Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Fabrikasjon av mikromønstret chip med kontrollert tykkelse for kryogen elektronmikroskopi med høy gjennomstrømning

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63739
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,4, 3,4,5,6
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

Summary

En nyutviklet mikromønstret brikke med grafenoksidvinduer fremstilles ved å bruke mikroelektromekaniske systemteknikker, noe som muliggjør effektiv og høy gjennomstrømning kryogen elektronmikroskopiavbildning av forskjellige biomolekyler og nanomaterialer.

Abstract

En stor begrensning for effektiv strukturanalyse med høy gjennomstrømning av biomolekyler ved bruk av kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) er vanskeligheten med å forberede kryo-EM-prøver med kontrollert istykkelse på nanoskala. Den silisiumbaserte (Si) -baserte brikken, som har et vanlig utvalg av mikrohull med grafenoksid (GO) vindu mønstret på en tykkelsesstyrt silisiumnitrid (SixNy) film, er utviklet ved å bruke mikroelektromekaniske system (MEMS) teknikker. UV-fotolitografi, kjemisk dampavsetning, våt og tørr etsning av tynnfilmen og dråpestøping av 2D nanoarkmaterialer ble brukt til masseproduksjon av mikromønstrede sjetonger med GO-vinduer. Dybden på mikrohullene reguleres for å kontrollere istykkelsen på forespørsel, avhengig av størrelsen på prøven for kryo-EM-analyse. Den gunstige affiniteten til GO mot biomolekyler konsentrerer biomolekylene av interesse i mikrohullet under kryo-EM-prøvepreparering. Den mikromønstrede brikken med GO-vinduer muliggjør kryo-EM-avbildning med høy gjennomstrømning av ulike biologiske molekyler, samt uorganiske nanomaterialer.

Introduction

Kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) er utviklet for å løse den tredimensjonale (3D) strukturen til proteiner i deres opprinnelige tilstand 1,2,3,4. Teknikken innebærer å feste proteiner i et tynt lag (10-100 nm) av glassaktig is og skaffe projeksjonsbilder av tilfeldig orienterte proteiner ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop (TEM), med prøven opprettholdt ved flytende nitrogentemperatur. Tusenvis til millioner av projeksjonsbilder er anskaffet og brukes til å rekonstruere en 3D-struktur av proteinet ved hjelp av beregningsalgoritmer 5,6. For vellykket analyse med cryo-EM, har kryoprøvepreparering blitt automatisert ved å stupfryse utstyret som styrer blottingforholdene, fuktigheten og temperaturen. Prøveløsningen lastes på et TEM-rutenett med en hullete karbonmembran, sempes suksessivt for å fjerne overflødig løsning, og deretter stupfryses med flytende etan for å produsere tynn, glassaktig is 1,5,6. Med fremskrittene innen kryo-EM og automatiseringen av prøvepreparering7, har kryo-EM i økende grad blitt brukt til å løse strukturen til proteiner, inkludert konvoluttproteiner for virus og ionekanalproteiner i cellemembranen 8,9,10. Strukturen av konvoluttproteiner av patogene viruspartikler er viktig for å forstå virusinfeksjonspatologi, samt utvikle diagnosesystemet og vaksiner som SARS-CoV-211, som forårsaket COVID-19-pandemien. Videre har kryo-EM-teknikker nylig blitt brukt på materialvitenskap, for eksempel for avbildning av strålefølsomme materialer som brukes i batteri 12,13,14 og katalytiske systemer 14,15 og analyse av strukturen til uorganiske materialer i løsningstilstand16.

Til tross for merkbar utvikling i kryo-EM og relevante teknikker, finnes det begrensninger i kryoprøvepreparering, noe som hindrer 3D-strukturanalyse med høy gjennomstrømning. Forberedelse av en glassaktig isfilm med optimal tykkelse er spesielt viktig for å oppnå 3D-strukturen av biologiske materialer med atomoppløsning. Isen må være tynn nok til å minimere bakgrunnsstøy fra elektroner spredt av isen og for å forby overlapping av biomolekyler langs elektronstrålebanen 1,17. Men hvis isen er for tynn, kan det føre til at proteinmolekyler justerer seg i foretrukne retninger eller denaturerer 18,19,20. Derfor bør tykkelsen på glassaktig is optimaliseres avhengig av størrelsen på materialet av interesse. Videre er det vanligvis behov for omfattende innsats for prøvepreparering og manuell screening av is- og proteinintegritet på de forberedte TEM-nettene. Denne prosessen er ekstremt tidkrevende, noe som hindrer effektiviteten for 3D-strukturanalyse med høy gjennomstrømning. Derfor vil forbedringer i påliteligheten og reproduserbarheten av kryo-EM prøvepreparering øke bruken av kryo-EM i strukturbiologi og kommersiell legemiddeloppdagelse, så vel som for materialvitenskap.

Her introduserer vi mikrofabrikasjonsprosesser for å lage en mikromønstret chip med grafenoksid (GO) vinduer designet for høy gjennomstrømning kryo-EM med kontrollert istykkelse21. Den mikromønstrede brikken ble produsert ved hjelp av mikroelektromekaniske systemteknikker (MEMS), som kan manipulere strukturen og dimensjonene til brikken avhengig av bildebehandlingsformålene. Den mikromønstrede brikken med GO-vinduer har en mikrobrønnstruktur som kan fylles med prøveløsningen, og dybden på mikrobrønnen kan reguleres for å kontrollere tykkelsen på glasslegemet. Den sterke affiniteten til GO for biomolekyler forbedrer konsentrasjonen av biomolekyler for visualisering, og forbedrer effektiviteten av strukturanalysen. Videre består den mikromønstrede brikken av en Si-ramme, som gir høy mekanisk stabilitet for rutenettet19, noe som gjør den ideell for håndtering av brikken under prøveprepareringsprosedyrer og kryo-EM-avbildning. Derfor gir en mikromønstret brikke med GO-vinduer produsert av MEMS-teknikker pålitelighet og reproduserbarhet av kryo-EM-prøvepreparering, noe som kan muliggjøre effektiv strukturanalyse med høy gjennomstrømning basert på cryo-EM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fabrikasjon av mikromønstret chip med GO-vinduer (figur 1)

  1. Sett inn silisiumnitridet.
    1. Avsett silisiumnitrid med lav spenning (SixNy) på begge sider av Si-waferen (4 tommers diameter og 100 μm tykkelse) ved bruk av lavtrykks kjemisk dampavsetning (LPCVD) ved 830 ° C og et trykk på 150 mTorr, under en strømning på 170 sccm diklorsilan (SiH2Cl2, DCS) og 38 sccm ammoniakk (NH3).
    2. Bruk en avsetningshastighet på ~ 30 Å / min, kontroller SixNy tykkelsen til å være innenfor 25-100 nm ved å variere avsetningstiden.
      MERK: Ekstrem forsiktighet bør utvises ved håndtering av Si-platen fordi waferen er veldig tynn og skjør. Pass på at du ikke bøyer platen under håndtering eller lasting i utstyret.
  2. Mønster fotoresisten.
    1. Påfør en heksametyldisilazan (HMDS) løsning på SixNy-avsatt Si-wafer med nok volum til å dekke hele overflaten av waferen, spinnbelegg med en spin coater ved 3,000 rpm i 30 s, og stek ved 95 ° C i 30 s på en kokeplate for å gjøre waferoverflaten hydrofob og dermed sikre en god beleggytelse med fotoresist (PR).
    2. Påfør positiv PR (Materialtabell) med nok volum til å dekke hele overflaten av platen, spinn belegg ved 3000 o / min i 30 s, og stek ved 100 ° C i 90 s på en kokeplate. Spin-coated PR har en tykkelse på 500 nm.
    3. Utsett den PR-belagte waferen med ultrafiolett lys (365 nm bølgelengde og 20 mW / cm2 intensitet) i 5 s gjennom en krommaske (Figur 2A-D) ved hjelp av en reguleringsenhet.
    4. Utvikle PR i 1 min ved hjelp av en utvikler (materialtabell) og skyll platen ved å senke den ned i avionisert (DI) vann 2x. Tørk den PR-mønstrede waferen helt ved å blåse N2-gass på waferoverflaten.
      MERK: Ekstrem forsiktighet bør utvises når du blåser N2-gass på Si-platen fordi waferen er veldig tynn og skjør. Ikke blås N2-gass med høyt trykk i vinkelrett på waferen, da dette kan føre til at platen sprekker.
  3. Mønster SixNy.
    1. Ets den eksponerte SixNy etter mønster av PR ved hjelp av en laboratoriebygget reaktiv ionetser (RIE), med 3 sccm svovelheksafluorid (SF6) gass ved en radiofrekvens (RF) effekt på 50 W. Etsehastigheten med disse innstillingene er ~6 Å/s. Still inn etsetiden avhengig av tykkelsen på SixNy-laget som er avsatt.
      MERK: Etsningshastigheten kan variere og trenger optimalisering i laboratoriet, avhengig av spesifikasjonene til RITE-utstyret som brukes.
    2. Eliminer PR ved å senke SixNy mønstret wafer i aceton ved romtemperatur i 30 minutter, etterfulgt av å skylle waferen ved å senke den ned i DI-vann 2x. Tørk waferen helt ved å blåse N2-gass på waferoverflaten.
      MERK: Ekstrem forsiktighet bør utvises mens du nedsenker eller tar ut platen fra løsningene fordi waferen kan brytes av overflatespenningen til løsningen. Ikke senk eller ta ut platen parallelt med overflaten av oppløsningen. Bruk pinsett med presisjonsplatehåndtering med karbonfibertupper. Ikke ta tak i waferen sterkt med pinsetten; løft den ene siden av waferen til waferen vipper til en vinkel, hvor den kan tas ut av løsningen. Waferen kan sprekke når den bøyer seg på grunn av det faste grepet under løfting.
  4. Etse Si.
    1. Klargjør en 1,5 M kaliumhydroksidløsning (KOH) ved å oppløse KOH-pulver i DI-vann ved 80 °C.
    2. Senk SixNy mønstret wafer i KOH-løsning for å etse den eksponerte Si. La waferen ligge i løsningen under omrøring til de frittstående SixNy-vinduene kan observeres på motsatt side av den mønstrede SixNy.
      MERK: Den våte etsetiden kan variere avhengig av tykkelsen på Si; for en 100 μm tykk wafer tar våt etsning normalt flere timer. Ikke still omrøringshastigheten for høyt under Si-etsning fordi de frittstående SixNy-vinduene er veldig tynne og kan brytes av væskestrømmen. I dette eksperimentet ble omrøringshastigheten satt til 250 o / min.
    3. Rengjør den etsede platen ved å dyppe den flere ganger i et DI-vannbad for å eliminere etserester. Tørk waferen i luften.
      MERK: Ekstrem forsiktighet bør utvises mens du nedsenker eller tar ut den Si-mønstrede platen fra løsningene fordi de frittstående SixNy-vinduene er veldig tynne og skjøre og kan brytes av overflatespenningen til løsningen. Platen skal senkes ned eller tas ut i vinkel, slik at kanten av waferen kommer inn og ut av løsningen først.
  5. Eliminer KOH-etserester.
    1. Trykk lett på grensene til chip-matrisen med en pinsett for å få en rekke sjetonger som vil være mikromønstret (figur 1B).
    2. Klargjør 1,5 M KOH-oppløsning ved 80 °C under omrøring.
    3. Senk chip array i KOH-løsningen i 30 s og skyll den ved å dyppe den i DI-vann 2x. Tørk flisene helt ved å blåse N2 gass.
      MERK: Ekstrem forsiktighet bør utvises når du dypper flisene i løsninger og føner dem med N2-gass fordi de frittstående SixNy-vinduene er veldig tynne og skjøre. Mens brikken er nedsenket i KOH-løsning, bør omrøringen stoppes. Flisene skal dyppes med kantene først i retning vinkelrett på løsningen og blåses med N2 gass i parallell retning.
    4. Tørk chipmatrisen helt i luften i minst 1 time.
  6. Mønster PR.
    1. Forbered en blank 525 μm Si-wafer som solid støtte. Spin coat Si-waferen med HMDS og positiv PR, som beskrevet ovenfor, men fest chip-arrayet (med den frittstående SixNy vindussiden oppover) på Si-platen før du baker PR-en. PR fungerer som et lim mellom waferen og chip array. Stek Si-platen festet med chip array ved 100 ° C i 90 s på en kokeplate.
    2. Spin coat chipsettet med HMDS og positiv PR, som beskrevet ovenfor.
    3. Utsett sponsettet med ultrafiolett lys (365 nm bølgelengde; 20 mW / cm2 intensitet) i 5 s gjennom en krommaske (figur 2E, F) ved hjelp av en reguleringsenhet.
    4. Utvikle PR ved hjelp av en utvikler i 15 s, skyll chipsettet ved å dyppe det i DI-vann 2x, og tørk det PR-mønstrede sponsettet helt ved å blåse N2-gass .
  7. Forbered den mikromønstrede SixNy.
    1. Ets SixNy etter PR-mønsteret ved hjelp av en laboratoriebygget RITE, med 3 sccm SF6 gass ved RF-effekt på 50 W. Kontroller etsetiden avhengig av tykkelsen på SixNy-laget .
  8. Eliminer PR.
    1. Eliminer PR ved å senke det mønstrede sponsettet i 1-metyl-2-pyrrolidinon (NMP) løsning ved 60 ° C og la det stå over natten. Skyll sponsettet ved å dyppe det i DI-vann 2x, og tørk det mønstrede sponsettet helt ved å blåse N2-gass .
    2. Eliminer PR-restene med en O2-plasmaprosess ved bruk av 100 sccm O2 gass ved RF-effekt på 150 W i 1 min med den laboratoriebygde RITe.
  9. Skyll den mikromønstrede brikken.
    1. Klargjør 1,5 M KOH-oppløsning ved 80 °C.
    2. Senk de mikromønstrede sjetongene i KOH-løsningen i 30 s for å eliminere PR-restene fullstendig og skyll sjetongene ved å senke dem ned i DI-vann 2x. Tørk flisene helt ved å blåse N2 gass.
    3. Tørk flisene helt i luften i minst 1 time.
  10. Overfør grafenoksyd (GO) ved hjelp av drop-casting-metoden.
    1. Fortynn GO-løsning (2 mg / ml) til 0,2 mg / L med DI-vann og sonikat i 10 minutter for å bryte opp aggregater av GO-ark. Sentrifuger den fortynnede GO-løsningen ved 300 x g i 30 s.
    2. Glødutlad den Si-etsede siden av den mikromønstrede brikken for å gjengi sponoverflaten med positiv ladning ved hjelp av en glødeutlader (materialtabell) ved 15 mA i 1 min.
    3. Slipp 3 μL av GO-løsningen på den glødeutladede siden av den mikromønstrede brikken og la dråpen ligge på brikken i 1 min. Etter 1 min, fjern overflødig GO-løsning på brikken med filterpapir.
    4. Vask den GO-overførte brikken med DI-vanndråper tilberedt på parafinfilm og fjern DI-vannet på brikken med filterpapir. Gjenta denne prosedyren 2x på GO-overført side og 1x på motsatt side. Tørk den GO-overførte brikken ved romtemperatur over natten.
    5. Vask den mikromønstrede brikken med GO-vinduer ved å senke den ned i DI-vannet og tørk brikken med N2-gass .

2. Cryo-EM-bildebehandling

  1. Forbered kryoprøven.
    1. Forbered kryoprøven ved hjelp av en mekanisk kryo-stupende maskin (Materialtabell), som styrer temperatur, fuktighet, blottingtid og kraft. Etter at du har lagt blottingputen på blotterne, må du sørge for at fuktigheten og temperaturen i kammeret holdes på henholdsvis 100 % og 15 °C.
    2. Plukk opp den mikromønstrede brikken med en typisk kryo-pinsett og last pinsetten til kryo-stupende maskin. Rør 3 μL prøveløsning på den mikromønstrede brikken på hullmønstret side, med GO-vinduer på bunnen. Kontroller blottingtiden og kraften avhengig av prøveløsningen.
      MERK: Her ble biologiske prøver, nemlig humant immunsviktvirus (HIV-1), ferritin, proteasom 26S, groEL, apoferritinproteinpartikler og tau-filamentproteiner brukt til kryo-EM-avbildning. I tillegg ble ulike typer uorganiske materialer, som Fe2O3 nanopartikler (NP), Au nanopartikler, Au nanorods og silika nanopartikler, brukt til kryo-EM-avbildning. Ønsket blottingtid og kraft ble satt på kryostempelet for ulike typer prøver.
    3. Etter blottingprosessen, dypfrys den prøvelastede brikken umiddelbart i flytende etan. Overfør brikken til rutenettboksen i flytende nitrogen (LN2) og oppbevar den i LN2 før kryo-EM-avbildning.
  2. Utfør kryo-EM-avbildning.
    1. Legg kryoprøven i en kryo-EM-holder med temperaturen ved -180 °C.
    2. Legg kryo-EM-holderen i en TEM og observer prøvene med modusen minimumsdosesystem (MDS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En mikromønstret brikke med GO-vinduer ble produsert av MEMS-fabrikasjon og 2D GO nanoarkoverføring. Chips for mikromønstre ble masseprodusert, med ca 500 chips produsert fra en 4 i wafer (figur 1B og figur 2A, B). Utformingen av de mikromønstrede sjetongene kan manipuleres ved hjelp av forskjellige design av krommasken (figur 2) under fotolitografiprosedyren. De fabrikkerte mikromønstrede sjetongene hadde kontrollerte tall og dimensjoner av frittstående SixNy-membraner. Tallene på de frittstående SixNy membranene ble kontrollert fra 48 (6 x 8) til 50 (5 x 10) og dimensjonene fra 50 x 40 μm2 til 250 x 40 μm2 (figur 3A, B, F, G). Hver frittstående SixNy membran kan ha titalls til hundrevis av mikrohull med tilpassbare diametre fra 2-3 μm med forskjellig hullavstand. Fabrikkerte mikromønstrede brikker har opptil ~ 25 000 GO-suspenderte hull, mens antall hull også kan kontrolleres (figur 3B-D og figur 3G-I). Eksistensen av det tynne GO-laget over hullet ble bekreftet av Raman-spektroskopi og elektrondiffraksjon. Raman-spekteret ved GO-vinduet viste representative topper av GO, nemlig D- og G-bånd på henholdsvis 1360 cm-1 og 1590 cm-1 (figur 3E). De multiplikasjonsorienterte sekskantede diffraksjonsmønstrene indikerer at vinduene består av flerlags GO (figur 3J).

Den mikromønstrede brikken med GO-vinduer ble produsert i tre representative måldybder (25 nm, 50 nm og 100 nm) ved å kontrollere avsetningstykkelsen til SixNy på Si-waferen under LPCVD-prosessen for å bekrefte muligheten for å regulere dybden av mikrohullene. For å evaluere strukturen og tykkelsen på mikrohullene med GO-vinduer, ble det oppnådd 40 ° vippet og tverrsnittsskanning elektronmikroskop (SEM) bilder og atomkraftmikroskopi (AFM) bilder av den mikromønstrede brikken med GO-vinduer. Mikrohullets brønntypestruktur med GO-vindu ble tydelig observert, med dybden av mikrohullet tilsvarende den målrettede dybden (figur 4). Resultatene bekrefter at det er mulig å kontrollere nummeret og utformingen av den mikromønstrede brikken med GO-vinduer.

For å demonstrere bruken av den mikromønstrede brikken for kryo-EM-avbildning, ble forskjellige kryoprøver av biomolekyler og uorganiske NP-er fremstilt ved hjelp av den mikromønstrede brikken. For biologiske prøver ble HIV-1, ferritin, proteasom 26S, groEL, apoferritinproteinpartikler og tau-filamentproteiner avbildet med kryo-EM ved hjelp av den mikromønstrede brikken med GO-vinduer (Figur 5A-F). Foruten biomolekyler ble uorganiske materialer som Fe2O3 NP, Au NP, Au nanorods og silika NP også observert av kryo-EM ved bruk av mikromønstrede chips (Figur 5G-J).

Figure 1
Figur 1: Skjemaer og bilder av fabrikasjonsprosedyren til den nyutviklede mikromønstrede brikken med GO-vinduer for cryo-EM. (A) Skjemaer for fabrikasjonsprosessen og tverrsnitt av den mikromønstrede brikken med GO-vinduer under fabrikasjonsprosessen. (B) Bilder av fabrikasjonsproduktene ved hvert fabrikasjonstrinn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kort illustrasjon av krommaskene som brukes til fotolitografiprosessen. (A, B) Maskdesign for masseproduksjon av sjetonger for en 4 i Si-wafer (24 x 24 array av chips), (C, D) design av 2 x 2 array av chips, og (E, F) design av mikrohullmønstre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Struktur av de mikromønstrede sjetongene med GO-vinduer. (A, F) Optiske mikroskopibilder av hele mikromønstrede chips, (B, G) SEM-bilder av enkle mikromønstrede SixNy-membraner , (C, H) SEM-bilder av mikromønstre og (D, I) SEM-bilder av enkle mikrohull med GO-vinduer. (E,J) Bekreftelse av GO ved mikrohullet gjennom (E) Raman-spekteret og (J) det valgte området elektrondiffraksjon (SAED) mønster av GO-vinduet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Brønnstruktur og dybde av mikrohullet med GO-vinduer. (A-C) 40 ° vippet SEM-bilder av et enkelt mikrohull med et GO-vindu, og (D-F) tverrsnitts SEM-bilde av den mikromønstrede brikken med GO-vinduer i forskjellige dybder (25 nm, 50 nm og 100 nm). (G) Atomkraftmikroskopi (AFM) 3D-gjengivelsesbilde, (H) AFM-avbøyningsbilde og (I) linjeprofil langs den røde linjen i (H) som viser dybden på den mikromønstrede brikken med GO-vinduer produsert med 100 nm SixNy membran. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Cryo-EM-bilder av biomaterialer og uorganiske nanomaterialer i forskjellige størrelser ved bruk av mikromønstret chip med GO-vinduer. (A) HIV-1-viruspartikkel, (B) ferritin, (C) proteasom 26S, (D) groEL, (E) apoferritin, (F) tau-protein (piler som indikerer fibrillerisert tau-protein), (G) Fe2O3 NP, (H) Au NP, (I) Au nanorod og (J) silika NP. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrofabrikasjonsprosessene for produksjon av mikromønstrede brikker med GO-vinduer blir introdusert her. Den fabrikkerte mikromønstrede brikken er designet for å regulere tykkelsen på glasslegemet ved å kontrollere dybden på mikrohullet med GO-vinduer avhengig av størrelsen på materialet som skal analyseres. En mikromønstret brikke med GO-vinduer ble produsert ved hjelp av en rekke MEMS-teknikker og en 2D nanoarkoverføringsmetode (figur 1). Den største fordelen ved å bruke MEMS-fabrikasjonsteknikken er dens evne til masseproduksjon og muligheten for å manipulere strukturen og dimensjonene til mikrobrikken ved å bruke forskjellige design av krommasken under fotolitografi (figur 2). Det LPCVD-avsatte SixNy-laget med lav spenning sikrer stabiliteten til de titalls nanometer tykke frittstående SixNy 23,24,25,26. Imidlertid er nanometerskala frittstående SixNy-lag fortsatt sårbart for krefter i vinkelrett retning27. Derfor er det nødvendig med ekstrem forsiktighet ved håndtering av den mikromønstrede brikken, for eksempel ved dypping i løsning eller føning. I tillegg bruker fabrikasjonsprosessen for den mikromønstrede brikken 100 μm Si-waferen, som sikrer kompatibilitet med de fleste kryo-EM-prøveholdere og autoloadere. Imidlertid er det nødvendig med forsiktighet under fabrikasjonsprosessene for å forhindre at den skjøre waferen sprekker.

Det mikron-skala regulære utvalget av brønntypestrukturer med GO-vinduer ble bekreftet med et optisk mikroskop og et SEM (figur 3 og figur 4). Dessuten muliggjør dråpestøpemetoden for overføring av GO GO-avsetning med høy flathet og uten merkbare rynker (figur 3D, E, I, J). Den mikromønstrede brikken er egnet for lasting i kryo-EM-autoloaderen, og titusenvis av mikronskala hull i en vanlig matrise tillater automatisert innsamling av store bildedata for enkeltpartikkelanalyse. Videre kan antallet og morfologien til SixNy-membraner og GO-støttede mikrohull enkelt manipuleres i MEMS-fabrikasjonsprosessen, noe som muliggjør enkeltpartikkelanalyse med høy gjennomstrømning og andre kryo-EM-bildebehandlingseksperimenter avhengig av forskningsformålene. Videre kan utvidede anvendelser av mikromønstrede sjetonger med kontrollert tykkelse forenkles ved fremstilling av sjetonger som har hull mønstret på nanometerskalaen. Nano-mønsterteknikker utviklet i halvlederindustrien kan vedtas ved fremstilling av disse sjetongene 28,29,30.

Evnen til å regulere dybden på mikrohullene har blitt demonstrert her ved å fremstille mikromønstrede sjetonger med GO-vinduer i tre representative måldybder: 25 nm, 50 nm og 100 nm. Ulike dybder av mikrobrønnstrukturen ble oppnådd ved å kontrollere avsetningstiden til SixNy-laget på Si-waferen (figur 4). For å evaluere morfologien og tykkelsen på den mikromønstrede brikken med GO-vinduer, ble tverrsnitt av enhetene hentet fra fokusert ionstråle (FIB) seksjonering observert med SEM, og dybdeprofilen ble målt med AFM (figur 4). Brønntypestrukturen til mikrohullet med GO-vindu ble tydelig vist på SEM- og AFM-bildene, og bekreftet vellykket kontroll av dybden til SixNy mikrohullet og overføring av GO-vinduet. Bruken av den tilpassbare mikromønstrede brikken med GO-vinduer vil sannsynligvis sikre en høy suksessrate for å produsere regioner med optimal istykkelse for kryo-EM-avbildning.

Siden materialene som skal observeres med cryo-EM har forskjellige størrelser, kan produksjon av glassaktig is med passende tykkelse sikre forbedret kontrastoppløsning, bred orienteringsdekning og redusert denaturering av strukturen under kryo-EM-avbildning. For å demonstrere bruken av kryo-EM-bildebehandlingsprosessen for biologiske applikasjoner, ble forskjellige biologiske prøver av forskjellige størrelser, inkludert HIV-1, ferritin, proteasom 26S, groEL, apoferritin og tau-protein, avbildet ved hjelp av den mikromønstrede brikken med GO-vinduer. Biomolekylene ble tydelig observert ved hjelp av den mikromønstrede brikken med GO-vinduer (figur 5A-F). Foruten biomolekyler ble det også observert forskjellige typer uorganiske nanomaterialer, som Fe2O3 NP, Au NP, Au nanorods og silika NP, ved hjelp av mikromønstret chip med GO-vinduer (Figur 5G-J). Den mikromønstrede chip- og fabrikasjonsmetoden viser kompatibilitet for kryoavbildning av ulike materialer. Dermed gir den nyutviklede mikromønstrede brikken med GO-vinduer en pålitelig og reproduserbar prøveprepareringsstrategi for effektiv strukturanalyse med høy gjennomstrømning med kryo-EM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

M.-H.K., S.K., M.L. og J.P. anerkjenner den økonomiske støtten fra Institutt for grunnforskning (Grant nr. IBS-R006-D1). S.K., M.L. og J.P. anerkjenner den økonomiske støtten fra Creative-Pioneering Researchers Program gjennom Seoul National University (2021) og NRF-stipendet finansiert av den koreanske regjeringen (MSIT; Gi nr. NRF-2020R1A2C2101871, og NRF-2021M3A9I4022936). M.L. og J.P. anerkjenner den økonomiske støtten fra POSCO Science Fellowship of POSCO TJ Park Foundation og NRF-tilskuddet finansiert av den koreanske regjeringen (MSIT; Bevilgning nr. NRF-2017R1A5A1015365). J.P. anerkjenner den økonomiske støtten fra NRF-tilskuddet finansiert av den koreanske regjeringen (MSIT; Bevilgning nr. NRF-2020R1A6C101A183), og tverrfaglige forskningsinitiativprogrammer ved College of Engineering og College of Medicine, Seoul National University (2021). M.-H.K. anerkjenner den økonomiske støtten fra NRF-tilskuddet finansiert av den koreanske regjeringen (MSIT; Bevilgning nr. NRF-2020R1I1A1A0107416612). Forfatterne takker ansatte og mannskap på Seoul National University Center for Macromolecular and Cell Imaging (SNU CMCI) for deres utrettelige innsats og utholdenhet med kryo-EM-eksperimentene. Forfatterne takker SJ Kim fra National Center for Inter-university Research Facilities for hjelp med FIB-SEM-eksperimentene.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma Aldrich, USA 443778
Acetone
AFM Park Systems, South Korea NX-10
Aligner Midas System, South Korea MDA-600S
AZ 300 MIF developer AZ Electronic Materials USA Corp., USA 184411
Cryo-EM holder Gatan, USA 626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) FEI Company, USA Helios NanoLab 650
Glow discharger Ted Pella Inc., USA PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution Sigma Aldrich, USA 763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% Alfa Aesar, USA 10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) Centrotherm, Germany LPCVD E1200
maP1205 positive PR Micro resist technology, Germany A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea 6597-4400
Raman Spectrometer NOST, South Korea Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE) Scientific Engineering, South Korea Lab-built
SEM Carl Zeiss, Germany SUPRA 55VP
Si wafer JP COMMERCE, South Korea 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater Dong Ah Trade Corp., South Korea ACE-200
TEM JEOL, Japan JEM-2100F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
  2. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
  3. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  4. Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
  5. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
  6. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  7. Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
  8. Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
  9. Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
  10. Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
  11. Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
  12. Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
  13. Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
  14. Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  15. Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
  16. Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
  17. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
  18. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
  19. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
  20. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
  22. Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
  23. Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
  24. Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
  25. Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
  26. Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
  27. Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
  28. Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
  29. Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
  30. Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).

Tags

Engineering Kryogen-elektronmikroskop mikroelektromekaniske systemer grafenoksid glassaktig istykkelse virus protein nanomaterialer
Fabrikasjon av mikromønstret chip med kontrollert tykkelse for kryogen elektronmikroskopi med høy gjennomstrømning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S.,… More

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (182), e63739, doi:10.3791/63739 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter