Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Tillverkning av mikromönstrat chip med kontrollerad tjocklek för kryogen elektronmikroskopi med hög genomströmning

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63739
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,4, 3,4,5,6
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

Summary

Ett nyutvecklat mikromönstrat chip med grafenoxidfönster tillverkas genom att tillämpa mikroelektromekaniska systemtekniker, vilket möjliggör effektiv och högkapacitet kryogen elektronmikroskopiavbildning av olika biomolekyler och nanomaterial.

Abstract

En viktig begränsning för effektiv strukturanalys med hög genomströmning av biomolekyler med kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) är svårigheten att förbereda kryo-EM-prover med kontrollerad istjocklek på nanoskalan. Det kisel (Si)-baserade chipet, som har en vanlig uppsättning mikrohål med grafenoxidfönster (GO) mönstrat på en tjocklekskontrollerad kiselnitridfilm (SixNy), har utvecklats genom att tillämpa mikroelektromekaniska system (MEMS) tekniker. UV-fotolitografi, kemisk ångavsättning, våt och torr etsning av den tunna filmen och droppgjutning av 2D-nanoarkmaterial användes för massproduktion av de mikromönstrade chipsen med GO-fönster. Mikrohålens djup regleras för att kontrollera istjockleken på begäran, beroende på provets storlek för kryo-EM-analys. Den gynnsamma affiniteten hos GO mot biomolekyler koncentrerar biomolekylerna av intresse i mikrohålet under kryo-EM-provberedning. Det mikromönstrade chipet med GO-fönster möjliggör kryo-EM-avbildning med hög genomströmning av olika biologiska molekyler, såväl som oorganiska nanomaterial.

Introduction

Kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) har utvecklats för att lösa den tredimensionella (3D) strukturen hos proteiner i deras ursprungliga tillstånd 1,2,3,4. Tekniken innebär att proteiner fixeras i ett tunt skikt (10-100 nm) glasartad is och att man får projektionsbilder av slumpmässigt orienterade proteiner med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop (TEM), med provet bibehållet vid flytande kvävetemperatur. Tusentals till miljoner projektionsbilder förvärvas och används för att rekonstruera en 3D-struktur av proteinet med hjälp av beräkningsalgoritmer 5,6. För framgångsrik analys med cryo-EM har kryoprovberedning automatiserats genom att doppa och frysa utrustningen som styr blottingförhållandena, fuktigheten och temperaturen. Provlösningen laddas på ett TEM-rutnät med ett håligt kolmembran, blottas successivt för att avlägsna överskottslösningen och störtfryses sedan med flytande etan för att producera tunn, glasaktig is 1,5,6. Med framstegen inom kryo-EM och automatiseringen av provberedning7 har kryo-EM alltmer använts för att lösa proteinernas struktur, inklusive kuvertproteiner för virus och jonkanalproteiner i cellmembranet 8,9,10. Strukturen hos kuvertproteiner av patogena viruspartiklar är viktig för att förstå virusinfektionspatologi, liksom för att utveckla diagnossystemet och vaccinerna, t.ex. SARS-CoV-211, som orsakade COVID-19-pandemin. Dessutom har kryo-EM-tekniker nyligen tillämpats på materialvetenskap, såsom för avbildning av strålkänsliga material som används i batteri 12,13,14 och katalytiska system 14,15 och analys av strukturen hos oorganiska material i lösningstillstånd16.

Trots märkbar utveckling inom kryo-EM och relevanta tekniker finns det begränsningar i kryoprovberedning, vilket hindrar 3D-strukturanalys med hög genomströmning. Att förbereda en glasartad isfilm med optimal tjocklek är särskilt viktigt för att erhålla 3D-strukturen hos biologiska material med atomär upplösning. Isen måste vara tillräckligt tunn för att minimera bakgrundsbrus från elektroner som sprids av isen och för att förhindra överlappningar av biomolekyler längs elektronstrålens väg 1,17. Men om isen är för tunn kan det få proteinmolekyler att anpassa sig i föredragna riktningar eller denaturera 18,19,20. Därför bör tjockleken på glasis optimeras beroende på storleken på materialet av intresse. Dessutom krävs vanligtvis omfattande ansträngningar för provberedning och manuell screening av is- och proteinintegritet på de beredda TEM-gallren. Denna process är extremt tidskrävande, vilket hindrar dess effektivitet för 3D-strukturanalys med hög genomströmning. Därför skulle förbättringar av tillförlitligheten och reproducerbarheten av kryo-EM-provberedning förbättra användningen av kryo-EM i strukturbiologi och kommersiell läkemedelsupptäckt, liksom för materialvetenskap.

Här introducerar vi mikrofabrikationsprocesser för att göra ett mikromönstrat chip med grafenoxidfönster (GO) utformade för kryo-EM med hög genomströmning med kontrollerad istjocklek21. Det mikromönstrade chipet tillverkades med hjälp av mikroelektromekaniska systemtekniker (MEMS), som kan manipulera chipets struktur och dimensioner beroende på avbildningsändamålen. Det mikromönstrade chipet med GO-fönster har en mikrowellstruktur som kan fyllas med provlösningen, och mikrobrunnens djup kan regleras för att kontrollera tjockleken på glasisen. Gos starka affinitet för biomolekyler ökar koncentrationen av biomolekyler för visualisering, vilket förbättrar effektiviteten i strukturanalysen. Dessutom består det mikromönstrade chipet av en Si-ram, vilket ger hög mekanisk stabilitet för gallret19, vilket gör det idealiskt för hantering av chipet under provberedningsförfaranden och kryo-EM-avbildning. Därför ger ett mikromönstrat chip med GO-fönster tillverkade av MEMS-tekniker tillförlitlighet och reproducerbarhet för kryo-EM-provberedning, vilket kan möjliggöra effektiv strukturanalys med hög genomströmning baserad på kryo-EM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tillverkning av mikromönstrat chip med GO-fönster (figur 1)

  1. Sätt av kiselnitriden.
    1. Deponera kiselnitrid med låg spänning (SixNy) på båda sidor av Si-skivan (4 tum diameter och 100 μm tjocklek) med användning av kemisk ångavsättning med lågt tryck (LPCVD) vid 830 °C och ett tryck på 150 mTorr, under ett flöde av 170 sccm diklorsilan (SiH2Cl2, DCS) och 38 sccm ammoniak (NH3).
    2. Använd en depositionshastighet på ~ 30 Å / min, kontrollera SixNy-tjockleken så att den ligger inom 25-100 nm genom att variera deponeringstiden.
      OBS: Extrem försiktighet bör iakttas vid hantering av Si-skivan eftersom skivan är mycket tunn och ömtålig. Var försiktig så att du inte böjer skivan under hantering eller lastning i utrustningen.
  2. Mönster fotoresisten.
    1. Applicera en hexametyldisilazanlösning (HMDS) på sixNy-avsatt Si-skiva med tillräcklig volym för att täcka hela skivans yta, snurra beläggning med en spinnbeläggning vid 3 000 rpm i 30 s och baka vid 95 ° C i 30 s på en värmeplatta för att göra skivytan hydrofob och därmed säkerställa en bra beläggningsprestanda med fotoresist (PR).
    2. Applicera positiv PR (Materialtabell) med tillräcklig volym för att täcka hela skivans yta, centrifugera vid 3 000 rpm i 30 s och grädda vid 100 °C i 90 s på en kokplatta. Spin-coated PR har en tjocklek av 500 nm.
    3. Exponera den PR-belagda skivan med ultraviolett ljus (365 nm våglängd och 20 mW/cm2 intensitet) i 5 s genom en krommask (figur 2A-D) med hjälp av en justerare.
    4. Utveckla PR i 1 min med hjälp av en utvecklare (materialtabell) och skölj skivan genom att nedsänka den i avjoniserat (DI) vatten 2x. Torka helt av den PR-mönstrade skivan genom att blåsa N2-gas på skivytan.
      OBS: Extrem försiktighet bör iakttas när du blåser N2-gas på Si-skivan eftersom skivan är mycket tunn och ömtålig. Blås inte N2-gas med högt tryck i en riktning vinkelrätt mot skivan, eftersom det kan orsaka att skivan spricker.
  3. Mönster SixNy.
    1. Etsa den exponerade SixNy efter mönstringen av PR med hjälp av en laboratoriebyggd reaktiv jonetsare (RIE), med 3 sccm svavelhexafluorid (SF6) gas vid en radiofrekvens (RF) effekt på 50 W. Etsningshastigheten med dessa inställningar är ~6 Å/s. Ställ in etsningstiden beroende på tjockleken på det avsatta SixNy-skiktet .
      OBS: Etsningshastigheten kan variera och behöver optimeras i labbet beroende på specifikationerna för den RIE-utrustning som används.
    2. Eliminera PR genom att nedsänka den SixN y-mönstrade skivan i aceton vid rumstemperatur i 30 minuter, följt av sköljning av skivan genom att nedsänka den i DI-vatten 2x. Torka skivan helt genom att blåsa N2-gas på skivytan.
      OBS: Extrem försiktighet bör iakttas när du nedsänker eller tar ut skivan från lösningarna eftersom skivan kan sprickas av lösningens ytspänning. Sänk inte ner eller ta ut skivan parallellt med lösningens yta. Använd precisionsskiva som hanterar pincett med kolfiberspetsar. Ta inte starkt tag i skivan med pincetten; lyft ena sidan av skivan tills skivan lutar till en vinkel där den kan tas ut från lösningen. Skivan kan spricka när den böjer sig på grund av det fasta greppet under lyft.
  4. Etsa Si.
    1. Bered en 1,5 M kaliumhydroxidlösning (KOH) genom att lösa koh-pulver i DI-vatten vid 80 °C.
    2. Sänk ner den SixN y-mönstrade skivan i KOH-lösning för att etsa den exponerade Si. Lämna skivan i lösningen under omrörning tills de fristående SixNy-fönstren kan observeras på motsatt sida av den mönstrade SixNy.
      OBS: Den våta etsningstiden kan variera beroende på tjockleken på Si; för en 100 μm tjock skiva tar våt etsning normalt flera timmar. Ställ inte in omrörningshastigheten för högt under Si-etsning eftersom de fristående SixN y-fönstren är mycket tunna och kan sprickas av vätskeflödet. I detta experiment ställdes omrörningshastigheten till 250 rpm.
    3. Rengör den etsade skivan genom att doppa den flera gånger i ett DI-vattenbad för att eliminera etsningsrester. Torka skivan i luften.
      OBS: Extrem försiktighet bör iakttas när du nedsänker eller tar ut den Si-mönstrade skivan från lösningarna eftersom de fristående SixN y-fönstren är mycket tunna och ömtåliga och kan sprickas av lösningens ytspänning. Skivan ska nedsänkas eller tas ut i en vinkel, så att skivans kant kommer in och ut ur lösningen först.
  5. Eliminera KOH-etsningsresterna.
    1. Tryck lätt på gränserna för chipmatrisen med en pincett för att få en uppsättning chips som kommer att vara mikromönstrade (figur 1B).
    2. Bered 1,5 M KOH-lösning vid 80 °C under omrörning.
    3. Sänk ner chipuppsättningen i KOH-lösning i 30 s och skölj den genom att doppa den i DI-vatten 2x. Torka flisen helt genom att blåsa N2-gas .
      OBS: Extrem försiktighet bör iakttas när du doppar flisen i lösningar och fönar dem med N2-gas eftersom de fristående SixN y-fönstren är mycket tunna och ömtåliga. Medan chipet är nedsänkt i KOH-lösning bör omrörningen stoppas. Flisen ska doppas med kanterna först i riktning vinkelrätt mot lösningen och blåsas medN2-gas i parallell riktning.
    4. Torka helt chipuppsättningen i luften i minst 1 timme.
  6. Mönster PR.
    1. Förbered en tom 525 μm Si-skiva som fast stöd. Snurra belägga Si-skivan med HMDS och positiv PR, som beskrivits ovan, men fäst chipmatrisen (med den fristående SixNy-fönstersidan uppåt) på Si-skivan innan du bakar PR. PR fungerar som ett lim mellan skivan och chipmatrisen. Grädda Si-skivan som är fäst med spånmatrisen vid 100 °C i 90 s på en kokplatta.
    2. Spinnbeläggning av chipsatsen med HMDS och positiv PR, som beskrivits ovan.
    3. Exponera chipuppsättningen med ultraviolett ljus (365 nm våglängd; 20 mW / cm2 intensitet) i 5 s genom en krommask (figur 2E, F) med hjälp av en justerare.
    4. Utveckla PR med en utvecklare i 15 s, skölj chipet genom att doppa det i DI-vatten 2x och torka helt det PR-mönstrade chipet genom att blåsa N2-gas .
  7. Förbered den mikromönstrade SixNy.
    1. Etch SixNy efter PR-mönstringen med hjälp av en labbbyggd RIE, med 3 sccm SF6-gas vid RF-effekt på 50 W. Kontrollera etsningstiden beroende på tjockleken på SixNy-skiktet .
  8. Eliminera PR.
    1. Eliminera PR genom att nedsänka det mönstrade chipet i 1-metyl-2-pyrrolidinonlösning (NMP) vid 60 °C och lämna det över natten. Skölj chipet genom att doppa det i DI-vatten 2x och torka det mönstrade chipet helt genom att blåsa N2-gas .
    2. Eliminera PR-resterna med en O 2-plasmaprocess med 100 sccm O2-gas vid RF-effekt på 150 W i 1 min med den labbbyggda RIE.
  9. Skölj det mikromönstrade chipet.
    1. Bered 1,5 M KOH-lösning vid 80 °C.
    2. Sänk ner de mikromönstrade chipsen i KOH-lösning i 30 s för att helt eliminera PR-resterna och skölj flisen genom att nedsänka dem i DI-vatten 2x. Torka flisen helt genom att blåsa N2-gas .
    3. Torka helt flisen i luften i minst 1 h.
  10. Överför grafenoxid (GO) med droppgjutningsmetoden.
    1. Späd GO-lösningen (2 mg / ml) till 0,2 mg / L med DI-vatten och ultraljudsbehandling i 10 minuter för att bryta upp aggregat av GO-ark. Centrifugera den utspädda GO-lösningen vid 300 x g i 30 s.
    2. Glödurladdar den Si-etsade sidan av det mikromönstrade chipet för att göra chipytan med positiv laddning med hjälp av en glödurladdare (materialtabell) vid 15 mA i 1 min.
    3. Släpp 3 μL av GO-lösningen på den glödladdade sidan av det mikromönstrade chipet och lämna droppen på chipet i 1 min. Efter 1 min, torka bort överflödig GO-lösning på chipet med filterpapper.
    4. Tvätta det GO-överförda chipet med DI-vattendroppar beredda på paraffinfilm och tappa bort DI-vattnet på chipet med filterpapper. Upprepa denna procedur 2x på GO-överförd sida och 1x på motsatt sida. Torka det GO-överförda chipet vid rumstemperatur över natten.
    5. Tvätta det mikromönstrade chipet med GO-fönster genom att nedsänka det i DI-vattnet och föna chipet med N2-gas .

2. Cryo-EM-avbildning

  1. Förbered kryoprovet.
    1. Förbered kryoprovet med en mekanisk kryo-kastande maskin (materialtabell), som styr temperatur, fuktighet, blottningstid och kraft. Efter att ha laddat blottingdynan på blottarna, se till att fuktigheten och temperaturen i kammaren hålls vid 100% respektive 15 °C.
    2. Plocka upp det mikromönstrade chipet med en typisk kryo-pincett och ladda pincetten till kryo-störtmaskinen. Pipettera 3 μL provlösning på det mikromönstrade chipet vid den hålmönstrade sidan, med GO-fönster på botten. Kontrollera blottningstiden och kraften beroende på provlösningen.
      OBS: Här användes biologiska prover, nämligen humant immunbristvirus (HIV-1), ferritin, proteasom 26S, groEL, apoferritinproteinpartiklar och tau-filamentproteiner för kryo-EM-avbildning. Dessutom användes olika typer av oorganiska material, såsomFe2O3 nanopartiklar (NP), Au nanopartiklar, Au nanoroder och kiseldioxidnanopartiklar, för kryo-EM-avbildning. Önskad blottningstid och kraft sattes på kryokolven för olika typer av prover.
    3. Efter blottningsprocessen, doppa-frys det provbelastade chipet omedelbart i flytande etan. Överför chipet till gallerlådan i flytande kväve (LN2) och förvara det i LN2 före kryo-EM-avbildning.
  2. Utför kryo-EM-avbildning.
    1. Ladda kryoprovet till en kryo-EM-hållare med temperaturen vid -180 °C.
    2. Ladda kryo-EM-hållaren i en TEM och observera proverna med läget för minimidossystemet (MDS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett mikromönstrat chip med GO-fönster tillverkades genom MEMS-tillverkning och 2D GO nanoarköverföring. Chips för mikromönster massproducerades, med cirka 500 chips producerade från en 4 i skiva (figur 1B och figur 2A, B). Designen av de mikromönstrade chipsen kan manipuleras med olika mönster av krommasken (figur 2) under fotolitografiproceduren. De tillverkade mikromönstrade chipsen hade kontrollerade antal och dimensioner av fristående SixNy-membran. Antalet fristående SixNy-membran styrdes från 48 (6 x 8) till 50 (5 x 10) och måtten från 50 x 40 μm2 till 250 x 40 μm2 (figur 3A,B,F,G). Varje fristående SixNy-membran kan ha tiotals till hundratals mikrohål med anpassningsbara diametrar från 2-3 μm med olika hålavstånd. Tillverkade mikromönstrade marker har upp till ~ 25 000 GO-upphängda hål, medan antalet hål också är kontrollerbart (figur 3B-D och figur 3G-I). Förekomsten av det tunna GO-skiktet över hålet bekräftades av Raman-spektroskopi och elektrondiffraktion. Raman-spektrumet vid GO-fönstret visade representativa toppar av GO, nämligen D- och G-band vid 1360 cm-1 respektive 1590 cm-1, respektive 22 (figur 3E). De multipla orienterade sexkantiga diffraktionsmönstren indikerar att fönstren består av flerskikts GO (figur 3J).

Det mikromönstrade chipet med GO-fönster tillverkades i tre representativa måldjup (25 nm, 50 nm och 100 nm) genom att kontrollera avsättningstjockleken för SixNy på Si-skivan under LPCVD-processen för att bekräfta möjligheten att reglera mikrohålens djup. För att utvärdera strukturen och tjockleken på mikrohålen med GO-fönster erhölls 40 ° lutande och tvärsnittsskanningselektronmikroskop (SEM) bilder och atomkraftmikroskopi (AFM) bilder av det mikromönstrade chipet med GO-fönster. Mikrohålets struktur av vältyp med ett GO-fönster observerades tydligt, med mikrohålets djup motsvarande det riktade djupet (figur 4). Resultaten bekräftar att det är möjligt att kontrollera antalet och utformningen av det mikromönstrade chipet med GO-fönster.

För att demonstrera användningen av det mikromönstrade chipet för kryo-EM-avbildning framställdes olika kryoprover av biomolekyler och oorganiska NP med användning av det mikromönstrade chipet. För biologiska prover avbildades HIV-1, ferritin, proteasom 26S, groEL, apoferritinproteinpartiklar och tau-filamentproteiner med kryo-EM med hjälp av det mikromönstrade chipet med GO-fönster (figur 5A-F). Förutom biomolekyler observerades också oorganiska material som Fe2O3 NP, Au NPs, Au nanorods och kiseldioxid-NP med hjälp av mikromönstrade chips (Figur 5G-J).

Figure 1
Figur 1: Scheman och bilder av tillverkningsproceduren för det nyutvecklade mikromönstrade chipet med GO-fönster för kryo-EM. (A) Scheman över tillverkningsprocessen och tvärsnitt av det mikromönstrade chipet med GO-fönster under tillverkningsprocessen. (B) Bilder av tillverkningsprodukterna vid varje tillverkningssteg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Kort illustration av krommaskerna som används för fotolitografiprocessen(A,B) Maskdesign för massproduktion av chips för en 4-tums Si-skiva (24 x 24-uppsättning chips), (C,D) design av 2 x 2-uppsättning chips och (E,F) design av mikrohålmönster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Struktur av mikromönstrade chips med GO-fönster(A,F) Optiska mikroskopibilder av hela mikromönstrade chips, (B,G) SEM-bilder av enstaka mikromönstrade SixNy-membran, (C,H) SEM-bilder av mikromönster och (D,I) SEM-bilder av enstaka mikrohål med GO-fönster. (E,J) Bekräftelse av GO vid mikrohålet genom (E) Raman-spektrumet och (J) det valda areaelektrondiffraktionsmönstret (SAED) i GO-fönstret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Mikrohålets brunnsstruktur och djup med GO-fönster.(A-C) 40° lutade SEM-bilder av ett enda mikrohål med ett GO-fönster och (D-F) tvärsnitts-SEM-bild av det mikromönstrade chipet med GO-fönster i olika djup (25 nm, 50 nm och 100 nm). (G) Atomkraftsmikroskopi (AFM) 3D-renderingsbild, (H) AFM-avböjningsbild och (I) linjeprofil längs den röda linjen i (H) som visar djupet på det mikromönstrade chipet med GO-fönster tillverkade med 100 nm SixNy membran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Kryo-EM-bilder av biomaterial av olika storlek och oorganiska nanomaterial med hjälp av det mikromönstrade chipet med GO-fönster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrofabrikationsprocesserna för att producera mikromönstrade chips med GO-fönster introduceras här. Det tillverkade mikromönstrade chipet är utformat för att reglera tjockleken på glasartsskiktet genom att kontrollera mikrohålets djup med GO-fönster beroende på storleken på materialet som ska analyseras. Ett mikromönstrat chip med GO-fönster tillverkades med hjälp av en serie MEMS-tekniker och en 2D-nanoarköverföringsmetod (figur 1). Den största fördelen med att använda MEMS-tillverkningstekniken är dess förmåga till massproduktion och möjligheten att manipulera mikrochipets struktur och dimensioner genom att använda olika konstruktioner av krommasken under fotolitografi (figur 2). Det LPCVD-avsatta SixNy-skiktet med låg spänning säkerställer stabiliteten hos de tiotals nanometer tjocka fristående SixNy 23,24,25,26. Det fristående SixNy-skiktet i nanometerskala är dock fortfarande sårbart för krafter i vinkelrät riktning27. Därför krävs extrem försiktighet vid hantering av det mikromönstrade chipet, till exempel vid doppning i lösning eller föning. Dessutom använder tillverkningsprocessen för det mikromönstrade chipet 100 μm Si-skivan, vilket säkerställer kompatibilitet med de flesta kryo-EM-provhållare och autoladdare. Försiktighet krävs dock under tillverkningsprocesserna för att förhindra att den ömtåliga skivan spricker.

Den regelbundna uppsättningen av strukturer av mikronskala med GO-fönster bekräftades med ett optiskt mikroskop och en SEM (figur 3 och figur 4). Dessutom möjliggör droppgjutningsmetoden för överföring av GO GO-avsättning med hög planhet och utan märkbara rynkor (figur 3D, E, I, J). Det mikromönstrade chipet är lämpligt för laddning i kryo-EM-autoladdaren, och tiotusentals mikronskalahål i en vanlig matris möjliggör automatiserad insamling av stora bilddata för analys av enstaka partiklar. Dessutom kan antalet och morfologin hos SixNy-membran och GO-stödda mikrohål enkelt manipuleras i MEMS-tillverkningsprocessen, vilket möjliggör enpartikelanalys med hög genomströmning och andra kryo-EM-avbildningsexperiment beroende på forskningsändamål. Dessutom kan utökade tillämpningar av mikromönstrade flis med kontrollerad tjocklek underlättas genom tillverkning av flis som har hål mönstrade på nanometerskalan. Nano-mönstringstekniker som utvecklats inom halvledarindustrin kan antas vid tillverkningen av dessa chips 28,29,30.

Förmågan att reglera mikrohålens djup har demonstrerats här genom att tillverka mikromönstrade chips med GO-fönster i tre representativa måldjup: 25 nm, 50 nm och 100 nm. Olika djup i mikrobrunnsstrukturen uppnåddes genom att kontrollera deponeringstiden för SixNy-skiktet på Si-skivan (figur 4). För att utvärdera morfologin och tjockleken på det mikromönstrade chipet med GO-fönster observerades tvärsnitt av anordningarna erhållna från fokuserad jonstråle (FIB) -sektionering med SEM och djupprofilen mättes med AFM (figur 4). Mikrohålets vältypsstruktur med GO-fönster visades tydligt i SEM- och AFM-bilderna, vilket bekräftar framgångsrik kontroll av djupet på SixN y-mikrohålet och överföring av GO-fönstret. Användningen av det anpassningsbara mikromönstrade chipet med GO-fönster kommer sannolikt att säkerställa en hög framgångsgrad för att producera regioner med optimal istjocklek för kryo-EM-avbildning.

Eftersom materialen som ska observeras med kryo-EM har olika storlekar kan produktion av glaskropps med lämplig tjocklek säkerställa förbättrad kontrastupplösning, en bred orienteringstäckning och minskad denaturering av strukturen under kryo-EM-avbildning. För att demonstrera användningen av kryo-EM-avbildningsprocessen för biologiska applikationer avbildades olika biologiska prover av olika storlekar, inklusive HIV-1, ferritin, proteasom 26S, groEL, apoferritin och tau-protein, med hjälp av det mikromönstrade chipet med GO-fönster. Biomolekylerna observerades tydligt med hjälp av det mikromönstrade chipet med GO-fönster (figur 5A-F). Förutom biomolekyler observerades också olika typer av oorganiska nanomaterial, såsom Fe2O3 NP, Au NPs, Au nanorods och kiseldioxid-NP, med hjälp av det mikromönstrade chipet med GO-fönster (Figur 5G-J). Den mikromönstrade chip- och tillverkningsmetoden visar kompatibilitet för kryoavbildning av olika material. Således ger det nyutvecklade mikromönstrade chipet med GO-fönster en pålitlig och reproducerbar provberedningsstrategi för effektiv strukturanalys med hög genomströmning med kryo-EM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

M.-H.K., S.K., M.L. och J.P. erkänner det ekonomiska stödet från Institute for Basic Science (Grant No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. och J.P. erkänner det ekonomiska stödet från Creative-Pioneering Researchers Program genom Seoul National University (2021) och NRF-bidraget finansierat av den koreanska regeringen (MSIT; Bidrag nr. NRF-2020R1A2C2101871 och NRF-2021M3A9I4022936). M.L. och J.P. erkänner det ekonomiska stödet från POSCO Science Fellowship of POSCO TJ Park Foundation och NRF-bidraget som finansieras av den koreanska regeringen (MSIT; Bidrag nr. NRF-2017R1A5A1015365). J.P. erkänner det ekonomiska stödet från det nrf-bidrag som finansieras av den koreanska regeringen (MSIT; Bidrag nr. NRF-2020R1A6C101A183) och de tvärvetenskapliga forskningsinitiativprogrammen från College of Engineering och College of Medicine, Seoul National University (2021). M.-H.K. erkänner det ekonomiska stödet från det nrf-bidrag som finansieras av den koreanska regeringen (MSIT; Bidrag nr. NRF-2020R1I1A1A0107416612). Författarna tackar personalen och besättningen på Seoul National University Center for Macromolecular and Cell Imaging (SNU CMCI) för deras outtröttliga ansträngningar och uthållighet med kryo-EM-experimenten. Författarna tackar SJ Kim från National Center for Inter-university Research Facilities för hjälp med FIB-SEM-experimenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma Aldrich, USA 443778
Acetone
AFM Park Systems, South Korea NX-10
Aligner Midas System, South Korea MDA-600S
AZ 300 MIF developer AZ Electronic Materials USA Corp., USA 184411
Cryo-EM holder Gatan, USA 626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) FEI Company, USA Helios NanoLab 650
Glow discharger Ted Pella Inc., USA PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution Sigma Aldrich, USA 763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% Alfa Aesar, USA 10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) Centrotherm, Germany LPCVD E1200
maP1205 positive PR Micro resist technology, Germany A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea 6597-4400
Raman Spectrometer NOST, South Korea Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE) Scientific Engineering, South Korea Lab-built
SEM Carl Zeiss, Germany SUPRA 55VP
Si wafer JP COMMERCE, South Korea 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater Dong Ah Trade Corp., South Korea ACE-200
TEM JEOL, Japan JEM-2100F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dillard, R. S., et al. Biological applications at the cutting edge of cryo-electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (4), 406-419 (2018).
  2. Meyerson, J. R., et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports. Scientific Reports. 4, (2014).
  3. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  4. Xu, B. J., Developments Liu, L. applications, and prospects of cryo-electron microscopy. Protein Science. 29 (4), 872-882 (2020).
  5. Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews-Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (2), (2017).
  6. Murata, K., Wolf, M. Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).
  7. Darrow, M. C., et al. Chameleon: next generation sample preparation for cryoEM based on spotiton. Acta Crystallographica a-Foundation and Advances. 75, 424 (2019).
  8. Hite, R. K., Tao, X., MacKinnon, R. Structural basis for gating the high-conductance Ca2+-activated K+ channel. Nature. 541 (7635), 52-57 (2017).
  9. Zhang, Y., et al. Cryo-EM structure of the activated GLP-1 receptor in complex with a G protein. Nature. 546 (7657), 248-253 (2017).
  10. Shaik, M. M., et al. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature. 565 (7739), 318-323 (2019).
  11. Liu, C., et al. The architecture of inactivated SARS-CoV-2 with postfusion spikes revealed by cryo-EM and cryo-ET. Structure. 28 (11), 1218-1224 (2020).
  12. Ren, X. C., Zhang, X. Q., Xu, R., Huang, J. Q., Zhang, Q. Analyzing energy materials by cryogenic electron microscopy. Advanced Materials. 32 (24), 1908293 (2020).
  13. Li, Y. Z., et al. Atomic structure of sensitive battery materials and Interfaces revealed by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6362), 506-510 (2017).
  14. Li, Y. B., Huang, W., Li, Y. Z., Chiu, W., Cui, Y. Opportunities for cryogenic electron microscopy in materials science and nanoscience. Acs Nano. 14 (8), 9263-9276 (2020).
  15. Kim, Y., et al. Uniform synthesis of palladium species confined in a small-pore zeolite via full ion-exchange investigated by cryogenic electron microscopy. Journal of Materials Chemistry A. 9 (35), 19796-19806 (2021).
  16. Baumgartner, J., et al. Nucleation and growth of magnetite from solution. Nature Materials. 12 (4), 310-314 (2013).
  17. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
  18. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747 (2019).
  19. Alden, N. A., et al. Cryo-EM-on-a-chip: custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules. Small. 15 (21), 1900918 (2019).
  20. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Kang, M. H., et al. Graphene oxide-supported microwell grids for preparing cryo-EM samples with controlled ice thickness. Advanced Materials. 33 (43), 2102991 (2021).
  22. Johra, F. T., Lee, J. W., Jung, W. G. Facile and safe graphene preparation on solution based platform. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 20 (5), 2883-2887 (2014).
  23. Yang, C., Pham, J. Characteristic study of silicon nitride films deposited by LPCVD and PECVD. Silicon. 10 (6), 2561-2567 (2018).
  24. Olson, J. M. Analysis of LPCVD process conditions for the deposition of low stress silicon nitride. Part I: preliminary LPCVD experiments. Materials Science in Semiconductor Processing. 5 (1), 51-60 (2002).
  25. Zheng, B. R., Zhou, C., Wang, Q., Chen, Y. F., Xue, W. Deposition of low stress silicon nitride thin film and its application in surface micromachining device structures. Advances in Materials Science and Engineering. 2013, 835942 (2013).
  26. Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films. Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).
  27. Shafikov, A., et al. Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress. Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456 (2021).
  28. Ng, W. H., et al. Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures. Scientific Reports. 8, 3544 (2018).
  29. Han, D., et al. Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides. Frontiers in Chemistry. 7, 216 (2019).
  30. Escobedo, C. On-chip nanohole array based sensing: a review. Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).

Tags

Teknik utgåva 182 Kryogenelektronmikroskop mikroelektroniska system grafenoxid glasartad istjocklek virus protein nanomaterial
Tillverkning av mikromönstrat chip med kontrollerad tjocklek för kryogen elektronmikroskopi med hög genomströmning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S.,… More

Kang, M. H., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (182), e63739, doi:10.3791/63739 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter