Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zum Screening von Anti-Hepatitis-B-Virus-Verbindungen (HBV), die auf prä- und postvirale Eintrittsphasen abzielen, wobei die isotherme Titrationskalorimetrie verwendet wird, um die Bindungsaffinität (KD) mit dem Wirtsnatriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid zu messen. Die antivirale Wirksamkeit wurde durch die Unterdrückung viraler Lebenszyklusmarker (cccDNA-Bildung, Transkription und virale Assemblierung) bestimmt.
Abstract
Die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) gilt als entscheidender Risikofaktor für das hepatozelluläre Karzinom. Die derzeitige Behandlung kann nur die Viruslast verringern, aber nicht zu einer vollständigen Remission führen. Ein effizientes Hepatozytenmodell für HBV-Infektionen würde einen lebensechten viralen Lebenszyklus bieten, der für das Screening von Therapeutika entscheidend wäre. Die meisten verfügbaren Anti-HBV-Wirkstoffe zielen auf Lebenszyklusphasen nach dem viralen Eintritt ab, aber nicht vor dem Viruseintritt. Dieses Protokoll beschreibt die Generierung eines kompetenten Hepatozytenmodells, das in der Lage ist, nach Therapeutika zu suchen, die auf prävirale und postvirale Eintrittsphasen abzielen. Dies umfasst das Targeting der Natriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid-Bindung (NTCP), die cccDNA-Bildung, die Transkription und die virale Assemblierung basierend auf imHC oder HepaRG als Wirtszellen. Hier verwendete der HBV-Eintrittshemmungsassay Curcumin, um HBV-Bindungs- und Transportfunktionen über NTCP zu hemmen. Die Inhibitoren wurden auf Bindungsaffinität (KD) mit NTCP unter Verwendung der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) - einem universellen Werkzeug für das HBV-Arzneimittelscreening basierend auf thermodynamischen Parametern - untersucht.
Introduction
Die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) gilt weltweit als lebensbedrohliche Krankheit. Eine chronische HBV-Infektion birgt ein Risiko für Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom1. Die derzeitige Anti-HBV-Behandlung konzentriert sich hauptsächlich auf den postviralen Eintritt unter Verwendung von Nukleos(t)ide-Analoga (NAs) und Interferon-alpha (IFN-α)2,3. Die Entdeckung eines HBV-Eintrittsinhibitors, Myrcludex B, hat ein neues Ziel für Anti-HBV-Wirkstoffe identifiziert4. Die Kombination von Eintrittsinhibitoren und NAs bei chronischem HBV hat die Viruslast im Vergleich zu denen, die nur auf die Virusreplikation abzielen, signifikant verringert 5,6. Das klassische Hepatozytenmodell für das Screening von HBV-Eintrittsinhibitoren ist jedoch durch niedrige virale Rezeptorspiegel (Natriumtaurocholat-Cotransporting-Polypeptid, NTCP) begrenzt. Die Überexpression von hNTCP in Hepatomzellen (d.h. HepG2 und Huh7) verbessert die HBV-Infektiosität 7,8. Dennoch exprimieren diese Zelllinien geringe Mengen an medikamentenmetabolisierenden Enzymen der Phasen I und II und weisen eine genetische Instabilität auf9. Hepatozytenmodelle, die helfen können, verschiedene Mechanismen von Anti-HBV-Kandidatenverbindungen wie präviralen Eintrag, NTCP-Bindung und viralen Eintritt anzusprechen, würden die Identifizierung und Entwicklung wirksamer Kombinationsschemata beschleunigen. Die Studie zur Anti-HBV-Aktivität von Curcumin hat die Hemmung des Viruseintritts als neuen Mechanismus zusätzlich zur postviralen Eintrittsunterbrechung aufgeklärt. Dieses Protokoll beschreibt ein Wirtsmodell für das Screening von Anti-HBV-Eintrittsmolekülen10.
Das Ziel dieser Methode ist es, mögliche Anti-HBV-Verbindungen für die Hemmung des Viruseintritts zu erforschen, insbesondere die Blockierung der NTCP-Bindung und des NTCP-Transports. Da die NTCP-Expression ein kritischer Faktor für den HBV-Eintritt und die Infektion ist, haben wir das Hepatozyten-Reifungsprotokoll optimiert, um die NTCP-Wertezu maximieren 11. Darüber hinaus kann dieses Protokoll die hemmende Wirkung auf den HBV-Eintritt als Hemmung der HBV-Bindung gegenüber Hemmung der Internalisierung unterscheiden. Der Aufnahmetest für Taurocholsäure (TCA) wurde ebenfalls unter Verwendung einer ELISA-basierten Methode anstelle eines Radioisotops modifiziert, um den NTCP-Transport12,13 darzustellen. Die Rezeptor- und Ligandeninteraktion wurde durch ihre 3D-Strukturenbestätigt 14,15. Die Hemmung der NTCP-Funktion kann durch Messung der TCA-Aufnahmeaktivität16 bewertet werden. Diese Technik lieferte jedoch keinen direkten Nachweis einer NTCP-Bindung an die Kandidaten-Inhibitoren. Daher kann die Bindung mit verschiedenen Techniken untersucht werden, wie z.B. Oberflächenplasmonresonanz 17, ELISA, fluoreszenzbasierter Thermoverschiebungsassay (FTSA)18, FRET19, AlphaScreen und verschiedenen anderen Methoden20. Unter diesen Techniken ist ITC ein Zielstandard in der Bindungsanalyse, da es Wärmeabsorption oder -emission in fast jeder Reaktion beobachten kann21. Die Bindungsaffinität (KD) von NTCP und Kandidatenverbindungen wurde direkt mittels ITC bewertet; Diese Affinitätswerte waren genauer als diejenigen, die mit dem In-silico-Vorhersagemodell 22 ermittelt wurden.
Dieses Protokoll behandelt Techniken zur Hepatozytenreifung, HBV-Infektion und zum Screening auf HBV-Eintrittshemmer. Kurz gesagt, ein Hepatozytenmodell wurde basierend auf imHC- und HepaRG-Zelllinien entwickelt. Die kultivierten Zellen wurden innerhalb von 2 Wochen zu reifen Hepatozyten differenziert. Die Hochregulierung der NTCP-Spiegel wurde mittels real-time PCR, Western Blot und Durchflusszytometrienachgewiesen 11. Hepatitis-B-Virion (HBVcc) wurde produziert und aus HepG2.2.15 gesammelt. Das differenzierte imHC bzw. HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) wurde 2 h vor der Inokulation mit HBV-Virion prophylaktisch mit den Anti-HBV-Kandidaten behandelt. Das erwartete Ergebnis des Experiments war die Identifizierung der Wirkstoffe, die zelluläres HBV und Infektiosität verringern. Die Anti-NTCP-Aktivität wurde mit dem TCA-Aufnahmetest bewertet. Die NTCP-Aktivität konnte von den Agenten unterdrückt werden, die NTCP spezifisch gebunden haben. Die ITC-Technik wurde verwendet, um die Machbarkeit einer interaktiven Bindung zu untersuchen, die Inhibitoren und ihre Zielproteine vorhersagen kann, indem die Bindungsaffinität (KD) des Liganden für den Rezeptor über nicht-kovalente Wechselwirkungen des biomolekularen Komplexesbestimmt wird 23,24. Zum Beispiel steht K D ≥ 1 × 103 mM für schwache Bindung, K D ≥ 1 × 106 μM für moderate Bindung und K D ≤ 1 × 109 nM für starke Bindung. Das ΔG korreliert direkt mit Bindungswechselwirkungen. Insbesondere ist eine Reaktion mit negativem ΔG eine exergonische Reaktion, was darauf hinweist, dass die Bindung ein spontaner Prozess ist. Eine Reaktion mit einem negativen ΔH deutet darauf hin, dass die Bindungsprozesse von Wasserstoffbrückenbindungen und Van-der-Waals-Kräften abhängen. Sowohl TCA-Aufnahme als auch ITC-Daten könnten verwendet werden, um nach Anti-HBV-Eintragsagenten zu suchen. Die Ergebnisse dieser Protokolle können eine Grundlage nicht nur für das Anti-HBV-Screening bilden, sondern auch für die Interaktion mit NTCP, die durch Bindungsaffinität und Transportfunktion bewertet wird. Dieser Artikel beschreibt die Vorbereitung und Charakterisierung von Wirtszellen, das experimentelle Design und die Bewertung des Anti-HBV-Eintritts zusammen mit der NTCP-Bindungsaffinität.
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Protocol
HINWEIS: Die folgenden Verfahren müssen in einer Haube für biologische Gefahrenströme der Klasse II oder einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Der Umgang mit HBV wurde vom IRB ethisch genehmigt (MURA2020/1545). Weitere Informationen zu allen Lösungen, Reagenzien, Geräten und Zelllinien, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Materialtabelle .
1. Vorbereitung von Wirtszellen (reife Hepatozyten)
- Hepatozyten (3,75 × 105 Zellen HepaRG oder imHC) kultivieren und in einem 75 cm2 Kulturkolben mit 10 ml DMEM/F12-Medium aufbewahren, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin. Warten Sie, bis die Zellen 80% -90% Konfluenz erreicht haben (innerhalb von 1 Woche).
- Entsorgen Sie das alte Medium aus dem Kolben und waschen Sie die Zellen mit 4 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Das PBS absaugen und 4 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzufügen.
- Inkubieren Sie den Kolben im 37 °C Inkubator für 2-3 min und überprüfen Sie die anhaftenden Zellen mit einem inversen Mikroskop mit einer 10-fachen Objektivlinse. Stellen Sie sicher, dass sich die Monoschicht von der Kulturoberfläche gelöst hat.
- Hemmen Sie das Trypsin, indem Sie 4 ml des Kulturmediums, ergänzt mit 10% FBS, in den Kolben geben und die entnommenen Zellen vorsichtig resuspendieren. Die Zellsuspension in ein 15-ml-konisches Röhrchen geben und 3 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren.
- Saugen Sie den Überstand aus dem Zellpellet ab und resuspendieren Sie mit 1-2 ml des vorgewärmten Kulturmediums, ergänzt mit 10% FBS und Antibiotika.
- Mischen Sie jeweils 10 μL der Zellsuspension und Trypanblau und zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer. Stellen Sie sicher, dass die Zelllebensfähigkeit höher als 90% ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Samen Sie 1 × 10 6 Zellen pro 2 ml in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte und halten Sie das vollständige DME/F12-Medium aufrecht, bis die Zellen 100% Konfluenz erreichen.
- Für die hepatische Reifung bereiten Sie das hepatische Reifungsmedium vor (Williams-E-Medium, ergänzt mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 5 μg/ml Insulin, 50 μM Hydrocortison, 2 mM L-Glutamin und 2% DMSO).
- Ersetzen Sie das Kulturmedium 2x pro Woche.
- Halten Sie die Hepatozyten 2 Wochen lang im Reifungsmedium, um reife Hepatozyten zu erhalten, die für eine HBV-Infektion bereit sind.
2. Quantifizierung des zellulären NTCP
- Messung der NTCP-Expression mittels real-time PCR
- Sammeln Sie das Pellet reifer Hepatozyten durch Trypsinisierung (siehe Schritte 1.2-1.5).
- Extrahieren Sie die gesamte RNA aus dem Zellpellet mit einem RNA-Extraktionskit mit DNase-I-Behandlung.
- Synthetisieren Sie cDNA aus 200 ng Gesamt-RNA unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers und eines Reverse-Transkriptionssystems gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Verdünnen Sie die cDNA auf 50 ng/μL und verwenden Sie sie als Vorlage für die PCR-Reaktion. Mischen Sie 2 μL der verdünnten cDNA mit den PCR-Master-Mix-Reagenzien, die SYBR grüne qRT-PCR-Kit-Lösung enthalten, mit 5 μM NTCP-spezifischen Primern (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' und 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
- Zur Normalisierung verwenden Sie GAPDH als Housekeeping-Gen mit spezifischen Primern (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' und 5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3').
- Amplifizieren Sie die cDNA-Proben mit einem Thermocycler unter folgenden Temperaturbedingungen: 1 Zyklus von 3 min bei 95 °C (anfängliche Denaturierung); 40 Zyklen von 30 s bei 95 °C (Denaturierung), 30 s bei 60 °C bis 65 °C (Glühen), 30 s bei 72 °C (Verlängerung); 1 Zyklus von 5 min bei 72 °C (Endverlängerung).
- Berechnen Sie die NTCP-Faltenänderung in reifen Hepatozyten über undifferenzierten Zellen unter Verwendung von GAPDH als Kalibrorgen basierend auf der 2-ΔΔCT-Methode .
- Quantifizierung von NTCP mithilfe der Western-Blot-Analyse
- Hepatozyten mit einem Zellschaber ernten und bei 300 x g, 25 °C für 5 min zentrifugieren, um das Zellpellet zu sammeln.
- Befolgen Sie die Anweisungen des RIPA-Pufferherstellers, um das zelluläre Protein mit 100 μL RIPA-Puffer zu extrahieren, der 1x Proteaseinhibitor enthält.
- Messen Sie die Gesamtproteinkonzentration mit der Bicinchoninsäure (BCA) -Methode.
- Mischen Sie 12,5 μL Protein mit 2x Ladenfarbstoff im Verhältnis 1:1.
- Die Proteinmischung und die Standardleiter bei 95 °C 5 min kochen.
- Fügen Sie 1x Laufpuffer in die Elektrophoresekammer ein.
- Laden Sie 5 μL der Proteinstandardleiter oder 20 μL der gekochten Proteinmischung in ein 10% (w/v) Polyacrylamidgel.
- Durchführung der Gelelektrophorese: 50 V für 30 min, gefolgt von 90 V für 1 h bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie eine PVDF-Membran vor, indem Sie sie 30 s lang in Methanol einweichen, mit doppelt destilliertem Wasser für 1-2 min waschen und zusammen mit zwei Stücken Filterpapier im Transferpuffer für 10 min oder bis zum Gebrauch einweichen.
- Legen Sie das Filterpapier auf die Anodenplatte einer halbtrockenen Transferzelle; Legen Sie dann die PVDF-Membran, das Gel und das Filterpapier in dieser Reihenfolge darauf.
- Übertragen Sie die Proteine aus dem Gel auf die PVDF-Membran bei 10 V für 25 min bei Raumtemperatur.
- Blockieren Sie die Membran mit WB-Blocklösung für 1 h bei Raumtemperatur.
- Die Membran mit Anti-Natrium-Taurocholat-Cotransport-Polypeptid (Anti-NTCP) (1:100 Verdünnung) bei 4 °C über Nacht inkubieren.
- Waschen Sie die Membran 3 x 10 min mit TBST.
- Die Membran mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Ziegen-Antikaninchen-Antikörper (1:10.000 Verdünnung) für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie die Membran 3 x 10 min mit TBST und dann 1 x 5 min mit TBS.
- Erkennen Sie NTCP mithilfe eines HRP-Substrats (siehe Materialtabelle).
- Fügen Sie mindestens 0,1 ml HRP-Substratlösung/cm2 der Membran hinzu und inkubieren Sie die Membran für 3-5 min im Dunkeln.
- Visualisieren Sie NTCP mit einem Gel-Dokumentationssystem im Chemilumineszenzmodus, wählen Sie die Markeroption für die Membran, passen Sie die Belichtungszeit im Akkumulationsmodus alle 1 Minute an und nehmen Sie das Foto mit verschiedenen Belichtungszeiten für 5 Minuten auf.
- Streifen und sondieren Sie den Blot mit Maus-Anti-GAPDH-Antikörper (1:200.000 Verdünnung) und HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (1:10.000 Verdünnung).
- Messung des NTCP-Spiegels mittels Durchflusszytometrie
- Sammeln Sie die Zellpellets reifer Hepatozyten, indem Sie die Zellen mit 8 mM EDTA für 15 min inkubieren.
HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Trypsin oder anderen Proteasen, die Zelloberflächenrezeptoren stören können. Da NTCP ein Zelloberflächenrezeptorprotein ist, können Schäden durch Trypsinisierung zu negativen Ergebnissen führen. - Fixieren Sie die Hepatozyten mit 300 μL 3,7% Paraformaldehyd in 1x PBS für 15 min. Die Zellsuspension wird in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugiert.
- Die Zellen 2x mit 700 μL oder 1x PBS mit 1% FBS (v/v) waschen, 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren, 300 μL 0,05% Triton X-100 in PBS zum Zellpellet geben und die Zellen bei Raumtemperatur für 20 min inkubieren, um sie zu permeabilisieren.
- 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren, Zellpellet 3 x 1 min mit 700 μL PBS mit 1% FBS (v/v) waschen. Inkubieren Sie die Zellen mit dem primären Antikörper gegen NTCP (1:100 Verdünnung) bei 4 °C für 30 min. Die Zellen 3 x 1 min mit Perm/Wash-Puffer waschen und 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren.
- Färben Sie die Zellen mit sekundären Antikörpern, die an Alexa Fluor 488 konjugiert sind, bei 4 °C für 30 min. Die Zellen 3 x 1 min mit Perm/Wash-Puffer waschen und 10 min bei 300 × g, 25 °C zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 200 μL PBS mit 1% FBS (v/v).
- Schalten Sie das Durchflusszytometer ein, erwärmen Sie den Laser für 15 Minuten und führen Sie eine routinemäßige Reinigung durch.
- Wählen Sie die Messparameter aus, einschließlich Vorwärtsstreuung (FSC), Seitenstreuung (SSC) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE), und stellen Sie die automatische Kompensationsanpassung über die Software ein. Fügen Sie die Kompensationskontrollproben hinzu: ungefärbte Kontrolle, FITC-gefärbte Kontrolle und PE-gefärbte Kontrolle.
HINWEIS: FSC- und SSC-Parameter werden verwendet, um die Größe und Granularität einzelner Zellen zu bestimmen, um die Zellpopulation für die Gating-Analyse auszuwählen. Der Fluoreszenzkanaldetektor verfügt über FITC- und PE-Kanäle. Wählen Sie für dieses Protokoll den FITC-Kanal aus, um Alexa Fluor 488 zu erkennen. - Führen Sie die ungefärbte Probe mit mittlerer fluidischer Flussrate (60 μL/min) durch, passen Sie den Schwellenwert von FSC und SSC an, bis sie die interessierende Zellpopulation abdecken, markieren Sie den Gate-Bereich in diesem Bereich und wenden Sie ihn auf alle Kompensationskontrollen an.
- Stellen Sie die Fluoreszenz-Photomultiplierröhre (PMT) mit der ungefärbten Steuerung ein und passen Sie die PMT-Spannung von FITC oder PE im negativen Quadranten an. Führen Sie die positiv gefärbte Probe aus und passen Sie FITC oder PE in der positiven Quadrantenskala an. Führen Sie die Steuerelemente ohne Färbung, FITC-gefärbt oder PE-gefärbt aus, berechnen Sie die Kompensation, und wenden Sie sie auf die Probeneinstellungen an. Führen Sie das Hepatozytenbeispiel aus, um den NTCP-Pegel zu messen.
- Analysieren Sie die gefärbten Hepatozyten mit der Durchflusszytometer-Software (siehe Materialtabelle).
- Klicken Sie unter BD FACSuite-Fenster auf das Steuerrohr auf der Registerkarte Datenquellen und warten Sie, bis die Rohdaten angezeigt werden.
- Klicken Sie auf der Registerkarte Arbeitsblatt auf der rechten Seite auf die Schaltfläche Ellipsentor , wählen Sie mit dem Mauszeiger die Zellpopulation in SSC und das FSC-Punktdiagramm aus und warten Sie, bis der Kreis P1 angezeigt wird.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Intervallgatter und markieren Sie den Bereich im FITC-Histogramm, beginnend mit dem höchsten Fluoreszenzintensitätswert auf der rechten Seite. Beachten Sie die angezeigte Zeile P2.
- Klicken Sie auf das Experimentröhrchen und beobachten Sie, dass sich die Daten auf der Registerkarte Arbeitsblatt ändern. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statistik und dann auf die leere Stelle im Arbeitsblatt. Beobachten Sie die angezeigten statistischen Werte der NTCP-Grundgesamtheit.
- Sammeln Sie die Zellpellets reifer Hepatozyten, indem Sie die Zellen mit 8 mM EDTA für 15 min inkubieren.
3. Herstellung der aus Zellkultur gewonnenen HBV-Partikel (HBVcc)
- Kultur HepG2.2.15 in vollständigem Medium (DMEM ergänzt mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) in einer 10 cm Petrischale für 24 h.
- Ersetzen Sie das komplette Medium, das mit 380 μg / ml Geneticin (G418) ergänzt wurde, wenn die HepG2.2.15 60% -70% Konfluenz erreichen. Ernte das konditionierte Medium alle 2 Tage; lagern Sie das HBV-haltige Medium bei 4 °C.
- Zellreste werden durch Zentrifugieren des Überstands bei 5.000 × g, 4 °C für 20 min entfernt. Sammeln Sie das konditionierte Medium mit einer 20-ml-Spritze und filtern Sie es durch einen 0,45 μm proteinarmen Filter, um Zelltrümmer zu entfernen.
- Um HBV zu konzentrieren, verdünnen Sie 1 Volumen Konzentrator mit 3 Volumen des gefilterten Überstands aus Schritt 3.3 in einem konischen Zentrifugenröhrchen und mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Rohrinversion. Die Mischung 1 h bei 4 °C eintragen. Zentrifugieren Sie die Lösung für 1 h bei 1.500 × g, 4 °C und stellen Sie sicher, dass ein cremefarbenes Pellet sichtbar ist.
HINWEIS: Fügen Sie für jeweils 30 ml gefilterten Überstand aus Schritt 3.3 10 ml des Konzentrators hinzu, um 40 ml Gesamtvolumen zu erreichen. - Bewerten Sie den HBV-Titer (Genomäquivalent) mit HBV 1,3-mer-WT-Replikon als Standardkurve im Bereich von 1 × 102 bis 1 × 1010 unter Verwendung der absoluten real-time PCR, wie zuvorbeschrieben 11.
- Das Pellet vorsichtig in FBS rekonstituieren und bis zu 1 Jahr bei −80 °C in Einwegaliquoten lagern.
4. Anti-HBV-Eintrittstest
- Halten Sie 100% konfluentes imHC oder HepaRG in 6-Well-Platten im Reifungsmedium (2% DMSO in Williams' E-Medium, 10% FBS, 100 U / ml Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 5 μg / ml Insulin, 50 μM Hydrocortison und 2 mM L-Glutamin) für 2 Wochen und wechseln Sie das Medium 2x pro Woche.
- Das Medium absaugen, dann das Curcumin (10-30 μM) oder 4 μM Cyclosporin A (CsA) verdünnt mit William's E-Medium für 2 h hinzufügen. Saugen Sie den Kandidaten HBV-Eintrittshemmer ab und ersetzen Sie ihn durch 1 ml William's E-Medium, das 4% Polyethylenglykol enthält.
- HBV-Partikel in das Kulturmedium bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 100 pro Vertiefung geben und bei 37 °C für 18 h inkubieren. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 2 ml kaltes PBS hinzu und schwenken Sie vorsichtig, um das alte Medium mit ungebundenem HBV abzuspülen.
- Fügen Sie 2 ml komplettes William's E-Medium hinzu und kultivieren Sie es für 7 Tage. Das Medium absaugen, die Zellen mit 1x PBS waschen und die Zellen mit 3,7% Paraformaldehyd in PBS für 15 min bei Raumtemperatur fixieren. Permeabilisieren und blockieren Sie die infizierten Zellen mit IF-Blockierungslösung (0,2% Triton X-100 und 3% Rinderserumalbumin in PBS) und inkubieren Sie sie für 60 min bei Raumtemperatur.
- Den primären Antikörper (Anti-HBV-Kernantigen) in einer Verdünnung von 1:200 in die Blockierlösung geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Zellen 3 x 1 min mit einer Waschlösung (0,5% Tween 20 in PBS).
- Sekundäre Antikörper (1:500 Verdünnung) in die IF-Blockierlösung geben, 1 h bei Raumtemperatur inkubieren und die Zellen 3 x 1 min mit Waschlösung waschen.
- Montieren Sie die Probe mit einem Antifade-Montagemedium mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und decken Sie sie mit einem Glasdeckglas ab. Erfassen Sie das Fluoreszenzsignal mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem DAPI-Filter (Ex 352-402 nM und Em 417-477) und einem PE-Filter (Ex 542-582 und Em 604-644) sowie einer 20-fachen Objektivlinse ausgestattet ist, und bestimmen Sie die Anti-HBV-Eintrittsaktivität der Kandidatenverbindungen.
5. HBV-Zellbindungsassay
- Halten Sie 100% konfluentes imHC oder HepaRG in 6-Well-Platten im Reifungsmedium (2% DMSO in Williams' E-Medium, 10% FBS, 100 U / ml Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 5 μg / ml Insulin, 50 μM Hydrocortison und 2 mM L-Glutamin) für 2 Wochen und wechseln Sie das Medium 2x pro Woche.
- Das Medium absaugen, dann Curcumin (10-30 μM) oder Cyclosporin A (4 μM) in Williams E-Medium für 2 h verdünnt hinzufügen. Saugen Sie den HBV-Eintrittshemmer ab und ersetzen Sie ihn durch 1 ml William's E-Medium, das 4% Polyethylenglykol enthält.
- HBV-Partikel in das Kulturmedium bei einem MOI von 100 pro Vertiefung geben und bei 4 °C für 2 h inkubieren, um eine HBV-Bindung an die Hepatozyten zu ermöglichen. Verwerfen Sie das Medium, das ungebundenes HBV enthält, fügen Sie 2 ml kaltes PBS hinzu und schwenken Sie vorsichtig, um Spuren des verbrauchten Mediums zu entfernen.
- Ernten Sie die infizierten Zellen mit einem Zellschaber und stören Sie die Zellen mit Lysepuffer. Das Lysat wird in ein Sammelröhrchen überführt und die Gesamt-DNA extrahiert, um die HBV-DNA mittels real-time PCR mit spezifischen Primern für HBV (Forward Primer: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3' und Reverse Primer: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') unter Verwendung von PRNP (Forward Primer: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', Reverse Primer: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') als interne Kontrolle zu bewerten.
- Amplifizieren Sie die PCR-Produkte in einem Thermocycler unter Verwendung der in Schritt 2.1 beschriebenen Temperaturbedingungen.
- Berechnung der relativen HBV-DNA-Spiegel/1 × 106 Zellen in Behandlung versus Kontrolle unter Verwendung von PRNP als Kalibrorgen basierend auf der 2-ΔΔCT-Methode.
6. Aufnahmetest für Taurocholsäure (TCA)
- Halten Sie 100% konfluente imHC- und HepaRG-Zellen 14 Tage lang im Reifungsmedium.
- Das Medium absaugen und die Hepatozyten mit 1x PBS waschen. Curcumin oder Ciclosporin A (10-50 μM) in William's E-Medium für 2 h verdünnt hinzufügen. Das Medium durch die Natriumtaurocholsäurelösung (0,5 M Natriumtaurocholsäurehydrat in 1x HEPES) ersetzen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Die Natriumtaurocholsäurelösung absaugen und 3x mit kaltem 1x HEPES waschen. Fügen Sie 300-500 μL kaltes 1x HEPES hinzu und ernten Sie die Zellen mit Zellschaber auf Eis.
- Die Zellen werden durch Ultraschall bei einer Frequenz von 20 kHz für 20 s homogenisiert und 5 min auf Eis inkubiert. Zentrifugieren Sie die Lysate bei 10.000 × g für 20 Minuten, um Zelltrümmer auszufällen. Sammeln Sie den Überstand und bewerten Sie die intrazelluläre Taurocholsäurekonzentration mit einem TCA-ELISA-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).
7. Bestimmung von Protein-Liganden-Wechselwirkungen mittels isothermer Titrationskalorimetrie
HINWEIS: Dieses Assay-System wurde auf Basis der MicroCal PEAQ-ITC (ITC-Software) entwickelt.
- Bereiten Sie den Puffer vor (50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,0).
- Bereiten Sie 15 μM NTCP im Puffer vor.
- Bereiten Sie 150 μM-Kandidaten HBV-Eintrittsinhibitorlösungen im Puffer vor.
- Waschen Sie die Probenzelle, die Referenzzelle und die Spritze im ITC-Gerät mit dem Puffer (Schritt 7.1.).
- Starten Sie die ITC-Software durch Doppelklick auf das Software-Symbol in Windows-Systemen. Wählen Sie auf der Registerkarte Highlight Run experiment die Option microCal Method for 19 Injection.itcm aus und klicken Sie auf Öffnen. Wenn ein neues Fenster geöffnet wird, klicken Sie auf die Registerkarte Reinigen, und wählen Sie im Fenster Reinigungsmethode die Schaltfläche Waschen für Zellenreinigungsmethode und die Schaltfläche Spülen für Spritzenreinigungsmethode aus. Klicken Sie auf Weiter und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm.
HINWEIS: Der Waschvorgang kann 1,4 Stunden dauern.
- Starten Sie die ITC-Software durch Doppelklick auf das Software-Symbol in Windows-Systemen. Wählen Sie auf der Registerkarte Highlight Run experiment die Option microCal Method for 19 Injection.itcm aus und klicken Sie auf Öffnen. Wenn ein neues Fenster geöffnet wird, klicken Sie auf die Registerkarte Reinigen, und wählen Sie im Fenster Reinigungsmethode die Schaltfläche Waschen für Zellenreinigungsmethode und die Schaltfläche Spülen für Spritzenreinigungsmethode aus. Klicken Sie auf Weiter und folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm.
- Laden Sie die Probe in die ITC; Klicken Sie auf der Registerkarte Experiment ausführen auf die Schaltfläche Laden und lesen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm. Klicken Sie auf Weiter und folgen Sie den Videoanweisungen, bis dieser Ladeschritt abgeschlossen ist.
- Füllen Sie die Referenzzelle mit einer Spritze mit Lösungspuffer. Füllen Sie die Probenzelle mit 15 μM NTCP im Puffer mit einer Spritze und entfernen Sie die überschüssige NTCP-Lösung über der Probenzelle. Füllen Sie die Spritze mit 150 μM Lösung des Curcumins (Liganden) und vermeiden Sie Luftblasen in der Spritze.
- Führen Sie das Beispiel aus, und klicken Sie auf der Registerkarte Experiment ausführen auf die Schaltfläche Ausführen . Beobachten Sie die Fenster auf der linken Seite, die experimentelle Informationen und experimentelle Einstellungen anzeigen. Geben Sie die Liganden- und Proteinkonzentrationen als 150 μM in [ Syr], 15 μM in [Zelle] und 25 °C in der Temperatur ein.
- Klicken Sie in der Software auf Start , um den Injektionsprozess durchzuführen, und warten Sie 1,4 h, bis die Protein-Liganden-Interaktion abgeschlossen ist.
HINWEIS: Die verblasste Schaltfläche Analysieren wird unter den Softwarefenstern angezeigt. - Beachten Sie, dass die Analysetaste nach Abschluss der Injektion heller wird. Klicken Sie auf die Analyseschaltfläche in der Steuerungssoftware, um die Rohdaten mit der Analysesoftware zu analysieren. Klicken Sie auf Übersicht , um die Rohdaten anzuzeigen und wählen Sie das Anpassungsmodell als One Set of Binding Site aus.
- Stellen Sie sicher, dass im Bindungsstatus die experimentellen Daten (Bindungs-, keine Bindungs-, Steuer- oder Prüfdaten) und die Experimentwerte (KD, ΔG, ΔH, TΔS und N) im Softwarefenster angezeigt werden.
- Exportieren Sie die thermodynamischen Parameter, die die Wechselwirkungsbindung vorhersagen, einschließlich Wasserstoffbrückenbindung, Van-der-Waals-Bindung und hydrophober Wechselwirkung, in das TIF- oder JPEG-Format.
- Nach Abschluss des Experiments waschen Sie die Probenzelle nach Schritt 7.4.
8. Statistische Auswertung
- Führen Sie alle Experimente in drei unabhängigen Replikaten durch (n = 3).
- Präsentieren Sie experimentelle Daten als Mittel ± SD und führen Sie statistische Analysen mit der gewünschten statistischen Analysesoftware durch.
- Verwenden Sie einen zweiseitigen, ungepaarten Studenten-t-Test, um zwischen zwei Mittelwerten zu vergleichen, oder wenden Sie die Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) mit Dunnett an, um mehrere Werte mit einem Kontrollwert zu vergleichen. Legen Sie das Signifikanzniveau auf p ≤ 0,05 fest.
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Representative Results
Es wurden hepatische Reifungsmerkmale beobachtet, einschließlich zweikerniger Zellen und polygonaler Morphologie (Abbildung 1), insbesondere im differenzierten Stadium von imHC (Abbildung 1A). Ein starker Anstieg der NTCP-Expression wurde in d-HepaRG und d-imHC um das 7-fache bzw. 40-fache gemessen (Abbildung 1B). Die stark glykosylierte Form von NTCP, die postuliert wurde, um die Anfälligkeit für den HBV-Eintritt zu verleihen, wurde in d-imHC häufiger nachgewiesen als in d-HepaRG (Abbildung 1C). Das differenzierte imHC enthielt 65,9% höhere NTCP-Spiegel als die undifferenzierten Zellen (Abbildung 1D).
Abbildung 2A zeigt eine Zusammenfassung der prophylaktischen Behandlung. Abbildung 2B zeigt die HBV-Immunfluoreszenzfärbung, die durchgeführt wurde, um die Anti-HBV-Eintrittsaktivitäten am Tag 7 nach der Infektion zu bewerten, während Abbildung 2C das HBV-Bindungsassay-Protokoll umreißt. Das Niveau der HBV-Bindung am Zelloberflächenrezeptor wurde mittels real-time PCR bewertet (Abbildung 2D). Um festzustellen, ob NTCP der Rezeptor für die HBV-Bindung war, wurde die TCA-Aufnahme für die Kandidatenbindungshemmer bestimmt (Abbildung 2E). Basierend auf diesem Modell verringerte die mutmaßliche inhibitorische Aktivität der Kandidatenverbindungen die HBV-Bindung durch NTCP.
Die kalorimetrische Veränderung wurde durch kontinuierliche Injektionen in die Probenzelle nachgewiesen (Abbildung 3). Eine standardmäßige nichtlineare Regression der kleinsten Quadrate wurde basierend auf einer Bindungsstelle aufgetragen, die gut an die Daten angepasst war. Die durchgezogene Linie zeigte die beste Anpassung an die experimentellen Werte an (Abbildung 3A,B). Tabelle 1 zeigt thermodynamische Parameter, die mit der Bindung von NTCP an Cyclosporin A (CsA) oder eine Kandidatenverbindung korrelieren.
Abbildung 1: Leberreifung von HepaRG und imHC mit NTCP-Charakterisierung. Beide Zelllinien wurden 2 Wochen lang in hepatischem Reifungsmedium kultiviert. (A) Hepatozyteneigenschaften wie zweikernige Zellen und polygonal geformte Morphologie wurden ausschließlich im Reifestadium von imHC beobachtet. Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Die Expression von NTCP wurde sowohl in HepaRG als auch in imHC hochreguliert. NTCP normalisiert mit GAPDH war in imHC höher als in HepaRG. (C) Eine stark glykosylierte Form von NTCP wurde nach der Reifung beobachtet. (D) Der Prozentsatz der NTCP-Erhöhung in d-imHC wurde mittels Durchflusszytometrie bewertet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. *, ** und *** stellen eine statistische Differenz mit p < 0,05, p < 0,01 bzw. p < 0,001 dar. Abkürzungen: NTCP = Natriumtaurocholat cotransporting polypeptide; GAPDH = Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase; NTCP-FITC = fluorescein-isothiocyanat-markiertes NTCP. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Die prophylaktische CCM-Behandlung verringerte den Viruseintritt, die intrazelluläre HBV-DNA und die TCA-Aufnahmeaktivität . (A) d-imHC wurden vor der Impfung mit HBV 2 h lang mit CCM vorbehandelt. (B) Die Anti-HBV-Eintrittsaktivität wurde durch Immunfluoreszenzfärbung am Tag 7 nach der Infektion bestimmt. (C) Ein schematischer Zeitplan des HBV-Bindungsprotokolls wird vorgelegt. (D) Der Gehalt an gebundener HBV-DNA auf Hepatozyten wurde bewertet und mit 4 μM CsA und dem klassischen HBV-Eintrittshemmer 25 Einheiten/ml Heparin verglichen. (E) Die Wirkung des 10-30 μM CCM auf die TCA-Aufnahmehemmung wurde durch den NTCP-Rezeptor vermittelt. Abkürzungen: CCM = Curcumin; HBV = Hepatitis-B-Virus; TCA = Taurocholsäure; d-imHC = differenziertes imHC; CsA = Cyclosporin A; HP = Heparin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die Affinität von NTCP zu einzelnen Molekülen (CsA oder Kandidatenverbindung) wurde mittels ITC nachgewiesen. Das ITC-Profil für die Kombination von NTCP mit entweder (A) CsA oder (B) Curcumin wurde durch sequentielle Injektion einer Verbindung (150 μM CsA oder Kandidat) in die NTCP-Lösung (15 μM NTCP, pH 7,0, 25 °C) erzeugt. Die kalorimetrischen Rohdaten zwischen Differenzleistung (μcal/s) und Zeit (min) wurden aufgetragen. Die Daten wurden basierend auf einem Ein-Standort-Bindungsmodell analysiert, bei dem die durchgezogenen Linien die am besten geeigneten Ergebnisse anzeigten. Während der Injektion von Liganden (CSA oder Curcumin) in die NTCP-Lösung änderte sich die Enthalpie (ΔH) nach einer Erhöhung der Ligandenkonzentration in der Probenzelle. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Bindungsreaktion stattgefunden hat. Abkürzungen: CsA = Cyclosporin A; NTCP = Natriumtaurocholat, das Polypeptid transportiert; ITC = isotherme Titrationskalorimetrie; DP = differentielle Leistung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Protein | Ligand | Bindungskonstante (KD) | Enthalpieänderung (ΔH) | Entropieänderung (ΔTΔS) | Gibbs Free Energy Change (ΔG) | Art der Bindung |
| (M-1) | (kcal/mol) | (kcal/mol) | (kcal/mol) | |||
| Menschliches NTCP (SLA10A1) | CCM | 1,21 ×10-6 | -1 | 0.6 | -0.39 | Wasserstoffbrückenbindung |
| Menschliches NTCP (SLA10A1) | TCA | 1 ×10-9 | 80 | -96 | -16 | Hydrophobe Wechselwirkung |
Tabelle 1: Thermodynamische Parameter, die sich aus der Wechselwirkung zwischen NTCP und einzelnen Verbindungen (CCM und TCA) mittels ITC ergeben. Abkürzungen: NTCP = Natriumtaurocholat cotransporting polypeptide; CCM = Curcumin; TCA = Taurocholsäure; ITC = isotherme Titrationskalorimetrie.
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Discussion
Die HBV-Infektion wird über eine niedrigaffine Bindung an Heparansulfat-Proteoglykane (HSPGs) an Hepatozyten25 initiiert, gefolgt von der Bindung an NTCP mit anschließender Internalisierung durch Endozytose26. Da NTCP ein entscheidender Rezeptor für den HBV-Eintritt ist, kann der gezielte HBV-Eintritt klinisch übersetzt werden, um die De-novo-Infektion, die Mutter-Kind-Übertragung (MTCT) und das Rezidiv nach Lebertransplantation zu verringern. Die Unterbrechung des Viruseintritts wäre eine praktikable alternative Heilung für chronische HBV-Infektionen.
Einige kritische Schritte im oben genannten Protokoll sind hier zusammengefasst. Stellen Sie bei der Vorbereitung der Wirtszellen sicher, dass die Hepatozyten 100% Konfluenz erreichen, bevor Sie das Reifungsmedium mit 2% DMSO hinzufügen. Die Kultivierung subkonfluenter Hepatozyten in 2% DMSO führt zum Zelltod und zur Zellablösung. Die Reifezeit kann auf bis zu 4 Wochen verlängert werden, um die NTCP-Expression27,28 zu maximieren, obwohl eine 2-wöchige Reifezeit empfohlen wird.
Drei Techniken wurden für die Quantifizierung der zellulären NTCP-Expression vorgeschlagen. Es wird empfohlen, dass Benutzer die Technik auswählen, mit der sie am besten vertraut sind. Hier haben wir die Durchflusszytometrie der Western-Blot-Analyse vorgezogen, weil sie bequem, schnell und einfach ist.
Für die Herstellung der Zellkultur-abgeleiteten HBV-Partikel (HBVcc) wurde HepG2.2.15 aus HepG2 durch transiente Transfektion mit HBV-Genom in voller Länge zusammen mit dem Geneticin (G418)-Resistenzgen29 gewonnen. Das Kulturmedium sollte 380-500 μg/ml Geneticin enthalten, da die Zellen sonst kein HBVcc produzieren. Der proteinarme 0,45 μm-Filter sollte zur Klärung des Überstands verwendet werden, um einen Verlust der HBV-Ausbeute zu vermeiden. Zur Konzentration von HBV wurde Polyethylenglykol (PEG) mit einer Standardzentrifuge verwendet. HBV-Partikel können auch durch einen Saccharosegradienten und Ultrazentrifugation konzentriert werden. Mehrfache Gefrier- und Auftauzyklen sollten vermieden werden, da die Infektiosität verringert wird.
Im Anti-HBV-Entry-Assay müssen die Hepatozyten vor der Reifungsinduktion eine 100%ige Konfluenz erreichen. Dieses Protokoll wurde auf der Grundlage einer prophylaktischen Behandlung entwickelt. Wirtszellen wurden vor der Infektion mit HBV12 2 h lang den Kandidatenverbindungen ausgesetzt. Nach 7 Tagen nach der Infektion wurde die HBV-Infektiosität mittels Immunfluoreszenz bewertet. Alle Komponenten, Konzentrationen der Blocklösung, primäre und sekundäre Antikörper und Waschschritte müssen optimiert werden, um das beste Ergebnis mit minimaler unspezifischer Färbung zu erzielen. Hier haben wir optimierte Konzentrationen und Techniken bereitgestellt.
Das TCA-Aufnahme-Assay-Protokoll beschreibt den Goldstandard für die Hemmung des NTCP-Transports. Wir haben das Protokoll geändert, um radioaktives TCA zu vermeiden. Die kritischen Schritte für den TCA-Aufnahmetest sind das Waschen und Harvesten von Zellen. Alle diese Verfahren müssen die ganze Zeit auf Eis durchgeführt werden, um eine weitere zelluläre Aktivität-Internalisierung der Verbindung zu verhindern. Nach der Homogenisierung der Zellen und der Pelletierung von Zellresten muss der Überstand schonend abgesaugt werden, ohne das Pellet zu stören. Wenn die Einrichtung des Benutzers die Verwendung der Flüssigszintillationstechnik zulässt, wird 3H-Taurocholsäure häufig in TCA-Transport- und Aufnahmestudien verwendet. Da wir die TCA-Aufnahme mit ELISA validiert haben, kann diese alternative Technik die Verwendung der radioaktiven Verbindung ersetzen.
ITC ist eine biophysikalische Methode, die häufig verwendet wird, um die thermodynamischen Parameter zu bestimmen, die mit den Wechselwirkungen zwischen löslichen Proteinen und niedermolekularen Liganden verbunden sind30,31. Mit dieser Technik kann die Wechselwirkung verschiedener Liganden mit einem kleinen Molekül oder Protein untersucht werden. ITC ist eine direkte und nichtinvasive Methode ohne zusätzliche Schritte zur Signalerkennung, ohne Molekulargewichtsbeschränkungen und ohne Markierung, Immobilisierung oder andere chemische Modifikationen. Die Begrenzung der ITC ist die Voraussetzung für hohe Konzentrationen der wechselwirkenden Materialien. Protein und Ligand müssen hochgereinigt und ausreichend löslich in Wasser (10-100 μM) bei 25 °C für 1 h unter Rühren sein. Die instabile Proteinlösung kann durch Wärmesignaländerung als Funktion der Zeit nachgewiesen werden.
Humane Enhanced-NTCP-Hepatozyten bieten ein alternatives Modell für die In-vitro-Studie der HBV-Infektion, ähneln jedoch HepaRG und primären menschlichen Hepatozyten. Diese Wirtsmodelle werden durch ihre begrenzte Zuverlässigkeit und Anfälligkeit behindert 8,33. Die ineffiziente HBV-Ausbreitung in HepG2-NTCP- oder Huh7-NTCP-Zellen wurde durch niedriges HBV-Inokulum nachgewiesen, das von HBVcc-produzierenden Zellen abgeleitet wurde. In mehreren Studien wurde HBV verwendet, um die Zielzellen bei einem MOI von 1.00033,34 zu infizieren. Die subviralen Partikel in HBVcc enthalten HBV-Hüllprotein (L/M/S) und binden kompetitiv NTCP, was zu einer verminderten Infektiosität führt35. Um diese Einschränkung zu überwinden, modifizierte dieses Protokoll die HepaRG- oder imHC-Kultur mit einem Reifungsprotokoll, um die NTCP-Spiegel zu maximieren. HBVcc abgeleitet von HepG2.2.15 wurde konzentriert, bevor es als Inokulum verwendet wurde. Die HBV-Infektiosität war höher als 80% in differenziertem imHC, basierend auf der Messung des HBV-Kernantigens11.
Wir haben die Identifizierung von Anti-HBV-Verbindungen beschrieben, die auf NTCP abzielen, um den Viruseintritt zu unterbrechen, und ein hepatisches Reifungsverfahren zur Erhöhung der NTCP-Spiegel eingeführt. Um Eintrittshemmer zu identifizieren, wurden Hepatozyten vor der Infektion mit HBV bei 4 °C 2 h lang mit Kandidatenverbindungen vorbehandelt, um eine virale Bindung, aber keinen Eintritt zu ermöglichen. Die Abnahme der HBV-Infektiosität wurde am Tag 7 nach der Infektion bewertet. Die repräsentativen Daten enthielten Cyclosporin A, einen klassischen NTCP-Inhibitor, als Positivkontrolle zur Validierung des Modells.
Da NTCP sowohl Transporter- als auch Rezeptor-vermittelte Endozytosefunktionen erleichtert, könnten HBV-Eintrittsinhibitoren auf mindestens einen dieser Mechanismen abzielen. Die Hemmung des NTCP-Transports kann unter Verwendung eines TCA-Aufnahmeassays auf der Grundlage von ELISA bewertet werden, wodurch die radioaktive TCA aus dem klassischen Protokoll36 eliminiert wird. Die Affinität zwischen NTCP und dem Eintrittsinhibitor wurde mittels ITC gemessen. Diese Technik lieferte wesentliche thermodynamische Parameter, einschließlich der Stöchiometrie (n), der Dissoziationskonstante (KD), der Änderung der freien Energie (ΔG), der Enthalpie (ΔH), der Entropie (ΔS) und der Wärmekapazität der Bindung (ΔCp). Verschiedene Anti-HBV-Wirkstoffe wurden durch molekulares Andocken identifiziert, wie Quercetin, Rutin, Hesperidin und Luperol, die spezifisch HBV-Reverse-Transkriptase binden könnten, vergleichbar mit Lamivudin, einem Nukleosidanalogon. Die Verbindungen wurden mittels ITC untersucht und wiesen mit HBV-Polymerase37 eine negative Gibb-Energie (−ΔG) im Bereich von −9,3 bis −5,2 kcal/mol und KD von 1 × 10-6 bis 1 × 10-3 M auf. Zusammengenommen werden die Daten aus diesen oben genannten Assays dazu beitragen, die antivirale Wirksamkeit von Kandidatenverbindungen zu überprüfen, die als HBV-Eintrittshemmer wirken. Das etablierte Protokoll wird nützlich sein, um neuartige NTCP-Antagonisten/-Inhibitoren zu entdecken. Die Unterdrückung des Viruseintrags könnte in der prophylaktischen und therapeutischen Behandlung nützlich sein.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.
Acknowledgments
Dieses Forschungsprojekt wird von der Mahidol University und der Thailand Science Research and Innovation (TSRI) unterstützt und separat an A. Wongkajornsilp und K. Sa-ngiamsuntorn vergeben. Diese Arbeit wurde vom Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council über die Program Management Unit for Competitiveness (Fördernummer C10F630093) finanziell unterstützt. A. Wongkajornsilp ist Empfänger eines Chalermprakiat-Stipendiums der Medizinischen Fakultät Siriraj Hospital, Mahidol University. Die Autoren danken Frau Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University) für ihre Unterstützung bei der ITC-Technik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 cell culture flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
References
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