Summary
Vi præsenterer en protokol til screening af anti-hepatitis B-virus (HBV) forbindelser rettet mod præ- og postvirale indgangslivscyklusfaser ved hjælp af isotermisk titreringskalorimetri til måling af bindingsaffinitet (KD) med værtsnatriumtaurocholat, der cotransporterer polypeptid. Antiviral effekt blev bestemt gennem undertrykkelse af virale livscyklusmarkører (cccDNA-dannelse, transkription og viral samling).
Abstract
Hepatitis B-virus (HBV) infektion er blevet betragtet som en afgørende risikofaktor for hepatocellulært karcinom. Nuværende behandling kan kun mindske den virale belastning, men ikke resultere i fuldstændig remission. En effektiv hepatocytmodel for HBV-infektion ville tilbyde en virkelighedstro viral livscyklus, der ville være afgørende for screening af terapeutiske midler. De fleste tilgængelige anti-HBV-midler er målrettet mod livscyklusfaser efter viral indgang, men ikke før viral indgang. Denne protokol beskriver genereringen af en kompetent hepatocytmodel, der er i stand til at screene for terapeutiske midler rettet mod prævirale indtræden og efter viral indgangslivscyklusfaser. Dette inkluderer målretning af natriumtaurocholat, der cotransporterer polypeptid (NTCP) binding, cccDNA-dannelse, transkription og viral samling baseret på imHC eller HepaRG som værtsceller. Her anvendte HBV-indgangshæmningsanalysen curcumin til at hæmme HBV-bindings- og transportfunktioner via NTCP. Inhibitorerne blev evalueret for bindingsaffinitet (KD) med NTCP ved hjælp af isotermisk titreringskalorimetri (ITC) - et universelt værktøj til HBV-lægemiddelscreening baseret på termodynamiske parametre.
Introduction
Hepatitis B-virus (HBV) infektion betragtes som en livstruende sygdom over hele verden. Kronisk HBV-infektion er belastet med risiko for levercirrhose og hepatocellulært karcinom1. Nuværende anti-HBV-behandling fokuserer mest på post viral indgang ved hjælp af nukleoer (t) id-analoger (NA'er) og interferon-alfa (IFN-α)2,3. Opdagelsen af en HBV-indgangshæmmer, Myrcludex B, har identificeret et nyt mål for anti-HBV-midler4. Kombinationen af indgangshæmmere og NA'er i kronisk HBV har signifikant mindsket den virale belastning sammenlignet med dem, der er målrettet mod viral replikation alene 5,6. Den klassiske hepatocytmodel til screening af HBV-indgangshæmmere er imidlertid begrænset af lave virale receptorniveauer (natriumtaurocholat, der cotransporterer polypeptid, NTCP). Overekspressionen af hNTCP i hepatomceller (dvs. HepG2 og Huh7) forbedrer HBV-infektivitet 7,8. Ikke desto mindre udtrykker disse cellelinjer lave niveauer af fase I og II lægemiddelmetaboliserende enzymer og udviser genetisk ustabilitet9. Hepatocytmodeller, der kan hjælpe med at målrette forskellige mekanismer for kandidatanti-HBV-forbindelser, såsom præviral indtræden, NTCP-binding og viral indgang, vil fremskynde identifikation og udvikling af effektive kombinationsregimer. Undersøgelsen for anti-HBV-aktivitet af curcumin har belyst inhiberingen af viral indgang som en ny mekanisme ud over afbrydelse efter viral indrejse. Denne protokol beskriver en værtsmodel til screening af anti-HBV-indgangsmolekyler10.
Målet med denne metode er at udforske kandidat anti-HBV-forbindelser til viral indgangshæmning, især blokering af NTCP-binding og transport. Da NTCP-ekspression er en kritisk faktor for HBV-indgang og infektion, optimerede vi hepatocytmodningsprotokollen for at maksimere NTCP-niveauer11. Derudover kan denne protokol differentiere den hæmmende virkning på HBV-indgang som hæmning af HBV-vedhæftning versus hæmning af internalisering. Analysen af optagelsen af taurocholsyre (TCA) blev også modificeret ved hjælp af en ELISA-baseret metode i stedet for en radioisotop til at repræsentere NTCP-transport12,13. Receptoren og ligandinteraktionen blev bekræftet af deres 3D-strukturer14,15. Hæmningen af NTCP-funktionen kan evalueres ved at måle TCA-optagelsesaktivitet16. Denne teknik gav imidlertid ikke direkte bevis for, at NTCP var bindende for kandidathæmmerne. Derfor kan bindingen undersøges ved hjælp af forskellige teknikker, såsom overfladeplasmonresonans17, ELISA, fluorescensbaseret termisk skiftassay (FTSA)18, FRET19, AlphaScreen og forskellige andre metoder20. Blandt disse teknikker er ITC en målstandard inden for bindende analyse, fordi den kan observere varmeabsorption eller emission i næsten enhver reaktion21. Bindingsaffiniteten (KD) af NTCP og kandidatforbindelser blev direkte evalueret ved hjælp af ITC; Disse affinitetsværdier var mere præcise end dem, der blev opnået ved hjælp af In Silico-forudsigelsesmodel 22.
Denne protokol dækker teknikker til hepatocytmodning, HBV-infektion og screening for HBV-indgangshæmmer. Kort fortalt blev der udviklet en hepatocytmodel baseret på imHC- og HepaRG-cellelinjer. De dyrkede celler blev differentieret til modne hepatocytter inden for 2 uger. Opreguleringen af NTCP-niveauer blev detekteret ved hjælp af realtids PCR, western blotte og flowcytometri11. Hepatitis B virion (HBVcc) blev produceret og indsamlet fra HepG2.2.15. Den differentierede imHC eller HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) blev profylaktisk behandlet med anti-HBV-kandidaterne 2 timer før podningen med HBV-virion. Det forventede resultat af eksperimentet var identifikationen af de midler, der reducerer cellulær HBV og infektivitet. Anti-NTCP-aktivitet blev evalueret ved hjælp af TCA-optagelsesanalysen. NTCP-aktivitet kunne undertrykkes af de agenter, der specifikt bandt NTCP. ITC-teknikken blev anvendt til at undersøge muligheden for interaktiv binding, der kunne forudsige hæmmere og deres målproteiner, bestemme bindingsaffiniteten (KD) af liganden for receptoren via ikke-kovalente interaktioner af det biomolekylære kompleks23,24. For eksempel repræsenterer K D ≥ 1 × 103 mM svag binding, K D ≥ 1 × 106 μM repræsenterer moderat binding, og K D ≤ 1 × 109 nM repræsenterer stærk binding. ΔG er direkte korreleret med bindingsinteraktioner. Især er en reaktion med negativ ΔG en exergonisk reaktion, hvilket indikerer, at binding er en spontan proces. En reaktion med en negativ ΔH indikerer, at bindingsprocesserne afhænger af hydrogenbinding og Van der Waals-kræfter. Både TCA-optagelse og ITC-data kan bruges til at screene for anti-HBV-indgangsmidler. Resultaterne af disse protokoller kan danne grundlag for ikke kun anti-HBV-screening, men også interaktionen med NTCP som vurderet gennem bindende affinitet og transportfunktion. Dette papir beskriver værtscelleforberedelse og karakterisering, eksperimentelt design og evaluering af anti-HBV-posten sammen med NTCP-bindingsaffiniteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Følgende procedurer skal udføres i en klasse II biologisk farestrømningshætte eller en laminar-flow hætte. Håndteringen af HBV blev etisk godkendt af IRB (MURA2020/1545). Se materialetabellen for at få flere oplysninger om alle løsninger, reagenser, udstyr og cellelinjer, der anvendes i denne protokol.
1. Forberedelse af værtsceller (modne hepatocytter)
- Kultur hepatocytter (3,75 × 105 celler HepaRG eller imHC) og opretholde i en 75 cm2 kulturkolbe med 10 ml DMEM / F12 medium suppleret med 10% føtalt bovin serum (FBS), 1% L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin. Vent på, at cellerne når 80% -90% sammenløb (inden for 1 uge).
- Det gamle medium kasseres fra kolben, og cellerne vaskes med 4 ml fosfatbufferet saltvand (PBS).
- Aspirer PBS og tilsæt 4 ml 0,05% trypsin-EDTA.
- Kolben inkuberes i 37 °C inkubatoren i 2-3 minutter, og de klæbende celler kontrolleres ved hjælp af et omvendt mikroskop med en 10x objektivlinse. Sørg for, at monolaget har løsnet sig fra dyrkningsoverfladen.
- Hæmmer trypsinen ved at tilsætte 4 ml af dyrkningsmediet suppleret med 10% FBS til kolben og suspenderer forsigtigt de høstede celler. Cellesuspensionen overføres til et 15 ml konisk rør og centrifugeres i 3 minutter ved 300 × g, 25 °C.
- Aspirer supernatanten fra cellepelleten og resuspender med 1-2 ml af det forvarmede kulturmedium suppleret med 10% FBS og antibiotika.
- Bland 10 μL hver af cellesuspensionen og trypan blå og tæl cellerne ved hjælp af et hæmacytometer. Sørg for, at cellens levedygtighed er højere end 90%, før du går videre til næste trin.
- Frø 1 × 10 6 celler pr. 2 ml i hver brønd i en 6-brønds plade og opretholdes i DME / F12 komplet medium, indtil cellerne når 100% sammenløb.
- Til levermodning skal du forberede levermodningsmedium (Williams 'E-medium suppleret med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 5 μg / ml insulin, 50 μM hydrocortison, 2 mM L-glutamin og 2% DMSO).
- Udskift kulturmediet 2x om ugen.
- Vedligehold hepatocytterne i modningsmedium i 2 uger for at opnå modne hepatocytter klar til HBV-infektion.
2. Kvantificering af cellulær NTCP
- Måling af NTCP-udtryk ved hjælp af PCR i realtid
- Saml pellet af modne hepatocytter gennem trypsinisering (se trin 1.2-1.5).
- Ekstraher total RNA fra cellepellet ved hjælp af et RNA-ekstraktionssæt med DNase I-behandling.
- Syntetiser cDNA fra 200 ng total RNA ved hjælp af en oligo-dT-primer og omvendt transkriptionssystem efter producentens anvisninger.
- Fortynd cDNA til 50 ng/μL og brug det som skabelon for PCR-reaktionen. Bland 2 μL af det fortyndede cDNA med PCR-mastermixreagenser indeholdende SYBR grøn qRT-PCR Kit-opløsning med 5 μM NTCP-specifikke primere (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' og 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
- Til normalisering skal du bruge GAPDH som et husholdningsgen med specifikke primere (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' og 5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3').
- Amplify cDNA-prøverne ved hjælp af en termisk cycler under følgende temperaturforhold: 1 cyklus på 3 min ved 95 °C (indledende denaturering); 40 cyklusser på 30 s ved 95 °C (denaturering), 30 s ved 60 °C til 65 °C (udglødning), 30 s ved 72 °C (forlængelse) 1 cyklus på 5 min ved 72 °C (endelig forlængelse).
- Beregn NTCP-foldændringen i modne hepatocytter over udifferentierede celler ved hjælp af GAPDH som et kalibratorgen baseret på 2-ΔΔCT-metoden .
- Kvantificering af NTCP ved hjælp af western blot-analyse
- Høst hepatocytter ved hjælp af en celleskraber og centrifuger dem ved 300 x g, 25 ° C i 5 minutter for at opsamle cellepellet.
- Følg RIPA-bufferproducentens anvisninger for at ekstrahere det cellulære protein med 100 μL RAPA-buffer indeholdende 1x proteasehæmmer.
- Mål den samlede proteinkoncentration ved hjælp af bicinchoninsyre (BCA) metoden.
- Bland 12,5 μL protein med 2x påfyldningsfarvestof i et 1: 1-forhold efter volumen.
- Kog proteinblandingen og standardstigen ved 95 °C i 5 min.
- Tilsæt 1x løbende buffer til elektroforesekammeret.
- Der fyldes 5 μL af proteinstandardstigen eller 20 μL af den kogte proteinblanding i en 10% (w/v) polyacrylamid gel.
- Udfør gelelektroforese: 50 V i 30 minutter efterfulgt af 90 V i 1 time ved stuetemperatur.
- Forbered en PVDF-membran ved at lægge den i blød i methanol i 30 s, vask den med dobbeltdestilleret vand i 1-2 minutter, og blødgør den sammen med to stykker filterpapir i overførselsbuffer i 10 minutter eller indtil brug.
- Anbring filterpapiret på anodepladen i en halvtør overførselscelle; Placer derefter PVDF-membranen, gelen og filterpapiret ovenpå i den rækkefølge.
- Overfør proteinerne fra gelen til PVDF-membranen ved 10 V i 25 minutter ved stuetemperatur.
- Bloker membranen med WB-blokerende opløsning i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkubere membranen med antinatriumtaurocholat cotransporterende polypeptid (anti-NTCP) (1:100 fortynding) ved 4 °C natten over.
- Vask membranen 3 x 10 min med TBST.
- Inkubere membranen med peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret gedeantikaninantistof (1:10.000 fortynding) i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask membranen 3 x 10 min med TBST og derefter 1 x 5 min med TBS.
- Registrer NTCP ved hjælp af et HRP-substrat (se materialetabellen).
- Tilsæt mindst 0,1 ml HRP-substratopløsning/cm2 af membranen og inkuber membranen i 3-5 minutter i mørke.
- Visualiser NTCP ved hjælp af et geldokumentationssystem i kemiluminescenstilstand, vælg markørindstillingen for membranen, juster eksponeringstiden med akkumulerende tilstand hvert 1. minut, og tag billedet med forskellige eksponeringstider i 5 minutter.
- Strip og sonde pletten med museanti-GAPDH-antistof (1:200.000 fortynding) og HRP-konjugeret gedeantimus sekundært antistof (1:10.000 fortynding).
- Måling af NTCP-niveauet ved hjælp af flowcytometri
- Saml cellepillerne fra modne hepatocytter ved at inkubere cellerne med 8 mM EDTA i 15 min.
BEMÆRK: Undgå at bruge trypsin eller andre proteaser, der kan forstyrre celleoverfladereceptorer. Da NTCP er et celleoverfladereceptorprotein, kan skader på grund af trypsinisering give negative resultater. - Fix hepatocytterne med 300 μL 3,7% paraformaldehyd i 1x PBS i 15 min. Cellesuspensionen overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifuge i 10 minutter ved 300 × g, 25 °C.
- Cellerne vaskes 2x med 700 μL 1x PBS med 1% FBS (v/v), centrifuge i 10 min ved 300 × g, 25 °C, tilsættes 300 μL 0,05% Triton X-100 i PBS til cellepellet, og cellerne inkuberes ved stuetemperatur i 20 minutter for at gennemtrænge dem.
- Centrifuge i 10 min ved 300 × g, 25 °C, vask cellepelleten 3 x 1 min med 700 μL PBS indeholdende 1% FBS (v/v). Inkubere cellerne med det primære antistof mod NTCP (1:100 fortynding) ved 4 °C i 30 min. Cellerne vaskes 3 x 1 min med Perm/Wash buffer og centrifuge i 10 min ved 300 × g, 25 °C.
- Plet cellerne med sekundært antistof konjugeret til Alexa Fluor 488 ved 4 °C i 30 min. Cellerne vaskes 3 x 1 min med Perm/Wash buffer og centrifuge i 10 min ved 300 × g, 25 °C. Cellepelleten gensuspenderes med 200 μL PBS med 1% FBS (v/v).
- Tænd for flowcytometeret, varm laseren op i 15 minutter, og udfør rutinemæssig rengøring.
- Vælg måleparametrene, herunder forward scatter (FSC), side scatter (SSC) og fluoresceinisothiocyanat (FITC) eller phycoerythrin (PE), og indstil softwarens automatiske kompensationsjustering . Medtag kompensationskontrolprøverne: ufarvet kontrol, FITC-farvet kontrol og PE-farvet kontrol.
BEMÆRK: FSC- og SSC-parametre bruges til at bestemme størrelsen og granulariteten af individuelle celler for at vælge cellepopulationen til gatinganalyse. Fluorescenskanaldetektoren har FITC- og PE-kanaler. For denne protokol skal du vælge FITC-kanalen for at registrere Alexa Fluor 488. - Kør den ufarvede prøve med medium fluidisk strømningshastighed (60 μL / min), juster tærsklen for FSC og SSC, indtil de dækker cellepopulationen af interesse, marker portområdet i dette område, og gælder for alle kompensationskontroller.
- Indstil fluorescensfotomultiplikatorrøret (PMT) ved hjælp af den ufarvede kontrol, og juster PMT-spændingen for FITC eller PE i den negative kvadrant. Kør den positive farvede prøve, og juster FITC eller PE i den positive kvadrantskala. Kør de ikke-farvede, FITC-farvede eller PE-farvede kontroller, beregn kompensationen, og anvend den på prøveindstillingerne. Kør hepatocytprøven for at måle NTCP-niveauet.
- Analyser de farvede hepatocytter ved hjælp af flowcytometersoftware (se materialetabellen).
- Under BD FACSuite-vinduer skal du klikke på kontrolrøret i fanen Datakilder og vente på, at rådataene vises.
- I fanen Arbejdsark i højre side skal du klikke på Ellipse Gate-knappen , vælge cellepopulationen i SSC og FSC-prikplottet ved hjælp af musemarkøren og vente på, at cirklen P1 vises.
- Klik på knappen Intervalport , og markér området i FITC-histogrammet, startende fra den højeste fluorescensintensitetsværdi til højre side. Overhold linjen P2, der vises.
- Klik på eksperimentrøret , og observer, at dataene under fanen Arbejdsark ændres. Klik på knappen Statistik og derefter på det tomme rum i regnearket. Overhold de statistiske værdier for NTCP-befolkningen, der vises.
- Saml cellepillerne fra modne hepatocytter ved at inkubere cellerne med 8 mM EDTA i 15 min.
3. Fremstilling af de cellekulturafledte HBV-partikler (HBVcc)
- Kultur HepG2.2.15 i komplet medium (DMEM suppleret med 10% FBS, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin) i en 10 cm petriskål i 24 timer.
- Udskift det komplette medium suppleret med 380 μg/ml geneticin (G418), når HepG2.2.15 når 60%-70% sammenløb. Høst det konditionerede medium hver 2. dag; Det flydende stof indeholdende HBV opbevares ved 4 °C.
- Fjern cellerester ved centrifugering af supernatanten ved 5.000 × g, 4 °C i 20 minutter. Saml det konditionerede medium ved hjælp af en 20 ml sprøjte, og filtrer det gennem et 0,45 μm lavproteinbindende filter for at fjerne celleaffald.
- For at koncentrere HBV fortyndes 1 volumen koncentrator med 3 volumener af den filtrerede supernatant fra trin 3.3 i et konisk centrifugerør og blandes forsigtigt opløsningen ved rørinversion. Blandingen anbringes ved 4 °C i 1 time. Opløsningen centrifugeres i 1 time ved 1.500 × g, 4 °C, og sørg for, at en råhvid pellet er synlig.
BEMÆRK: For hver 30 ml filtreret supernatant fra trin 3.3 tilsættes 10 ml koncentrator for at nå 40 ml af det samlede volumen. - Evaluer HBV-titeren (genomækvivalent) med HBV 1,3-mer WT-replicon som en standardkurve fra 1 × 102 til 1 × 1010 ved hjælp af absolut realtids-PCR, som beskrevet tidligere11.
- Pelleten rekonstitueres forsigtigt i FBS og opbevares i op til 1 år ved -80 °C i alikvoter til engangsbrug.
4. Analyse af anti-HBV-indgang
- Vedligehold 100% sammenflydende imHC eller HepaRG i 6-brøndsplader i modningsmedium (2% DMSO i Williams 'E-medium, 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 5 μg / ml insulin, 50 μM hydrocortison og 2 mM L-glutamin) i 2 uger og skift medium 2x om ugen.
- Aspirer mediet, tilsæt derefter curcumin (10-30 μM) eller 4 μM cyclosporin A (CsA) fortyndet med Williams E-medium i 2 timer. Aspirer kandidaten HBV-indgangshæmmer og erstat den med 1 ml Williams E-medium indeholdende 4% polyethylenglycol.
- Der tilsættes HBV-partikler til dyrkningsmediet ved en infektionsgrad (MOI) på 100 pr. boring, og der inkuberes ved 37 °C i 18 timer. Kassér supernatanten, tilsæt 2 ml kold PBS, og hvirvl forsigtigt for at skylle det gamle medium af med ubundet HBV.
- Tilsæt 2 ml komplet William's E-medium og kultur i 7 dage. Aspirer mediet, vask cellerne med 1x PBS, og fastgør cellerne med 3,7% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur. Permeabilize og blokere de inficerede celler med IF-blokerende opløsning (0,2% Triton X-100 og 3% bovin serumalbumin i PBS) og inkubere dem i 60 minutter ved stuetemperatur.
- Det primære antistof (anti-HBV-kerneantigen) tilsættes ved 1:200 fortynding i blokeringsopløsningen, og der inkuberes natten over ved 4 °C. Cellerne vaskes 3 x 1 min med vaskeopløsning (0,5% Tween 20 i PBS).
- Tilsæt sekundært antistof (1:500 fortynding) til IF-blokeringsopløsningen, inkuberes i 1 time ved stuetemperatur, og cellerne vaskes 3 x 1 minut med vaskeopløsning.
- Monter prøven med antifade monteringsmedium med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), og dæk med en glasdæksel. Registrer fluorescenssignalet ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med et DAPI-filter (Ex 352-402 nM og Em 417-477) og et PE-filter (Ex 542-582 og Em 604-644) sammen med en 20x objektiv linse, og bestem anti-HBV-indgangsaktiviteten for kandidatforbindelserne.
5. HBV-cellebindende assay
- Vedligehold 100% sammenflydende imHC eller HepaRG i 6-brøndsplader i modningsmedium (2% DMSO i Williams 'E-medium, 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 5 μg / ml insulin, 50 μM hydrocortison og 2 mM L-glutamin) i 2 uger og skift medium 2x om ugen.
- Aspirer mediet, tilsæt derefter curcumin (10-30 μM) eller cyclosporin A (4 μM) fortyndet i Williams E-medium i 2 timer. Aspirer HBV-indgangshæmmeren og udskift den med 1 ml Williams E-medium indeholdende 4% polyethylenglycol.
- Der tilsættes HBV-partikler til dyrkningsmediet ved en MOI på 100 pr. boring, og der inkuberes ved 4 °C i 2 timer for at tillade HBV-binding til hepatocytterne. Kassér mediet, der indeholder ubundet HBV, tilsæt 2 ml kold PBS, og hvirvl forsigtigt for at fjerne spor af det brugte medium.
- Høst de inficerede celler ved hjælp af en celleskraber og forstyrre cellerne med lysisbuffer. Overfør lysatet til et opsamlingsrør og ekstraher total DNA for at evaluere HBV-DNA'et ved hjælp af realtids-PCR med specifikke primere til HBV (fremadgående primer: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', og omvendt primer: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') ved hjælp af PRNP (fremadgående primer: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', omvendt primer: 5'- TTTATGCCACCTCCTCCTA-3') som en intern kontrol.
- Forstærk PCR-produkterne i en termisk cycler ved hjælp af temperaturforholdene beskrevet i trin 2.1.
- Beregn relative HBV DNA-niveauer / 1 × 106 celler i behandling versus kontrol ved hjælp af PRNP som kalibratorgenet baseret på 2-ΔΔCT-metoden .
6. Taurocholsyre (TCA) optagelsesanalyse
- Oprethold 100% sammenflydende imHC- og HepaRG-celler i modningsmedium i 14 dage.
- Aspirer mediet og vask hepatocytterne med 1x PBS. Tilsæt curcumin eller cyclosporin A (10-50 μM) fortyndet i Williams E-medium i 2 timer. Medium udskiftes med natrium taurocholinsyreopløsningen (0,5 M natriumtaurocholathydrat i 1x HEPES) og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer natrium taurocholsyreopløsningen, og vask 3x med kold 1x HEPES. Tilsæt 300-500 μL kold 1x HEPES og høst cellerne med celleskrabere på is.
- Homogeniser cellerne ved ultralydbehandling med en frekvens på 20 kHz i 20 s og inkuberes på is i 5 min. Centrifuge lysaterne ved 10.000 × g i 20 minutter for at udfælde celleaffald. Saml supernatanten og evaluer intracellulær taurocholsyrekoncentration ved hjælp af et TCA ELISA-analysesæt (se materialetabellen).
7. Bestemmelse af protein-ligand-interaktioner ved anvendelse af isotermisk titreringskalorimetri
BEMÆRK: Dette analysesystem blev udviklet baseret på MicroCal PEAQ-ITC (ITC-software).
- Bufferen klargøres (50 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,0).
- Forbered 15 μM NTCP i bufferen.
- Der fremstilles 150 μM kandidat HBV-indgangsinhibitoropløsninger i bufferen.
- Prøvecellen, referencecellen og sprøjten i ITC-instrumentet vaskes ved hjælp af bufferen (trin 7.1.).
- Start ITC-softwaren ved at dobbeltklikke på softwareikonet i Windows-systemer. Under fanen Kør eksperimentfremhævning skal du vælge microCal Method for 19 Injection.itcm og klikke på åbn. Når et nyt vindue åbnes, skal du klikke på fanen Rens, og i vinduet Rengøringsmetode skal du vælge knappen Vask til Cellerensningsmetode og Skylleknappen til sprøjterensningsmetode. Klik på Næste, og følg instruktionerne på skærmen.
BEMÆRK: Vasketrinnet kan tage 1,4 timer at gennemføre.
- Start ITC-softwaren ved at dobbeltklikke på softwareikonet i Windows-systemer. Under fanen Kør eksperimentfremhævning skal du vælge microCal Method for 19 Injection.itcm og klikke på åbn. Når et nyt vindue åbnes, skal du klikke på fanen Rens, og i vinduet Rengøringsmetode skal du vælge knappen Vask til Cellerensningsmetode og Skylleknappen til sprøjterensningsmetode. Klik på Næste, og følg instruktionerne på skærmen.
- Indlæs prøven i ITC; under fanen Kør eksperiment skal du klikke på knappen Indlæs og læse instruktionerne på skærmen. Klik på næste og følg videoinstruktionerne, indtil dette indlæsningstrin er afsluttet.
- Fyld referencecellen med opløsningsbuffer med en sprøjte. Prøvecellen fyldes med 15 μM NTCP i buffer ved hjælp af en sprøjte, og overskydende NTCP-opløsning fjernes over prøvecellen. Fyld sprøjten med 150 μM opløsning af curcumin (ligand), undgå luftbobler i sprøjten.
- Kør prøven, og klik på knappen Kør under fanen Kør eksperiment. Overhold vinduerne i venstre side, der viser eksperimentel information og eksperimentel indstilling. Indtast ligand- og proteinkoncentrationerne som 150 μM i [Syr], 15 μM i [Celle] og 25 °C i temperatur.
- I softwaren skal du klikke på start for at udføre injektionsprocessen og vente i 1,4 timer på, at protein-ligand-interaktionen er afsluttet.
BEMÆRK: Den falmede analyseknap vises under softwarevinduerne. - Bemærk, at analyseknappen lyser, når injektionen er afsluttet. Klik på analyseknappen i kontrolsoftwaren for at analysere de rå data ved hjælp af analysesoftwaren . Klik på oversigt for at få vist rådata og vælg tilpasningsmodellen som One Set of Binding Site.
- Sørg for, at bindingsstatus viser eksperimentdataene (binding, ingen binding, kontrol- eller kontroldata), og at eksperimentværdierne (KD, ΔG, ΔH, TΔS og N) vises på softwarepanelet.
- Eksporter de termodynamiske parametre, der forudsiger interaktionsbindingen, herunder hydrogenbinding, van der Waals-binding og hydrofob interaktion til tif- eller jpeg-format.
- Når eksperimentet er fuldført, vaskes prøvecellen efter trin 7.4.
8. Statistisk analyse
- Udfør alle eksperimenter i tre uafhængige replikater (n = 3).
- Præsenter eksperimentelle data som middel ± SD, og udfør statistisk analyse ved hjælp af den ønskede statistiske analysesoftware.
- Brug en tosidet uparret studerendes t-test til at sammenligne mellem to middelværdier, eller anvend envejsanalyse af varians (ANOVA) med Dunnett til flere sammenligninger mellem flere værdier og en kontrolværdi. Indstil signifikansniveauet til p ≤ 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatiske modningsfunktioner blev observeret, herunder binukleerede celler og polygonalformet morfologi (figur 1), især i det differentierede stadium af imHC (figur 1A). En stor stigning i NTCP-ekspression blev målt i d-HepaRG og d-imHC ved henholdsvis 7 gange og 40 gange (figur 1B). Den stærkt glykosylerede form af NTCP, postuleret for at give modtagelighed for HBV-indgang, blev påvist mere i d-imHC end i d-HepaRG (figur 1C). Den differentierede imHC indeholdt 65,9% højere NTCP-niveauer end de udifferentierede celler (figur 1D).
Figur 2A viser en oversigt over den profylaktiske behandling. Figur 2B viser HBV-immunfluorescensfarvning udført for at evaluere anti-HBV-indgangsaktiviteterne på dag 7 efter infektion, mens figur 2C skitserer HBV-bindingsassayprotokollen. Niveauet af HBV-binding på celleoverfladereceptoren blev evalueret ved realtids PCR (figur 2D). For at afgøre, om NTCP var receptoren for HBV-vedhæftning, blev TCA-optagelsen bestemt for kandidatbindingsinhibitorerne (figur 2E). Baseret på denne model reducerede den formodede hæmmende aktivitet af kandidatforbindelser HBV-binding gennem NTCP.
Den kalorimetriske ændring blev påvist med kontinuerlige injektioner i prøvecellen (figur 3). En standard ikke-lineær mindste kvadraters regression blev plottet baseret på et bindingssted monteret godt på dataene. Den faste linje angav den bedste pasform til de eksperimentelle værdier (figur 3A, B). Tabel 1 viser termodynamiske parametre korreleret med bindingen af NTCP med cyclosporin A (CsA) eller en kandidatforbindelse.
Figur 1: Hepatisk modning af HepaRG og imHC med NTCP-karakterisering. Begge cellelinjer blev dyrket i levermodningsmedium i 2 uger. (A) Hepatocytegenskaber såsom binukleerede celler og polygonalformet morfologi blev udelukkende observeret i modningsfasen af imHC. Skalabjælker = 50 μm. (B) Udtrykket af NTCP blev opreguleret i både HepaRG og imHC. NTCP normaliseret med GAPDH var højere i imHC end i HepaRG. (C) En stærkt glykosyleret form af NTCP blev observeret efter modning. (D) Procentdel af NTCP-stigning i d-imHC blev evalueret ved hjælp af flowcytometri. Data præsenteres som middel ± SD. *, ** og *** repræsenterer statistisk forskel med henholdsvis p < 0,05, p < 0,01 og p < 0,001. Forkortelser: NTCP = natriumtaurocholat, der cotransporterer polypeptid; GAPDH = glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase; NTCP-FITC = fluoresceinisothiocyanatmærket NTCP. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Profylaktisk CCM-behandling nedsatte viral indtræden, intracellulær HBV-DNA og TCA-optagelsesaktivitet. (A) d-imHC blev forbehandlet med CCM i 2 timer før podningen med HBV. (B) Anti-HBV-indgangsaktivitet blev bestemt ved immunfluorescensfarvning på dag 7 efter infektion. (C) Der fremlægges en skematisk tidsplan for HBV's bindende protokol. (D) Niveauet af bundet HBV-DNA på hepatocytter blev evalueret og sammenlignet med 4 μM CsA og den klassiske HBV-indgangshæmmer 25 enheder / ml heparin. (E) Virkningen af 10-30 μM CCM på TCA-optagelseshæmning blev medieret gennem NTCP-receptoren. Forkortelser: CCM = curcumin; HBV = hepatitis B-virus; TCA = taurocholsyre; d-imHC = differentieret imHC; CsA = cyclosporin A; HP = heparin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Affiniteten af NTCP til individuelle molekyler (CsA eller kandidatforbindelse) blev påvist ved anvendelse af ITC. ITC-profilen for kombinationen af NTCP med enten (A) CsA eller (B) curcumin blev genereret ved sekventiel injektion af en forbindelse (150 μM CsA eller kandidat) i NTCP-opløsningen (15 μM NTCP, pH 7,0, 25 °C). De kalorimetriske rådata mellem differentiel effekt (μcal/s) og tid (min) blev plottet. Data blev analyseret baseret på en one-site bindingsmodel, hvor de faste linjer angav de bedst egnede resultater. Under injektionen af ligander (CSA eller curcumin) i NTCP-opløsningen ændrede entalpien (ΔH) sig efter en stigning i ligandkoncentrationen i prøvecellen. Disse data indikerer, at bindingsreaktionen opstod. Forkortelser: CsA = cyclosporin A; NTCP = natriumtaurocholat, der cotransporterer polypeptid; ITC = isotermisk titreringskalorimetri; DP = differentiel effekt. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Protein | Ligand | Bindingskonstant (KD) | Entalpi ændring (ΔH) | Entropiændring (ΔTΔS) | Gibbs Gratis energiændring (ΔG) | Type binding |
| (M-1) | (kcal/mol) | (kcal/mol) | (kcal/mol) | |||
| Menneskelig NTCP (SLA10A1) | CCM | 1.21 ×10-6 | -1 | 0.6 | -0.39 | Hydrogenbinding |
| Menneskelig NTCP (SLA10A1) | TCA | 1 ×10-9 | 80 | -96 | -16 | Hydrofob interaktion |
Tabel 1: Termodynamiske parametre som følge af interaktionen mellem NTCP og individuelle forbindelser (CCM og TCA) ved anvendelse af ITC. Forkortelser: NTCP = natriumtaurocholat, der cotransporterer polypeptid; CCM = curcumin; TCA = taurocholsyre; ITC = isotermisk titreringskalorimetri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HBV-infektion initieres via binding med lav affinitet til heparansulfatproteoglycaner (HSPG'er) på hepatocytter25 efterfulgt af bindingen til NTCP med efterfølgende internalisering gennem endocytose26. Da NTCP er en afgørende receptor for HBV-indgang, kan målretning af HBV-indgang klinisk oversættes til at mindske de novo-infektion , mor-til-barn-transmission (MTCT) og gentagelse efter levertransplantation. Afbrydelse af viral indrejse ville være en mulig alternativ kur mod kronisk HBV-infektion.
Nogle kritiske trin i ovennævnte protokol er opsummeret her. Mens du forbereder værtsceller, skal du sikre dig, at hepatocytter når 100% sammenløb, før modningsmediet tilsættes med 2% DMSO. Dyrkning af subkonfluente hepatocytter i 2% DMSO vil føre til celledød og løsrivelse. Modningsperioden kan forlænges op til 4 uger for at maksimere NTCP-ekspression27,28, selvom en 2 ugers modningsperiode anbefales.
Tre teknikker er blevet foreslået til kvantificering af cellulær NTCP-ekspression. Det anbefales, at brugerne vælger den teknik, de er mest fortrolige med; Her foretrak vi flowcytometri frem for Western Blot-analyse, fordi det er praktisk, hurtigt og nemt.
Til fremstilling af de cellekulturafledte HBV-partikler (HBVcc) blev HepG2.2.15 afledt af HepG2 ved forbigående transfektion med HBV-genom i fuld længde sammen med det genetiske (G418) resistensgen29. Kulturmediet skal indeholde 380-500 μg/ml genetik, ellers producerer cellerne ikke HBVcc. Det lavproteinbindende 0,45 μm filter skal bruges til at afklare supernatanten for at undgå at miste HBV-udbyttet. Til koncentrering af HBV blev polyethylenglycol (PEG) anvendt med en standardcentrifuge. HBV-partikler kan også koncentreres ved hjælp af en saccharosegradient og ultracentrifugering. Flere fryse- og optøningscyklusser bør undgås, da infektiviteten vil blive reduceret.
I anti-HBV-indgangsanalysen skal hepatocytterne nå 100% sammenløb før modningsinduktion. Denne protokol blev udviklet baseret på profylaktisk behandling. Værtsceller blev udsat for kandidatforbindelserne i 2 timer før infektion med HBV12. Efter 7 dage efter infektion blev HBV-infektivitet evalueret ved anvendelse af immunfluorescens. Alle komponenter, koncentrationer af blokeringsopløsningen, primære og sekundære antistoffer og vasketrin skal optimeres for at opnå det bedste resultat med minimal ikke-specifik farvning. Her har vi leveret optimerede koncentrationer og teknikker.
TCA-optagelsesassayprotokollen beskriver guldstandarden for hæmning af NTCP-transport. Vi ændrede protokollen for at undgå radioaktive TCA. De kritiske trin for TCA-optagelsesanalysen er cellevask og høst. Alle disse procedurer skal udføres på is hele tiden for at forhindre yderligere cellulær aktivitet-internalisering af forbindelsen. Efter homogenisering af cellerne og pelleteringscelleaffald skal supernatanten forsigtigt aspireres uden at forstyrre pelleten. Hvis brugerens facilitet tillader anvendelse af den flydende scintillationsteknik, anvendes 3H-taurocholsyre almindeligvis i TCA-transport- og optagelsesundersøgelser. Da vi validerede TCA-optagelsen ved hjælp af ELISA, kan denne alternative teknik erstatte brugen af det radioaktive stof.
ITC er en biofysisk metode, der i vid udstrækning anvendes til at bestemme de termodynamiske parametre, der er knyttet til interaktionerne mellem opløselige proteiner og små molekylvægtligander30,31. Denne teknik kan bruges til at undersøge interaktionen mellem forskellige ligander med et lille molekyle eller protein. ITC er en direkte og ikke-invasiv metode uden yderligere trin til signaldetektion, ingen molekylvægtbegrænsninger og ingen mærkning, immobilisering eller anden kemisk modifikation. Begrænsningen af ITC er forudsætningen for høje koncentrationer af de interagerende materialer. Protein og ligand skal være stærkt renset og tilstrækkeligt opløseligt i vand (10-100 μM) ved 25 °C i 1 time under omrøring. Den ustabile proteinopløsning kan detekteres gennem varmesignalændring som en funktion af tiden.
Human enhanced-NTCP hepatocytter giver en alternativ model til in vitro-undersøgelsen af HBV-infektion, men ligner HepaRG og primære humane hepatocytter. Disse værtsmodeller hæmmes af deres begrænsede pålidelighed og modtagelighed 8,33. Den ineffektive HBV-formering i HepG2-NTCP- eller Huh7-NTCP-celler blev bevist ved lav HBV-inokulum afledt af HBVcc-producerende celler. I flere undersøgelser blev HBV brugt til at inficere målcellerne ved en MOI på 1.00033.34. De subvirale partikler i HBVcc indeholder HBV-kuvertprotein (L/M/S) og binder konkurrencedygtigt NTCP, hvilket resulterer i nedsat infektivitet35. For at overvinde denne begrænsning ændrede denne protokol HepaRG- eller imHC-kultur med en modningsprotokol for at maksimere NTCP-niveauer. HBVcc afledt af HepG2.2.15 blev koncentreret, før den blev brugt som podning. HBV-infektiviteten var højere end 80% i differentieret imHC baseret på måling af HBV-kerneantigenet11.
Vi har beskrevet identifikationen af anti-HBV-forbindelser rettet mod NTCP for at afbryde viral indrejse og vedtaget en levermodningsprocedure for at øge NTCP-niveauerne. For at identificere indgangshæmmere blev hepatocytter forbehandlet med kandidatforbindelser i 2 timer før infektionen med HBV ved 4 °C for at tillade viral binding, men ikke indtræden. Faldet i HBV-infektivitet blev evalueret på dag 7 efter infektion. De repræsentative data omfattede cyclosporin A, en klassisk NTCP-hæmmer, som en positiv kontrol til validering af modellen.
Da NTCP letter både transporter- og receptormedierede endocytosefunktioner, kan HBV-indgangshæmmere målrette mod mindst en af disse mekanismer. Hæmningen af NTCP-transport kan evalueres ved hjælp af et TCA-optagelsesassay baseret på ELISA, hvilket eliminerer den radioaktive TCA fra den klassiske protokol36. Affiniteten mellem NTCP og indgangsinhibitoren blev målt ved hjælp af ITC. Denne teknik tilvejebragte essentielle termodynamiske parametre, herunder støkiometri (n), dissociationskonstant (KD), ændring i fri energi (ΔG), entalpi (ΔH), entropi (ΔS) og varmekapacitet for binding (ΔCp). Forskellige anti-HBV-midler er blevet identificeret ved molekylær docking, såsom quercetin, rutin, hesperidin og luperol, der specifikt kunne binde HBV reverse transcriptase, der kan sammenlignes med lamivudin, en nukleosidanalog. Forbindelserne blev undersøgt ved anvendelse af ITC og udviste negativ Gibb-energi (-ΔG) fra -9,3 til -5,2 kcal / mol og KD på 1 × 10-6 til 1 × 10-3 M med HBV-polymerase 37. Samlet set vil dataene opnået fra disse ovennævnte assays hjælpe med at screene den antivirale effekt af kandidatforbindelser, der fungerer som HBV-indgangshæmmere. Den etablerede protokol vil være nyttig til at opdage nye NTCP-antagonister / hæmmere. Undertrykkelsen af viral indgang kan være nyttig i profylaktisk og terapeutisk behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette forskningsprojekt støttes af Mahidol University og Thailand Science Research and Innovation (TSRI) separat tildelt A. Wongkajornsilp og K. Sa-ngiamsuntorn. Dette arbejde blev økonomisk støttet af Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council gennem Program Management Unit for Competitiveness (tilskudsnummer C10F630093). A. Wongkajornsilp er modtager af et Chalermprakiat-stipendium fra Det Medicinske Fakultet Siriraj Hospital, Mahidol University. Forfatterne vil gerne takke Miss Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Det Naturvidenskabelige Fakultet, Mahidol University) for hendes hjælp med ITC-teknikken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 cell culture flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
References
- Levrero, M., Zucman-Rossi, J.
- Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
- Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
- Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
- Mak, L. -Y., Seto, W. -K., Yuen, M. -F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
- Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
- Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
- Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
- Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
- Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
- Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
- Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
- Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
- Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
- Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
- Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
- Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
- Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
- Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
- Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
- Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
- Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
- Srivastava, V. K., Yadav, R. Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. Misra, G. , Academic Press. 125-137 (2019).
- Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
- Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
- Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
- Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
- Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
- Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).
