdens cryo-EM-beeldvorming. Om het gebruik van het cryo-EM-beeldvormingsproces voor biologische toepassingen aan te tonen, werden verschillende biologische monsters van verschillende groottes, waaronder HIV-1, ferritine, proteasoom 26S, groEL, apoferritine en tau-eiwit, in beeld gebracht met behulp van de micro-patroonchip met GO-vensters. De biomoleculen werden duidelijk waargenomen met behulp van de micro-patroonchip met GO-vensters (figuur 5A-F). Naast biomoleculen werden ook verschillende soorten anorganische nanomaterialen, zoals Fe2O3 NP's, Au NP's, Au nanorods en silica NP's, waargenomen met behulp van de micro-patroonchip met GO-vensters (figuur 5G-J). De chip- en fabricagemethode met micropatroon zijn compatibel met de cryo-beeldvorming van verschillende materialen. Zo biedt de nieuw ontwikkelde chip met micropatroon met GO-vensters een betrouwbare en reproduceerbare monstervoorbereidingsstrategie voor efficiënte en high-throughput structuuranalyse met cryo-EM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

M.-H.K., S.K., M.L. en J.P. erkennen de financiële steun van het Institute for Basic Science (Grant No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. en J.P. erkennen de financiële steun van het Creative-Pioneering Researchers Program via Seoul National University (2021) en de NRF-subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT; Subsidie nrs. NRF-2020R1A2C2101871 en NRF-2021M3A9I4022936). M.L. en J.P. erkennen de financiële steun van de POSCO Science Fellowship van POSCO TJ Park Foundation en de NRF-subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT; Subsidie nr. NRF-2017R1A5A1015365). J.P. erkent de financiële steun van de NRF-subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT; Subsidie nr. NRF-2020R1A6C101A183) en de interdisciplinaire onderzoeksinitiatievenprogramma's van college of engineering en college of medicine, Seoul National University (2021). M.-H.K. erkent de financiële steun van de NRF-subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT; Subsidie nr. NRF-2020R1I1A1A0107416612). De auteurs bedanken het personeel en de bemanning van het Seoul National University Center for Macromolecular and Cell Imaging (SNU CMCI) voor hun onvermoeibare inspanningen en doorzettingsvermogen met de cryo-EM-experimenten. De auteurs bedanken S. J. Kim van het National Center for Inter-university Research Facilities voor hulp bij de FIB-SEM-experimenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma Aldrich, USA 443778
Acetone
AFM Park Systems, South Korea NX-10
Aligner Midas System, South Korea MDA-600S
AZ 300 MIF developer AZ Electronic Materials USA Corp., USA 184411
Cryo-EM holder Gatan, USA 626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) FEI Company, USA Helios NanoLab 650
Glow discharger Ted Pella Inc., USA PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution Sigma Aldrich, USA 763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% Alfa Aesar, USA 10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) Centrotherm, Germany LPCVD E1200
maP1205 positive PR Micro resist technology, Germany A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea 6597-4400
Raman Spectrometer NOST, South Korea Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE) Scientific Engineering, South Korea Lab-built
SEM Carl Zeiss, Germany SUPRA 55VP
Si wafer JP COMMERCE, South Korea 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater Dong Ah Trade Corp., South Korea ACE-200
TEM JEOL, Japan JEM-2100F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
  2. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
  3. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  4. Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
  5. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
  6. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  7. Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
  8. Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
  9. Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
  10. Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
  11. Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
  12. Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
  13. Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
  14. Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  15. Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
  16. Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
  17. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
  18. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
  19. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
  20. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
  22. Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
  23. Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
  24. Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
  25. Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
  26. Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
  27. Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
  28. Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
  29. Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
  30. Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).

Tags

Engineering Cryogene-elektronenmicroscoop micro-elektromechanische systemen grafeenoxide glasachtige ijsdikte virus eiwit nanomaterialen
Fabricage van micro-patroonchip met gecontroleerde dikte voor cryogene elektronenmicroscopie met hoge doorvoer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S.,… More

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (182), e63739, doi:10.3791/63739 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter