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Engineering

Fabricación de chip micropatrón con espesor controlado para microscopía electrónica criogénica de alto rendimiento

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63739
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,4, 3,4,5,6
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

Summary

Un chip micropatronado recientemente desarrollado con ventanas de óxido de grafeno se fabrica mediante la aplicación de técnicas de sistemas microelectromecánicos, lo que permite obtener imágenes de microscopía electrónica criogénica eficiente y de alto rendimiento de varias biomoléculas y nanomateriales.

Abstract

Una limitación importante para el análisis eficiente y de alto rendimiento de la estructura de biomoléculas utilizando microscopía electrónica criogénica (crio-EM) es la dificultad de preparar muestras crio-EM con espesor de hielo controlado a nanoescala. El chip basado en silicio (Si), que tiene una matriz regular de microagujos con ventana de óxido de grafeno (GO) modelada en una película de nitruro de silicio controlado por espesor (SixNy), se ha desarrollado mediante la aplicación de técnicas de sistema microelectromecánico (MEMS). La fotolitografía UV, la deposición química de vapor, el grabado húmedo y seco de la película delgada y la fundición en gota de materiales de nanoláminas 2D se utilizaron para la producción en masa de los chips micropatronados con ventanas GO. La profundidad de los micro-agujeros se regula para controlar el espesor del hielo bajo demanda, dependiendo del tamaño de la muestra para el análisis crio-EM. La afinidad favorable de GO hacia las biomoléculas concentra las biomoléculas de interés dentro del microagujeto durante la preparación de la muestra crio-EM. El chip micropatronado con ventanas GO permite imágenes crio-EM de alto rendimiento de varias moléculas biológicas, así como nanomateriales inorgánicos.

Introduction

La microscopía electrónica criogénica (crio-EM) se ha desarrollado para resolver la estructura tridimensional (3D) de las proteínas en su estado nativo 1,2,3,4. La técnica consiste en fijar proteínas en una capa delgada (10-100 nm) de hielo vítreo y adquirir imágenes de proyección de proteínas orientadas aleatoriamente utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM), con la muestra mantenida a temperatura de nitrógeno líquido. Miles o millones de imágenes de proyección son adquiridas y utilizadas para reconstruir una estructura 3D de la proteína mediante algoritmos computacionales 5,6. Para un análisis exitoso con crio-EM, la preparación de crio-muestras se ha automatizado mediante la congelación por inmersión del equipo que controla las condiciones de borrado, la humedad y la temperatura. La solución de muestra se carga en una rejilla TEM con una membrana de carbono agujereada, se borra sucesivamente para eliminar el exceso de solución y luego se congela con etano líquido para producir hielo vítreo delgado 1,5,6. Con los avances en crio-EM y la automatización de la preparación demuestras 7, el crio-EM se ha utilizado cada vez más para resolver la estructura de las proteínas, incluidas las proteínas de la envoltura para virus y las proteínas del canal iónico en la membrana celular 8,9,10. La estructura de las proteínas de la envoltura de las partículas virales patógenas es importante para comprender la patología de la infección viral, así como para desarrollar el sistema de diagnóstico y las vacunas, por ejemplo, el SARS-CoV-211, que causó la pandemia de COVID-19. Además, las técnicas de crio-EM se han aplicado recientemente a las ciencias de los materiales, como para materiales sensibles al haz de imágenes utilizados en la batería 12,13,14 y los sistemas catalíticos 14,15 y el análisis de la estructura de materiales inorgánicos en estado de solución16.

A pesar de los notables desarrollos en crio-EM y técnicas relevantes, existen limitaciones en la preparación de criomuestras, lo que dificulta el análisis de estructuras 3D de alto rendimiento. Preparar una película de hielo vítreo con un espesor óptimo es especialmente importante para obtener la estructura 3D de materiales biológicos con resolución atómica. El hielo debe ser lo suficientemente delgado como para minimizar el ruido de fondo de los electrones dispersos por el hielo y para prohibir la superposición de biomoléculas a lo largo de la trayectoria del haz de electrones 1,17. Sin embargo, si el hielo es demasiado delgado, puede hacer que las moléculas de proteínas se alineen en las orientaciones preferidas o desnaturalicen 18,19,20. Por lo tanto, el espesor del hielo vítreo debe optimizarse en función del tamaño del material de interés. Además, generalmente se necesita un esfuerzo extenso para la preparación de la muestra y la detección manual de la integridad del hielo y la proteína en las rejillas TEM preparadas. Este proceso consume mucho tiempo, lo que dificulta su eficiencia para el análisis de estructuras 3D de alto rendimiento. Por lo tanto, las mejoras en la fiabilidad y reproducibilidad de la preparación de muestras de crio-EM mejorarían la utilización de crio-EM en biología estructural y descubrimiento de fármacos comerciales, así como para la ciencia de materiales.

Aquí, presentamos procesos de microfabricación para hacer un chip micro-estampado con ventanas de óxido de grafeno (GO) diseñadas para crio-EM de alto rendimiento con espesor de hielo controlado21. El chip micropatronado se fabricó utilizando técnicas de sistema microelectromecánico (MEMS), que pueden manipular la estructura y las dimensiones del chip según los fines de imagen. El chip micropatronado con ventanas GO tiene una estructura de micropocillo que se puede llenar con la solución de muestra, y la profundidad del micropozo se puede regular para controlar el grosor del hielo vítreo. La fuerte afinidad de GO por las biomoléculas mejora la concentración de biomoléculas para la visualización, mejorando la eficiencia del análisis de la estructura. Además, el chip micropatronado está compuesto por un marco de Si, que proporciona una alta estabilidad mecánica para la rejilla19, lo que lo hace ideal para manipular el chip durante los procedimientos de preparación de muestras y la obtención de imágenes crio-EM. Por lo tanto, un chip micropatrullado con ventanas GO fabricadas por técnicas MEMS proporciona confiabilidad y reproducibilidad de la preparación de muestras crio-EM, lo que puede permitir un análisis de estructura eficiente y de alto rendimiento basado en cryo-EM.

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Protocol

1. Fabricación de chip micro-estampado con ventanas GO (Figura 1)

  1. Deposite el nitruro de silicio.
    1. Deposite nitruro de silicio de baja tensión (SixNy) a ambos lados de la oblea de Si (4 pulgadas de diámetro y 100 μm de espesor) utilizando deposición química de vapor de baja presión (LPCVD) a 830 °C y una presión de 150 mTorr, bajo un flujo de 170 sccm de diclorosilano (SiH2Cl2, DCS) y 38 sccm de amoníaco (NH3).
    2. Usando una velocidad de deposición de ~30 Å/min, controle el espesor de SixNy para que esté dentro de 25-100 nm variando el tiempo de deposición.
      NOTA: Se debe tener mucho cuidado al manipular la oblea Si porque la oblea es muy delgada y frágil. Tenga cuidado de no doblar la oblea durante su manipulación o carga en el equipo.
  2. Patrón de la fotorresistente.
    1. Aplique una solución de hexametildisilazano (HMDS) sobre la oblea de SixN depositada eny con volumen suficiente para cubrir toda la superficie de la oblea, haga girar la capa con un recubrimiento de espín a 3.000 rpm durante 30 s, y hornee a 95 °C durante 30 s en una placa caliente para hacer que la superficie de la oblea sea hidrofóbica y así garantizar un buen rendimiento de recubrimiento con fotorresistencia (PR).
    2. Aplicar PR positivo (Tabla de Materiales) con volumen suficiente para cubrir toda la superficie de la oblea, hilar la capa a 3.000 rpm durante 30 s, y hornear a 100 °C durante 90 s en una placa caliente. El PR recubierto de espín tiene un grosor de 500 nm.
    3. Exponga la oblea recubierta de PR con luz ultravioleta (longitud de onda de 365 nm e intensidadde 20 mW/cm 2) durante 5 s a través de una máscara de cromo (Figura 2A-D) utilizando un alineador.
    4. Desarrolle el PR durante 1 minuto utilizando un revelador (Tabla de Materiales) y enjuague la oblea sumergiéndola en agua desionizada (DI) 2x. Seque completamente la oblea con patrón PR soplando gas N2 sobre la superficie de la oblea.
      NOTA: Se debe tener mucho cuidado al soplar gas N2 en la oblea Si porque la oblea es muy delgada y frágil. No sople gas N2 con alta presión en una dirección perpendicular a la oblea, ya que esto puede causar la fractura de la oblea.
  3. Patrón SixNy.
    1. Grabe el SixNy expuesto siguiendo el patrón del PR utilizando un grabador de iones reactivos (RIE) construido en laboratorio, con 3 sccm de gas hexafluoruro de azufre (SF6) a una potencia de radiofrecuencia (RF) de 50 W. La velocidad de grabado con estos ajustes es de ~6 Å/s. Establecer el tiempo de grabado en función del grosor de la capa de SixNy depositada.
      NOTA: La velocidad de grabado puede variar y necesitar optimización en el laboratorio dependiendo de las especificaciones del equipo RIE utilizado.
    2. Elimine el PR sumergiendo la oblea con patrón SixNy en acetona a temperatura ambiente durante 30 min, seguido de enjuagar la oblea sumergiéndola en agua DI 2x. Seque completamente la oblea soplando gas N2 sobre la superficie de la oblea.
      NOTA: Se debe tener extremo cuidado al sumergir o sacar la oblea de las soluciones porque la oblea puede fracturarse por la tensión superficial de la solución. No sumerja ni saque la oblea paralela a la superficie de la solución. Utilice pinzas de manejo de obleas de precisión con puntas de fibra de carbono. No agarre fuertemente la oblea con la pinza; Levante un lado de la oblea hasta que la oblea se incline hacia un ángulo, donde se puede sacar de la solución. La oblea puede fracturarse cuando se dobla debido al agarre firme durante el levantamiento.
  4. Graba el Si.
    1. Prepare una solución de hidróxido de potasio (KOH) de 1,5 M disolviendo el polvo de KOH en agua DI a 80 °C.
    2. Sumerja la oblea estampada de SixNy en una solución de KOH para grabar el Si expuesto. Deje la oblea en la solución con agitación hasta que se puedan observar las ventanas independientes de SixNy en el lado opuesto del SixNy estampado.
      NOTA: El tiempo de grabado húmedo puede diferir dependiendo del grosor del Si; para una oblea de 100 μm de espesor, el grabado húmedo normalmente toma varias horas. No ajuste la velocidad de agitación demasiado alta durante el grabado de Si porque las ventanas independientes de SixNy son muy delgadas y pueden fracturarse por el flujo del fluido. En este experimento, la velocidad de agitación se estableció en 250 rpm.
    3. Limpie la oblea grabada sumergiéndola varias veces en un baño de agua DI para eliminar los residuos de grabado. Seque la oblea al aire.
      NOTA: Se debe tener extremo cuidado al sumergir o sacar la oblea con patrón de Si de las soluciones porque las ventanas independientes de SixNy son muy delgadas y frágiles y pueden fracturarse por la tensión superficial de la solución. La oblea debe sumergirse o sacarse en ángulo, de modo que el borde de la oblea entre y salga primero de la solución.
  5. Eliminar los residuos de grabado KOH.
    1. Presione ligeramente los límites de la matriz de chips con una pinza para obtener una matriz de chips que serán micro-modelados (Figura 1B).
    2. Preparar una solución de KOH de 1,5 M a 80 °C con agitación.
    3. Sumerja la matriz de chips en una solución KOH durante 30 s y enjuáguela sumergiéndola en agua DI 2x. Seque completamente las virutas soplando gas N2 .
      NOTA: Se debe tener mucho cuidado al sumergir las virutas en soluciones y secarlas con gas N2 porque las ventanas independientes de SixNy son muy delgadas y frágiles. Mientras el chip está sumergido en la solución de KOH, se debe detener la agitación. Las virutas deben sumergirse con sus bordes primero en la dirección perpendicular a la solución y soplarse con gas N2 en la dirección paralela.
    4. Seque completamente la matriz de chips en el aire durante al menos 1 h.
  6. Modela el PR.
    1. Prepare una oblea de Si en blanco de 525 μm como soporte sólido. Cubra la oblea Si con HMDS y PR positivo, como se describió anteriormente, pero conecte la matriz de chips (con la ventana independiente SixNy hacia arriba) en la oblea Si antes de hornear la PR. El PR actúa como un adhesivo entre la oblea y la matriz de chips. Hornea la oblea Si unida con la matriz de chips a 100 °C durante 90 s en una placa caliente.
    2. Gire el conjunto de chips con HMDS y PR positivo, como se describió anteriormente.
    3. Exponga el conjunto de chips con luz ultravioleta (longitud de onda de 365 nm; intensidad de 20 mW / cm2 ) durante 5 s a través de una máscara de cromo (Figura 2E, F) utilizando un alineador.
    4. Desarrolle el PR usando un revelador durante 15 s, enjuague el conjunto de chips sumergiéndolo en agua DI 2x y seque completamente el conjunto de chips con patrón PR soplando gas N2 .
  7. Preparar el SixN y con micropatrones.
    1. Etch SixNy siguiendo el patrón PR utilizando un RIE construido en laboratorio, con 3 sccm SF6 gas a una potencia de RF de 50 W. Controle el tiempo de grabado dependiendo del grosor de la capa SixNy .
  8. Eliminar las relaciones públicas.
    1. Elimine el PR sumergiendo el chip estampado en solución de 1-metil-2-pirrolidinona (NMP) a 60 °C y dejándolo durante la noche. Enjuague el juego de chips sumergiéndolo en agua DI 2x, y seque completamente el conjunto de chips estampado soplando gas N2 .
    2. Elimine los residuos de PR con un proceso de plasma O2 utilizando gas O2 de 100 sccm a una potencia de RF de 150 W durante 1 minuto con el RIE construido en laboratorio.
  9. Enjuague el chip micro-estampado.
    1. Preparar una solución de KOH de 1,5 M a 80 °C.
    2. Sumerja los chips micropatrullados en una solución KOH durante 30 s para eliminar completamente los residuos de PR y enjuague los chips sumergiéndolos en agua DI 2x. Seque completamente las virutas soplando gas N2 .
    3. Seque completamente las virutas al aire durante al menos 1 h.
  10. Transferencia de óxido de grafeno (GO) por el método de fundición por gota.
    1. Diluya la solución de GO (2 mg/ml) a 0,2 mg/L con agua DI y sonicato durante 10 min para romper los agregados de las láminas de GO. Centrifugar la solución diluida de GO a 300 x g durante 30 s.
    2. Descarga de resplandor el lado grabado en Si del chip micropatronado para renderizar la superficie del chip con carga positiva utilizando un descargador de resplandor (Tabla de Materiales) a 15 mA durante 1 min.
    3. Deje caer 3 μL de la solución GO en el lado descargado por resplandor del chip micropatronado y deje la gota en el chip durante 1 minuto. Después de 1 minuto, seque el exceso de solución go en el chip con papel de filtro.
    4. Lave el chip transferido por GO con gotas de agua DI preparadas en película de parafina y borre el agua DI en el chip con papel de filtro. Repita este procedimiento 2x en el lado transferido GO y 1x en el lado opuesto. Seque el chip transferido por GO a temperatura ambiente durante la noche.
    5. Lave el chip microesmplado con ventanas GO sumergiéndolo en el agua DI y seque el chip con gas N2 .

2. Imágenes crio-EM

  1. Prepare la criomuestra.
    1. Prepare la criomuestra utilizando una máquina criopulsadora mecánica (Tabla de materiales), que controla la temperatura, la humedad, el tiempo de secado y la fuerza. Después de cargar la almohadilla secante en los blotters, asegúrese de que la humedad y la temperatura en la cámara se mantengan al 100% y 15 ° C, respectivamente.
    2. Recoja el chip micro-estampado con una crio-pinza típica y cargue la pinza a la máquina crio-sumergida. Pipete 3 μL de solución de muestra en el chip micro-estampado en el lado con patrón de agujero, con ventanas GO en la parte inferior. Controle el tiempo y la fuerza de borrado en función de la solución de muestra.
      NOTA: Aquí, se utilizaron especímenes biológicos, a saber, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1), la ferritina, el proteasoma 26S, el groEL, las partículas de proteína apoferritina y las proteínas de filamento tau para las imágenes crio-EM. Además, se utilizaron diversos tipos de materiales inorgánicos, como nanopartículas de Fe2O3 (NP), nanopartículas de Au, nanovarillas de Au y nanopartículas de sílice, para la obtención de imágenes crio-EM. El tiempo y la fuerza de borrado deseados se establecieron en el émbolo criogénico para diferentes tipos de muestras.
    3. Después del proceso de secado, congele el chip cargado con muestra inmediatamente en etano líquido. Transfiera el chip a la caja de rejilla en nitrógeno líquido (LN2) y guárdelo en LN2 antes de obtener imágenes crio-EM.
  2. Realizar imágenes crio-EM.
    1. Cargue la criomuestra en un soporte crio-EM con la temperatura mantenida a -180 °C.
    2. Cargue el soporte crio-EM en un TEM y observe las muestras con el modo de sistema de dosis mínima (MDS).

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Representative Results

Un chip micro-estampado con ventanas GO fue fabricado por la fabricación MEMS y la transferencia de nanoláminas GO 2D. Los chips para micropatrones se produjeron en masa, con aproximadamente 500 chips producidos a partir de un 4 en oblea (Figura 1B y Figura 2A, B). Los diseños de los chips micro-estampados pueden ser manipulados utilizando diferentes diseños de la máscara de cromo (Figura 2) durante el procedimiento de fotolitografía. Los chips micropatronados fabricados tenían números y dimensiones controlados de membranas independientes de SixNy. Los números de las membranas independientes de SixNy se controlaron de 48 (6 x 8) a 50 (5 x 10) y las dimensiones de 50 x 40 μm2 a 250 x 40 μm2 (Figura 3A, B, F, G). Cada membrana independiente de SixNy puede tener decenas a cientos de microagujetos con diámetros personalizables que van desde 2-3 μm con diferentes espacios entre agujeros. Los chips micropatronados fabricados tienen hasta ~ 25,000 orificios suspendidos en GO, mientras que el número de los orificios también es controlable (Figura 3B-D y Figura 3G-I). La existencia de la delgada capa de GO a través del agujero fue confirmada por espectroscopia Raman y difracción de electrones. El espectro Raman en la ventana GO mostró picos representativos de GO, a saber, las bandas D y G a 1360 cm-1 y 1590 cm-1, respectivamente22 (Figura 3E). Los patrones de difracción hexagonal orientados a multiplicar indican que las ventanas consisten en GO multicapa (Figura 3J).

El chip micropatronado con ventanas GO se fabricó en tres profundidades objetivo representativas (25 nm, 50 nm y 100 nm) controlando el espesor de deposición del SixNy en la oblea de Si durante el proceso LPCVD para confirmar la viabilidad de regular la profundidad de los microagujeros. Para evaluar la estructura y el grosor de los micro-agujeros con ventanas GO, se obtuvieron imágenes de microscopio electrónico de barrido (SEM) inclinadas y de sección transversal de 40° e imágenes de microscopía de fuerza atómica (AFM) del chip micropatronado con ventanas GO. Se observó claramente la estructura tipo pozo del microagujeto con una ventana GO, con la profundidad del microagujeto correspondiente a la profundidad objetivo (Figura 4). Los resultados confirman que es posible controlar el número y el diseño del chip micropatronado con ventanas GO.

Para demostrar el uso del chip micropatronado para imágenes crio-EM, se prepararon varias criomuestras de biomoléculas y NP inorgánicas utilizando el chip micropatronado. Para especímenes biológicos, se tomaron imágenes de VIH-1, ferritina, proteasoma 26S, groEL, partículas de proteína de apoferritina y proteínas de filamento tau con crio-EM utilizando el chip micropatronado con ventanas GO (Figura 5A-F). Además de las biomoléculas, los materiales inorgánicos como Fe2O3 NPs, Au NPs, Au nanorods y NPs de sílice también fueron observados por crio-EM utilizando chips micro-modelados (Figura 5G-J).

Figure 1
Figura 1: Esquemas e imágenes del procedimiento de fabricación del chip micropatronado recientemente desarrollado con ventanas GO para crio-EM. (A) Esquemas del proceso de fabricación y secciones transversales del chip micropatronado con ventanas GO durante el proceso de fabricación. (B) Imágenes de los productos de fabricación en cada etapa de fabricación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Breve ilustración de las máscaras de cromo utilizadas para el proceso de fotolitografía. (A, B) Diseño de máscaras para la producción en masa de chips para una oblea de 4 en Si (24 x 24 matriz de chips), (C, D) diseños de 2 x 2 matrices de chips y (E, F) diseños de patrones de microagujos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Estructura de los chips micropatronados con ventanas GO. (A, F) Imágenes de microscopía óptica de chips micropatronados completos, (B, G) Imágenes SEM de membranas SixNy de micropatrones individuales, (C, H) Imágenes SEM de micropatrones y (D, I) Imágenes SEM de microagujos individuales con ventanas GO. (E,J) Confirmación de GO en el microagujeto a través de (E) el espectro Raman y (J) el patrón de difracción de electrones de área seleccionada (SAED) de la ventana GO. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Estructura del pozo y profundidad del microagujeto con ventanas GO. (A-C) Imágenes SEM inclinadas de 40° de un solo microagujeto con una ventana GO, e imagen SEM de sección transversal (D-F) del chip micropatronado con ventanas GO en diferentes profundidades (25 nm, 50 nm y 100 nm). (G) Microscopía de fuerza atómica (AFM) Imagen de renderizado 3D, (H) Imagen de deflexión AFM y (I) perfil de línea a lo largo de la línea roja en (H) que muestra la profundidad del chip micropatronado con ventanas GO fabricadas con membrana de 100 nm SixNy. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imágenes crio-EM de biomateriales de varios tamaños y nanomateriales inorgánicos utilizando el chip micropatrón con ventanas GO. (A) Partícula del virus VIH-1, (B) ferritina, (C) proteasoma 26S, (D) groEL, (E) apoferritina, (F) proteína tau (flechas que indican proteína tau fibrilada), (G) Fe2O3 NP, (H) Au NP, (I) Nanorod Au y (J) NP de sílice. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los procesos de microfabricación para producir chips micro-modelados con ventanas GO se presentan aquí. El chip micropatronado fabricado está diseñado para regular el grosor de la capa de hielo vítreo controlando la profundidad del microagujeto con ventanas GO dependiendo del tamaño del material a analizar. Se fabricó un chip microestampado con ventanas GO utilizando una serie de técnicas MEMS y un método de transferencia de nanoláminas 2D (Figura 1). La principal ventaja de utilizar la técnica de fabricación MEMS es su capacidad para la producción en masa y la viabilidad de manipular la estructura y las dimensiones del microchip mediante el uso de diferentes diseños de la máscara de cromo durante la fotolitografía (Figura 2). La capa de SixNy depositada en LPCVD con baja tensión garantiza la estabilidad de las decenas de nanómetros de espesor independiente de SixNy 23,24,25,26. Sin embargo, la capa independiente de SixNy a escala nanométrica sigue siendo vulnerable a las fuerzas en la dirección perpendicular27. Por lo tanto, se necesita extrema precaución al manipular el chip micropatrullado, como cuando se sumerge en solución o se seca por soplado. Además, el proceso de fabricación del chip micropatronado utiliza la oblea Si de 100 μm, lo que garantiza la compatibilidad con la mayoría de los portamuestras y cargadores automáticos crio-EM. Sin embargo, se necesita precaución durante los procesos de fabricación para evitar que la frágil oblea se fracture.

La matriz regular a escala de micras de estructuras de tipo pozo con ventanas GO se confirmó con un microscopio óptico y un SEM (Figura 3 y Figura 4). Además, el método de fundición en gota para transferir GO permite la deposición de GO con alta planitud y sin arrugas notables (Figura 3D, E, I, J). El chip micropatronado es adecuado para cargar en el cargador automático crio-EM, y decenas de miles de agujeros a escala de micras en una matriz regular permiten la recopilación automatizada de datos de imágenes grandes para el análisis de partículas individuales. Además, el número y la morfología de las membranas SixNy y los microfisoros compatibles con GO se pueden manipular fácilmente en el proceso de fabricación de MEMS, lo que permite el análisis de partículas individuales de alto rendimiento y otros experimentos de imágenes crio-EM dependiendo de los propósitos de investigación. Además, las aplicaciones extendidas de chips micropatronados con espesor controlado pueden facilitarse mediante la fabricación de chips que tienen orificios modelados a escala nanométrica. Las técnicas de nanopatrones desarrolladas en la industria de semiconductores se pueden adoptar en la fabricación de esos chips 28,29,30.

La capacidad de regular la profundidad de los micro-agujeros se ha demostrado aquí mediante la fabricación de chips micro-modelados con ventanas GO en tres profundidades objetivo representativas: 25 nm, 50 nm y 100 nm. Se lograron diferentes profundidades de la estructura del micropocillo controlando el tiempo de deposición de la capa de SixNy en la oblea de Si (Figura 4). Para evaluar la morfología y el grosor del chip micropatronado con ventanas GO, se observaron secciones transversales de los dispositivos obtenidos a partir de la sección de haz de iones enfocado (FIB) con SEM, y se midió el perfil de profundidad con AFM (Figura 4). La estructura de tipo pozo del micro-agujero con ventana GO se mostró claramente en las imágenes SEM y AFM, confirmando el control exitoso de la profundidad del micro-agujero SixNy y la transferencia de la ventana GO. Es probable que el uso del chip micropatronado personalizable con ventanas GO garantice una alta tasa de éxito en la producción de regiones de espesor de hielo óptimo para imágenes crio-EM.

Dado que los materiales que se observarán con crio-EM tienen diferentes tamaños, la producción de hielo vítreo con un espesor adecuado puede garantizar una resolución de contraste mejorada, una amplia cobertura de orientación y una desnaturalización reducida de la estructura durante las imágenes crio-EM. Para demostrar el uso del proceso de imágenes crio-EM para aplicaciones biológicas, se tomaron imágenes de varias muestras biológicas de diferentes tamaños, incluyendo VIH-1, ferritina, proteasoma 26S, groEL, apoferritina y proteína tau, utilizando el chip micropatrullado con ventanas GO. Las biomoléculas se observaron claramente utilizando el chip micropatronado con ventanas GO (Figura 5A-F). Además de las biomoléculas, también se observaron diversos tipos de nanomateriales inorgánicos, como Fe2O3 NP, Au NP, nanovarillas Au y NP de sílice, utilizando el chip micropatronado con ventanas GO (Figura 5G-J). El chip micro-estampado y el método de fabricación muestran compatibilidad para la crio-imagen de varios materiales. Por lo tanto, el chip micropatronado recientemente desarrollado con ventanas GO proporciona una estrategia de preparación de muestras confiable y reproducible para un análisis de estructura eficiente y de alto rendimiento con crio-EM.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

M.-H.K., S.K., M.L. y J.P. reconocen el apoyo financiero del Instituto de Ciencias Básicas (Grant No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. y J.P. reconocen el apoyo financiero del Programa de Investigadores Pioneros Creativos a través de la Universidad Nacional de Seúl (2021) y la subvención NRF financiada por el gobierno coreano (MSIT; Grant Nos. NRF-2020R1A2C2101871 y NRF-2021M3A9I4022936). M.L. y J.P. reconocen el apoyo financiero de la BECA DE Ciencia POSCO de POSCO TJ Park Foundation y la subvención NRF financiada por el gobierno coreano (MSIT; Conceda el Número de subvención. NRF-2017R1A5A1015365). J.P. reconoce el apoyo financiero de la subvención NRF financiada por el gobierno coreano (MSIT; Conceda el Número de subvención. NRF-2020R1A6C101A183), y los Programas de Iniciativas de Investigación Interdisciplinaria de la Facultad de Ingeniería y la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl (2021). M.-H.K. reconoce el apoyo financiero de la subvención NRF financiada por el gobierno coreano (MSIT; Conceda el Número de subvención. NRF-2020R1I1A1A0107416612). Los autores agradecen al personal y al equipo del Centro de Imágenes Macromoleculares y Celulares de la Universidad Nacional de Seúl (SNU CMCI) por sus incansables esfuerzos y perseverancia con los experimentos crio-EM. Los autores agradecen a S. J. Kim del Centro Nacional de Instalaciones de Investigación Interuniversitaria por su ayuda con los experimentos FIB-SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma Aldrich, USA 443778
Acetone
AFM Park Systems, South Korea NX-10
Aligner Midas System, South Korea MDA-600S
AZ 300 MIF developer AZ Electronic Materials USA Corp., USA 184411
Cryo-EM holder Gatan, USA 626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) FEI Company, USA Helios NanoLab 650
Glow discharger Ted Pella Inc., USA PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution Sigma Aldrich, USA 763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% Alfa Aesar, USA 10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) Centrotherm, Germany LPCVD E1200
maP1205 positive PR Micro resist technology, Germany A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea 6597-4400
Raman Spectrometer NOST, South Korea Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE) Scientific Engineering, South Korea Lab-built
SEM Carl Zeiss, Germany SUPRA 55VP
Si wafer JP COMMERCE, South Korea 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater Dong Ah Trade Corp., South Korea ACE-200
TEM JEOL, Japan JEM-2100F

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References

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Ingeniería Número 182 Microscopio electrónico criogénico sistemas microelectromecánicos óxido de grafeno espesor de hielo vítreo virus proteína nanomateriales
Fabricación de chip micropatrón con espesor controlado para microscopía electrónica criogénica de alto rendimiento
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Kang, M. H., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (182), e63739, doi:10.3791/63739 (2022).

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