Summary

En kompetent hepatocytmodel, der undersøger hepatitis B-virusindgang gennem natriumtauracholat cotransporterende polypeptid som et terapeutisk mål

Published: May 10, 2022
doi:

Summary

Vi præsenterer en protokol til screening af anti-hepatitis B-virus (HBV) forbindelser rettet mod præ- og postvirale indgangslivscyklusfaser ved hjælp af isotermisk titreringskalorimetri til måling af bindingsaffinitet (KD) med værtsnatriumtaurocholat, der cotransporterer polypeptid. Antiviral effekt blev bestemt gennem undertrykkelse af virale livscyklusmarkører (cccDNA-dannelse, transkription og viral samling).

Abstract

Hepatitis B-virus (HBV) infektion er blevet betragtet som en afgørende risikofaktor for hepatocellulært karcinom. Nuværende behandling kan kun mindske den virale belastning, men ikke resultere i fuldstændig remission. En effektiv hepatocytmodel for HBV-infektion ville tilbyde en virkelighedstro viral livscyklus, der ville være afgørende for screening af terapeutiske midler. De fleste tilgængelige anti-HBV-midler er målrettet mod livscyklusfaser efter viral indgang, men ikke før viral indgang. Denne protokol beskriver genereringen af en kompetent hepatocytmodel, der er i stand til at screene for terapeutiske midler rettet mod prævirale indtræden og efter viral indgangslivscyklusfaser. Dette inkluderer målretning af natriumtaurocholat, der cotransporterer polypeptid (NTCP) binding, cccDNA-dannelse, transkription og viral samling baseret på imHC eller HepaRG som værtsceller. Her anvendte HBV-indgangshæmningsanalysen curcumin til at hæmme HBV-bindings- og transportfunktioner via NTCP. Inhibitorerne blev evalueret for bindingsaffinitet (KD) med NTCP ved hjælp af isotermisk titreringskalorimetri (ITC) – et universelt værktøj til HBV-lægemiddelscreening baseret på termodynamiske parametre.

Introduction

Hepatitis B-virus (HBV) infektion betragtes som en livstruende sygdom over hele verden. Kronisk HBV-infektion er belastet med risiko for levercirrhose og hepatocellulært karcinom1. Nuværende anti-HBV-behandling fokuserer mest på post viral indgang ved hjælp af nukleoer (t) id-analoger (NA’er) og interferon-alfa (IFN-α)2,3. Opdagelsen af en HBV-indgangshæmmer, Myrcludex B, har identificeret et nyt mål for anti-HBV-midler4. Kombinationen af indgangshæmmere og NA’er i kronisk HBV har signifikant mindsket den virale belastning sammenlignet med dem, der er målrettet mod viral replikation alene 5,6. Den klassiske hepatocytmodel til screening af HBV-indgangshæmmere er imidlertid begrænset af lave virale receptorniveauer (natriumtaurocholat, der cotransporterer polypeptid, NTCP). Overekspressionen af hNTCP i hepatomceller (dvs. HepG2 og Huh7) forbedrer HBV-infektivitet 7,8. Ikke desto mindre udtrykker disse cellelinjer lave niveauer af fase I og II lægemiddelmetaboliserende enzymer og udviser genetisk ustabilitet9. Hepatocytmodeller, der kan hjælpe med at målrette forskellige mekanismer for kandidatanti-HBV-forbindelser, såsom præviral indtræden, NTCP-binding og viral indgang, vil fremskynde identifikation og udvikling af effektive kombinationsregimer. Undersøgelsen for anti-HBV-aktivitet af curcumin har belyst inhiberingen af viral indgang som en ny mekanisme ud over afbrydelse efter viral indrejse. Denne protokol beskriver en værtsmodel til screening af anti-HBV-indgangsmolekyler10.

Målet med denne metode er at udforske kandidat anti-HBV-forbindelser til viral indgangshæmning, især blokering af NTCP-binding og transport. Da NTCP-ekspression er en kritisk faktor for HBV-indgang og infektion, optimerede vi hepatocytmodningsprotokollen for at maksimere NTCP-niveauer11. Derudover kan denne protokol differentiere den hæmmende virkning på HBV-indgang som hæmning af HBV-vedhæftning versus hæmning af internalisering. Analysen af optagelsen af taurocholsyre (TCA) blev også modificeret ved hjælp af en ELISA-baseret metode i stedet for en radioisotop til at repræsentere NTCP-transport12,13. Receptoren og ligandinteraktionen blev bekræftet af deres 3D-strukturer14,15. Hæmningen af NTCP-funktionen kan evalueres ved at måle TCA-optagelsesaktivitet16. Denne teknik gav imidlertid ikke direkte bevis for, at NTCP var bindende for kandidathæmmerne. Derfor kan bindingen undersøges ved hjælp af forskellige teknikker, såsom overfladeplasmonresonans17, ELISA, fluorescensbaseret termisk skiftassay (FTSA)18, FRET19, AlphaScreen og forskellige andre metoder20. Blandt disse teknikker er ITC en målstandard inden for bindende analyse, fordi den kan observere varmeabsorption eller emission i næsten enhver reaktion21. Bindingsaffiniteten (KD) af NTCP og kandidatforbindelser blev direkte evalueret ved hjælp af ITC; Disse affinitetsværdier var mere præcise end dem, der blev opnået ved hjælp af In Silico-forudsigelsesmodel 22.

Denne protokol dækker teknikker til hepatocytmodning, HBV-infektion og screening for HBV-indgangshæmmer. Kort fortalt blev der udviklet en hepatocytmodel baseret på imHC- og HepaRG-cellelinjer. De dyrkede celler blev differentieret til modne hepatocytter inden for 2 uger. Opreguleringen af NTCP-niveauer blev detekteret ved hjælp af realtids PCR, western blotte og flowcytometri11. Hepatitis B virion (HBVcc) blev produceret og indsamlet fra HepG2.2.15. Den differentierede imHC eller HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) blev profylaktisk behandlet med anti-HBV-kandidaterne 2 timer før podningen med HBV-virion. Det forventede resultat af eksperimentet var identifikationen af de midler, der reducerer cellulær HBV og infektivitet. Anti-NTCP-aktivitet blev evalueret ved hjælp af TCA-optagelsesanalysen. NTCP-aktivitet kunne undertrykkes af de agenter, der specifikt bandt NTCP. ITC-teknikken blev anvendt til at undersøge muligheden for interaktiv binding, der kunne forudsige hæmmere og deres målproteiner, bestemme bindingsaffiniteten (KD) af liganden for receptoren via ikke-kovalente interaktioner af det biomolekylære kompleks23,24. For eksempel repræsenterer K D ≥ 1 × 103 mM svag binding, K D ≥ 1 × 106 μM repræsenterer moderat binding, og K D ≤ 1 × 109 nM repræsenterer stærk binding. ΔG er direkte korreleret med bindingsinteraktioner. Især er en reaktion med negativ ΔG en exergonisk reaktion, hvilket indikerer, at binding er en spontan proces. En reaktion med en negativ ΔH indikerer, at bindingsprocesserne afhænger af hydrogenbinding og Van der Waals-kræfter. Både TCA-optagelse og ITC-data kan bruges til at screene for anti-HBV-indgangsmidler. Resultaterne af disse protokoller kan danne grundlag for ikke kun anti-HBV-screening, men også interaktionen med NTCP som vurderet gennem bindende affinitet og transportfunktion. Dette papir beskriver værtscelleforberedelse og karakterisering, eksperimentelt design og evaluering af anti-HBV-posten sammen med NTCP-bindingsaffiniteten.

Protocol

BEMÆRK: Følgende procedurer skal udføres i en klasse II biologisk farestrømningshætte eller en laminar-flow hætte. Håndteringen af HBV blev etisk godkendt af IRB (MURA2020/1545). Se materialetabellen for at få flere oplysninger om alle løsninger, reagenser, udstyr og cellelinjer, der anvendes i denne protokol. 1. Forberedelse af værtsceller (modne hepatocytter) Kultur hepatocytter (3,75 × 105 celler HepaRG eller imHC) og opretho…

Representative Results

Hepatiske modningsfunktioner blev observeret, herunder binukleerede celler og polygonalformet morfologi (figur 1), især i det differentierede stadium af imHC (figur 1A). En stor stigning i NTCP-ekspression blev målt i d-HepaRG og d-imHC ved henholdsvis 7 gange og 40 gange (figur 1B). Den stærkt glykosylerede form af NTCP, postuleret for at give modtagelighed for HBV-indgang, blev påvist mere i d-imHC end i d-HepaRG (<strong clas…

Discussion

HBV-infektion initieres via binding med lav affinitet til heparansulfatproteoglycaner (HSPG’er) på hepatocytter25 efterfulgt af bindingen til NTCP med efterfølgende internalisering gennem endocytose26. Da NTCP er en afgørende receptor for HBV-indgang, kan målretning af HBV-indgang klinisk oversættes til at mindske de novo-infektion , mor-til-barn-transmission (MTCT) og gentagelse efter levertransplantation. Afbrydelse af viral indrejse ville være en mulig alt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette forskningsprojekt støttes af Mahidol University og Thailand Science Research and Innovation (TSRI) separat tildelt A. Wongkajornsilp og K. Sa-ngiamsuntorn. Dette arbejde blev økonomisk støttet af Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council gennem Program Management Unit for Competitiveness (tilskudsnummer C10F630093). A. Wongkajornsilp er modtager af et Chalermprakiat-stipendium fra Det Medicinske Fakultet Siriraj Hospital, Mahidol University. Forfatterne vil gerne takke Miss Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Det Naturvidenskabelige Fakultet, Mahidol University) for hendes hjælp med ITC-teknikken.

Materials

Cell lines
HepaRG Cells, Cryopreserved Thermo Fisher Scientific HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line Merck SCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution FUJIFLIM Wako chemical 163-20145
BD Perm/Wash buffer BD Biosciences 554723 Perm/Wash buffer
Cyclosporin A abcam 59865-13-3
EDTA Invitrogen 15575-038 8 mM
G 418 disulfate salt Merck 108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78425
HEPES Merck 7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits GE Healthcare 25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit GE Healthcare 25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
KAPA SYBR FAST qPCR Kit Kapa Biosystems KK4600
Lenti-X Concentrator Takara bio PT4421-2 concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrate Merck WBLUR0100
Master Mix (2x) Universal Kapa Biosystems KK4600
Nucleospin DNA extraction kit macherey-nagel 1806/003
Phosphate buffered saline Merck P3813
Polyethylene glycol 8000 Merck 25322-68-3
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo scientific P36930
Recombinant NTCP Cloud-Clone RPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x) Merck 20-188
TCA Sigma 345909-26-4
TCA Elisa kit Mybiosource MB2033685
Triton X-100 Merck 9036-19-5
Trypsin-EDTA Gibco 25200072 Dilute to 0.125%
Antibodies
    Anti-NTCP1 antibody Abcam ab131084 1:100 dilution
    Anti-GAPDH antibody Thermo Fisher Scientific AM4300 1:200,000 dilution
   HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody Abcam ab205718 1:10,000 dilution
   HRP goat anti-mouse secondary antibody Abcam ab97023 1:10,000 dilution
   Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11008 1:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     Sodium azide Sigma 199931 Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
      DME/F12 Gibco 12400-024
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
Hepatic maturation medium
      Williams’ E medium Sigma Aldrich W4125-1L
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
      5 µg/mL  Insulin Sigma Aldrich 91077C-100MG
      50 µM hydrocotisone Sigma Aldrich H0888-1g
     2% DMSO PanReac AppliChem A3672-250ml
IF Blocking solution
     1x PBS Gibco 21300-058
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     0.2% Triton X-100 Sigma T8787 Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer Solution Merck 20-188 Final concentration: 1X
     Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 78425 Final concentration: 1X
       Na3VO4 Final concentration: 1 mM
       PMSF Final concentration: 1 mM
       NaF Final concentration: 10 mM
Western blot reagent
     10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Tween 20 Merck 9005-64-5
     1x TBST 0.1% Tween 20
     1x PBS Gibco 21300-058
     Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific A53225
     Polyacrylamide gel Bio-Rad 161-0183
     Ammonium Persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700 Final concentration: 0.05%
    TEMED Bio-Rad 161-0800 Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
    2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Final concentration: 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     5% Skim milk (nonfat dry milk) Bio-Rad 170-6404 Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 14.4 g
     SDS Merck 7910 Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 7.2 g
     Methanol Merck 106009 100 mL
Mild stripping solution 1 L Adjust pH to 2.2
    Glycine Sigma G8898 15 g
     SDS Merck 7910 1 g
     Tween 20 Merck 9005-64-5 10 mL
Equipments
15 mL centrifuge tube Corning 430052
50 mL centrifuge tube Corning 430291
Airstream Class II Esco 2010621 Biological safety cabinet
CelCulture CO2 Incubator Esco 2170002 Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector Bio-Rad 1855196
FACSVerse Flow Cytometer BD Biosciences 651154
Graduated pipettes (10 mL) Jet Biofil GSP010010
Graduated pipettes (5 mL) Jet Biofil GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC Malvern Isothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004 Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paper Bio-Rad 1703932
Omega Lum G Imaging System Aplegen 8418-10-0005
Pipette controller Eppendorf 4430000.018 Easypet 3
PowerPac HC Bio-Rad 1645052 Power supply
PVDF membrane Merck IPVH00010
T-75 A91:D106flask Corning 431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 1703940 Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge Esco T1000R Centrifuge with swinging bucket rotar

References

  1. Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
  2. Kim, K. -. H., Kim, N. D., Seong, B. -. L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
  3. Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
  4. Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
  5. Mak, L. -. Y., Seto, W. -. K., Yuen, M. -. F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
  6. Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
  7. Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
  8. Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
  9. Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
  10. Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
  11. Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
  12. Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
  13. Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
  14. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  15. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  16. Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
  17. Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
  18. Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
  19. Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
  20. Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
  21. Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
  22. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  23. Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
  24. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
  25. Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
  26. Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
  27. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  28. Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
  29. Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
  30. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
  31. Srivastava, V. K., Yadav, R., Misra, G. . Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. , 125-137 (2019).
  32. Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
  33. Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
  34. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  35. Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
  36. Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
  37. Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).

Play Video

Cite This Article
Sa-ngiamsuntorn, K., Thongsri, P., Pewkliang, Y., Borwornpinyo, S., Wongkajornsilp, A. A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target. J. Vis. Exp. (183), e63761, doi:10.3791/63761 (2022).

View Video