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Biochemistry

एक सक्षम हेपेटोसाइट मॉडल एक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में सोडियम टौरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड के माध्यम से हेपेटाइटिस बी वायरस प्रवेश की जांच करता है

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63761
Automatic Translation
1, 2, 2, 3,4, 5
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Mahidol University, 2Program in Translational Medicine, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University, 3Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University, 4Department of Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University, 5Department of Pharmacology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University

Summary

हम मेजबान सोडियम टॉरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड के साथ बाध्यकारी आत्मीयता (केडी) को मापने के लिए आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री का उपयोग करके, पूर्व और बाद के वायरल प्रवेश जीवनचक्र चरणों को लक्षित करने वाले एंटी-हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एंटीवायरल प्रभावकारिता वायरल जीवनचक्र मार्करों (सीसीसीडीएनए गठन, प्रतिलेखन और वायरल असेंबली) के दमन के माध्यम से निर्धारित की गई थी।

Abstract

हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संक्रमण को हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक माना जाता है। वर्तमान उपचार केवल वायरल लोड को कम कर सकता है लेकिन इसके परिणामस्वरूप पूर्ण छूट नहीं हो सकती है। एचबीवी संक्रमण के लिए एक कुशल हेपेटोसाइट मॉडल एक सच्चे-से-जीवन वायरल जीवन चक्र की पेशकश करेगा जो चिकित्सीय एजेंटों की स्क्रीनिंग के लिए महत्वपूर्ण होगा। अधिकांश उपलब्ध एंटी-एचबीवी एजेंट वायरल प्रविष्टि के बाद जीवनचक्र चरणों को लक्षित करते हैं लेकिन वायरल प्रविष्टि से पहले नहीं। यह प्रोटोकॉल एक सक्षम हेपेटोसाइट मॉडल की पीढ़ी का विवरण देता है जो पूर्व-वायरल प्रविष्टि और पोस्ट वायरल प्रवेश जीवनचक्र चरणों को लक्षित करने वाले चिकित्सीय एजेंटों के लिए स्क्रीनिंग करने में सक्षम है। इसमें मेजबान कोशिकाओं के रूप में आईएमएचसी या हेपएआरजी के आधार पर सोडियम टॉरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड (एनटीसीपी) बाइंडिंग, सीसीसीडीएनए गठन, प्रतिलेखन और वायरल असेंबली का लक्ष्यीकरण शामिल है। यहां, एचबीवी प्रवेश निषेध परख ने एचबीवी बाइंडिंग को रोकने और एनटीसीपी के माध्यम से कार्यों को परिवहन करने के लिए कर्क्यूमिन का उपयोग किया। इनहिबिटर्स का मूल्यांकन इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) का उपयोग करके एनटीसीपी के साथ बाध्यकारी आत्मीयता (केडी) के लिए किया गया था - थर्मोडायनामिक मापदंडों के आधार पर एचबीवी दवा स्क्रीनिंग के लिए एक सार्वभौमिक उपकरण।

Introduction

हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संक्रमण को दुनिया भर में एक जानलेवा बीमारी माना जाता है। क्रोनिक एचबीवी संक्रमण यकृत सिरोसिस और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा1 के जोखिम से भरा हुआ है। वर्तमान एंटी-एचबीवी उपचार ज्यादातर न्यूक्लियोस (टी) आईडी एनालॉग्स (एनए) और इंटरफेरॉन-अल्फा (आईएफएन-α) 2,3 का उपयोग करके पोस्ट वायरल एंट्री पर केंद्रित है। एक एचबीवी प्रवेश अवरोधक, मिरक्ल्यूडेक्स बी की खोज ने एंटी-एचबीवीएजेंटों 4 के लिए एक नए लक्ष्य की पहचान की है। क्रोनिक एचबीवी में एंट्री इनहिबिटर और एनए के संयोजनने अकेले वायरल प्रतिकृति को लक्षित करने वालों की तुलना में वायरल लोड को काफी कम कर दिया है। हालांकि, एचबीवी एंट्री इनहिबिटर की स्क्रीनिंग के लिए शास्त्रीय हेपेटोसाइट मॉडल कम वायरल रिसेप्टर स्तरों (सोडियम टॉरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड, एनटीसीपी) द्वारा सीमित है। हेपेटोमा कोशिकाओं (यानी, हेपजी 2 और हुह 7) में एचएनटीसीपी की अतिवृद्धि एचबीवी संक्रामकता 7,8 में सुधार करती है। फिर भी, ये सेल लाइनें चरण I और II दवा-चयापचय एंजाइमों के निम्न स्तर को व्यक्त करती हैं और आनुवंशिक अस्थिरता प्रदर्शित करतीहैं। हेपेटोसाइट मॉडल जो उम्मीदवार एंटी-एचबीवी यौगिकों जैसे प्रीवायरल एंट्री, एनटीसीपी बाइंडिंग और वायरल एंट्री के अलग-अलग तंत्र को लक्षित करने में मदद कर सकते हैं, प्रभावोत्पादक संयोजन आहार की पहचान और विकास में तेजी लाएंगे। कर्क्यूमिन की एंटी-एचबीवी गतिविधि के अध्ययन ने पोस्ट वायरल एंट्री रुकावट के अलावा एक नए तंत्र के रूप में वायरल एंट्री के निषेध को स्पष्ट किया है। यह प्रोटोकॉल एंटी-एचबीवी प्रवेश अणुओं 10 की स्क्रीनिंग के लिए एक मेजबान मॉडल का विवरणदेता है।

इस विधि का लक्ष्य वायरल प्रवेश निषेध के लिए उम्मीदवार एंटी-एचबीवी यौगिकों का पता लगाना है, विशेष रूप से एनटीसीपी बाइंडिंग और परिवहन को अवरुद्ध करना। चूंकि एनटीसीपी अभिव्यक्ति एचबीवी प्रवेश और संक्रमण के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, इसलिए हमने एनटीसीपी स्तर11 को अधिकतम करने के लिए हेपेटोसाइट परिपक्वता प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल एचबीवी प्रवेश पर निरोधात्मक प्रभाव को एचबीवी अनुलग्नक के निषेध बनाम आंतरिककरण के निषेध के रूप में अलग कर सकता है। टॉरोकोलिक एसिड (टीसीए) अपटेक परख को एनटीसीपी परिवहन12,13 का प्रतिनिधित्व करने के लिए रेडियोआइसोटोप के बजाय एलिसा-आधारित विधि का उपयोग करके भी संशोधित किया गया था। रिसेप्टर और लिगैंड इंटरैक्शन की पुष्टि उनके 3 डी संरचनाओं14,15 द्वारा की गई थी। एनटीसीपी फ़ंक्शन के निषेध का मूल्यांकन टीसीए अपटेक गतिविधि16 को मापकर किया जा सकता है। हालांकि, इस तकनीक ने उम्मीदवार अवरोधकों के लिए एनटीसीपी बाइंडिंग का प्रत्यक्ष प्रमाण प्रदान नहीं किया। इसलिए, बाइंडिंग की जांच विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके की जा सकती है, जैसे कि सतह प्लास्मोन अनुनाद17, एलिसा, फ्लोरेसेंस-आधारित थर्मल शिफ्ट परख (एफटीएसए)18, फ्रेट19, अल्फास्क्रीन, और विभिन्न अन्य तरीके20। इन तकनीकों के बीच, आईटीसी बाध्यकारी विश्लेषण में एक लक्ष्य मानक है क्योंकि यह लगभग हर प्रतिक्रिया 21 में गर्मी अवशोषण या उत्सर्जन का निरीक्षण करसकता है। एनटीसीपी और उम्मीदवार यौगिकों के बाध्यकारी आत्मीयता (केडी) का आईटीसी का उपयोग करके सीधे मूल्यांकन किया गया था; ये आत्मीयता मान सिलिको भविष्यवाणी मॉडल22 का उपयोग करके प्राप्त किए गए लोगों की तुलना में अधिक सटीक थे।

यह प्रोटोकॉल हेपेटोसाइट परिपक्वता, एचबीवी संक्रमण और एचबीवी प्रवेश अवरोधक के लिए स्क्रीनिंग में तकनीकों को शामिल करता है। संक्षेप में, आईएमएचसी और हेपरग सेल लाइनों के आधार पर एक हेपेटोसाइट मॉडल विकसित किया गया था। सुसंस्कृत कोशिकाओं को 2 सप्ताह के भीतर परिपक्व हेपेटोसाइट्स में विभेदित किया गया था। वास्तविक समय पीसीआर, पश्चिमी धब्बा और प्रवाह साइटोमेट्री11 का उपयोग करके एनटीसीपी स्तरों के अपरेग्यूलेशन का पता लगाया गया था। हेपेटाइटिस बी वायरियन (एचबीवीसीसी) का उत्पादन और हेपजी 2.2.15 से एकत्र किया गया था। विभेदित आईएमएचसी या हेपएआरजी (डी-आईएमएचसी, डी-हेपएआरजी) को एचबीवी विषाणु के साथ टीकाकरण से 2 घंटे पहले एंटी-एचबीवी उम्मीदवारों के साथ रोगनिरोधी रूप से इलाज किया गया था। प्रयोग का अपेक्षित परिणाम उन एजेंटों की पहचान थी जो सेलुलर एचबीवी और संक्रामकता को कम करते हैं। टीसीए अपटेक परख का उपयोग करके एंटी-एनटीसीपी गतिविधि का मूल्यांकन किया गया था। एनटीसीपी गतिविधि को उन एजेंटों द्वारा दबाया जा सकता है जो विशेष रूप से एनटीसीपी को बाध्य करते हैं। आईटीसी तकनीक को इंटरैक्टिव बाइंडिंग की व्यवहार्यता की जांच करने के लिए नियोजित किया गया था जो इनहिबिटर और उनके लक्ष्य प्रोटीन की भविष्यवाणी कर सकता है, बायोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स23,24 के गैर-सहसंयोजक इंटरैक्शन के माध्यम से रिसेप्टर के लिए लिगैंड के बाध्यकारी आत्मीयता (केडी) का निर्धारण कर सकता है। उदाहरण के लिए, KD ≥ 1 × 103 mM कमजोर बाइंडिंग का प्रतिनिधित्व करता है, KD ≥ 1 × 106 μM मध्यम बाइंडिंग का प्रतिनिधित्व करता है, और KD ≤ 1 × 109 nM मजबूत बाइंडिंग का प्रतिनिधित्व करता है। ऍजी सीधे बाध्यकारी इंटरैक्शन के साथ सहसंबद्ध है। विशेष रूप से, नकारात्मक एजी के साथ एक प्रतिक्रिया एक एक्सर्जोनिक प्रतिक्रिया है, यह दर्शाता है कि बंधन एक सहज प्रक्रिया है। एक नकारात्मक ओएच के साथ एक प्रतिक्रिया इंगित करती है कि बाध्यकारी प्रक्रियाएं हाइड्रोजन बॉन्डिंग और वैन डेर वाल्स बलों पर निर्भर करती हैं। टीसीए अपटेक और आईटीसी डेटा दोनों का उपयोग एंटी-एचबीवी एंट्री एजेंटों के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। इन प्रोटोकॉल के परिणाम न केवल एंटी-एचबीवी स्क्रीनिंग के लिए एक आधार प्रदान कर सकते हैं, बल्कि बाध्यकारी आत्मीयता और परिवहन समारोह के माध्यम से मूल्यांकन के रूप में एनटीसीपी के साथ बातचीत भी कर सकते हैं। यह पेपर मेजबान सेल तैयारी और लक्षण वर्णन, प्रयोगात्मक डिजाइन और एनटीसीपी बाध्यकारी आत्मीयता के साथ एंटी-एचबीवी प्रविष्टि के मूल्यांकन का वर्णन करता है।

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Protocol

नोट: निम्नलिखित प्रक्रियाओं को कक्षा II जैविक जोखिम प्रवाह हुड या लैमिनार-फ्लो हुड में किया जाना चाहिए। एचबीवी की हैंडलिंग को नैतिक रूप से आईआरबी (मुरा 2020/1545) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी समाधानों, अभिकर्मकों, उपकरणों और सेल लाइनों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. मेजबान कोशिकाओं (परिपक्व हेपेटोसाइट्स) की तैयारी

  1. कल्चर हेपेटोसाइट्स (3.75 × 105 कोशिकाएं हेपाआरजी या आईएमएचसी) और 10 एमएल डीएमईएम / एफ12 माध्यम के साथ 75 सेमी 2 कल्चर फ्लास्क में बनाए रखते हैं, जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% एल-ग्लूटामाइन, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं। कोशिकाओं को 80% -90% संगम (1 सप्ताह के भीतर) तक पहुंचने की प्रतीक्षा करें।
  2. फ्लास्क से पुराने माध्यम को त्याग दें और कोशिकाओं को 4 एमएल फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ धोएं।
  3. पीबीएस को एस्पिरेट करें और 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 4 एमएल जोड़ें।
  4. फ्लास्क को 2-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें, और 10x उद्देश्य लेंस के साथ उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अनुयायी कोशिकाओं की जांच करें। सुनिश्चित करें कि मोनोलेयर संवर्धन की सतह से अलग हो गया है।
  5. फ्लास्क में 10% एफबीएस के साथ पूरक कल्चर माध्यम के 4 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिन को रोकें और सावधानीपूर्वक काटी गई कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। सेल निलंबन को 15-एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और सेंट्रीफ्यूज को 300 × ग्राम, 25 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए स्थानांतरित करें।
  6. सेल पेलेट से सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें और 10% एफबीएस और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक प्रीवार्मेड कल्चर माध्यम के 1-2 एमएल के साथ पुन: निलंबित करें।
  7. सेल सस्पेंशन और ट्रिपैन ब्लू में से प्रत्येक को 10 μL मिलाएं और हेमसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। सुनिश्चित करें कि अगले चरण पर जाने से पहले सेल व्यवहार्यता 90% से अधिक है।
  8. बीज 1 ×6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में प्रति 2 एमएल 10 6 कोशिकाएं होती हैं और डीएमई / एफ 12 पूर्ण माध्यम में तब तक बनाए रखती हैं जब तक कि कोशिकाएं 100% संगम तक नहीं पहुंच जाती हैं।
  9. यकृत परिपक्वता के लिए, यकृत परिपक्वता माध्यम तैयार करें (विलियम्स का ई माध्यम 10% एफबीएस, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 μg / mL इंसुलिन, 50 μM हाइड्रोकार्टिसोन, 2 mM L-ग्लूटामाइन, और 2% DMSO के साथ पूरक)।
  10. संस्कृति माध्यम को प्रति सप्ताह 2x प्रतिस्थापित करें।
  11. एचबीवी संक्रमण के लिए तैयार परिपक्व हेपेटोसाइट्स प्राप्त करने के लिए 2 सप्ताह के लिए परिपक्वता माध्यम में हेपेटोसाइट्स को बनाए रखें।

2. सेलुलर एनटीसीपी का परिमाणीकरण

  1. वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करके एनटीसीपी अभिव्यक्ति को मापना
    1. ट्रिप्सिनाइजेशन के माध्यम से परिपक्व हेपेटोसाइट्स की गोली एकत्र करें (चरण 1.2-1.5 देखें)।
    2. DNase I उपचार के साथ एक आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके सेल पेलेट से कुल आरएनए निकालें।
    3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए ऑलिगो-डीटी प्राइमर और रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम का उपयोग करके कुल आरएनए के 200 एनजी से सीडीएनए को संश्लेषित करें।
    4. सीडीएनए को 50 एनजी / μL तक पतला करें और इसे पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग करें। पतला सीडीएनए के 2 μL को पीसीआर मास्टर मिक्स अभिकर्मकों के साथ मिलाएं जिसमें SYBR ग्रीन क्यूआरटी-पीसीआर किट समाधान होता है, जिसमें 5 μM NTCP-विशिष्ट प्राइमर (5'-GGACATGAACCTCCACTGTG-3' और 5'-ATCATAGATCCCCCCCTGGAGTAGAT-3') होते हैं।
    5. सामान्यीकरण के लिए, विशिष्ट प्राइमरों के साथ हाउसकीपिंग जीन के रूप में जीएपीडीएच का उपयोग करें (5'-GAATCCCCCCCCATCCCCCCCC-3' और 5'-AATGAGCCCCCCCCTTC-3')।
    6. निम्नलिखित तापमान स्थितियों के तहत थर्मल साइकिलर का उपयोग करके सीडीएनए नमूनों को बढ़ाएं: 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट का 1 चक्र (प्रारंभिक विकृतीकरण); 95 डिग्री सेल्सियस (विकृतीकरण) पर 30 सेकंड के 40 चक्र, 60 डिग्री सेल्सियस से 65 डिग्री सेल्सियस (एनीलिंग) पर 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस (विस्तार) पर 30 चक्र; 72 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट का 1 चक्र (अंतिम विस्तार)।
    7. जीएपीडीएच का उपयोग करके अपरिभाषित कोशिकाओं पर परिपक्व हेपेटोसाइट्स में एनटीसीपी फोल्ड परिवर्तन की गणना करें।
  2. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग करके NTCP की मात्रा निर्धारित करना
    1. सेल स्क्रैपर का उपयोग करके हेपेटोसाइट्स की कटाई करें और सेल पेलेट को इकट्ठा करने के लिए 5 मिनट के लिए उन्हें 300 x g, 25 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. 1x प्रोटीज अवरोधक युक्त आरआईपीए बफर के 100 μL के साथ सेलुलर प्रोटीन निकालने के लिए RIPA बफर निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    3. बिसिंकोनिक एसिड (बीसीए) विधि का उपयोग करके कुल प्रोटीन एकाग्रता को मापें।
    4. मात्रा के अनुसार 1: 1 के अनुपात में 2x लोडिंग डाई के साथ 12.5 μL प्रोटीन मिलाएं।
    5. प्रोटीन मिश्रण और मानक सीढ़ी को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें।
    6. वैद्युतकणसंचलन कक्ष में 1x रनिंग बफर जोड़ें।
    7. प्रोटीन मानक सीढ़ी के 5 μL या उबले हुए प्रोटीन मिश्रण के 20 μL को 10% (w / v) पॉलीक्रिलामाइड जेल में लोड करें।
    8. जेल वैद्युतकणसंचलन करें: कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 50 वी और 1 घंटे के लिए 90 वी।
    9. इसे मेथनॉल में 30 सेकंड के लिए भिगोकर एक पीवीडीएफ झिल्ली तैयार करें, इसे 1-2 मिनट के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी से धोएं, और इसे 10 मिनट के लिए या उपयोग होने तक ट्रांसफर बफर में फिल्टर पेपर के दो टुकड़ों के साथ भिगोदें।
    10. फ़िल्टर पेपर को अर्ध-शुष्क स्थानांतरण सेल के एनोड प्लेट पर रखें; फिर, पीवीडीएफ झिल्ली, जेल और फिल्टर पेपर को शीर्ष पर रखें, उस क्रम में।
    11. कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए 10 वी पर जेल से पीवीडीएफ झिल्ली में प्रोटीन स्थानांतरित करें।
    12. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए डब्ल्यूबी ब्लॉकिंग समाधान के साथ झिल्ली को अवरुद्ध करें।
    13. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एंटी-सोडियम टॉरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड (एंटी-एनटीसीपी) (1: 100 कमजोर पड़ने) के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
    14. झिल्ली को टीबीएसटी के साथ 3 x 10 मिनट धोएं।
    15. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) -संयुग्मित बकरी एंटी-खरगोश एंटीबॉडी (1: 10,000 कमजोर पड़ने) के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
    16. झिल्ली को 3 x 10 मिनट टीबीएसटी से धोएं और फिर टीबीएस के साथ 1 x 5 मिनट।
    17. एचआरपी सब्सट्रेट का उपयोग करके एनटीसीपी का पता लगाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
    18. झिल्ली के कम से कम 0.1 एमएल एचआरपी सब्सट्रेट समाधान / सेमी2 जोड़ें और अंधेरे में 3-5 मिनट के लिए झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
    19. केमिल्यूमिनेसेंस मोड में जेल डॉक्यूमेंटेशन सिस्टम का उपयोग करके एनटीसीपी की कल्पना करें, झिल्ली के लिए मार्कर विकल्प का चयन करें, हर 1 मिनट में संचयी मोड के साथ एक्सपोज़र समय समायोजित करें, और 5 मिनट के लिए विभिन्न एक्सपोज़र समय के साथ फोटो लें।
    20. माउस एंटी-जीएपीडीएच एंटीबॉडी (1: 200,000 कमजोर पड़ने) और एचआरपी-संयुग्मित बकरी एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी (1: 10,000 कमजोर पड़ने) के साथ धब्बा को स्ट्रिप और जांचें।
  3. फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके एनटीसीपी स्तर को मापना
    1. परिपक्व हेपेटोसाइट्स के सेल छर्रों को 15 मिनट के लिए 8 एमएम ईडीटीए के साथ जोड़कर एकत्र करें।
      नोट: ट्रिप्सिन या अन्य प्रोटीज का उपयोग करने से बचें जो सेल सतह रिसेप्टर्स को बाधित कर सकते हैं। चूंकि एनटीसीपी एक सेल सतह रिसेप्टर प्रोटीन है, ट्रिप्सिनाइजेशन के कारण क्षति नकारात्मक परिणाम दे सकती है।
    2. हेपेटोसाइट्स को 15 मिनट के लिए 1x PBS में 3.7% पैराफॉर्मलडिहाइड के 300 μL के साथ ठीक करें। सेल निलंबन को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और सेंट्रीफ्यूज को 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम, 25 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
    3. कोशिकाओं को 1% एफबीएस (v/v) के साथ 1x PBS के 700° L के साथ 2x धोएं, 300 × ग्राम, 25 °C पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, सेल गोली में पीबीएस में 0.05% ट्राइटन X-100 का 300 μL जोड़ें, और कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें ताकि उन्हें स्थिर किया जा सके।
    4. सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम, 25 डिग्री सेल्सियस पर, सेल पेलेट को 3 x 1 मिनट के लिए 700 μL PBS के साथ धोएं जिसमें 1% FBS (v / v) हो। एनटीसीपी (1: 100 कमजोर पड़ने) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। वॉश बफर के साथ कोशिकाओं को 3 x 1 मिनट धोएं और सेंट्रीफ्यूज को 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम, 25 डिग्री सेल्सियस पर धोएं।
    5. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एलेक्सा फ्लोर 488 से संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को दाग दें। वॉश बफर के साथ कोशिकाओं को 3 x 1 मिनट धोएं और सेंट्रीफ्यूज को 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम, 25 डिग्री सेल्सियस पर धोएं। सेल पेलेट को 1% एफबीएस (वी / वी) के साथ पीबीएस के 200 μL के साथ पुन: निलंबित करें।
    6. प्रवाह साइटोमीटर चालू करें, 15 मिनट के लिए लेजर को गर्म करें, और नियमित सफाई करें।
    7. फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी), साइड स्कैटर (एसएससी), और फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) या फाइकोएरिथ्रिन (पीई) सहित माप मापदंडों का चयन करें, और सॉफ्टवेयर द्वारा ऑटो मुआवजा समायोजन सेट करें। मुआवजा नियंत्रण नमूने शामिल करें: बिना दाग वाले नियंत्रण, एफआईटीसी-दाग नियंत्रण, और पीई-दाग नियंत्रण।
      नोट: एफएससी और एसएससी मापदंडों का उपयोग गेटिंग विश्लेषण के लिए सेल आबादी का चयन करने के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं के आकार और ग्रैन्यूलैरिटी को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। फ्लोरेसेंस चैनल डिटेक्टर में एफआईटीसी और पीई चैनल होते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए, एलेक्सा फ्लूर 488 का पता लगाने के लिए FITC चैनल का चयन करें।
    8. मध्यम द्रव प्रवाह दर (60 μL / min) के साथ बिना दाग वाले नमूने को चलाएं, एफएससी और एसएससी की सीमा को समायोजित करें जब तक कि वे रुचि की सेल आबादी को कवर न करें, इस क्षेत्र में गेट क्षेत्र को चिह्नित करें, और सभी मुआवजा नियंत्रणों पर लागू हों।
    9. बिना दाग वाले नियंत्रण का उपयोग करके फ्लोरेसेंस फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) सेट करें, और नकारात्मक क्वाड्रंट में एफआईटीसी या पीई के पीएमटी वोल्टेज को समायोजित करें। सकारात्मक दाग वाले नमूने को चलाएं और सकारात्मक क्वाड्रंट पैमाने में एफआईटीसी या पीई समायोजित करें। बिना दाग वाले, एफआईटीसी-दाग वाले, या पीई-दाग वाले नियंत्रण चलाएं, मुआवजे की गणना करें, और इसे नमूना सेटिंग्स पर लागू करें। एनटीसीपी स्तर को मापने के लिए हेपेटोसाइट नमूना चलाएं।
    10. प्रवाह साइटोमीटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके दाग वाले हेपेटोसाइट्स का विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      1. BD FACSuite Windows के अंतर्गत, डेटा स्रोत टैब में नियंत्रण ट्यूब पर क्लिक करें और कच्चे डेटा के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें.
      2. दाईं ओर वर्कशीट टैब में, एलिप्स गेट बटन पर क्लिक करें, माउस कर्सर का उपयोग करके एसएससी और एफएससी डॉट प्लॉट में सेल आबादी का चयन करें, और सर्कल पी 1 के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें।
      3. इंटरवल गेट बटन पर क्लिक करें और एफआईटीसी हिस्टोग्राम में क्षेत्र को चिह्नित करें, जो उच्चतम प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्य से दाईं ओर शुरू होता है। दिखाई देने वाली पंक्ति P2 का निरीक्षण करें।
      4. प्रयोग ट्यूब पर क्लिक करें और देखें कि कार्यपत्रक टैब में डेटा बदलता है। सांख्यिकी बटन पर क्लिक करें और फिर कार्यपत्रक में रिक्त स्थान पर क्लिक करें। दिखाई देने वाली NTCP आबादी के सांख्यिकीय मूल्यों का निरीक्षण करें।

3. सेल संस्कृति-व्युत्पन्न एचबीवी कणों (एचबीवीसीसी) का उत्पादन

  1. 24 घंटे के लिए 10 सेमी पेट्री डिश में पूर्ण माध्यम में कल्चर हेपजी 2.2.15 (डीएमईएम 10% एफबीएस, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक)।
  2. जब हेपजी 2.2.15 60% -70% संगम तक पहुंचता है, तो पूर्ण माध्यम को 380 μg / mL जेनेटिकिन (G418) के साथ पूरक करें। हर 2 दिनों में वातानुकूलित माध्यम की कटाई करें; एचबीवी युक्त माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. 20 मिनट के लिए 5,000 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरने वाले को सेंट्रीफ्यूज करके सेल मलबे को हटा दें। 20 एमएल सिरिंज का उपयोग करके वातानुकूलित माध्यम एकत्र करें और सेल मलबे को हटाने के लिए इसे 0.45 μm कम-प्रोटीन-बाइंडिंग फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  4. एचबीवी पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में चरण 3.3 से फ़िल्टर किए गए सुपरनैटेंट के 3 वॉल्यूम के साथ कंसंट्रेटर के 1 वॉल्यूम को पतला करें और ट्यूब व्युत्क्रमण द्वारा समाधान को सावधानीपूर्वक मिलाएं। मिश्रण को 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। 1,500 × ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए घोल को सेंट्रीफ्यूज करें और सुनिश्चित करें कि एक ऑफ-व्हाइट गोली दिखाई दे।
    नोट: चरण 3.3 से फ़िल्टर किए गए सुपरनैटेंट के प्रत्येक 30 एमएल के लिए, कुल मात्रा के 40 एमएल तक पहुंचने के लिए 10 एमएल कंसंट्रेटर जोड़ें।
  5. पूर्ण वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करके एचबीवी 1.3-मेर डब्ल्यूटी रिप्लिकॉन × के साथ एचबीवी टिटर (जीनोम समकक्ष) का मूल्यांकन 1 से 102 से 1 × 1010 तक के मानक वक्र के रूप में करें, जैसा कि पहले11 वर्णित है।
  6. धीरे से एफबीएस में गोली का पुनर्गठन करें और एकल-उपयोग एलिकोट में -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 वर्ष तक स्टोर करें।

4. एंटी-एचबीवी प्रवेश परख

  1. परिपक्वता माध्यम में 6-वेल प्लेटों में 100% कंफ्लुएंट आईएमएचसी या हेपाआरजी बनाए रखें (विलियम्स के ई माध्यम में 2% डीएमएसओ, 10% एफबीएस, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5μg / mL इंसुलिन, 50 μM हाइड्रोकार्टिसोन, और 2 mM L-Glutamine) 2 सप्ताह के लिए और प्रति सप्ताह मध्यम 2x बदलें।
  2. माध्यम को एस्पिरेट करें, फिर 2 घंटे के लिए विलियम के ई माध्यम से पतला कर्क्यूमिन (10-30 μM) या 4 μM साइक्लोस्पोरिन ए (सीएसए) जोड़ें। उम्मीदवार एचबीवी प्रवेश अवरोधक को एस्पिरेट करें और इसे विलियम के ई माध्यम के 1 एमएल के साथ बदलें जिसमें 4% पॉलीथीन ग्लाइकोल होता है।
  3. 100 प्रति कुएं के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर कल्चर माध्यम में एचबीवी कणों को जोड़ें और 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सतह पर तैरने वाला छोड़ दें, 2 मिलीलीटर ठंडा पीबीएस जोड़ें, और अनबाउंड एचबीवी के साथ पुराने माध्यम से कुल्ला करने के लिए धीरे से घुमाएं।
  4. 7 दिनों के लिए पूर्ण विलियम ई माध्यम और संस्कृति के 2 एमएल जोड़ें। माध्यम को एस्पिरेट करें, कोशिकाओं को 1x PBS के साथ धोएं, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए PBS में 3.7% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। आईएफ ब्लॉकिंग समाधान (पीबीएस में 0.2% ट्राइटन एक्स -100 और 3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन) के साथ संक्रमित कोशिकाओं को परमेबिलाइज और ब्लॉक करें और उन्हें कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. ब्लॉकिंग समाधान में 1:200 कमजोर पड़ने पर प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-एचबीवी कोर एंटीजन) जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को धोने के घोल के साथ 3 x 1 मिनट धोएं (पीबीएस में 0.5% ट्वीन 20)।
  6. आईएफ ब्लॉकिंग समाधान में द्वितीयक एंटीबॉडी (1: 500 कमजोर पड़ने) जोड़ें, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, और धोने के घोल के साथ कोशिकाओं को 3 x 1 मिनट धोएं।
  7. नमूने को 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) के साथ एंटीफेड माउंटिंग माध्यम के साथ माउंट करें, और ग्लास कवरस्लिप के साथ कवर करें। एक DAPI फ़िल्टर (Ex 352-402 nM और Em 417-477) और एक PE फ़िल्टर (Ex 542-582 और Em 604-644) से लैस फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाएं, साथ ही 20x उद्देश्य लेंस के साथ, और उम्मीदवार यौगिकों की एंटी-एचबीवी प्रवेश गतिविधि निर्धारित करें।

5. एचबीवी-सेल बाइंडिंग परख

  1. परिपक्वता माध्यम में 6-वेल प्लेटों में 100% कंफ्लुएंट आईएमएचसी या हेपाआरजी बनाए रखें (विलियम्स के ई माध्यम में 2% डीएमएसओ, 10% एफबीएस, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5μg / mL इंसुलिन, 50 μM हाइड्रोकार्टिसोन, और 2 mM L-Glutamine) 2 सप्ताह के लिए और प्रति सप्ताह मध्यम 2x बदलें।
  2. माध्यम को एस्पिरेट करें, फिर 2 घंटे के लिए विलियम के ई माध्यम में पतला कर्क्यूमिन (10-30 μM) या साइक्लोस्पोरिन ए (4 μM) जोड़ें। एचबीवी प्रवेश अवरोधक को एस्पिरेट करें और इसे विलियम के ई माध्यम के 1 एमएल के साथ बदलें जिसमें 4% पॉलीथीन ग्लाइकोल होता है।
  3. 100 प्रति कुएं के एमओआई पर कल्चर माध्यम में एचबीवी कणों को जोड़ें और हेपेटोसाइट्स को एचबीवी बाइंडिंग की अनुमति देने के लिए 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अनबाउंड एचबीवी युक्त माध्यम को छोड़ दें, 2 एमएल ठंडा पीबीएस जोड़ें, और खर्च किए गए माध्यम के निशान को हटाने के लिए धीरे से घुमाएं।
  4. सेल स्क्रैपर का उपयोग करके संक्रमित कोशिकाओं को काटें और लाइसिस बफर के साथ कोशिकाओं को बाधित करें। लाइसेट को एक संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें और एचबीवी (फॉरवर्ड प्राइमर: 5'- जीटीटी जीसीसी सीजीटीटीटी टीसीसी टीसीसी टीसीटी एटीएटीसी -3', और रिवर्स प्राइमर: 5'- जीजीए जीजीजी एटीएटीए कैट एजीए जीजीटी टीसीसी टीटीजी ए -3' ) के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करके एचबीवी डीएनए का मूल्यांकन करने के लिए कुल डीएनए निकालें।
  5. चरण 2.1 में वर्णित तापमान स्थितियों का उपयोग करके थर्मल साइक्लर में पीसीआर उत्पादों को बढ़ाएं।
  6. उपचार बनाम नियंत्रण में सापेक्ष एचबीवी डीएनए स्तर /1 × 106 कोशिकाओं की गणना करें, जिसमें 2-1सीटी विधि के आधार पर कैलिब्रेटर जीन के रूप में पीआरएनपी का उपयोग किया जाता है।

6. टौरोकोलिक एसिड (टीसीए) अपटेक परख

  1. 14 दिनों के लिए परिपक्वता माध्यम में 100% कंफ्लुएंट आईएमएचसी और हेपएआरजी कोशिकाओं को बनाए रखें।
  2. माध्यम को एस्पिरेट करें और हेपेटोसाइट्स को 1x PBS के साथ धो लें। 2 घंटे के लिए विलियम के ई माध्यम में पतला कर्क्यूमिन या साइक्लोस्पोरिन ए (10-50 μM) जोड़ें। माध्यम को सोडियम टॉरोकोलिक एसिड समाधान (1x HEPES में 0.5 M सोडियम टॉरोकोलेट हाइड्रेट) के साथ बदलें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. सोडियम टॉरोकोलिक एसिड समाधान को एस्पिरेट करें, और ठंडे 1x HEPES के साथ 3x धो लें। ठंडा 1x HEPES के 300-500 μL जोड़ें और बर्फ पर सेल स्क्रैपर के साथ कोशिकाओं की कटाई करें।
  4. 20 सेकंड के लिए 20 kHz की आवृत्ति पर अल्ट्रासोनिकेशन द्वारा कोशिकाओं को समरूप करें और 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। सेल मलबे को अवक्षेपित करने के लिए 20 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर लाइसेट को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट एकत्र करें और टीसीए एलिसा परख किट का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर टॉरोकोलिक एसिड एकाग्रता का मूल्यांकन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

7. आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री का उपयोग करके प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन का निर्धारण

नोट: इस परख प्रणाली माइक्रोकैल PEAQ-ITC (ITC सॉफ्टवेयर) के आधार पर विकसित किया गया था।

  1. बफर तैयार करें (50 mM Tris-HCl बफर, pH 7.0)।
  2. बफर में 15 μM NTCP तैयार करें।
  3. बफर में 150 μM उम्मीदवार HBV प्रवेश अवरोधक समाधान तैयार करें।
  4. बफर (चरण 7.1.) का उपयोग करके आईटीसी उपकरण में नमूना सेल, संदर्भ सेल और सिरिंज को धोएं।
    1. विंडोज सिस्टम में सॉफ्टवेयर आइकन पर डबल-क्लिक करके आईटीसी सॉफ्टवेयर लॉन्च करें। रन प्रयोग हाइलाइट टैब के तहत, 19 Injection.itcm के लिए माइक्रोकैल विधि का चयन करें, और ओपन पर क्लिक करें। जब कोई नई विंडो खुलती है, तो क्लीन टैब पर क्लिक करें, और सफाई विधि विंडो में, सेल सफाई विधि के लिए वॉश बटन और सिरिंज सफाई विधि के लिए कुल्ला बटन का चयन करें। अगला पर क्लिक करें और ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें।
      नोट: धोने के चरण को पूरा होने में 1.4 घंटे लग सकते हैं।
  5. नमूना को आईटीसी में लोड करें; प्रयोग चलाएँ टैब के अंतर्गत, लोड बटन पर क्लिक करें, और ऑन-स्क्रीन निर्देश पढ़ें. अगला पर क्लिक करें और इस लोडिंग चरण के पूरा होने तक वीडियो निर्देशों का पालन करें।
    1. सिरिंज का उपयोग करके समाधान बफर के साथ संदर्भ सेल भरें। एक सिरिंज का उपयोग करके बफर में 15 μM NTCP के साथ नमूना सेल भरें और नमूना सेल पर अतिरिक्त NTCP समाधान को हटा दें। सिरिंज में हवा के बुलबुले से बचते हुए, कर्क्यूमिन (लिगैंड) के 150 μM घोल के साथ सिरिंज भरें।
  6. नमूना चलाएँ, और प्रयोग चलाएँ टैब के तहत, रन बटन पर क्लिक करें। प्रयोगात्मक जानकारी और प्रयोगात्मक सेटिंग दिखाने वाली बाईं ओर की खिड़कियों का निरीक्षण करें। लिगैंड और प्रोटीन सांद्रता को [Syr] में 150 μM, [सेल] में 15 μM और तापमान में 25 °C के रूप में दर्ज करें।
  7. सॉफ्टवेयर में, इंजेक्शन प्रक्रिया करने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें और प्रोटीन-लिगैंड इंटरैक्शन पूरा होने के लिए 1.4 घंटे तक प्रतीक्षा करें।
    नोट: फीका विश्लेषण बटन सॉफ़्टवेयर विंडो के तहत प्रकट होता है।
  8. ध्यान दें कि इंजेक्शन पूरा होने के बाद विश्लेषण बटन उज्ज्वल हो जाता है। विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कच्चे डेटा का विश्लेषण करने के लिए नियंत्रण सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण बटन पर क्लिक करें। कच्चे डेटा को प्रदर्शित करने के लिए अवलोकन पर क्लिक करें और बाइंडिंग साइट के एक सेट के रूप में फिटिंग मॉडल चुनें।
  9. सुनिश्चित करें कि बाइंडिंग स्थिति प्रयोगात्मक डेटा (बाइंडिंग, कोई बाइंडिंग, नियंत्रण, या चेक डेटा) दिखाती है और यह कि प्रयोग मान (केडी, एजी, एएच, टीओएस, और एन) सॉफ्टवेयर पैनल पर प्रस्तुत किए जाते हैं।
  10. थर्मोडायनामिक मापदंडों को निर्यात करें जो हाइड्रोजन बॉन्ड, वैन डेर वाल्स बॉन्ड और हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन सहित इंटरैक्शन बाइंडिंग की भविष्यवाणी करते हैं।
  11. प्रयोग पूरा होने के बाद, चरण 7.4 के बाद नमूना सेल धो लें।

8. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. सभी प्रयोगों को तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियों (एन = 3) में निष्पादित करें।
  2. एसडी ± साधन के रूप में प्रयोगात्मक डेटा प्रस्तुत करें, और वांछित सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
  3. दो माध्य मानों के बीच तुलना करने के लिए दो-पूंछ वाले अप्रकाशित छात्रों के टी-टेस्ट का उपयोग करें या नियंत्रण मूल्य के लिए कई मूल्यों के बीच कई तुलनाओं के लिए डंनेट के साथ विचरण का एक-तरफ़ा विश्लेषण (एनोवा) लागू करें। p ≤ 0.05 पर महत्व स्तर सेट करें।

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Representative Results

हेपेटिक परिपक्वता विशेषताओं को देखा गया, जिसमें द्विराष्ट्रीय कोशिकाएं और बहुभुज आकार की आकृति विज्ञान (चित्रा 1) शामिल हैं, विशेष रूप से आईएमएचसी (चित्रा 1 ए) के विभेदित चरण में। एनटीसीपी अभिव्यक्ति में एक बड़ी वृद्धि को डी-हेपएआरजी और डी-आईएमएचसी में क्रमशः 7 गुना और 40 गुना मापा गया था (चित्रा 1 बी)। एनटीसीपी का अत्यधिक ग्लाइकोसिलेटेड रूप, जिसे एचबीवी प्रवेश के लिए संवेदनशीलता प्रदान करने के लिए माना जाता है, डी-हेपएआरजी (चित्रा 1 सी) की तुलना में डी-आईएमएचसी में अधिक पाया गया था। विभेदित आईएमएचसी में अविभाजित कोशिकाओं की तुलना में 65.9% अधिक एनटीसीपी स्तर थे (चित्रा 1 डी)।

चित्रा 2 ए रोगनिरोधी उपचार का सारांश दिखाता है। चित्रा 2 बी एचबीवी इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग को दिखाता है जो संक्रमण के बाद 7 वें दिन एंटी-एचबीवी प्रवेश गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है, जबकि चित्रा 2 सी एचबीवी बाध्यकारी परख प्रोटोकॉल को रेखांकित करता है। सेल सतह रिसेप्टर पर एचबीवी बाइंडिंग के स्तर का मूल्यांकन वास्तविक समय पीसीआर (चित्रा 2 डी) द्वारा किया गया था। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एनटीसीपी एचबीवी अनुलग्नक के लिए रिसेप्टर था, टीसीए अपटेक उम्मीदवार बाइंडिंग इनहिबिटर (चित्रा 2 ई) के लिए निर्धारित किया गया था। इस मॉडल के आधार पर, उम्मीदवार यौगिकों की कथित निरोधात्मक गतिविधि ने एनटीसीपी के माध्यम से एचबीवी बाइंडिंग को कम कर दिया।

नमूना सेल में निरंतर इंजेक्शन के साथ कैलोरीमेट्रिक परिवर्तन का पता लगाया गया था (चित्रा 3)। डेटा के लिए अच्छी तरह से फिट की गई एक बाइंडिंग साइट के आधार पर एक मानक गैर-रैखिक कम से कम वर्ग प्रतिगमन प्लॉट किया गया था। ठोस रेखा ने प्रयोगात्मक मूल्यों (चित्रा 3 ए, बी) के लिए सबसे अच्छा फिट संकेत दिया। तालिका 1 थर्मोडायनामिक मापदंडों को साइक्लोस्पोरिन ए (सीएसए) या उम्मीदवार यौगिक के साथ एनटीसीपी के बंधन के साथ सहसंबद्ध दिखाती है।

Figure 1
चित्रा 1: एनटीसीपी लक्षण वर्णन के साथ हेपरग और आईएमएचसी की हेपेटिक परिपक्वता। दोनों सेल लाइनों को 2 सप्ताह के लिए यकृत परिपक्वता माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था। (ए) हेपेटोसाइट विशेषताओं जैसे कि द्विराष्ट्रीय कोशिकाओं और बहुभुज आकार की आकृति विज्ञान को विशेष रूप से आईएमएचसी के परिपक्वता चरण में देखा गया था। स्केल सलाखों = 50 μm. (B) NTCP की अभिव्यक्ति HepaRG और IMHC दोनों में विनियमित थी। जीएपीडीएच के साथ सामान्यीकृत एनटीसीपी हेपरग की तुलना में आईएमएचसी में अधिक था। (ग) परिपक्वता के बाद एनटीसीपी का एक अत्यधिक ग्लाइकोसिलेटेड रूप देखा गया था। (घ) डी-आईएमएचसी में एनटीसीपी उन्नयन के प्रतिशत का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके किया गया था। डेटा को एसडी ± के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। *, **, और *** क्रमशः पी < 0.05, पी < 0.01 और पी < 0.001 के साथ सांख्यिकीय अंतर का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षेप: एनटीसीपी = सोडियम टॉरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड; जीएपीडीएच = ग्लिसराल्डिहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज; NTCP-FITC = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट-लेबल NTCP। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: रोगनिरोधी सीसीएम उपचार ने वायरल प्रविष्टि, इंट्रासेल्युलर एचबीवी डीएनए और टीसीए अपटेक गतिविधि को कम कर दिया। (ए) डी-आईएमएचसी को एचबीवी के साथ टीकाकरण से पहले 2 घंटे के लिए सीसीएम के साथ इलाज किया गया था। (बी) संक्रमण के बाद 7 वें दिन इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा एंटी-एचबीवी प्रवेश गतिविधि निर्धारित की गई थी। (सी) एचबीवी बाइंडिंग प्रोटोकॉल की एक योजनाबद्ध अनुसूची प्रस्तुत की गई है। (घ) हेपेटोसाइट्स पर बाध्य एचबीवी डीएनए के स्तर का मूल्यांकन किया गया और इसकी तुलना 4 μM CSA और शास्त्रीय HBV प्रवेश अवरोधक 25 इकाइयों/ mL हेपरिन के साथ की गई। (ई) टीसीए अपटेक अवरोध पर 10-30 एसएम सीसीएम के प्रभाव को एनटीसीपी रिसेप्टर के माध्यम से मध्यस्थ किया गया था। संक्षेप: सीसीएम = कर्क्यूमिन; एचबीवी = हेपेटाइटिस बी वायरस; टीसीए = टॉरोकोलिक एसिड; डी-आईएमएचसी = विभेदित आईएमएचसी; सीएसए = साइक्लोस्पोरिन ए; एचपी = हेपरिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: आईटीसी का उपयोग करके व्यक्तिगत अणुओं (सीएसए या उम्मीदवार यौगिक) के लिए एनटीसीपी की आत्मीयता का प्रदर्शन किया गया था। (ए) सीएसए या (बी) कर्क्यूमिन के साथ एनटीसीपी के संयोजन के लिए आईटीसी प्रोफाइल एनटीसीपी समाधान (एनटीसीपी के 15 μM, pH 7.0, 25 डिग्री सेल्सियस) में एक यौगिक (150 μM CSA या उम्मीदवार) के अनुक्रमिक इंजेक्शन से उत्पन्न किया गया था। विभेदक शक्ति (μcal/s) और समय (min) के बीच कैलोरीमेट्रिक कच्चे डेटा को प्लॉट किया गया था। डेटा का विश्लेषण एक-साइट बाइंडिंग मॉडल के आधार पर किया गया था जहां ठोस लाइनों ने सर्वोत्तम-फिट परिणामों का संकेत दिया था। एनटीसीपी समाधान में लिगेंड (सीएसए या कर्क्यूमिन) के इंजेक्शन के दौरान, नमूना सेल में लिगैंड एकाग्रता में वृद्धि के बाद थैलेपी (एएच) बदल गया। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि बाध्यकारी प्रतिक्रिया हुई। संक्षेप: सीएसए = साइक्लोस्पोरिन ए; एनटीसीपी = सोडियम टॉरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड; आईटीसी = आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री; डीपी = विभेदक शक्ति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रोटीन लिगैंड बाइंडिंग स्थिरांक (KD) थैलेपी परिवर्तन (ऍH) एन्ट्रॉपी परिवर्तन (33) गिब्स मुक्त ऊर्जा परिवर्तन (3जी) बाइंडिंग का प्रकार
(एम -1) (kcal/mol) (kcal/mol) (kcal/mol)
मानव NTCP (SLA10A1) CCM 1.21 ×10-6 -1 0.6 -0.39 हाइड्रोजन बांड
मानव NTCP (SLA10A1) TCA 1 ×10-9 80 -96 -16 हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन

तालिका 1: आईटीसी का उपयोग करके एनटीसीपी और व्यक्तिगत यौगिकों (सीसीएम और टीसीए) के बीच बातचीत के परिणामस्वरूप थर्मोडायनामिक पैरामीटर। संक्षेप: एनटीसीपी = सोडियम टॉरोकोलेट कोट्रांसपोर्टिंग पॉलीपेप्टाइड; सीसीएम = कर्क्यूमिन; टीसीए = टॉरोकोलिक एसिड; आईटीसी = आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री।

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Discussion

एचबीवी संक्रमण हेपेटोसाइट्स25 पर हेपरन सल्फेट प्रोटीओग्लाइकेन्स (एचएसपीजी) के लिए कम-आत्मीयता बंधन के माध्यम से शुरू होता है, इसके बाद एंडोसाइटोसिस26 के माध्यम से बाद में आंतरिककरण के साथ एनटीसीपी से बंधन होता है। चूंकि एनटीसीपी एचबीवी प्रवेश के लिए एक महत्वपूर्ण रिसेप्टर है, एचबीवी प्रवेश को लक्षित करने से नए संक्रमण, मां से बच्चे के संचरण (एमटीसीटी) और यकृत प्रत्यारोपण के बाद पुनरावृत्ति को कम करने के लिए चिकित्सकीय रूप से अनुवाद किया जा सकता है। वायरल प्रविष्टि को बाधित करना क्रोनिक एचबीवी संक्रमण के लिए एक व्यवहार्य वैकल्पिक इलाज होगा।

उपर्युक्त प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण चरणों को यहां संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। मेजबान कोशिकाओं को तैयार करते समय, सुनिश्चित करें कि हेपेटोसाइट्स 2% डीएमएसओ के साथ परिपक्वता माध्यम को जोड़ने से पहले 100% कंफ्लुएंसी तक पहुंचते हैं। 2% डीएमएसओ में सबकॉन्फ्लुएंट हेपेटोसाइट्स की खेती करने से कोशिका मृत्यु और अलगाव होगा। परिपक्वता अवधि को एनटीसीपी अभिव्यक्ति27,28 को अधिकतम करने के लिए 4 सप्ताह तक बढ़ाया जा सकता है, हालांकि 2 सप्ताह की परिपक्वता अवधि की सिफारिश की जाती है।

सेलुलर एनटीसीपी अभिव्यक्ति के परिमाणीकरण के लिए तीन तकनीकों का प्रस्ताव किया गया है। यह अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता उस तकनीक का चयन करें जिससे वे सबसे अधिक परिचित हैं; यहां, हमने पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए प्रवाह साइटोमेट्री को प्राथमिकता दी क्योंकि यह सुविधाजनक, त्वरित और आसान है।

सेल कल्चर-व्युत्पन्न एचबीवी कणों (एचबीवीसीसी) के उत्पादन के लिए, हेपजी 2.2.15 को जेनेटिकिन (जी 418) प्रतिरोध जीन29 के साथ एचबीवी पूर्ण लंबाई जीनोम के साथ क्षणिक अभिकर्मक द्वारा हेपजी 2 से प्राप्त किया गया था। कल्चर माध्यम में 380-500 μg / mL जेनेटिकिन होना चाहिए, अन्यथा कोशिकाएं HBVcc का उत्पादन नहीं करेंगी। एचबीवी उपज खोने से बचने के लिए सतह पर तैरने वाले को स्पष्ट करने के लिए कम प्रोटीन-बाइंडिंग, 0.45 μm फ़िल्टर का उपयोग किया जाना चाहिए। एचबीवी पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) का उपयोग मानक सेंट्रीफ्यूज के साथ किया गया था। एचबीवी कणों को सुक्रोज ढाल और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके भी केंद्रित किया जा सकता है। एकाधिक फ्रीज और पिघलना चक्रों से बचा जाना चाहिए क्योंकि संक्रामकता कम हो जाएगी।

एंटी-एचबीवी प्रवेश परख में, परिपक्वता प्रेरण से पहले हेपेटोसाइट्स को 100% संगम तक पहुंचना चाहिए। यह प्रोटोकॉल रोगनिरोधी उपचार के आधार पर विकसित किया गया था। मेजबान कोशिकाओं को एचबीवी12 के साथ संक्रमण से पहले 2 घंटे के लिए उम्मीदवार यौगिकों के संपर्क में लाया गया था। संक्रमण के 7 दिनों के बाद, इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके एचबीवी संक्रामकता का मूल्यांकन किया गया था। सभी घटकों, ब्लॉकिंग समाधान की सांद्रता, प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी, और धोने के चरणों को न्यूनतम गैर-विशिष्ट धुंधलापन के साथ सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यहां, हमने अनुकूलित सांद्रता और तकनीक प्रदान की है।

टीसीए अपटेक परख प्रोटोकॉल एनटीसीपी परिवहन के निषेध के लिए सोने के मानक का वर्णन करता है। हमने रेडियोधर्मी टीसीए से बचने के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित किया। टीसीए अपटेक परख के लिए महत्वपूर्ण कदम सेल धोने और कटाई हैं। यौगिक के आगे सेलुलर गतिविधि-आंतरिककरण को रोकने के लिए इन सभी प्रक्रियाओं को हर समय बर्फ पर किया जाना चाहिए। कोशिकाओं को समरूप बनाने और सेल मलबे को छर्रों को छर्रे मारने के बाद, सतह पर तैरने वाले को गोली को बाधित किए बिना धीरे से एस्पिरेटेड किया जाना चाहिए। यदि उपयोगकर्ता की सुविधा तरल सिंटिलेशन तकनीक के उपयोग की अनुमति देती है, तो 3एच-टॉरोकोलिक एसिड का उपयोग आमतौर पर टीसीए परिवहन और अपटेक अध्ययनों में किया जाता है। जैसा कि हमने एलिसा का उपयोग करके टीसीए अपटेक को मान्य किया, यह वैकल्पिक तकनीक रेडियोधर्मी यौगिक के उपयोग को प्रतिस्थापित कर सकती है।

आईटीसी एक बायोफिज़िकल विधि है जिसका व्यापक रूप से घुलनशील प्रोटीन और छोटे आणविक भार लिगेंड30,31 के बीच बातचीत से जुड़े थर्मोडायनामिक मापदंडों को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग एक छोटे अणु या प्रोटीन के साथ विभिन्न लिगेंड की बातचीत की जांच करने के लिए किया जा सकता है। आईटीसी एक प्रत्यक्ष और गैर-आक्रामक विधि है जिसमें सिग्नल का पता लगाने के लिए कोई अतिरिक्त कदम नहीं है, कोई आणविक भार सीमाएं नहीं हैं, और कोई लेबलिंग, स्थिरीकरण या कोई अन्य रासायनिक संशोधन नहीं है। आईटीसी की सीमा अंतःक्रियात्मक सामग्री की उच्च सांद्रता की शर्त है। प्रोटीन और लिगैंड को अत्यधिक शुद्ध और पानी में पर्याप्त रूप से घुलनशील होना चाहिए (10-100 μM) 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए हिलाने के साथ। अस्थिर प्रोटीन समाधान का पता समय के कार्य के रूप में गर्मी संकेत परिवर्तन के माध्यम से लगाया जा सकता है।

मानव एन्हांस्ड-एनटीसीपी हेपेटोसाइट्स एचबीवी संक्रमण के इन विट्रो अध्ययन के लिए एक वैकल्पिक मॉडल प्रदान करते हैं लेकिन हेपएआरजी और प्राथमिक मानव हेपेटोसाइट्स के समान हैं। ये मेजबान मॉडल उनकी सीमित विश्वसनीयता और संवेदनशीलता 8,33 से बाधित हैं। हेपजी 2-एनटीसीपी या हुह 7-एनटीसीपी कोशिकाओं में अक्षम एचबीवी प्रसार एचबीवीसीसी-उत्पादक कोशिकाओं से प्राप्त कम एचबीवी इनोकुलम द्वारा प्रमाणित किया गया था। कई अध्ययनों में, एचबीवी का उपयोग 1,00033,34 के एमओआई पर लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए किया गया था। एचबीवीसीसी में उपवायरल कणों में एचबीवी लिफाफा प्रोटीन (एल / एम / एस) होता है और प्रतिस्पर्धी रूप से एनटीसीपी को बांधता है, जिसके परिणामस्वरूप संक्रामकता में कमी आतीहै। इस सीमा को दूर करने के लिए, इस प्रोटोकॉल ने एनटीसीपी स्तरों को अधिकतम करने के लिए परिपक्वता प्रोटोकॉल के साथ हेपएआरजी या आईएमएचसी संस्कृति को संशोधित किया। हेपजी 2.2.15 से प्राप्त एचबीवीसीसी को इनोकुलम के रूप में उपयोग किए जाने से पहले केंद्रित किया गया था। एचबीवी कोर एंटीजन11 के माप के आधार पर विभेदित आईएमएचसी में एचबीवी संक्रामकता 80% से अधिक थी।

हमने वायरल प्रविष्टि को बाधित करने के लिए एनटीसीपी को लक्षित करने वाले एंटी-एचबीवी यौगिकों की पहचान का वर्णन किया है और एनटीसीपी स्तर को बढ़ाने के लिए एक यकृत परिपक्वता प्रक्रिया अपनाई है। प्रवेश अवरोधकों की पहचान करने के लिए, हेपेटोसाइट्स को वायरल बाइंडिंग की अनुमति देने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एचबीवी के साथ संक्रमण से पहले 2 घंटे के लिए उम्मीदवार यौगिकों के साथ इलाज किया गया था, लेकिन प्रवेश नहीं। संक्रमण के बाद 7 वें दिन एचबीवी संक्रामकता में कमी का मूल्यांकन किया गया था। प्रतिनिधि डेटा में मॉडल को मान्य करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में साइक्लोस्पोरिन ए, एक शास्त्रीय एनटीसीपी अवरोधक शामिल था।

चूंकि एनटीसीपी ट्रांसपोर्टर- और रिसेप्टर-मध्यस्थता एंडोसाइटोसिस कार्यों दोनों की सुविधा प्रदान करता है, इसलिए एचबीवी प्रवेश अवरोधक इनमें से कम से कम एक तंत्र को लक्षित कर सकते हैं। एनटीसीपी परिवहन के निषेध का मूल्यांकन एलिसा पर आधारित टीसीए अपटेक परख का उपयोग करके किया जा सकता है, जो शास्त्रीय प्रोटोकॉल36 से रेडियोधर्मी टीसीए को समाप्त करता है। एनटीसीपी और प्रवेश अवरोधक के बीच संबंध आईटीसी का उपयोग करके मापा गया था। इस तकनीक ने आवश्यक थर्मोडायनामिक पैरामीटर प्रदान किए, जिसमें स्टोइकोमेट्री (एन), पृथक्करण स्थिरांक (केडी), मुक्त ऊर्जा में परिवर्तन (एजी), थैलेपी (एएच), एन्ट्रॉपी (एएचएस), और बाइंडिंग की गर्मी क्षमता (सीपी) शामिल हैं। आणविक डॉकिंग द्वारा विभिन्न एंटी-एचबीवी एजेंटों की पहचान की गई है, जैसे कि क्वेरसेटिन, रुटिन, हेस्पेरिडिन और ल्यूपेरोल, जो विशेष रूप से एचबीवी रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस को लैमिवुडाइन, एक न्यूक्लियोसाइड एनालॉग के बराबर बांध सकते हैं। यौगिकों की जांच आईटीसी का उपयोग करके की गई और एचबीवी पोलीमरेज़37 के साथ -9.3 से -5.2 किलो कैलोरी / मोल और 1 × 10-6 से 1 × 10-3 एम के केडी तक नकारात्मक गिब ऊर्जा (-एजी) का प्रदर्शन किया गया। एक साथ लिया गया, इन उपरोक्त परखों से प्राप्त डेटा उम्मीदवार यौगिकों की एंटीवायरल प्रभावकारिता को स्क्रीन करने में मदद करेगा जो एचबीवी एंट्री इनहिबिटर के रूप में कार्य करते हैं। स्थापित प्रोटोकॉल नए एनटीसीपी विरोधी / अवरोधकों की खोज के लिए उपयोगी होगा। वायरल प्रविष्टि का दमन रोगनिरोधी और चिकित्सीय उपचार में उपयोगी हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि शोध किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे हितों के संभावित टकराव के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

इस शोध परियोजना को माहिडोल विश्वविद्यालय और थाईलैंड विज्ञान अनुसंधान और नवाचार (टीएसआरआई) द्वारा अलग से ए वोंगकाजोर्नसिल्प और के सा-एनगियाम्सुंटॉर्न को दिया गया है। इस काम को राष्ट्रीय उच्च शिक्षा विज्ञान अनुसंधान और नवाचार नीति परिषद के कार्यालय द्वारा प्रतिस्पर्धा के लिए कार्यक्रम प्रबंधन इकाई (अनुदान संख्या C10F630093) के माध्यम से वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था। वोंगकाजोर्नसिल्प चिकित्सा संकाय सिरिराज अस्पताल, माहिडोल विश्वविद्यालय के चेलेरम्प्राकिट अनुदान के प्राप्तकर्ता हैं। लेखक आईटीसी तकनीक के साथ उनकी सहायता के लिए मिस सविनी सीमाखान (ड्रग डिस्कवरी के लिए उत्कृष्ट केंद्र, विज्ञान संकाय, महिडोल विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell lines
HepaRG Cells, Cryopreserved Thermo Fisher Scientific HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line Merck SCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution FUJIFLIM Wako chemical 163-20145
BD Perm/Wash buffer BD Biosciences 554723 Perm/Wash buffer
Cyclosporin A abcam 59865-13-3
EDTA Invitrogen 15575-038 8 mM
G 418 disulfate salt Merck 108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78425
HEPES Merck 7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits GE Healthcare 25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit GE Healthcare 25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
KAPA SYBR FAST qPCR Kit Kapa Biosystems KK4600
Lenti-X Concentrator Takara bio PT4421-2 concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrate Merck WBLUR0100
Master Mix (2x) Universal Kapa Biosystems KK4600
Nucleospin DNA extraction kit macherey-nagel 1806/003
Phosphate buffered saline Merck P3813
Polyethylene glycol 8000 Merck 25322-68-3
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo scientific P36930
Recombinant NTCP Cloud-Clone RPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x) Merck 20-188
TCA Sigma 345909-26-4
TCA Elisa kit Mybiosource MB2033685
Triton X-100 Merck 9036-19-5
Trypsin-EDTA Gibco 25200072 Dilute to 0.125%
Antibodies
    Anti-NTCP1 antibody Abcam ab131084 1:100 dilution
    Anti-GAPDH antibody Thermo Fisher Scientific AM4300 1:200,000 dilution
   HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody Abcam ab205718 1:10,000 dilution
   HRP goat anti-mouse secondary antibody Abcam ab97023 1:10,000 dilution
   Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11008 1:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     Sodium azide Sigma 199931 Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
      DME/F12 Gibco 12400-024
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
Hepatic maturation medium
      Williams’ E medium Sigma Aldrich W4125-1L
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
      5 µg/mL  Insulin Sigma Aldrich 91077C-100MG
      50 µM hydrocotisone Sigma Aldrich H0888-1g
     2% DMSO PanReac AppliChem A3672-250ml
IF Blocking solution
     1x PBS Gibco 21300-058
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     0.2% Triton X-100 Sigma T8787 Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer Solution Merck 20-188 Final concentration: 1X
     Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 78425 Final concentration: 1X
       Na3VO4 Final concentration: 1 mM
       PMSF Final concentration: 1 mM
       NaF Final concentration: 10 mM
Western blot reagent
     10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Tween 20 Merck 9005-64-5
     1x TBST 0.1% Tween 20
     1x PBS Gibco 21300-058
     Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific A53225
     Polyacrylamide gel Bio-Rad 161-0183
     Ammonium Persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700 Final concentration: 0.05%
    TEMED Bio-Rad 161-0800 Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
    2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Final concentration: 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     5% Skim milk (nonfat dry milk) Bio-Rad 170-6404 Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 14.4 g
     SDS Merck 7910 Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 7.2 g
     Methanol Merck 106009 100 mL
Mild stripping solution 1 L Adjust pH to 2.2
    Glycine Sigma G8898 15 g
     SDS Merck 7910 1 g
     Tween 20 Merck 9005-64-5 10 mL
Equipments
15 mL centrifuge tube Corning 430052
50 mL centrifuge tube Corning 430291
Airstream Class II Esco 2010621 Biological safety cabinet
CelCulture CO2 Incubator Esco 2170002 Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector Bio-Rad 1855196
FACSVerse Flow Cytometer BD Biosciences 651154
Graduated pipettes (10 mL) Jet Biofil GSP010010
Graduated pipettes (5 mL) Jet Biofil GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC Malvern Isothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004 Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paper Bio-Rad 1703932
Omega Lum G Imaging System Aplegen 8418-10-0005
Pipette controller Eppendorf 4430000.018 Easypet 3
PowerPac HC Bio-Rad 1645052 Power supply
PVDF membrane Merck IPVH00010
T-75 cell culture flask Corning 431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 1703940 Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge Esco T1000R Centrifuge with swinging bucket rotar

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