Vi præsenterer en protokol til screening af anti-hepatitis B-virus (HBV) forbindelser rettet mod præ- og postvirale indgangslivscyklusfaser ved hjælp af isotermisk titreringskalorimetri til måling af bindingsaffinitet (KD) med værtsnatriumtaurocholat, der cotransporterer polypeptid. Antiviral effekt blev bestemt gennem undertrykkelse af virale livscyklusmarkører (cccDNA-dannelse, transkription og viral samling).
Hepatitis B-virus (HBV) infektion er blevet betragtet som en afgørende risikofaktor for hepatocellulært karcinom. Nuværende behandling kan kun mindske den virale belastning, men ikke resultere i fuldstændig remission. En effektiv hepatocytmodel for HBV-infektion ville tilbyde en virkelighedstro viral livscyklus, der ville være afgørende for screening af terapeutiske midler. De fleste tilgængelige anti-HBV-midler er målrettet mod livscyklusfaser efter viral indgang, men ikke før viral indgang. Denne protokol beskriver genereringen af en kompetent hepatocytmodel, der er i stand til at screene for terapeutiske midler rettet mod prævirale indtræden og efter viral indgangslivscyklusfaser. Dette inkluderer målretning af natriumtaurocholat, der cotransporterer polypeptid (NTCP) binding, cccDNA-dannelse, transkription og viral samling baseret på imHC eller HepaRG som værtsceller. Her anvendte HBV-indgangshæmningsanalysen curcumin til at hæmme HBV-bindings- og transportfunktioner via NTCP. Inhibitorerne blev evalueret for bindingsaffinitet (KD) med NTCP ved hjælp af isotermisk titreringskalorimetri (ITC) – et universelt værktøj til HBV-lægemiddelscreening baseret på termodynamiske parametre.
Hepatitis B-virus (HBV) infektion betragtes som en livstruende sygdom over hele verden. Kronisk HBV-infektion er belastet med risiko for levercirrhose og hepatocellulært karcinom1. Nuværende anti-HBV-behandling fokuserer mest på post viral indgang ved hjælp af nukleoer (t) id-analoger (NA’er) og interferon-alfa (IFN-α)2,3. Opdagelsen af en HBV-indgangshæmmer, Myrcludex B, har identificeret et nyt mål for anti-HBV-midler4. Kombinationen af indgangshæmmere og NA’er i kronisk HBV har signifikant mindsket den virale belastning sammenlignet med dem, der er målrettet mod viral replikation alene 5,6. Den klassiske hepatocytmodel til screening af HBV-indgangshæmmere er imidlertid begrænset af lave virale receptorniveauer (natriumtaurocholat, der cotransporterer polypeptid, NTCP). Overekspressionen af hNTCP i hepatomceller (dvs. HepG2 og Huh7) forbedrer HBV-infektivitet 7,8. Ikke desto mindre udtrykker disse cellelinjer lave niveauer af fase I og II lægemiddelmetaboliserende enzymer og udviser genetisk ustabilitet9. Hepatocytmodeller, der kan hjælpe med at målrette forskellige mekanismer for kandidatanti-HBV-forbindelser, såsom præviral indtræden, NTCP-binding og viral indgang, vil fremskynde identifikation og udvikling af effektive kombinationsregimer. Undersøgelsen for anti-HBV-aktivitet af curcumin har belyst inhiberingen af viral indgang som en ny mekanisme ud over afbrydelse efter viral indrejse. Denne protokol beskriver en værtsmodel til screening af anti-HBV-indgangsmolekyler10.
Målet med denne metode er at udforske kandidat anti-HBV-forbindelser til viral indgangshæmning, især blokering af NTCP-binding og transport. Da NTCP-ekspression er en kritisk faktor for HBV-indgang og infektion, optimerede vi hepatocytmodningsprotokollen for at maksimere NTCP-niveauer11. Derudover kan denne protokol differentiere den hæmmende virkning på HBV-indgang som hæmning af HBV-vedhæftning versus hæmning af internalisering. Analysen af optagelsen af taurocholsyre (TCA) blev også modificeret ved hjælp af en ELISA-baseret metode i stedet for en radioisotop til at repræsentere NTCP-transport12,13. Receptoren og ligandinteraktionen blev bekræftet af deres 3D-strukturer14,15. Hæmningen af NTCP-funktionen kan evalueres ved at måle TCA-optagelsesaktivitet16. Denne teknik gav imidlertid ikke direkte bevis for, at NTCP var bindende for kandidathæmmerne. Derfor kan bindingen undersøges ved hjælp af forskellige teknikker, såsom overfladeplasmonresonans17, ELISA, fluorescensbaseret termisk skiftassay (FTSA)18, FRET19, AlphaScreen og forskellige andre metoder20. Blandt disse teknikker er ITC en målstandard inden for bindende analyse, fordi den kan observere varmeabsorption eller emission i næsten enhver reaktion21. Bindingsaffiniteten (KD) af NTCP og kandidatforbindelser blev direkte evalueret ved hjælp af ITC; Disse affinitetsværdier var mere præcise end dem, der blev opnået ved hjælp af In Silico-forudsigelsesmodel 22.
Denne protokol dækker teknikker til hepatocytmodning, HBV-infektion og screening for HBV-indgangshæmmer. Kort fortalt blev der udviklet en hepatocytmodel baseret på imHC- og HepaRG-cellelinjer. De dyrkede celler blev differentieret til modne hepatocytter inden for 2 uger. Opreguleringen af NTCP-niveauer blev detekteret ved hjælp af realtids PCR, western blotte og flowcytometri11. Hepatitis B virion (HBVcc) blev produceret og indsamlet fra HepG2.2.15. Den differentierede imHC eller HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) blev profylaktisk behandlet med anti-HBV-kandidaterne 2 timer før podningen med HBV-virion. Det forventede resultat af eksperimentet var identifikationen af de midler, der reducerer cellulær HBV og infektivitet. Anti-NTCP-aktivitet blev evalueret ved hjælp af TCA-optagelsesanalysen. NTCP-aktivitet kunne undertrykkes af de agenter, der specifikt bandt NTCP. ITC-teknikken blev anvendt til at undersøge muligheden for interaktiv binding, der kunne forudsige hæmmere og deres målproteiner, bestemme bindingsaffiniteten (KD) af liganden for receptoren via ikke-kovalente interaktioner af det biomolekylære kompleks23,24. For eksempel repræsenterer K D ≥ 1 × 103 mM svag binding, K D ≥ 1 × 106 μM repræsenterer moderat binding, og K D ≤ 1 × 109 nM repræsenterer stærk binding. ΔG er direkte korreleret med bindingsinteraktioner. Især er en reaktion med negativ ΔG en exergonisk reaktion, hvilket indikerer, at binding er en spontan proces. En reaktion med en negativ ΔH indikerer, at bindingsprocesserne afhænger af hydrogenbinding og Van der Waals-kræfter. Både TCA-optagelse og ITC-data kan bruges til at screene for anti-HBV-indgangsmidler. Resultaterne af disse protokoller kan danne grundlag for ikke kun anti-HBV-screening, men også interaktionen med NTCP som vurderet gennem bindende affinitet og transportfunktion. Dette papir beskriver værtscelleforberedelse og karakterisering, eksperimentelt design og evaluering af anti-HBV-posten sammen med NTCP-bindingsaffiniteten.
HBV-infektion initieres via binding med lav affinitet til heparansulfatproteoglycaner (HSPG’er) på hepatocytter25 efterfulgt af bindingen til NTCP med efterfølgende internalisering gennem endocytose26. Da NTCP er en afgørende receptor for HBV-indgang, kan målretning af HBV-indgang klinisk oversættes til at mindske de novo-infektion , mor-til-barn-transmission (MTCT) og gentagelse efter levertransplantation. Afbrydelse af viral indrejse ville være en mulig alt…
The authors have nothing to disclose.
Dette forskningsprojekt støttes af Mahidol University og Thailand Science Research and Innovation (TSRI) separat tildelt A. Wongkajornsilp og K. Sa-ngiamsuntorn. Dette arbejde blev økonomisk støttet af Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council gennem Program Management Unit for Competitiveness (tilskudsnummer C10F630093). A. Wongkajornsilp er modtager af et Chalermprakiat-stipendium fra Det Medicinske Fakultet Siriraj Hospital, Mahidol University. Forfatterne vil gerne takke Miss Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Det Naturvidenskabelige Fakultet, Mahidol University) for hendes hjælp med ITC-teknikken.
Cell lines | |||
HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
Reagents | |||
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
Antibodies | |||
Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
Reagent composition | |||
1° Antibody dilution buffer | |||
1x TBST | |||
3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
Hepatocyte Growth Medium | |||
DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
Hepatic maturation medium | |||
Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
IF Blocking solution | |||
1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
NaF | Final concentration: 10 mM | ||
Western blot reagent | |||
10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
1x TBST | |||
5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
1x Running buffer 1 L | |||
10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
Blot transfer buffer 500 mL | |||
10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
SDS | Merck | 7910 | 1 g |
Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
Equipments | |||
15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
T-75 A91:D106flask | Corning | 431464U | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |