Summary
אנו מציגים פרוטוקול לסינון תרכובות נגד נגיף הפטיטיס B (HBV) המכוונות לשלבי מחזור החיים של הכניסה לפני ואחרי הנגיף, תוך שימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית למדידת זיקה קושרת (KD) עם פוליפפטיד קו-טרנספורטינג של נתרן טאורוכולאט מארח. היעילות האנטי-ויראלית נקבעה באמצעות דיכוי סמני מחזור חיים נגיפיים (היווצרות cccDNA, שעתוק והרכבה ויראלית).
Abstract
זיהום בנגיף הפטיטיס B (HBV) נחשב לגורם סיכון מכריע לקרצינומה הפטוצלולרית. הטיפול הנוכחי יכול רק להפחית את העומס הנגיפי אך לא לגרום להפוגה מוחלטת. מודל הפטוציטים יעיל לזיהום HBV יציע מחזור חיים נגיפי נאמן לחיים שיהיה חיוני לסינון של חומרים טיפוליים. רוב הסוכנים הזמינים נגד HBV מתמקדים בשלבי מחזור החיים לאחר כניסה ויראלית אך לא לפני כניסה ויראלית. פרוטוקול זה מפרט את יצירתו של מודל הפטוציטים מוכשר המסוגל לבצע סינון לסוכנים טיפוליים המכוונים לשלבי מחזור החיים של כניסה טרום-ויראלית ופוסט-ויראלית. זה כולל את ההתמקדות של נתרן טאורוחולאט cotransporting פוליפפטיד (NTCP) קשירה, היווצרות cccDNA, שעתוק, והרכבה ויראלית המבוססת על imHC או HepaRG כמו תאים מארחים. כאן, בדיקת עיכוב הכניסה HBV השתמשה בכורכומין כדי לעכב פונקציות קשירה והובלה של HBV באמצעות NTCP. המעכבים הוערכו עבור זיקה מחייבת (KD) עם NTCP באמצעות קלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) - כלי אוניברסלי לבדיקת תרופות HBV המבוסס על פרמטרים תרמודינמיים.
Introduction
זיהום בנגיף הפטיטיס B (HBV) נחשב למחלה מסכנת חיים ברחבי העולם. זיהום HBV כרוני עמוס בסיכון לשחמת הכבד וקרצינומה הפטוצלולרית1. הטיפול הנוכחי נגד HBV מתמקד בעיקר בכניסה לאחר הנגיף באמצעות אנלוגים גרעיניים(t)IDE (NAs) ואינטרפרון-אלפא (IFN-α)2,3. הגילוי של מעכב כניסה HBV, Myrcludex B, זיהה מטרה חדשה לחומרים נגד HBV4. השילוב של מעכבי כניסה ו-NAs ב-HBV כרוני הפחית משמעותית את העומס הנגיפי בהשוואה לאלה המכוונים לשכפול נגיפי בלבד 5,6. עם זאת, המודל הקלאסי של הפטוציטים להקרנה של מעכבי כניסה HBV מוגבל על ידי רמות נמוכות של קולטנים נגיפיים (נתרן טאורוחולאט cotransporting polypeptide, NTCP). ביטוי יתר של hNTCP בתאי הפטומה (כלומר, HepG2 ו- Huh7) משפר את זיהום HBV 7,8. אף על פי כן, קווי תאים אלה מבטאים רמות נמוכות של אנזימים מעכלים של תרופות בשלב I ו-II ומפגינים חוסר יציבות גנטית9. מודלים של הפטוציטים שיכולים לסייע במיקוד מנגנונים מובחנים של תרכובות אנטי-HBV מועמדות כגון כניסה טרום-ויראלית, קשירת NTCP וכניסה ויראלית יזרזו את הזיהוי והפיתוח של משטרי שילוב יעילים. המחקר על פעילות אנטי-HBV של כורכומין הבהיר את עיכוב כניסת הנגיף כמנגנון חדש בנוסף להפרעה לאחר כניסת הנגיף. פרוטוקול זה מפרט מודל מארח להקרנה של מולקולות כניסה נגד HBV10.
המטרה של שיטה זו היא לחקור תרכובות אנטי-HBV מועמדות לעיכוב כניסה נגיפית, במיוחד חסימת קשירת NTCP והובלתו. מכיוון שביטוי NTCP הוא גורם קריטי לכניסה וזיהום של HBV, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול ההבשלה של הפטוציטים כדי למקסם את רמות NTCP11. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להבדיל בין ההשפעה המעכבת על כניסת HBV כעיכוב של חיבור HBV לעומת עיכוב של הפנמה. בדיקת ספיגת החומצה הטאורוכולית (TCA) שונתה גם היא באמצעות שיטה מבוססת ELISA במקום רדיואיזוטופ כדי לייצג הובלת NTCP12,13. האינטראקציה בין הקולטן לליגנד אושרה על ידי המבנים התלת-ממדיים שלהם14,15. ניתן להעריך את העיכוב של פונקציית NTCP על ידי מדידת פעילות ספיגת TCA16. עם זאת, טכניקה זו לא סיפקה עדות ישירה לקשירת NTCP למעכבי המועמדים. לכן, ניתן לחקור את הקשירה באמצעות טכניקות שונות, כגון תהודת פלסמוןפני השטח 17, ELISA, בדיקת הסטה תרמית מבוססת פלואורסצנציה (FTSA)18, FRET 19, AlphaScreen, ושיטות שונות אחרות20. בין טכניקות אלה, ITC הוא תקן מטרה בניתוח מחייב מכיוון שהוא יכול לצפות בספיגת חום או פליטה כמעט בכל תגובה21. זיקת הקשירה (KD) של NTCP ותרכובות מועמדות הוערכה ישירות באמצעות ITC; ערכי זיקה אלה היו מדויקים יותר מאלו שהושגו באמצעות מודל החיזוי של סיליקו 22.
פרוטוקול זה מכסה טכניקות בהבשלת הפטוציטים, זיהום HBV והקרנה למעכבי כניסה HBV. בקצרה, פותח מודל הפטוציטים המבוסס על קווי תאים imHC ו- HepaRG. התאים בתרבית התמינו להפטוציטים בוגרים תוך שבועיים. העלייה ברמות NTCP זוהתה באמצעות PCR בזמן אמת, כתם מערבי וציטומטריה של זרימה11. הפטיטיס B virion (HBVcc) הופק ונאסף מ- HepG2.2.15. ה-imHC או ה-HepaRG המובחנים (d-imHC, d-HepaRG) טופלו באופן מניעתי עם המועמדים נגד HBV שעתיים לפני החיסון ב-HBV virion. התוצאה הצפויה של הניסוי הייתה זיהוי הסוכנים המפחיתים את ה-HBV התאי ואת ההדבקה. פעילות אנטי-NTCP הוערכה באמצעות בדיקת קליטת TCA. ניתן לדכא את פעילות NTCP על ידי הסוכנים שקשרו באופן ספציפי את NTCP. טכניקת ITC שימשה כדי לחקור את ההיתכנות של קשירה אינטראקטיבית שיכולה לחזות מעכבים וחלבוני המטרה שלהם, ולקבוע את זיקת הקשירה (KD) של הליגנד לקולטן באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות של הקומפלקס הביומולקולרי23,24. לדוגמה, K D ≥ 1 × 103 mM מייצג כריכה חלשה, K D ≥ 1 × 106 μM מייצג כריכה בינונית, ו- K D ≤ 1 × 109 nM מייצג כריכה חזקה. ה- ΔG נמצא בקורלציה ישירה עם אינטראקציות מחייבות. בפרט, תגובה עם ΔG שלילי היא תגובה אקסרגונית, המציינת כי מחייב הוא תהליך ספונטני. תגובה עם ΔH שלילי מצביעה על כך שתהליכי הקשירה תלויים בקשרי מימן ובכוחות ואן דר ואלס. ניתן להשתמש הן בקליטת TCA והן בנתוני ITC כדי לסנן סוכני כניסה נגד HBV. התוצאות של פרוטוקולים אלה יכולות לספק בסיס לא רק לסינון נגד HBV אלא גם לאינטראקציה עם NTCP כפי שהיא מוערכת באמצעות זיקה מחייבת ופונקציית תחבורה. מאמר זה מתאר הכנה ואפיון של תאי מארח, תכנון ניסויי והערכה של הערך נגד HBV יחד עם זיקת קשירת NTCP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: יש לבצע את ההליכים הבאים במכסה מנוע זרימת סיכון ביולוגי מדרגה II או במכסה מנוע זרימה למינרית. הטיפול ב-HBV אושר אתית על ידי ה-IRB (MURA2020/1545). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל הפתרונות, הריאגנטים, הציוד וקווי התאים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת תאים מארחים (הפטוציטים בוגרים)
- תרבית הפטוציטים (3.75 × 105 תאים HepaRG או imHC) ולשמור על בקבוקון תרבית בגודל 75 ס"מ2 עם 10 מ"ל של DMEM/F12 בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% L-גלוטמין, 100 U/mL פניצילין, ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. המתן עד שהתאים יגיעו למפגש של 80%-90% (תוך שבוע).
- השליכו את המדיום הישן מהבקבוקון ושטפו את התאים עם 4 מ"ל של מלח אפוף פוספטים (PBS).
- שאפו את ה- PBS והוסיפו 4 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA.
- דגרו את הבקבוקון באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות, ובדקו את התאים הדבקים באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם עדשה אובייקטיבית של פי 10. ודא כי monolayer התנתק מן המשטח culturing.
- לעכב את הטריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של מדיום התרבית בתוספת 10% FBS לבקבוקון ולהשהות בזהירות את התאים שנקטפו. העבר את מתלה התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 300 × גרם, 25 מעלות צלזיוס.
- שאפו את הסופרנטנט מכדור התא ושתו מחדש עם 1-2 מ"ל של מדיום התרבית שחומם מראש בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקה.
- מערבבים 10 μL כל אחד מתרחיף התאים וטריפאן כחול וסופרים את התאים באמצעות המציטומטר. ודא שכדאיות התא גבוהה מ- 90% לפני שתמשיך לשלב הבא.
- זרעו 1 × 106 תאים לכל 2 מ"ל בכל באר של צלחת 6 בארות ושמרו על המדיום השלם של DME/F12 עד שהתאים מגיעים למפגש של 100%.
- להבשלת הכבד, הכינו מדיום התבגרות בכבד (מדיום E של וויליאמס בתוספת 10% FBS, 100 פניצילין U/mL, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 50 μM הידרוקורטיזון, 2 mM L-גלוטמין ו-2% DMSO).
- החלף את מדיום התרבות 2 פעמים בשבוע.
- שמור על hepatocytes במדיום התבגרות במשך 2 שבועות כדי לקבל hepatocytes בוגר מוכן לזיהום HBV.
2. כימות של NTCP סלולרי
- מדידת ביטוי NTCP באמצעות PCR בזמן אמת
- לאסוף את הכדור של hepatocytes בוגרים באמצעות טריפסיניזציה (ראה שלבים 1.2-1.5).
- חלץ RNA כולל מכדור התא באמצעות ערכת מיצוי RNA עם טיפול DNase I.
- סינתזה של cDNA מ-200 ננוגרם של רנ"א כולל באמצעות פריימר oligo-dT ומערכת שעתוק לאחור בהתאם להוראות היצרן.
- דלל את ה-cDNA ל-50 ng/μL והשתמש בו כתבנית לתגובת ה-PCR. ערבבו 2 μL של ה-cDNA המדולל עם ריאגנטים של תערובת מאסטר PCR המכילים תמיסת ערכת qRT-PCR ירוקה של SYBR עם פריימרים ספציפיים ל-5 μM NTCP (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' ו-5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
- לנורמליזציה, השתמש ב- GAPDH כגן משק בית עם פריימרים ספציפיים (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' ו- 5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3').
- הגבר את דגימות ה- cDNA באמצעות מחזור תרמי בתנאי הטמפרטורה הבאים: מחזור אחד של 3 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס (דנטורציה ראשונית); 40 מחזורים של 30 שניות ב-95°C (דנטורציה), 30 שניות ב-60°C עד 65°C (חישול), 30 שניות ב-72°C (הרחבה); מחזור אחד של 5 דקות ב-72°C (הארכה סופית).
- חשב את השינוי בקיפול NTCP בהפטוציטים בוגרים על פני תאים לא מובחנים באמצעות GAPDH כגן כיול המבוסס על שיטת 2-ΔΔCT .
- כימות NTCP באמצעות ניתוח כתמים מערביים
- קציר hepatocytes באמצעות מגרד תאים צנטריפוגה אותם ב 300 x גרם, 25 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי לאסוף את גלולת התא.
- עקוב אחר הוראות יצרן חיץ RIPA כדי לחלץ את החלבון התאי עם 100 μL של חיץ RIPA המכיל מעכב פרוטאז 1x.
- מדדו את ריכוז החלבון הכולל בשיטת החומצה הביסינצ'ונית (BCA).
- יש לערבב 12.5 μL של חלבון עם 2x צבע העמסה ביחס של 1:1 לפי נפח.
- מרתיחים את תערובת החלבונים והסולם הסטנדרטי בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- הוסף מאגר פועל 1x לתא האלקטרופורזה.
- יש לטעון 5 מיקרו-ליטר מהסולם הסטנדרטי של החלבון או 20 מיקרו-ליטר של תערובת החלבון המבושל בג'ל פוליאקרילאמיד של 10% (w/v).
- בצע אלקטרופורזה בג'ל: 50 וולט למשך 30 דקות ואחריו 90 וולט למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- הכינו קרום PVDF על ידי השרייתו במתנול למשך 30 שניות, שטפו אותו במים מזוקקים פעמיים למשך 1-2 דקות, והשרו אותו יחד עם שתי פיסות נייר סינון במאגר העברה למשך 10 דקות או עד לשימוש.
- מניחים את נייר הסינון על צלחת האנודה של תא העברה יבש למחצה; לאחר מכן, הניחו את קרום ה-PVDF, הג'ל ונייר הסינון מלמעלה, בסדר הזה.
- מעבירים את החלבונים מהג'ל לקרום ה-PVDF ב-10 וולט למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.
- חסום את הממברנה עם תמיסת חסימת WB למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- לדגום את הממברנה עם אנטי נתרן taurocholate cotransporting פוליפפטיד (אנטי NTCP) (1:100 דילול) ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
- לשטוף את הממברנה 3 x 10 דקות עם TBST.
- לדגום את הממברנה עם נוגדן נגד עזים מצומד נגד ארנבת (1:10,000 דילול) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הממברנה 3 x 10 דקות עם TBST ולאחר מכן 1 x 5 דקות עם TBS.
- זהה NTCP באמצעות מצע HRP (ראה טבלת חומרים).
- הוסיפו לפחות 0.1 מ"ל של תמיסת מצע HRP / ס"מ2 של הממברנה ודגרו את הממברנה למשך 3-5 דקות בחושך.
- דמיינו את NTCP באמצעות מערכת תיעוד ג'ל במצב chemiluminescence, בחר את אפשרות הסמן עבור הממברנה, התאם את זמן החשיפה עם מצב מצטבר כל 1 דקות, וצלם את התמונה עם זמני חשיפה שונים במשך 5 דקות.
- הפשיטו ובדקו את הכתם עם נוגדן נגד GAPDH לעכבר (דילול 1:200,000) ונוגדן משני נגד עיזים מצומד HRP (דילול 1:10,000).
- מדידת רמת NTCP באמצעות ציטומטריה של זרימה
- לאסוף את כדורי התא של hepatocytes בוגר על ידי דגירה של התאים עם 8 mM EDTA במשך 15 דקות.
הערה: הימנע משימוש בטריפסין או בפרוטאזות אחרות שעלולות לשבש את הקולטנים על פני התא. מכיוון ש-NTCP הוא חלבון קולטן על פני התא, נזק כתוצאה מטריפסיניזציה יכול לתת תוצאות שליליות. - לתקן את hepatocytes עם 300 μL של 3.7% paraformaldehyde ב 1x PBS במשך 15 דקות. העבר את מתלה התא לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 × גרם, 25 °C.
- לשטוף את התאים 2x עם 700 μL של 1x PBS עם 1% FBS (v / v), צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 × גרם, 25 °C, להוסיף 300 μL של 0.05% Triton X-100 ב PBS גלולה התא, ולדגור את התאים בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות כדי לחדור אותם.
- צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 × גרם, 25 מעלות צלזיוס, לשטוף את כדור התא 3 x 1 דקות עם 700 μL של PBS המכיל 1% FBS (v / v). דגירה של התאים עם הנוגדן העיקרי נגד NTCP (דילול 1:100) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לשטוף את התאים 3 x 1 דקות עם חיץ Perm / Wash צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 × גרם, 25 מעלות צלזיוס.
- הכתימו את התאים בנוגדן משני המצומד לאלקסה פלואור 488 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לשטוף את התאים 3 x 1 דקות עם חיץ Perm / Wash צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 × גרם, 25 מעלות צלזיוס. החזירו את כדור התא עם 200 μL של PBS עם 1% FBS (v/v).
- הפעל את ציטומטר הזרימה, חמם את הלייזר למשך 15 דקות ובצע ניקוי שגרתי.
- בחר את פרמטרי המדידה, כולל פיזור קדימה (FSC), פיזור צד (SSC) ואיזותיוציאנט פלואורסצין (FITC) או פיקוריתרין (PE), והגדר את התאמת הפיצוי האוטומטי על-ידי התוכנה. כלול את דגימות בקרת הפיצוי: בקרה לא מוכתמת, בקרה מוכתמת ב- INTC ובקרה מוכתמת ב- PE.
הערה: פרמטרים FSC ו - SSC משמשים לקביעת הגודל והפירוט של תאים בודדים כדי לבחור את אוכלוסיית התאים לניתוח gating. לגלאי התעלה הפלואורסצנטית יש ערוצי FITC ו - PE . עבור פרוטוקול זה, בחר את ערוץ FITC כדי לזהות Alexa Fluor 488. - הפעל את הדגימה הלא מוכתמת בקצב זרימה נוזלי בינוני (60 μL/min), התאם את הסף של FSC ו- SSC עד שהם יכסו את אוכלוסיית התאים המעניינת, סמן את אזור השער באזור זה והחל על כל בקרות הפיצוי.
- הגדר את שפופרת הפוטומולטיפלייר הפלואורסצנטית (PMT) באמצעות הבקרה הלא מוכתמת, והתאם את מתח ה- PMT של FITC או PE ברביע השלילי. הפעל את הדגימה המוכתמת החיובית והתאם את FITC או PE בסולם הרביע החיובי. הפעל את הפקדים הלא מוכתמים, המוכתמים ב- FITC או מוכתמים ב- PE, חשב את הפיצוי והחל אותו על הגדרות הדגימה. הפעל את דגימת ההפטוציטים כדי למדוד את רמת NTCP.
- נתחו את ההפטוציטים המוכתמים באמצעות תוכנת ציטומטר זרימה (ראו טבלת חומרים).
- תחת חלונות BD FACSuite, לחץ על צינור הבקרה בכרטיסייה מקורות נתונים והמתן עד שהנתונים הגולמיים יופיעו.
- בכרטיסיה גליון עבודה בצד שמאל, לחץ על לחצן שער האליפסה , בחר את אוכלוסיית התאים ב- SSC ואת תרשים הנקודה של FSC באמצעות סמן העכבר והמתן עד שהעיגול P1 יופיע.
- לחץ על הלחצן Interval Gate וסמן את האזור בהיסטוגרמה של FITC, החל מערך עוצמת הפלואורסצנציה הגבוה ביותר לצד ימין. שימו לב לקו P2 שמופיע.
- לחץ על שפופרת הניסוי וראה שהנתונים בכרטיסיה גליון עבודה משתנים. לחץ על לחצן סטטיסטיקה ולאחר מכן על השטח הריק בגליון העבודה. שים לב לערכים הסטטיסטיים של אוכלוסיית NTCP המופיעים.
- לאסוף את כדורי התא של hepatocytes בוגר על ידי דגירה של התאים עם 8 mM EDTA במשך 15 דקות.
3. ייצור חלקיקי HBV שמקורם בתרבית תאים (HBVcc)
- תרבית HepG2.2.15 במדיום שלם (DMEM בתוספת 10% FBS, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין) בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ למשך 24 שעות.
- החלף את המדיום השלם בתוספת גנטיצין של 380 מיקרוגרם/מ"ל (G418) כאשר HepG2.2.15 מגיע למפגש של 60%-70%. לקצור את המדיום המותנה כל יומיים; לאחסן את המדיום המכיל HBV ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר פסולת תאים על ידי צנטריפוגה של הסופרנטנט ב-5,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. אסוף את המדיום המותנה באמצעות מזרק של 20 מ"ל וסנן אותו דרך מסנן בעל קשירה נמוכה של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר פסולת תאים.
- כדי לרכז HBV, דלל נפח 1 של רכז עם 3 כרכים של supernatant מסונן משלב 3.3 בצינור צנטריפוגה חרוטי ולערבב בזהירות את הפתרון על ידי היפוך צינור. מניחים את התערובת בחום של 4 מעלות למשך שעה. צנטריפוגה של התמיסה במשך שעה אחת ב 1,500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס וודא כי גלולה אוף-ווייט נראית לעין.
הערה: עבור כל 30 מ"ל של סופרנטנט מסונן משלב 3.3, הוסף 10 מ"ל של הרכז כדי להגיע לנפח כולל של 40 מ"ל. - הערך את titer HBV (שווה ערך לגנום) עם HBV 1.3-mer WT replicon כעקומה סטנדרטית הנעה בין 1 × 102 ל 1 × 1010 באמצעות PCR מוחלט בזמן אמת, כפי שתואר קודם לכן11.
- שחזרו בעדינות את הכדור ב-FBS ואחסנו עד שנה אחת ב-−80 מעלות צלזיוס ב-aliquots חד-פעמיים.
4. בדיקת כניסה נגד HBV
- שמור על 100% מפגש imHC או HepaRG ב-6 צלחות טובות במדיום ההבשלה (2% DMSO במדיום E של וויליאמס, 10% FBS, 100 פניצילין U/mL, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 50 מיקרומטר הידרוקורטיזון ו-2 mM L-גלוטמין) למשך שבועיים ושנה את המדיום פעמיים בשבוע.
- שאפו את המדיום, ואז הוסיפו את הכורכומין (10-30 μM) או 4 μM ציקלוספורין A (CsA) מדולל עם מדיום E של ויליאם למשך שעתיים. שאפו את מעכב הכניסה HBV המועמד והחליפו אותו ב-1 מ"ל של מדיום E של ויליאם המכיל 4% פוליאתילן גליקול.
- הוסיפו חלקיקי HBV למדיום התרבית בריבוי זיהום (MOI) של 100 לכל באר ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. השליכו את ה-supernatant, הוסיפו 2 מ"ל של PBS קר וסובבו בעדינות כדי לשטוף את המדיום הישן עם HBV לא מאוגד.
- הוסף 2 מ"ל של מדיום E שלם של ויליאם ותרבות במשך 7 ימים. שאפו את המדיום, שטפו את התאים עם PBS אחד, וקבעו את התאים עם 3.7% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. חלחלו וחסמו את התאים הנגועים עם תמיסה חוסמת IF (0.2% Triton X-100 ו-3% אלבומין בסרום בקר ב-PBS) ודגירה שלהם למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
- מוסיפים את הנוגדן העיקרי (אנטיגן הליבה נגד HBV) בדילול 1:200 בתמיסת החסימה ודוגרים לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים 3 x 1 דקות עם תמיסת כביסה (0.5% Tween 20 ב PBS).
- הוסיפו נוגדן משני (דילול 1:500) לתמיסת חסימת IF, דגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ושטפו את התאים 3X1 דקות בתמיסת כביסה.
- הרכב את הדגימה עם מדיום הרכבה אנטי-פאדי עם 4',6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI), וכסה בכיסוי זכוכית. זהה את אות הפלואורסצנציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסנן DAPI (Ex 352-402 nM ו- Em 417-477) ומסנן PE (Ex 542-582 ו- Em 604-644), יחד עם עדשה אובייקטיבית של פי 20, וקבע פעילות כניסה נגד HBV של התרכובות המועמדות.
5. בדיקת קשירת תאי HBV
- שמור על 100% מפגש imHC או HepaRG ב-6 צלחות טובות במדיום ההבשלה (2% DMSO במדיום E של וויליאמס, 10% FBS, 100 פניצילין U/mL, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 50 מיקרומטר הידרוקורטיזון ו-2 mM L-גלוטמין) למשך שבועיים ושנה את המדיום פעמיים בשבוע.
- שאפו את המדיום, ואז הוסיפו כורכומין (10-30 מיקרומטר) או ציקלוספורין A (4 מיקרומטר) מדולל במדיום E של ויליאם למשך שעתיים. שאפו את מעכב הכניסה HBV והחליפו אותו ב-1 מ"ל של מדיום E של ויליאם המכיל 4% פוליאתילן גליקול.
- הוסיפו חלקיקי HBV למדיום התרבית ב-MOI של 100 לכל באר ודגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לאפשר קשירת HBV להפטוציטים. השליכו את המדיום המכיל HBV לא מאוגד, הוסיפו 2 מ"ל של PBS קר והסתחררו בעדינות כדי להסיר עקבות של המדיום המושקע.
- קצור את התאים הנגועים באמצעות מגרד תאים ושבש את התאים עם מאגר תזה. העבר את הליזאט לצינור איסוף וחלץ דנ"א כולל כדי להעריך את הדנ"א של HBV באמצעות PCR בזמן אמת עם פריימרים ספציפיים עבור HBV (פריימר קדמי: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', ופריימר הפוך: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') באמצעות PRNP (פריימר קדמי: 5'- GACCAATTTATGCCTACC-3', פריימר הפוך: 5'- TTTATGCCTACCCTCCTA-3') כבקרה פנימית.
- הגבר את מוצרי ה-PCR במחזור תרמי באמצעות תנאי הטמפרטורה המתוארים בשלב 2.1.
- חישוב רמות דנ"א יחסית של HBV/1 × 106 תאים בטיפול לעומת בקרה באמצעות PRNP כגן הכיול המבוסס על שיטת 2-ΔΔCT .
6. בדיקת ספיגת חומצה טאורוכולית (TCA)
- שמור על 100% תאים מחוברים של imHC ו- HepaRG במדיום ההבשלה למשך 14 יום.
- לשאוף את המדיום ולשטוף את hepatocytes עם 1x PBS. הוסיפו כורכומין או ציקלוספורין A (10-50 מיקרומטר) מדולל במדיום E של ויליאם למשך שעתיים. החלף את המדיום בתמיסת חומצה טאורוכולית נתרן (0.5 M נתרן טאורוקולאט הידרט ב- 1x HEPES) ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- שאפו את תמיסת החומצה הסודיום טאורוחולית, ושטפו 3x עם HEPES קר 1x. הוסיפו 300-500 מיקרון של HEPES קר 1x וקצרו את התאים עם מגרדי תאים על קרח.
- הומוגניזציה של התאים על ידי אולטרה סאונד בתדר של 20 קילוהרץ במשך 20 שניות ודגירה על קרח במשך 5 דקות. צנטריפוגה של הליזאטים ב-10,000 × גרם למשך 20 דקות כדי לזרז את פסולת התאים. אסוף את העל-טבעי והערך את ריכוז החומצה הטאורוכולית התוך-תאית באמצעות ערכת בדיקה של TCA ELISA (ראה טבלת חומרים).
7. קביעת אינטראקציות חלבון-ליגנד באמצעות קלורימטריה איזותרמית
הערה: מערכת בדיקה זו פותחה על בסיס MicroCal PEAQ-ITC (תוכנת ITC).
- הכן את המאגר (50 mM חיץ Tris-HCl, pH 7.0).
- הכן 15 μM של NTCP במאגר.
- הכן 150 μM מועמדים לפתרונות מעכבי HBV במאגר.
- שטפו את תא הדגימה, את תא הייחוס ואת המזרק במכשיר ITC באמצעות המאגר (שלב 7.1.).
- הפעל את תוכנת ITC על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה במערכות Windows. תחת הכרטיסייה הפעל הדגשת ניסוי, בחר שיטת microCal עבור 19 Injection.itcm ולחץ על פתח. כאשר חלון חדש נפתח, לחץ על הכרטיסייה ניקוי, ובחלון שיטת ניקוי, בחר בלחצן 'שטיפה' עבור 'שיטת ניקוי תאים' ובלחצן 'שטיפה' עבור ' שיטת ניקוי מזרק'. לחץ על הבא ופעל לפי ההוראות שעל המסך.
הערה: שלב הכביסה עשוי להימשך 1.4 שעות.
- הפעל את תוכנת ITC על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה במערכות Windows. תחת הכרטיסייה הפעל הדגשת ניסוי, בחר שיטת microCal עבור 19 Injection.itcm ולחץ על פתח. כאשר חלון חדש נפתח, לחץ על הכרטיסייה ניקוי, ובחלון שיטת ניקוי, בחר בלחצן 'שטיפה' עבור 'שיטת ניקוי תאים' ובלחצן 'שטיפה' עבור ' שיטת ניקוי מזרק'. לחץ על הבא ופעל לפי ההוראות שעל המסך.
- טען את הדגימה לתוך ITC; תחת הכרטיסייה הפעל ניסוי , לחץ על הלחצן טען וקרא את ההוראות שעל המסך. לחץ על הבא ופעל לפי הוראות הווידאו עד להשלמת שלב טעינה זה.
- מלא את תא ההפניה במאגר פתרונות באמצעות מזרק. מלא את תא הדגימה במאגר NTCP של 15 μM באמצעות מזרק והסר את תמיסת ה- NTCP העודפת מעל תא הדגימה. מלאו את המזרק בתמיסת 150 μM של הכורכומין (ליגנד), והימנעו מבועות אוויר במזרק.
- הפעל את הדוגמה, ותחת הכרטיסייה הפעל ניסוי , לחץ על לחצן הפעלה . התבונן בחלונות בצד שמאל המציגים מידע ניסיוני ותפאורה ניסיונית. הזן את ריכוזי הליגנד והחלבון כ- 150 μM ב-[Syr], 15 μM ב-[Cell] ו-25 °C בטמפרטורה.
- בתוכנה, לחץ על התחל כדי לבצע את תהליך ההזרקה והמתן 1.4 שעות עד שהאינטראקציה בין החלבון לליגנד תושלם.
הערה: לחצן הניתוח הדהוי מופיע מתחת לחלונות התוכנה. - שים לב כי כפתור הניתוח מתבהר לאחר השלמת ההזרקה. לחץ על כפתור הניתוח בתוכנת הבקרה כדי לנתח את הנתונים הגולמיים באמצעות תוכנת הניתוח. לחץ על סקירה כללית כדי להציג את הנתונים הגולמיים ובחר את הדגם המתאים כסט אחד של אתר כריכה.
- ודא שמצב האיגוד מציג את נתוני הניסוי (איגוד, ללא כריכה, בקרה או בדיקת נתונים) ושערכי הניסוי (KD, ΔG, ΔH, TΔS ו- N) מוצגים בלוח התוכנה.
- ייצא את הפרמטרים התרמודינמיים המנבאים את קשירת האינטראקציה, כולל קשר מימן, קשר ואן דר ואלס ואינטראקציה הידרופובית לפורמט tif או jpeg.
- לאחר השלמת הניסוי, שטף את תא הדגימה לאחר שלב 7.4.
8. ניתוח סטטיסטי
- בצע את כל הניסויים בשלושה שכפולים עצמאיים (n = 3).
- הצג נתונים ניסיוניים כאמצעי ± SD, ובצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי הרצויה.
- השתמש במבחן t של תלמידים דו-זנביים לא משויכים כדי להשוות בין שני ערכים ממוצעים או החל ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) עם Dunnett להשוואות מרובות בין ערכים מרובים לערך פקד. הגדר את רמת המובהקות ב- p ≤ 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נצפו תכונות של הבשלת הכבד, כולל תאים דו-צדדיים ומורפולוגיה בצורת מצולע (איור 1), במיוחד בשלב ההבחנה, imHC (איור 1A). עלייה גדולה בביטוי NTCP נמדדה ב-d-HepaRG וב-d-imHC פי 7 ופי 40, בהתאמה (איור 1B). הצורה המגולגנת מאוד של NTCP, שהונחה כמעניקה רגישות לכניסת HBV, זוהתה יותר ב-d-imHC מאשר ב-d-HepaRG (איור 1C). ה-imHC הממוין הכיל רמות NTCP גבוהות ב-65.9% בהשוואה לתאים הלא מובחנים (איור 1D).
איור 2A מציג סיכום של הטיפול המניעתי. איור 2B מראה צביעת אימונופלואורסצנציה של HBV שבוצעה כדי להעריך את פעילויות הכניסה נגד HBV ביום השביעי לאחר ההדבקה, ואילו איור 2C מתאר את פרוטוקול הבדיקה המחייבת של HBV. רמת קשירת ה-HBV על פני השטח של התא הוערכה על-ידי PCR בזמן אמת (איור 2D). כדי לקבוע אם NTCP היה הקולטן לחיבור HBV, נקבעה קליטת TCA עבור מעכבי הקשירה המועמדים (איור 2E). בהתבסס על מודל זה, הפעילות המעכבת של תרכובות מועמדות הפחיתה את קשירת HBV באמצעות NTCP.
השינוי הקלורימטרי זוהה באמצעות זריקות רצופות לתא הדגימה (איור 3). רגרסיה סטנדרטית של ריבועים לא ליניאריים לפחות שורטטה על סמך אתר כריכה אחד שהותאם היטב לנתונים. הקו המוצק הצביע על ההתאמה הטובה ביותר לערכי הניסוי (איור 3A,B). טבלה 1 מציגה פרמטרים תרמודינמיים בקורלציה עם קשירת NTCP עם ציקלוספורין A (CsA) או תרכובת מועמדת.
איור 1: התבגרות בכבד של HepaRG ו-imHC עם אפיון NTCP. שתי שורות התאים עברו תרבית במדיום התבגרות בכבד במשך שבועיים. (A) מאפייני הפטוציטים כגון תאים דו-צדדיים ומורפולוגיה בצורת מצולע נצפו באופן בלעדי בשלב ההבשלה של imHC. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) הביטוי של NTCP הוסדר הן ב- HepaRG והן ב- imHC. NTCP מנורמל עם GAPDH היה גבוה יותר ב- imHC מאשר ב- HepaRG. (C) צורה גליקוזילית מאוד של NTCP נצפתה לאחר ההבשלה. (D) אחוז הגובה של NTCP ב-d-imHC הוערך באמצעות ציטומטריה של זרימה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD. *, **, ו- *** מייצגים הבדל סטטיסטי עם p < 0.05, p < 0.01 ו- p < 0.001, בהתאמה. קיצורים: NTCP = נתרן טאורוחולאט cotransporting פוליפפטיד; GAPDH = גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז; NTCP-FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט המסומן NTCP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: טיפול מניעתי ב-CCM הפחית את כניסת הנגיף, את ה-DNA התוך-תאי של HBV ואת פעילות ספיגת ה-TCA . (A) d-imHC טופלו מראש ב-CCM במשך שעתיים לפני החיסון ב-HBV. (B) פעילות הכניסה נגד HBV נקבעה על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה ביום 7 לאחר ההדבקה. (C) לוח זמנים סכמטי של פרוטוקול מחייב HBV מוצג. (D) רמת הדנ"א של HBV המאוגד על הפטוציטים הוערכה והושוותה ל-4 μM CsA ולמעכב הכניסה הקלאסי HBV 25 יחידות/מ"ל הפרין. (E) ההשפעה של CCM של 10-30 μM על עיכוב ספיגת TCA מתווכת באמצעות קולטן NTCP. קיצורים: CCM = כורכומין; HBV = וירוס הפטיטיס B; TCA = חומצה טאורוכולית; d-imHC = imHC מובחן; CsA = ציקלוספורין A; HP = הפרין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הזיקה של NTCP למולקולות בודדות (CsA או תרכובת מועמדת) הודגמה באמצעות ITC. פרופיל ה-ITC לשילוב של NTCP עם (A) CsA או (B) כורכומין נוצר מהזרקה רציפה של תרכובת (150 μM CsA או מועמד) לתמיסת NTCP (15 μM של NTCP, pH 7.0, 25 °C). הנתונים הגולמיים הקלורימטריים בין הספק דיפרנציאלי (μcal/s) לזמן (min) שורטטו. הנתונים נותחו על סמך מודל כריכה של אתר אחד שבו הקווים המוצקים הצביעו על התוצאות המתאימות ביותר. במהלך הזרקת ליגנדות (CSA או כורכומין) לתמיסת NTCP, האנתלפיה (ΔH) השתנתה לאחר עלייה בריכוז הליגנד בתא הדגימה. נתונים אלה מצביעים על כך שתגובת הכריכה התרחשה. קיצורים: CsA = ציקלוספורין A; NTCP = נתרן טאורוחולאט cotransporting פוליפפטיד; ITC = קלורימטריה איזותרמית טיטרציה; DP = הספק דיפרנציאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| חלבון | ליגנד | קבוע כריכה (KD) | שינוי אנתלפיה (ΔH) | שינוי אנטרופיה (ΔTΔS) | שינוי אנרגיה חופשית של גיבס (ΔG) | סוג הכריכה |
| (ז-1) | (קק"ל/מול) | (קק"ל/מול) | (קק"ל/מול) | |||
| NTCP אנושי (SLA10A1) | CCM | 1.21 ×10-6 | -1 | 0.6 | -0.39 | קשר מימן |
| NTCP אנושי (SLA10A1) | TCA | 1 ×10-9 | 80 | -96 | -16 | אינטראקציה הידרופובית |
טבלה 1: פרמטרים תרמודינמיים הנובעים מהאינטראקציה בין NTCP לבין תרכובות בודדות (CCM ו- TCA) באמצעות ITC. קיצורים: NTCP = נתרן טאורוחולאט cotransporting פוליפפטיד; CCM = כורכומין; TCA = חומצה טאורוכולית; ITC = קלורימטריה של טיטרציה איזותרמית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זיהום HBV מתחיל באמצעות זיקה נמוכה קשירה לפרוטאוגליקנים של הפראן סולפט (HSPGs) על הפטוציטים25, ולאחר מכן קשירה ל- NTCP עם הפנמה לאחר מכן באמצעות אנדוציטוזה26. מכיוון ש-NTCP הוא קולטן חיוני לכניסת HBV, ניתן לתרגם קלינית את הכניסה ל-HBV להפחתת זיהום דה נובו , העברה מאם לילד (MTCT) והישנות המחלה לאחר השתלת כבד. הפרעה לכניסת הנגיף תהיה תרופה חלופית אפשרית לזיהום כרוני ב-HBV.
כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול הנ"ל מסוכמים כאן. בעת הכנת תאים מארחים, ודא כי הפטוציטים מגיעים למפגש של 100% לפני הוספת מדיום ההבשלה עם 2% DMSO. גידול הפטוציטים תת-קרקעיים ב-2% DMSO יוביל למוות ולניתוק של תאים. ניתן להאריך את תקופת ההבשלה עד 4 שבועות כדי למקסם את ביטוי NTCP27,28, אם כי מומלץ תקופת הבשלה של שבועיים.
שלוש טכניקות הוצעו לכימות ביטוי NTCP תאי. מומלץ למשתמשים לבחור את הטכניקה שהם מכירים היטב; כאן, העדפנו ציטומטריה של זרימה על פני ניתוח כתמים מערבי מכיוון שהיא נוחה, מהירה וקלה.
לצורך ייצור חלקיקי HBV שמקורם בתרבית תאים (HBVcc), HepG2.2.15 נגזר מ-HepG2 על ידי טרנספקציה חולפת עם גנום באורך מלא של HBV יחד עם גן העמידות לגנטיצין (G418)29. מדיום התרבית צריך להכיל גנטיצין של 380-500 מיקרוגרם/מ"ל, אחרת התאים לא ייצרו HBVcc. יש להשתמש במסנן 0.45 מיקרומטר בעל קשירת חלבון נמוכה כדי להבהיר את הסופר-נטנט כדי למנוע אובדן תפוקת HBV. לריכוז HBV, פוליאתילן גליקול (PEG) שימש עם צנטריפוגה סטנדרטית. חלקיקי HBV יכולים גם להיות מרוכזים באמצעות שיפוע סוכרוז ואולטרה-צנטריפוגציה. יש להימנע ממחזורי הקפאה והפשרה מרובים מכיוון שההדבקה תפחת.
בבדיקת הכניסה נגד HBV, ההפטוציטים חייבים להגיע למפגש של 100% לפני ההשראת ההבשלה. פרוטוקול זה פותח על בסיס טיפול מניעתי. תאים מארחים נחשפו לתרכובות המועמדות במשך שעתיים לפני ההדבקה ב-HBV12. לאחר 7 ימים לאחר ההדבקה, הוערכה הדבקה ב-HBV באמצעות אימונופלואורסצנציה. כל הרכיבים, הריכוזים של תמיסת החסימה, נוגדנים ראשוניים ומשניים ושלבי הכביסה חייבים להיות מותאמים כדי להשיג את התוצאה הטובה ביותר עם מינימום כתמים לא ספציפיים. כאן, סיפקנו ריכוזים וטכניקות אופטימליים.
פרוטוקול בדיקת קליטת TCA מתאר את תקן הזהב לעיכוב הובלת NTCP. שינינו את הפרוטוקול כדי להימנע מ-TCA רדיואקטיבי. השלבים הקריטיים לבדיקת קליטת TCA הם שטיפת תאים וקצירתם. כל ההליכים הללו חייבים להתבצע על קרח כל הזמן כדי למנוע פעילות תאית נוספת - הפנמה של התרכובת. לאחר הומוגניזציה של התאים וסילוק פסולת תאים, יש לשאוף בעדינות את הסופר-נאטנט מבלי להפריע לכדור. אם המתקן של המשתמש מאפשר שימוש בטכניקת ה-scintillation הנוזלית, 3חומצה H-taurocholic משמשת בדרך כלל במחקרי הובלה וספיגה של TCA. כפי שאימתנו קליטת TCA באמצעות ELISA, טכניקה חלופית זו יכולה להחליף את השימוש בתרכובת הרדיואקטיבית.
ITC היא שיטה ביופיזית הנמצאת בשימוש נרחב לקביעת הפרמטרים התרמודינמיים הקשורים לאינטראקציות בין חלבונים מסיסים לבין ליגנדות בעלות משקל מולקולרי קטן30,31. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את האינטראקציה של ליגנדות שונות עם מולקולה קטנה או חלבון. ITC היא שיטה ישירה ולא פולשנית ללא שלבים נוספים לזיהוי אותות, ללא מגבלות משקל מולקולריות וללא תיוג, אימוביליזציה או כל שינוי כימי אחר. המגבלה של ITC היא התנאי המוקדם של ריכוזים גבוהים של החומרים המקיימים אינטראקציה. חלבון וליגנד צריכים להיות מטוהרים מאוד ומסיסים מספיק במים (10-100 מיקרומטר) בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת עם ערבוב. ניתן לזהות את תמיסת החלבון הלא יציבה באמצעות שינוי אות חום כפונקציה של זמן.
הפטוציטים משופרים-NTCP אנושיים מספקים מודל חלופי למחקר במבחנה של זיהום HBV, אך הם דומים ל- HepaRG ולהפטוציטים אנושיים ראשוניים. דגמים מארחים אלה נפגעים בשל האמינות המוגבלת והרגישותשלהם 8,33. התפשטות HBV לא יעילה בתאי HepG2-NTCP או Huh7-NTCP הוכחה על ידי אינוקולום HBV נמוך שמקורו בתאים המייצרים HBVcc. במספר מחקרים, HBV שימש להדבקת תאי המטרה ב-MOI של 1,00033,34. החלקיקים התת-ויראליים ב-HBVcc מכילים חלבון מעטפת HBV (L/M/S) וקושרים באופן תחרותי NTCP, וכתוצאה מכך ירידה בהדבקה35. כדי להתגבר על מגבלה זו, פרוטוקול זה שינה את תרבות HepaRG או imHC עם פרוטוקול הבשלה כדי למקסם את רמות NTCP. HBVcc שמקורו ב-HepG2.2.15 היה מרוכז לפני שנעשה בו שימוש כאינוקולום. ההדבקה ב-HBV הייתה גבוהה מ-80% ב-imHC מובחן בהתבסס על מדידת אנטיגן הליבה HBV11.
תיארנו את הזיהוי של תרכובות אנטי-HBV המכוונות ל-NTCP כדי להפריע לכניסת הנגיף, ואימצנו הליך הבשלה בכבד כדי להעלות את רמות ה-NTCP. כדי לזהות מעכבי כניסה, הפטוציטים טופלו מראש בתרכובות מועמדות במשך שעתיים לפני ההדבקה ב- HBV ב -4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר קשירת נגיפי אך לא כניסה. הירידה בהדבקה ב-HBV נבדקה ביום השביעי לאחר ההדבקה. הנתונים המייצגים כללו ציקלוספורין A, מעכב NTCP קלאסי, כבקרה חיובית לאימות המודל.
מאחר ש-NTCP מקל על תפקודי אנדוציטוזה בתיווך טרנספורטר וקולטן, מעכבי כניסה של HBV יכולים להתמקד לפחות באחד מהמנגנונים הללו. ניתן להעריך את העיכוב של הובלת NTCP באמצעות בדיקת קליטת TCA המבוססת על ELISA, תוך ביטול ה- TCA הרדיואקטיבי מהפרוטוקול הקלאסי36. הזיקה בין NTCP לבין מעכב הכניסה נמדדה באמצעות ITC. טכניקה זו סיפקה פרמטרים תרמודינמיים חיוניים, כולל הסטויכיומטריה (n), קבוע הדיסוציאציה (KD), שינוי באנרגיה חופשית (ΔG), אנתלפיה (ΔH), אנטרופיה (ΔS) וקיבולת חום של קשירה (ΔCp). חומרים שונים נגד HBV זוהו על ידי עגינה מולקולרית, כגון קוורצטין, רוטין, הספרידין ולופרול, שיכולים לקשור באופן ספציפי HBV הפוך transcriptase דומה ללמיבודין, אנלוגי נוקלאוזיד. התרכובות נחקרו באמצעות ITC והפגינו אנרגיית גיב שלילית (−ΔG) שנעה בין −9.3 ל-−5.2 קק"ל/מול ו-KD של 1 × 10-6 עד 1 × 10-3 M עם HBV פולימראז37. יחד, הנתונים המתקבלים מהמבחנים הנ"ל יסייעו לסנן את היעילות האנטי-ויראלית של תרכובות מועמדות הפועלות כמעכבי כניסה של HBV. הפרוטוקול שנקבע יהיה שימושי לגילוי אנטגוניסטים / מעכבי NTCP חדשים. דיכוי הכניסה הנגיפית יכול להיות שימושי בטיפול מניעתי וטיפולי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.
Acknowledgments
פרויקט מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת Mahidol והמחקר והחדשנות המדעית של תאילנד (TSRI) המוענקים בנפרד ל- A. Wongkajornsilp ו- K. Sa-ngiamsuntorn. עבודה זו נתמכה כספית על ידי המשרד הלאומי למחקר מדעי ומדיניות חדשנות באמצעות היחידה לניהול תוכניות לתחרותיות (מענק מספר C10F630093). A. Wongkajornsilp הוא זוכה במענק Chalermprakiat של הפקולטה לרפואה בית החולים סיריראג ', אוניברסיטת Mahidol. המחברים רוצים להודות למיס סאווין סימקאן (המרכז המצוין לגילוי תרופות, הפקולטה למדעים, אוניברסיטת מאהידול) על עזרתה בטכניקת ITC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HepaRG Cells, Cryopreserved | Thermo Fisher Scientific | HPRGC10 | |
| Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line | Merck | SCC249 | |
| Reagents | |||
| 4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution | FUJIFLIM Wako chemical | 163-20145 | |
| BD Perm/Wash buffer | BD Biosciences | 554723 | Perm/Wash buffer |
| Cyclosporin A | abcam | 59865-13-3 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | 8 mM |
| G 418 disulfate salt | Merck | 108321-42-2 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail EDTA-free (100x) | Thermo Scientific | 78425 | |
| HEPES | Merck | 7365-45-9 | |
| illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit | GE Healthcare | 25-0500-71 | |
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| KAPA SYBR FAST qPCR Kit | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara bio | PT4421-2 | concentrator |
| Luminata crescendo Western HRP substrate | Merck | WBLUR0100 | |
| Master Mix (2x) Universal | Kapa Biosystems | KK4600 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | macherey-nagel | 1806/003 | |
| Phosphate buffered saline | Merck | P3813 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Merck | 25322-68-3 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo scientific | P36930 | |
| Recombinant NTCP | Cloud-Clone | RPE421Hu02 | |
| RIPA Lysis Buffer (10x) | Merck | 20-188 | |
| TCA | Sigma | 345909-26-4 | |
| TCA Elisa kit | Mybiosource | MB2033685 | |
| Triton X-100 | Merck | 9036-19-5 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Dilute to 0.125% |
| Antibodies | |||
| Anti-NTCP1 antibody | Abcam | ab131084 | 1:100 dilution |
| Anti-GAPDH antibody | Thermo Fisher Scientific | AM4300 | 1:200,000 dilution |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab205718 | 1:10,000 dilution |
| HRP goat anti-mouse secondary antibody | Abcam | ab97023 | 1:10,000 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | 1:500 dilution |
| Reagent composition | |||
| 1° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| Sodium azide | Sigma | 199931 | Working concentration: 0.05% |
| Hepatocyte Growth Medium | |||
| DME/F12 | Gibco | 12400-024 | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Hepatic maturation medium | |||
| Williams’ E medium | Sigma Aldrich | W4125-1L | |
| 10% FBS | Sigma Aldrich | F7524 | |
| 1% Pen/Strep | HyClon | SV30010 | |
| 1% GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 5 µg/mL Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-100MG | |
| 50 µM hydrocotisone | Sigma Aldrich | H0888-1g | |
| 2% DMSO | PanReac AppliChem | A3672-250ml | |
| IF Blocking solution | |||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| 3% BSA | Sigma | A7906-100G | Working concentration: 3% |
| 0.2% Triton X-100 | Sigma | T8787 | Working concentration: 0.2% |
| RIPA Lysis Buffer Solution | Merck | 20-188 | Final concentration: 1X |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78425 | Final concentration: 1X |
| Na3VO4 | Final concentration: 1 mM | ||
| PMSF | Final concentration: 1 mM | ||
| NaF | Final concentration: 10 mM | ||
| Western blot reagent | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | |
| 1x TBST | 0.1% Tween 20 | ||
| 1x PBS | Gibco | 21300-058 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
| Polyacrylamide gel | Bio-Rad | 161-0183 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | Final concentration: 0.05% |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05% |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Final concentration: 1X |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 161-0374 | |
| WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer | |||
| 1x TBST | |||
| 5% Skim milk (nonfat dry milk) | Bio-Rad | 170-6404 | Working concentration: 5% |
| 1x Running buffer 1 L | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 14.4 g |
| SDS | Merck | 7910 | Working concentration: 0.1% |
| Blot transfer buffer 500 mL | |||
| 10x Tris-buffered saline (TBS) | Bio-Rad | 170-6435 | Final concentration: 1X |
| Glycine | Sigma | G8898 | 7.2 g |
| Methanol | Merck | 106009 | 100 mL |
| Mild stripping solution 1 L | Adjust pH to 2.2 | ||
| Glycine | Sigma | G8898 | 15 g |
| SDS | Merck | 7910 | 1 g |
| Tween 20 | Merck | 9005-64-5 | 10 mL |
| Equipments | |||
| 15 mL centrifuge tube | Corning | 430052 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Airstream Class II | Esco | 2010621 | Biological safety cabinet |
| CelCulture CO2 Incubator | Esco | 2170002 | Humidified tissue culture incubator |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detector | Bio-Rad | 1855196 | |
| FACSVerse Flow Cytometer | BD Biosciences | 651154 | |
| Graduated pipettes (10 mL) | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Graduated pipettes (5 mL) | Jet Biofil | GSP010005 | |
| MicroCal PEAQ-ITC | Malvern | Isothermal titration calorimeters | |
| Mini PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | Electrophoresis chamber |
| Mini Trans-blot absorbent filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Omega Lum G Imaging System | Aplegen | 8418-10-0005 | |
| Pipette controller | Eppendorf | 4430000.018 | Easypet 3 |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | Power supply |
| PVDF membrane | Merck | IPVH00010 | |
| T-75 cell culture flask | Corning | 431464U | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | Semi-dry transfer cell |
| Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) | Sonics & Materials | ||
| Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge | Esco | T1000R | Centrifuge with swinging bucket rotar |
References
- Levrero, M., Zucman-Rossi, J.
- Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
- Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
- Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
- Mak, L. -Y., Seto, W. -K., Yuen, M. -F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
- Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
- Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
- Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
- Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
- Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
- Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
- Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
- Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
- Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
- Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
- Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
- Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
- Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
- Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
- Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
- Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
- Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
- Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
- Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
- Srivastava, V. K., Yadav, R. Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. Misra, G. , Academic Press. 125-137 (2019).
- Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
- Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
- Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
- Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
- Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
- Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).
