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Immunology and Infection

मानव न्यूट्रोफिल और स्टेफिलोकोकस ऑरियस बायोफिल्म के बीच बातचीत की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए मानकीकृत इन विट्रो परख

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63773
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Microbiology, The Ohio State University, 2Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल न्यूट्रोफिल-बायोफिल्म इंटरैक्शन के अध्ययन का वर्णन करता है। स्टेफिलोकोकस ऑरियस बायोफिल्म विट्रो में स्थापित किए जाते हैं और परिधीय रक्त-व्युत्पन्न मानव न्यूट्रोफिल के साथ इनक्यूबेट किए जाते हैं। न्यूट्रोफिल से ऑक्सीडेटिव विस्फोट प्रतिक्रिया निर्धारित की जाती है, और बायोफिल्म के भीतर न्यूट्रोफिल स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित किया जाता है।

Abstract

न्यूट्रोफिल माइक्रोबियल संक्रमण के दौरान प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा तैनात रक्षा की पहली पंक्ति है। विवो में, न्यूट्रोफिल को संक्रमण की साइट पर भर्ती किया जाता है जहां वे फागोसाइटोसिस, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और नाइट्रोजन प्रजातियों (आरओएस, आरएनएस, क्रमशः), एनईटोसिस (न्यूट्रोफिल बाह्य जाल), और रोगाणुओं को मारने और संक्रमण को हल करने के लिए विघटन जैसी प्रक्रियाओं का उपयोग करते हैं। न्यूट्रोफिल और प्लवक रोगाणुओं के बीच बातचीत का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। हाल के वर्षों में बायोफिल्म के कारण होने वाले संक्रमणों का अध्ययन करने में रुचि उभर रही है। बायोफिल्म अपने प्लवक-विकसित समकक्षों से अलग न्यूट्रोफिल द्वारा हत्या के लिए सहिष्णुता सहित गुणों का प्रदर्शन करते हैं। इन विट्रो और विवो बायोफिल्म मॉडल दोनों की सफल स्थापना के साथ, विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ इन माइक्रोबियल समुदायों के बीच बातचीत की जांच की जा सकती है। यहां, पारंपरिक बायोफिल्म मॉडल और अच्छी तरह से स्थापित न्यूट्रोफिल गतिविधि परख के संयोजन का उपयोग करने वाली तकनीकों को विशेष रूप से न्यूट्रोफिल और बायोफिल्म इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए तैयार किया गया है। बायोफिल्म में न्यूट्रोफिल के स्थानीयकरण की निगरानी के लिए वाइड-फील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है। ये बायोफिल्म स्थिर स्थितियों में उगाए जाते हैं, इसके बाद मानव परिधीय रक्त से प्राप्त न्यूट्रोफिल को जोड़ा जाता है। माइक्रोस्कोप के तहत विज़ुअलाइज़ेशन से पहले नमूने उचित रंगों से दाग दिए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, आरओएस का उत्पादन, जो रोगजनकों के खिलाफ कई न्यूट्रोफिल प्रतिक्रियाओं में से एक है, एक बायोफिल्म की उपस्थिति में निर्धारित किया जाता है। इस स्थापित प्रणाली में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अतिरिक्त इन प्रक्रियाओं को सटीक रूप से मापने के लिए मानकीकृत और अनुकूलित स्थितियों के उपयोग को सुनिश्चित करते हुए मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन की समझ का विस्तार होगा।

Introduction

एक बायोफिल्म सतह से जुड़े रोगाणुओं या गैर-संलग्न समुच्चय का एक समुदाय है जो एक बाह्य बहुलक पदार्थ (ईपीएस) 1,2 में संलग्न है। ये समुदाय एंटीमाइक्रोबियल एजेंटों और प्रतिरक्षा प्रणाली के प्रति सहिष्णुता सहित पर्यावरणीय तनावों से घिरे सूक्ष्मजीवों की रक्षा करतेहैं। कई रोगजनक माइक्रोबियल प्रजातियां बायोफिल्म बनाती हैं जो पुराने संक्रमणसे जुड़ी हुई हैं। बायोफिल्म का विकास एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें सतहों से लगाव, ईपीएस उत्पादन, सेल प्रसार, बायोफिल्म संरचना और सेल डिटेचमेंट5 शामिल हैं। एक बार जब कोशिकाएं बायोफिल्म बनाने के लिए फैल जाती हैं, तो वे प्लवक रहते हैं या एक नए सबस्ट्रेटम में स्थानांतरित हो जाते हैं और बायोफिल्मविकास को फिर से शुरू करते हैं।

स्टेफिलोकोकस ऑरियस, एक अवसरवादी रोगज़नक़, बायोफिल्म विकास की एक सामान्य योजना का पालन करता है, जिसमें लगाव, प्रसार, परिपक्वता और फैलावशामिल हैं। ऑरियस बायोफिल्म में अनुलग्नक प्रक्रिया हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन, टेक्सोइक एसिड और माइक्रोबियल सतह घटकों द्वारा चिपकने वाले मैट्रिक्स अणुओं (एमएससीआरएएमएस) 8,9 को पहचानने के लिए निर्धारित की जाती है। ऑरियस का प्रसार शुरू होने के साथ, ईपीएस, जिसमें मुख्य रूप से पॉलीसेकेराइड, प्रोटीन, बाह्य डीएनए और टीचोइक एसिड होते हैं, का उत्पादन होता है। जैसा कि ईपीएस घटकों का उत्पादन किया जाता है, विभिन्न एक्सोएंजाइम और छोटे अणु भी उत्पादित होते हैं, जो बायोफिल्म 3-आयामी संरचना में योगदान करते हैं और डिटेचमेंट5 में सहायता करते हैं। एस ऑरियस विभिन्न पुराने संक्रमणों को स्थापित करने के लिए इस अत्यधिक समन्वित जीवन शैली का लाभ उठाता है, जिसमेंचिकित्सा उपकरणों के निवास के कारण संक्रमण भी शामिल है।

मेथिसिलिन प्रतिरोधी एस ऑरियस (एमआरएसए) केंद्रीय शिरापरक और मूत्र कैथेटर, कृत्रिम जोड़ों, पेसमेकर, यांत्रिक हृदय वाल्व और अंतर्गर्भाशयी उपकरणों जैसे चिकित्सा उपकरणों से संबंधित संक्रमणके प्रमुख कारणों में से एक है। इस तरह के संक्रमणों के दौरान, न्यूट्रोफिल कई रणनीतियों के माध्यम से रोगजनकों का मुकाबला करने के लिए संक्रमण स्थल पर भर्ती होने वालीपहली मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं। इनमें फागोसाइटोसिस, डीग्रेनुलेशन, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और नाइट्रोजन प्रजातियां (आरओएस / आरएनएस) उत्पादन, या रोगजनकों को खत्म करने के लिए न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (एनईटी) की रिहाई शामिलहै।

रोगाणुओं के फागोसाइटोसिस पर आरओएस की उत्पत्ति न्यूट्रोफिल14 द्वारा प्रदर्शित प्रमुख रोगाणुरोधी प्रतिक्रियाओं में से एक है। फागोसाइटोसिस को बढ़ाया जाता है यदि रोगाणुओं को ऑप्सोनिन में लेपित किया जाता है, विशेष रूप से इम्युनोग्लोबुलिन और सीरम15 में पाए जाने वाले घटकों के पूरक। ऑप्सोनाइज्ड रोगाणुओं को तब न्यूट्रोफिल पर सेल सतह रिसेप्टर्स द्वारा पहचाना जाता है और घेर लिया जाता है, जिससे फागोसोम15 नामक एक कम्पार्टमेंट बनता है। न्यूट्रोफिल झिल्ली से जुड़े एनएडीपीएच-ऑक्सीडेज16 के माध्यम से फागोसोम में आरओएस उत्पन्न और जारी करते हैं। यह बहु-घटक एंजाइम कॉम्प्लेक्स आणविक ऑक्सीजन16 में इलेक्ट्रॉनों को स्थानांतरित करके सुपरऑक्साइड आयन उत्पन्न करता है। इसके अतिरिक्त, न्यूट्रोफिल इंड्यूसेबल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (आईएनओएस) 17 की अभिव्यक्ति के माध्यम से आरएनएस भी उत्पन्न करते हैं। फागोसोम के भीतर इन उच्च सुपरऑक्साइड और नाइट्रिक ऑक्साइड कणों में व्यापक रोगाणुरोधी गतिविधियां होती हैं। वे एंजाइमों में धातु केंद्रों के साथ बातचीत कर सकते हैं और रोगज़नक़18,19,20,21 के न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन और कोशिका झिल्ली को नुकसान पहुंचा सकते हैं। कई रोगाणु एक बायोफिल्म जीवन शैली को अपनाते हैं और आरओएस22,23 द्वारा हत्या से बचने के लिए विभिन्न रणनीतियों का उपयोग करते हैं। इस प्रकार, आरओएस की मात्रा निर्धारित करने के लिए न्यूट्रोफिल के साथ बायोफिल्म को जोड़ने वाले मानकीकृत परख लगातार परिणामों के लिए फायदेमंद हैं।

जबकि न्यूट्रोफिल आरओएस उत्पादन की मात्रा निर्धारित करने जैसे परख, बायोफिल्म के लिए न्यूट्रोफिल की प्रतिक्रियाओं के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, बायोफिल्म के भीतर न्यूट्रोफिल की बातचीत की कल्पना करने की क्षमता भी एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में काम कर सकती है। माइक्रोस्कोपी के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग को अक्सर उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है जिनका उपयोग माइक्रोस्कोपी इमेजिंग विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। कुछ स्थितियों को अनुकूलित करने का लचीलापन सीमित है क्योंकि न्यूट्रोफिल अलगाव के बाद कोशिका मृत्यु से गुजर सकते हैं। इसके अलावा, बायोफिल्म को आमतौर पर न्यूट्रोफिल के अलावा प्रयोगात्मक सेट-अप से प्लवक आबादी को हटाने के लिए धोया जाता है। धोते समय, आंशिक बायोमास के नुकसान के कारण प्रतिकृति बायोफिल्म के बीच परिवर्तनशीलता उत्पन्न हो सकती है यदि बायोफिल्म को सतह पर शिथिल रूप से पालन किया जाता है।

मोटे तौर पर, न्यूट्रोफिल और बायोफिल्म के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए क्षेत्र में वर्तमान तरीकों में मुख्य रूप से माइक्रोस्कोपी, फ्लो साइटोमेट्री और कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां (सीएफयू) गणना 24,25,26,27 शामिल हैं। माइक्रोस्कोपी में रंगों का उपयोग शामिल है जो या तो सीधे न्यूट्रोफिल और बायोफिल्म को दाग देते हैं, या रोगाणुओं के खिलाफ विभिन्न न्यूट्रोफिल प्रतिक्रियाओं को लक्षित करते हैं जैसे कि नेट गठन, अपघटन और कोशिका मृत्यु25,28। इन प्रतिक्रियाओं का एक उप-समूह, जैसे कि न्यूट्रोफिल कोशिका मृत्यु और अपघटन, का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से भी किया जा सकता है, लेकिन न्यूट्रोफिल को बायोफिल्म28,29 में रोगाणुओं के बड़े समुच्चय के साथ अधिमानतः असंबद्ध करने की आवश्यकता होती है। फ्लो साइटोमेट्री कुछ बायोफिल्म मापदंडों को भी निर्धारित कर सकती है, जैसे कि सेल व्यवहार्यता27। हालांकि, इन प्रक्रियाओं को बायोफिल्म बायोमास के विघटन की आवश्यकता होती है और बायोफिल्म 27,29,30 के भीतर न्यूट्रोफिल और उनके घटकों के स्थानिक वितरण जैसे अन्य महत्वपूर्ण इंटरैक्शन की कल्पना करने के लिए उपयोगी नहीं होगा।

वर्तमान प्रोटोकॉल बायोफिल्म पर न्यूट्रोफिल-बायोफिल्म इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पारंपरिक रूप से उपयोग किए जाने वाले कुछ तरीकों को अपनाने पर केंद्रित है जिन्हें हैंडलिंग के दौरान न्यूनतम परिवर्तनशीलता प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया गया है। यह प्रोटोकॉल इस प्रकार बायोफिल्म को विकसित करने और मात्रा निर्धारित करने, परिधीय रक्त से प्राथमिक मानव न्यूट्रोफिल को अलग करने, आरओएस उत्पादन की मात्रा निर्धारित करने और माइक्रोस्कोपी के माध्यम से बायोफिल्म-न्यूट्रोफिल इंटरैक्शन की कल्पना करने के लिए मानकीकृत तरीके प्रदान करता है। दाता पूल के बीच विषमता पर विचार करते हुए बायोफिल्म-न्यूट्रोफिल इंटरैक्शन को समझने के लिए इस प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Protocol

सभी प्रक्रियाओं को ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (आईआरबी) (2014एच0154) द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्राथमिक मानव न्यूट्रोफिल को अलग करने के लिए परिधीय रक्त एकत्र करने के लिए सभी दाताओं से सूचित लिखित सहमति प्राप्त की गई थी। स्टेफिलोकोकस ऑरियस (यूएसए 300 एलएसी) 31 का उपयोग प्रयोगों को करने के लिए मॉडल जीव के रूप में किया गया था। रक्तजनित रोगज़नक़ के संभावित संपर्क के कारण उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) के साथ प्रयोग किए गए थे।

1. इन विट्रो बायोफिल्म की तैयारी

  1. पोषक तत्वों से भरपूर आगर प्लेट पर32,33 की लकीर-प्लेट तकनीक32,33 का उपयोग करके क्रायोसंरक्षित स्टॉक 31 से एस ऑरियस की पृथक कॉलोनियां प्राप्त करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. 0.001% (v/v) पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल) के 100 μL के साथ 96-वेल प्लेट के अलग-अलग कुओं को बाँझH2Oमें पतला करें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। सड़न रोकने योग्य रूप से, वैक्यूम-असिस्टेड एस्पिरेशन ट्रैप का उपयोग करके पीएलएल समाधान को एस्पिरेटेड करें। कुओं को कमरे के तापमान पर रात भर सूखने दें।
    नोट: प्रोटोकॉल में सभी आकांक्षा चरण वैक्यूम-असिस्टेड एस्पिरेशन ट्रैप का उपयोग करके किए जाते हैं जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है।
  3. एस ऑरियस की एक कॉलोनी को न्यूनतम आवश्यक मीडिया अल्फा (एमईएम) में 2% ग्लूकोज के साथ पूरक करके और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके रात भर की संस्कृति तैयार करें, 16-18 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर हिलें।
  4. 2% ग्लूकोज के साथ पूरक 50 μL से 5 mL ताजा MEM को स्थानांतरित करके रात भर की संस्कृति को पतला करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 200 आरपीएम पर हिलते हुए, मध्य-लघुगणकीय चरण तक, आमतौर पर 0.5-0.8 के ऑप्टिकल घनत्व600 (OD 600nm) के बीच। 0.1 के ओडी600 एनएम के लिए मध्य-लघुगणक संस्कृति को सामान्य करने के लिए एमईएम का उपयोग करें।
  5. पीएलएल उपचारित 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में सामान्यीकृत संस्कृति के 150 μL स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में 18-20 घंटे के लिए स्थिर रूप से इनक्यूबेट करें।
    नोट: बायोफिल्म को अन्य प्रारूपों जैसे μ-चैनल स्लाइड ( सामग्री की तालिका देखें) में भी उगाया जा सकता है।
  6. प्लवक कोशिकाओं को हटाने के लिए सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने के लिए हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के 150 μL के साथ शेष बायोमास को धीरे से धोएं। बायोफिल्म को बाधित करने से बचने के लिए एचबीएसएस ड्रॉपवाइज जोड़ें।
    नोट: धोने के दौरान सतह पर तैरने वाले और एचबीएसएस को एस्पिरेटेड करते समय, बायोफिल्म युक्त कुओं में पर्याप्त तरल (सुपरनैटेंट या एचबीएसएस) छोड़ दें ताकि बायोफिल्म अभी भी डूबा हुआ हो। यह बायोफिल्म संरचना के विघटन को रोकता है जब बायोफिल्म को धोने के लिए एचबीएसएस को ड्रॉपवाइज जोड़ा जाता है।
  7. सभी प्लवक कोशिकाओं को हटाने के लिए चरण 1.6 को कम से कम दो बार दोहराएं। इस बिंदु पर, बायोफिल्म तत्काल डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए तैयार हैं।
    नोट: यदि बायोफिल्म का उपयोग न्यूट्रोफिल प्रयोगों के लिए नहीं किया जाता है, तो एचबीएसएस को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। एचबीएसएस को पीबीएस पर पसंद किया जाता है क्योंकि एचबीएसएस में ग्लूकोज सहित घटक होते हैं, जो न्यूट्रोफिल सक्रियण34 के लिए इष्टतम स्थिति प्रदान करते हैं।

2. बायोफिल्म बायोमास का परिमाणीकरण

  1. 20% (v/v) इथेनॉल और 80% (v/v) H 2 O में घुलकर 0.1% (w/v) क्रिस्टल वायलेट (CV) समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) का स्टॉक तैयार करें। सुनिश्चित करें किH2O जोड़ने से पहले CV इथेनॉल में पूरी तरह से घुलगयाहै। घोल को फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें।
  2. धुले हुए बायोफिल्म में 0.1% सीवी समाधान का 150 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। मीडिया-केवल नियंत्रण के रूप में कम से कम तीन खाली कुओं का उपयोग करें।
  3. बायोफिल्म से 0.1% सीवी समाधान को एस्पिरेट करें और दाग वाले बायोफिल्म को 1x PBS के 200 μL के साथ धोएं। कुओं से किसी भी अतिरिक्त सीवी को हटाने के लिए कुल तीन धोने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  4. 33% (v/v) ग्लेशियल एसिटिक एसिड का 150 μL जोड़ें, जिसेH2O के साथ पतला किया गया है। 30 मिनट के लिए 50 आरपीएम पर एक रॉकर पर कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें ताकि बायोमास से बंधे CV को पूरी तरह से घुलने की अनुमति मिल सके।
    सावधानी: इस चरण को उचित पीपीई के साथ एक लामिनार प्रवाह हुड में करें क्योंकि ग्लेशियल एसिटिक एसिड एक संक्षारक रसायन है।
  5. इस बीच, सीवी स्टेन मानों को पढ़ने के लिए माइक्रोप्लेट रीडर ( सामग्री की तालिका देखें) सेट करें। ग्लेशियल एसिटिक एसिड उपचार के बाद, प्लेट को 595 एनएम तरंग दैर्ध्य पर पढ़ें।
    नोट: सीवी के ओडी को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली तरंग दैर्ध्य 500-600 एनएम35 तक हो सकती है।

3. न्यूट्रोफिल अलगाव

नोट: न्यूट्रोफिल को मामूली परिवर्तनों के साथ पहले प्रकाशित विधि के बाद अलगकिया गया था। यह अलगाव प्रोटोकॉल पहले घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन को जोड़ता है, इसके बाद 3% डेक्सट्रान अवसादन। यह खंड केवल समग्र न्यूट्रोफिल अलगाव प्रोटोकॉल को कवर करता है, प्रकाशित प्रोटोकॉल में किए गए परिवर्तनों पर ध्यान केंद्रित करता है। इसके अलावा, नीचे उल्लिखित प्रोटोकॉल कई तरीकों में से एक है जो न्यूट्रोफिल को अलग कर सकता है, और आवश्यकतानुसार प्रतिस्थापित किया जा सकता है। न्यूट्रोफिल को अलग करने के अन्य तरीकों में सेल सेपरेशन मीडिया या चुंबकीय एंटीबॉडी सेल पृथक्करण37 का उपयोग शामिल है।

  1. संस्थागत आईआरबी में उल्लिखित प्रोटोकॉल के अनुसार, वेनिपंक्चर के माध्यम से एक वयस्क दाता से रक्त खींचें। रक्त खींचने से पहले, सुनिश्चित करें कि सिरिंज में पर्याप्त संरक्षक-मुक्त हेपरिन है, जैसे कि हेपरिन की अंतिम एकाग्रता 20 यू / एमएल है।
  2. कमरे के तापमान पर एच 2 ओ में एंडोटॉक्सिन-मुक्त 0.9% एनएसीएल ( सामग्री की तालिका देखें) की मात्रा केसाथ हेपरिनाइज्डरक्त को पतला करें।
  3. पतला रक्त के नमूने के प्रत्येक 20 एमएल के लिए, एक ताजा 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घनत्व ढाल माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) का 14 एमएल एलिकोट करें। घनत्व ढाल माध्यम के शीर्ष पर पतला रक्त के नमूने को सावधानीपूर्वक परत करें।
  4. कमरे के तापमान पर 40 मिनट के लिए 400 x g पर स्तरित रक्त के नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। सुनिश्चित करें कि सेंट्रीफ्यूजेशन पूरा होने के बाद परत को परेशान करने से बचने के लिए सेंट्रीफ्यूज में धीमी गति से ब्रेक है।
    नोट: रक्त के नमूने में पांच परतें होंगी जिनमें खारा और प्लाज्मा, एक मोनोन्यूक्लियर सेल परत, घनत्व ढाल माध्यम, न्यूट्रोफिल और एरिथ्रोसाइट्स का मिश्रण होगा।
  5. एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, न्यूट्रोफिल और एरिथ्रोसाइट गोली के ऊपर की सभी परतों को एस्पिरेट करें, इसके बाद एच2ओ में ठंडे एंडोटॉक्सिन-मुक्त 0.9% एनएसीएल में गोली का कोमल पुन: निलंबन होता है। 20 एमएल रक्त के नमूने से उत्पन्न प्रत्येक गोली के लिए, गोली को कुल 20 एमएल मात्रा में वापस रोक दें। 3% डेक्सट्रान की 1: 1 मात्रा जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। बर्फ पर 18-20 मिनट के लिए ट्यूब को सीधा करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि 3% डेक्सट्रान एच 2 ओ में एंडोटॉक्सिन-मुक्त 0.9% एनएसीएल के साथ बनायागयाहै।
  6. ऊपरी परत के 20 एमएल को हटा दें जिसमें न्यूट्रोफिल और कुछ एरिथ्रोसाइट्स होते हैं, एक नई 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 355 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। एक लाल गोली छोड़कर सतह पर तैरने वाले को उतार दें।
  7. धीरे से 10 एमएल ठंडे, बाँझ एच2ओ में 30 सेकंड के लिए पेलेट को फिर से निलंबित करें ताकि शेष एरिथ्रोसाइट्स को लाइस किया जा सके। टोनिसिटी को बहाल करने के लिए मिश्रण में तुरंत 10 एमएल ठंडा एंडोटॉक्सिन-मुक्त 0.9% खारा जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 233 x g पर घोल को सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. सतह पर तैरने वाले को डालें और रक्त के नमूने के प्रति 20 एमएल 1 एमएल ठंडे एचबीएसएस में 95% -97% न्यूट्रोफिल युक्त गोली को फिर से निलंबित करें।
  9. पुन: निलंबित न्यूट्रोफिल के 10 μL को 0.4% ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण डाई के 90 μL में स्थानांतरित करें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: गैर-व्यवहार्य कोशिकाएं नीले रंग की होती हैं क्योंकि ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण डाई व्यवहार्य कोशिकाओं में अभेद्य है। यह प्रोटोकॉल >99% सेल व्यवहार्यता37,38 प्रदान करता है।
  10. अतिरिक्त एचबीएसएस जोड़ें जैसे कि न्यूट्रोफिल की अंतिम एकाग्रता 4 x 106 कोशिकाएं / एमएल है।
    नोट: <99% सेल व्यवहार्यता वाले उदाहरणों के लिए, 4 x 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता अभी भी प्राप्त की जा सकती है; हालांकि, प्राप्त 4 x 106 कोशिकाओं / एमएल वाले समाधान की कुल मात्रा कम हो जाएगी। न्यूट्रोफिल की अंतिम एकाग्रता को उपयोगकर्ता की प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। न्यूट्रोफिल को नीचे वर्णित सभी प्रयोगों के लिए 4 x 106 कोशिकाओं / एमएल अंतिम एकाग्रता पर पुन: निलंबित किया गया था। दाता-से-दाता परिवर्तनशीलता के लिए, यह दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है कि न्यूट्रोफिल के साथ शामिल सभी प्रयोगों को कम से कम तीन अलग-अलग दाताओं के साथ किया जाए।

4. न्यूट्रोफिल द्वारा उत्पादित आरओएस का माप

  1. धोए गए बायोफिल्म (चरण 1.6) में 20% सामान्य मानव सीरम (एचबीएसएस में पतला) का 100 μL जोड़ें और बायोफिल्म को ऑप्सनाइज करने के लिए 30 मिनट के लिए स्थिर स्थिति के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. 20% सीरम घोल को एस्पिरेट करें और बायोफिल्म को 150 μL HBSS के साथ एक बार ड्रॉपवाइज धो लें। एचबीएसएस को एस्पिरेट करें, ओप्सोनाइज्ड बायोफिल्म के साथ कुओं को पीछे छोड़ दें।
    नोट: प्रयोग की व्याख्या के लिए, न्यूनतम चार समूहों की सिफारिश की जाती है: (ए) न्यूट्रोफिल + बायोफिल्म, (बी) न्यूट्रोफिल + पीएमए (सकारात्मक नियंत्रण, सामग्री की तालिका देखें), (सी) केवल न्यूट्रोफिल, और (डी) बायोफिल्म।
  3. 4 x 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर एचबीएसएस में पुन: निलंबित न्यूट्रोफिल में ल्यूमिनोल (सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें ताकि अंतिम ल्यूमिनोल एकाग्रता 50 μM हो। यह समाधान समूहों (ए) और (सी) के लिए उपयोग करने के लिए तैयार है। ऑप्सोनाइज्ड बायोफिल्म के साथ कुओं में ल्यूमिनोल के साथ मिश्रित 4 x 105 न्यूट्रोफिल जोड़ें।
  4. एक अलग ट्यूब में, बिना किसी न्यूट्रोफिल के एचबीएसएस में 50 μM ल्यूमिनोल समाधान तैयार करें और इसे बायोफिल्म (समूह डी) युक्त कुएं में जोड़ें।
  5. न्यूट्रोफिल के एलिकोट 350 μL को ल्यूमिनोल के साथ मिलाया जाता है और मिश्रण में 500 ng / mL की अंतिम एकाग्रता पर फोरबोल 12-माइरिस्टेट 13-एसीटेट (PMA) जोड़ता है। समूह (बी) के लिए, इस मिश्रण से 4 x 105 न्यूट्रोफिल को बायोफिल्म के बिना कुओं में जोड़ें। यह एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
    नोट: इस चरण में इंगित पीएमए की एकाग्रता मजबूत विस्फोट प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के लिए अपेक्षाकृत अधिक है क्योंकि पीएमए उत्तेजित न्यूट्रोफिल एक सकारात्मक नियंत्रण है। प्रयोग के आधार पर न्यूट्रोफिल को सक्रिय करने के लिए पीएमए का उपयोग कम सांद्रता पर किया जा सकता है।
  6. प्लेट को 270 x g पर 30 सेकंड के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. सुनिश्चित करें कि प्लेट रीडर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट है, साथ ही 3 मिनट के अंतराल के साथ 60 मिनट के लिए ल्यूमिनेसेंस और गतिज पढ़ने के लिए सेटिंग है। 60 मिनट के लिए न्यूट्रोफिल द्वारा आरओएस उत्पादन को मापने के लिए प्लेट को प्लेट रीडर में रखें।
    नोट: इस परख के लिए, बायोफिल्म को ल्यूमिनेसेंस परख के लिए उपयोग की जाने वाली सफेद प्लेटों में उगाया गया था। पीएमए ऑक्सीडेटिव विस्फोट प्रतिक्रिया39 के लिए एक ज्ञात एगोनिस्ट है। पीएमए से जुड़े अध्ययन करते समय, सुनिश्चित करें कि पीएमए को अंतिम चरण में जोड़ा जाता है जबकि न्यूट्रोफिल युक्त समाधान ठंडा होता है क्योंकि पीएमए तुरंत विस्फोट प्रतिक्रिया शुरू करता है।

5. इमेजिंग बायोफिल्म-न्यूट्रोफिल इंटरैक्शन

  1. चरण 1.2-1.6 का उपयोग करके एक बायोफिल्म सेट करें। बायोफिल्म इमेजिंग की सुविधा के लिए, माइक्रोस्कोपी इमेजिंग की आसानी बढ़ाने के लिए एस ऑरियस के फ्लोरोसेंट स्ट्रेन को नियोजित करें, जैसे कि यूएसए 300 ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) 40,41 को व्यक्त करता है।
    नोट: इन विट्रो बायोफिल्म मॉडल (चरण 1) को प्रदर्शित करने के लिए 96-वेल प्लेट के बजाय एक 6 μ-चैनल स्लाइड (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया गया था।
  2. ब्लू सीएमएसी (7-एमिनो-4-क्लोरोमेथिलकौमेरिन) डाई (बीसीडी, सामग्री की तालिका देखें) के 100 μM के साथ न्यूट्रोफिल की 4 x 106 कोशिकाओं / एमएल को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक रॉकर में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सुनिश्चित करें कि नमूने अंधेरे में इनक्यूबेट किए गए हैं और शेष चरणों के लिए प्रकाश के संपर्क को सीमित करें।
  3. अतिरिक्त बीसीडी को धोने के लिए, सेंट्रीफ्यूज न्यूट्रोफिल 5 मिनट के लिए 270 x ग्राम पर और सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। ताजा एचबीएसएस में न्यूट्रोफिल को पुन: निलंबित करें। इस बिंदु पर, न्यूट्रोफिल और जीवाणु मृत्यु की निगरानी के लिए 4 μM की अंतिम एकाग्रता पर BCD-दाग वाले न्यूट्रोफिल में एथिडियम होमोडिमर -1 ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
  4. ऑरियस बायोफिल्म में न्यूट्रोफिल के 150 μL जोड़ें जो μ-स्लाइड में उगाया गया है, जैसे कि न्यूट्रोफिल से बैक्टीरिया अनुपात 1: 30 (न्यूट्रोफिल: बैक्टीरिया) है। μ-स्लाइड्स को 30 मिनट के लिए ह्यूमिडिफायर चैंबर में इनक्यूबेट करें। जीवाणु कोशिकाओं की संख्या 18 एच बायोफिल्म चढ़ाना से प्राप्त सेल गणना पर आधारित है।
  5. फ्लोरोसेंट रंगों / प्रोटीन के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के अनुरूप फ्लोरोसेंट चैनलों का उपयोग करके न्यूट्रोफिल-बायोफिल्म इंटरैक्शन की छवि।
    नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, बीसीडी 353/466 एनएम है, एथिडियम होमोडिमर -1 528/617 एनएम है, और जीएफपी 395/509 एनएम है। नमूने के फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए लेजर या प्रकाश के लिए नमूने के जोखिम को सीमित करें।
  6. माइक्रोस्कोपी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर या कार्यक्रमों जैसे फिजी / इमेजजे, कॉमस्टैट 2, बायोफिल्मक्यू और बीएआईटी का उपयोग करके छवियों का विश्लेषण करें, कई और 42,43,44,45 के बीच।
    नोट: दाग के साथ काम करते समय, उपयोग में रंगों की विशिष्टता पर विचार करना महत्वपूर्ण है। कुछ दाग प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक कोशिकाओं पर काम करते हैं, जबकि अन्य केवल एक पर काम करते हैं। यदि न्यूट्रोफिल और बायोफिल्म को रंगों का उपयोग करके अलग-अलग दाग दिया जाता है जो दोनों सेल प्रकारों को दाग सकते हैं, तो क्रॉस-स्टेनिंग को रोकने के लिए न्यूट्रोफिल और बायोफिल्म के संयोजन से पहले किसी भी शेष डाई को धोना सुनिश्चित करें।

Representative Results

बैक्टीरियल बायोफिल्म विकसित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला मीडिया न्यूट्रोफिल के अस्तित्व को प्रभावित करता है। न्यूट्रोफिल-बायोफिल्म इंटरैक्शन (चित्रा 1) का अध्ययन करने के लिए न्यूट्रोफिल की व्यवहार्यता पर अकेले मीडिया के प्रभाव को कम करने के लिए विभिन्न मीडिया का परीक्षण किया गया था। ट्राइप्टिक सोया ब्रोथ जैसे बैक्टीरियल विकास मीडिया न्यूट्रोफिल की व्यवहार्यता को कम करता है, जैसे कि ~ 60% न्यूट्रोफिल 30 मिनट की इनक्यूबेशन अवधि के बाद 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर जीवित होते हैं। स्तनधारी सेल कल्चर मीडिया, जैसे कि एमईएम, न्यूट्रोफिल की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है और एस ऑरियस बायोफिल्म के विकास का समर्थन करता है। वास्तव में, न्यूनतम मीडिया अन्य बैक्टीरिया46,47 में बायोफिल्म के मजबूत विकास को बढ़ावा देता है।

प्लवक कोशिकाओं को खत्म करने के लिए बायोमास को धोने के बाद बायोफिल्म के विकास और बायोफिल्म बायोमास परिमाणीकरण में परिवर्तनशीलता पर मीडिया के प्रभाव का आकलन करने के लिए, 96-वेल प्लेट में एक 18 एच एस ऑरियस बायोफिल्म उगाया गया था, जिसमें कुएं पॉली-एल-लाइसिन के साथ इलाज या अनुपचारित थे। एक पोषक तत्व युक्त (ट्राइप्टिक सोया ब्रोथ (टीएसबी)) और न्यूनतम (एमईएम) मीडिया का उपयोग 2% ग्लूकोज के साथ किया गया था। सीवी से सना बायोफिल्म बायोमास से पता चला है कि 2% ग्लूकोज के साथ पूरक एमईएम में उगाए गए एस ऑरियस बायोफिल्म ने सभी परीक्षण किए गए मीडिया (चित्रा 2 ए) के बीच सबसे मजबूत बायोफिल्म का उत्पादन किया। इसके अलावा, पीएलएल प्रीट्रीटेड कुओं में उगाए गए बायोफिल्म्स में एमईएम + 2% ग्लूकोज युक्त पीएलएल-अनुपचारित कुओं में बायोफिल्म की तुलना में कम परिवर्तनशीलता दिखाई दी, जिसमें एमईएम + 2% ग्लूकोज होता है। बायोमास परिमाणीकरण के लिए बायोफिल्म को ठीक से संभालने के बाद इन बायोफिल्मों ने सीवी परख35 और सीएफयू / एमएल के माध्यम से परिमाणीकरण में कम परिवर्तनशीलता दिखाई। इन बायोफिल्म में औसतन 1 x 108 सीएफयू / एमएल शामिल थे, जैसा कि 3 अलग-अलग दिनों में बायोफिल्म चढ़ाकर प्रदर्शित किया गया है (चित्रा 2 बी)। यह संख्या न्यूट्रोफिल कार्यक्षमता परख के लिए बायोफिल्म में जोड़ने के लिए न्यूट्रोफिल की संख्या निर्धारित करने में उपयोगी है।

बायोफिल्म के जवाब में न्यूट्रोफिल द्वारा आरओएस उत्पादन को मापने के लिए, एस ऑरियस बायोफिल्म को 96-वेल प्लेट में 18-20 घंटे के लिए स्थिर रूप से उगाया गया था। बायोफिल्म को तब ऑप्सनाइज्ड किया गया था, और न्यूट्रोफिल जोड़े गए थे। आरओएस उत्पादन तब 60 मिनट के लिए मापा गया था (चित्रा 3 ए)। न्यूट्रोफिल द्वारा कुल आरओएस उत्पादन को निर्धारित करने के लिए वक्र के नीचे के क्षेत्र की गणना गतिज वक्र से की जाती है। एक एगोनिस्ट के साथ इलाज किए गए न्यूट्रोफिल, जैसे कि पीएमए, एक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है, एक बढ़ी हुई आरओएस उत्पादन दिखाता है। बायोफिल्म की अनुपस्थिति में, पीएमए के साथ इलाज किए गए न्यूट्रोफिल ने मजबूत आरओएस उत्पादन दिखाया। ऑरियस बायोफिल्म की उपस्थिति में, पीएमए के साथ इलाज किए गए न्यूट्रोफिल द्वारा समग्र आरओएस उत्पादन में कमी आई। पीएमए की अनुपस्थिति में, न्यूट्रोफिल पूरी तरह से बायोफिल्म के साथ उनकी बातचीत पर भरोसा करते हैं, जो उत्पादित आरओएस की मात्रा को और कम कर देता है (चित्रा 3 बी)।

फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके न्यूट्रोफिल-बायोफिल्म इंटरैक्शन की कल्पना करने के लिए, एस ऑरियस, ब्लू सीएमएसी डाई और एथिडियम होमोडिमर -1 के एक जीएफपी-व्यक्त तनाव का उपयोग किया गया था, जो क्रमशः जीवित कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म और मृत कोशिकाओं के डीएनए को दाग देता है। ऑरियस बायोफिल्म को 6 μ-चैनल स्लाइड में 18 घंटे के लिए उगाया गया था। ब्लू सीएमएसी डाई-लेबल न्यूट्रोफिल को एथिडियम होमोडिमर -1 के साथ धोए गए बायोफिल्म में जोड़ा गया था और इमेजिंग से पहले 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था। वाइड-फील्ड फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी से पता चला कि कई न्यूट्रोफिल एस ऑरियस बायोफिल्म की सतह पर स्थानीयकृत थे, जबकि कुछ बायोफिल्म (चित्रा 4 ए) के भीतर हैं। न्यूट्रोफिल के भीतर एस ऑरियस कोशिकाओं के बीच बातचीत भी स्पष्ट थी (चित्रा 4 सी)। न्यूट्रोफिल (सियान) के साथ बातचीत करने वाली अधिकांश एस ऑरियस कोशिकाएं मृत (मैजेंटा) थीं, जबकि कुछ जीवित (पीला) बनी रहीं जैसा कि जीवित-मृत धुंधलापन (चित्रा 4 सी) द्वारा निर्धारित किया गया था। तुलना के लिए, जीएफपी-व्यक्त एस ऑरियस बायोफिल्म को एथिडियम होमोडिमर -1 से दाग दिया गया था, जिसने बायोफिल्म के भीतर मृत एस ऑरियस आबादी के एक अंश का खुलासा किया (चित्रा 4 बी)। गैर-व्यवहार्य न्यूट्रोफिल जो एथिडियम होमोडिमर -1 के लिए सकारात्मक थे, उन्हें एस ऑरियस बायोफिल्म के साथ इनक्यूबेशन के बाद विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके परिमाणित किया गया था। लगभग 48% न्यूट्रोफिल पहले से ही एस ऑरियस बायोफिल्म के साथ इनक्यूबेशन के 30 मिनट के भीतर मर चुके थे। माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान, गैर-पालन न्यूट्रोफिल को हटाने के लिए 30 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद बायोफिल्म और न्यूट्रोफिल को धोने के प्रभाव का भी मूल्यांकन किया गया था, जिससे लगभग 33% मृत न्यूट्रोफिल अभी भी बायोफिल्म से जुड़े हुए हैं (चित्रा 4 डी)।

Figure 1
चित्रा 1: लाइव-डेड परख बैक्टीरिया और स्तनधारी विकास मीडिया के बीच न्यूट्रोफिल अस्तित्व की तुलना करता है। न्यूट्रोफिल को 30 मिनट के लिए एचबीएसएस, एमईएम, टीएसबी, या 0.1% एसडीएस में अलग और इनक्यूबेट किया गया था। जीवित न्यूट्रोफिल का प्रतिशत निर्धारित किया गया था, जहां एचबीएसएस-इनक्यूबेटेड न्यूट्रोफिल को 100% जीवित न्यूट्रोफिल के रूप में माना जाता था। परिणाम तीन प्रतियों में किए गए दो स्वतंत्र प्रयोगों के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें दो अलग-अलग दाताओं से प्राप्त न्यूट्रोफिल होते हैं। डेटा को एसडी (* पी < 0.05, **** पी < 0.0001 के औसत ± रूप में प्रस्तुत किया जाता है। एक तरफा एनोवा)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न परिस्थितियों में बायोफिल्म बायोमास का परिमाणीकरण और अनुकूलित परिस्थितियों में उगाए गए बायोफिल्म की जीवाणु व्यवहार्यता गणना। (ए) एस ऑरियस को 96-वेल प्लेट में या तो लेपित या पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल) के साथ अनकोट किया गया था। बायोफिल्म को टीएसबी, एमईएम, या मीडिया में से किसी एक में 18 घंटे के लिए स्थिर परिस्थितियों में 2% ग्लूकोज के साथ पूरक किया गया था। बायोफिल्म बायोमास को दागने के लिए क्रिस्टल वायलेट (सीवी) धुंधला किया गया था। इल्यूटेड सीवी दाग को 1:10 पर पतला किया गया था और एक माइक्रोप्लेट रीडर में पढ़ा गया था। परिणाम तीन प्रतियों में किए गए तीन स्वतंत्र प्रयोगों के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा को एसडी के औसत ± रूप में प्रस्तुत किया जाता है। प्रत्येक समूह के लिए एसडी को विभिन्न बायोफिल्म विकास स्थितियों परिवर्तनशीलता को प्रदर्शित करने के लिए नीचे दिखाया गया है। (बी) बैक्टीरियल सीएफयू गिनती एक अनुकूलित माध्यम (एमईएम + 2% ग्लूकोज) में उगाए गए बायोफिल्म से प्राप्त की गई थी। 18 एच स्थैतिक बायोफिल्म को बायोफिल्म बायोमास को ढीला करने के लिए 10 मिनट के सोनिकेशन के बाद समान संख्या में धोया गया और चढ़ाना से पहले समुच्चय को बाधित करने के लिए 22 जी सुई के माध्यम से पारित किया गया। परिणाम तीन प्रतियों में किए गए तीन प्रतिकृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा को एसडी (एनएस = महत्वपूर्ण नहीं) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। एक तरफा एनोवा)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: केमिलुमिनेसेंस परख के माध्यम से न्यूट्रोफिल द्वारा आरओएस उत्पादन का परिमाणीकरण। (ए) न्यूट्रोफिल (पीएमएन) को न्यूट्रोफिल द्वारा आरओएस उत्पादन को मापने के लिए पीएमए की उपस्थिति (बंद ग्रे त्रिकोण) या अनुपस्थिति (ओपन ग्रे उल्टे त्रिकोण) में एचबीएसएस-धोए गए एस ऑरियस बायोफिल्म (बीएफ) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। एक माइक्रोप्लेट रीडर में 60 मिनट के लिए हर 3 मिनट में आरओएस का पता लगाने के लिए लुमिनोल का उपयोग किया गया था। जबकि बायोफिल्म (बंद काले सर्कल) की अनुपस्थिति में पीएमए के साथ इलाज किए गए न्यूट्रोफिल ने सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया, न्यूट्रोफिल केवल (ओपन ब्लैक सर्कल) और बायोफिल्म केवल (ओपन ग्रे त्रिकोण) समूहों ने नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। डेटा दो अलग-अलग दाताओं से प्राप्त न्यूट्रोफिल के साथ तीन प्रतियों में किए गए दो स्वतंत्र प्रयोगों के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। (B) (A) से वक्र के तहत क्षेत्र की गणना न्यूट्रोफिल द्वारा उत्पन्न कुल ROS को निर्धारित करने के लिए की गई थी। डेटा को एसडी ± माध्य के रूप में दर्शाया गया है। (***p < 0.0001. एक तरफा एनोवा)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: वाइड-फील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एस ऑरियस बायोफिल्म और न्यूट्रोफिल के बीच बातचीत का विज़ुअलाइज़ेशन। ब्लू सीएमएसी डाई-लेबल न्यूट्रोफिल (सियान) को 18 एच एस ऑरियस बायोफिल्म (पीला) के साथ इनक्यूबेट करने से पहले एथिडियम होमोडिमर -1 (मैजेंटा; डेड) के साथ पूरक किया गया था। बायोफिल्म-न्यूट्रोफिल इंटरैक्शन को वाइड-फील्ड फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित किया गया था और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियों को संसाधित किया गया था। प्रयोग तीन अलग-अलग दाताओं के साथ किए गए थे। प्रतिनिधि छवियों को (ए) जीवित (सियान) और मृत (मैजेंटा; कुछ सफेद तीर के साथ इंगित) न्यूट्रोफिल के साथ एस ऑरियस बायोफिल्म के 3 डी दृश्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, (बी) जीवित एस ऑरियस के साथ न्यूट्रोफिल की अनुपस्थिति में या तो जीवित एस ऑरियस जीएफपी (पीला) या मृत एस ऑरियस के साथ एथिडियम होमोडिमर -1 (मैजेंटा) से सना हुआ, (सी) एस ऑरियस का एक ऑर्थोगोनल दृश्य। और न्यूट्रोफिल इंटरैक्शन जैसा कि xy, yz, और xz विमानों द्वारा दर्शाया गया है, और (D) 30 मिनट के बाद S. Aureus बायोफिल्म की उपस्थिति में न्यूट्रोफिल व्यवहार्यता का परिमाणीकरण या तो तुरंत (बिना धोया गया) या गैर-पालन न्यूट्रोफिल (धोया गया) को हटाने के लिए एचबीएसएस के साथ धोने के तीन दौर के बाद। न्यूट्रोफिल कोशिका मृत्यु को एसडी (छात्र का टी-टेस्ट) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। स्केल पट्टी (A) और (B) में 50 μm और (C) में 10 μm को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

विट्रो 48,49,50 में डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एस ऑरियस बायोफिल्म विकसित करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं। एक मानकीकृत प्रोटोकॉल को रेखांकित किया गया है जो पीएलएल की धनिक प्रकृति का लाभ उठाता है, साथ ही मजबूत इन विट्रो एस ऑरियस बायोफिल्म के विकास के लिए ग्लूकोज के साथ मीडिया को पूरक करता है। पीएलएल के अलावा सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए पीएलएल लेपित सतहों के लिए नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए बैक्टीरियल सेल के बेहतर लगाव की अनुमति देता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि 10 μg / mL सांद्रता पर PLL में स्यूडोमोनास एरुगिनोसा, एस्चेरिचिया कोलाई और एस ऑरियस के खिलाफ रोगाणुरोधी गतिविधि होती है जब 24 घंटे51 के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। सतहों को कोट करने के लिए एक ही एकाग्रता का उपयोग किया जाता है; हालांकि, अतिरिक्त पीएलएल एस्पिरेटेड होता है, जिससे बायोफिल्म विकास के लिए बीज बोते समय पीएलएल की एकाग्रता 10 μg / mL से कम हो जाती है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि पीएलएल ने केवल विशिष्ट विकास मीडिया में काम किया है जैसे कि 2% ग्लूकोज के साथ एमईएम, जहां यह देखा गया कि एस ऑरियस ने न्यूनतम परिवर्तनशीलता के साथ मजबूत बायोफिल्म का उत्पादन किया (चित्रा 2 ए)। अन्य मीडिया प्रकारों के साथ संयोजन के रूप में उपयोग किए जाने वाले पीएलएल एकाग्रता को आगे अनुकूलन की आवश्यकता होगी, जैसे कि कुओं को कोट करने के लिए पीएलएल की बढ़ी हुई एकाग्रता का उपयोग करना। इसके अतिरिक्त, इन स्थितियों को एक मोनोप्रजाति एस ऑरियस बायोफिल्म के लिए अनुकूलित किया गया है। जबकि पुरानी घाव बायोफिल्म अक्सर पॉलीमाइक्रोबियल होते हैं, मोनोप्रजाति बायोफिल्म और न्यूट्रोफिल और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ इसकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए परखको मानकीकृत करना रोगजनन में उनके योगदान को समझने में महत्वपूर्ण है। इन मानकीकृत प्रोटोकॉल को पॉलीमाइक्रोबियल बायोफिल्म और न्यूट्रोफिल के साथ उनकी बातचीत को बनाए रखने और अध्ययन करने के लिए और अनुकूलित किया जा सकता है।

यह भी देखा गया कि टीएसबी जैसे समृद्ध जीवाणु संस्कृति मीडिया ने न्यूट्रोफिल व्यवहार्यता का नुकसान किया (चित्रा 1)। इसलिए, स्तनधारी कोशिका संस्कृतियों के लिए उपयोग किए जाने वाले एमईएम में एस ऑरियस बायोफिल्म की विकास स्थितियों को अनुकूलित किया गया था। न्यूट्रोफिल से जुड़े अध्ययनों के लिए, यह मीडिया न्यूट्रोफिल व्यवहार्यता का समर्थन करता है और एस ऑरियस विकास को बढ़ावा देता है। जबकि यह देखा गया कि मीडिया न्यूट्रोफिल की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है, यह विचार करना भी महत्वपूर्ण है कि परिधीय मानव रक्त से पृथक न्यूट्रोफिल 20 घंटे53 तक लगभग 70% एपोप्टोटिक न्यूट्रोफिल के साथ एपोप्टोसिस एक्स विवो से गुजरते हैं। इसके लिए उचित हैंडलिंग की आवश्यकता होती है, जैसे कि प्रयोगों की तैयारी करते समय बर्फ पर न्यूट्रोफिल को संग्रहीत करना, एंडोटॉक्सिन-मुक्त अभिकर्मकों का उपयोग करना, और न्यूट्रोफिल के साथ नमूनों के भंवर से बचकर न्यूट्रोफिल के सक्रियण को रोकना।

न्यूट्रोफिल में ऑक्सीडेटिव विस्फोट का आकलन नियमित रूप से रोगज़नक़14,54,55 पर न्यूट्रोफिल के हत्या प्रभाव को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। ये अध्ययन अक्सर प्लवक बैक्टीरिया के साथ किए जाते हैं जहां न्यूट्रोफिल जोड़े जाते हैं, और ऑक्सीडेटिव विस्फोट प्रतिक्रिया को ल्यूमिनोल-प्रवर्धित केमिलुमिनेसेंस का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है जो न्यूट्रोफिल द्वारा उत्पादित सुपरऑक्साइड आयनों का पता लगाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल को प्लवक बैक्टीरिया को स्थिर रूप से उगाए गए 18 एच एस ऑरियस बायोफिल्म के साथ बदलकर संशोधित किया गया है। जैसे, न्यूट्रोफिल को उनके सक्रियण का आकलन करने के लिए सीधे बायोफिल्म में जोड़ा जा सकता है। दूसरी ओर, बायोफिल्म में बैक्टीरिया आरओएस 23,56 को डिटॉक्सिफाई करने के लिए कैटालेज और सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज जैसेएंजाइमों का उत्पादन करते हैं। स्टेफिलोकोकस एपिडर्मिडिस बायोफिल्म तनाव57 के तहत अपने प्लवक समकक्ष की तुलना में उच्च कैटालेज का उत्पादन करते हैं। ऑरियस बायोफिल्म में पीएमए-उत्तेजित न्यूट्रोफिल का कुल केमिलुमिनेसेंस पीएमए-उत्तेजित न्यूट्रोफिल की तुलना में काफी कम है जहां बायोफिल्म अनुपस्थित है (चित्रा 2)। यह इन डिटॉक्सिफाइंग एंजाइमों की गतिविधि के कारण हो सकता है। ऑरियस बायोफिल्म ल्यूकोसिडिन नामक कई छिद्र बनाने वाले विषाक्त पदार्थों का उत्पादन करते हैं जो न्यूट्रोफिल58 को मारते हैं। एस ऑरियस बायोफिल्म की उपस्थिति में न्यूट्रोफिल की कम व्यवहार्यता के कारण कम विस्फोट प्रतिक्रिया की भी संभावना है। जबकि यह अध्ययन ल्यूमिनोल का उपयोग करता है जो कोशिकाओं के अंदर और बाहर दोनों उत्पादित कुल आरओएस का पता लगाता है, अन्य अभिकर्मकों, जैसे कि सीएम-एच2डीसीएफडीए (5-(और -6)-क्लोरोमेथिल-2'7'-डाइक्लोरोडिहाइड्रोफ्लोरेसिन डायसेटेट) या आइसोलुमिनोल पर विचार करने की आवश्यकता है यदि काम का लक्ष्य विशेष रूप से इंट्रासेल्युलर या बाह्य आरओएस उत्पादन 14,53,54 का अध्ययन करना है।

माइक्रोस्कोपी के माध्यम से न्यूट्रोफिल-बायोफिल्म इंटरैक्शन की कल्पना करने की क्षमता एक दूसरे की उपस्थिति में न्यूट्रोफिल और बायोफिल्म के व्यवहार के बारे में जानकारीपूर्ण हो सकती है। फ्लोरोसेंट रंजक और प्रोटीन के उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा 30 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद 18 एच एस ऑरियस बायोफिल्म और न्यूट्रोफिल के बीच बातचीत का एक स्नैपशॉट का प्रतिनिधित्व करते हैं। दाग वाली कोशिकाओं से संकेतों को प्रभावी ढंग से पकड़ने के लिए, माइक्रोस्कोपी के लिए नमूने स्थापित करते समय प्रकाश स्रोतों के लिए नमूनों के जोखिम को सीमित करना महत्वपूर्ण है। इमेजिंग करते समय, विभिन्न चैनलों के लिए जेड-स्टैक ऊंचाई और एक्सपोजर समय जैसे सभी मापदंडों को समायोजित करते समय प्रकाश स्रोत की तीव्रता को कम करके नमूनों के तेजी से फोटोब्लीचिंग से बचा गया था।

इन सरल प्रथाओं ने उचित माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए अनुमति दी जहां यह देखा गया कि कुछ न्यूट्रोफिल बायोफिल्म (चित्रा 4 ए) के भीतर स्थानीयकृत हैं। यह बायोफिल्म के भीतर मौजूद रिक्त स्थान के कारण हो सकता है क्योंकि 2% ग्लूकोज के साथ एमईएम में उगाया गया 18 एच एस ऑरियस बायोफिल्म सतह को समान रूप से कवर नहीं करता है (चित्रा 4 बी)। हालांकि, समृद्ध मीडिया के अन्य अध्ययनों के उपयोग ने बायोफिल्म30,58 के माध्यम से प्रवेश करने वाले एस ऑरियस बायोफिल्म विकास और ल्यूकोसाइट्स का एक समान लॉन दिखाया है। इसके अलावा, यह भी देखा गया है कि एस ऑरियस बायोफिल्म-उत्पादित ल्यूकोसिडिन के कारण एस ऑरियस बायोफिल्म के साथ 30 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद न्यूट्रोफिल कोशिका मृत्यु हो गई थी जो न्यूट्रोफिल58 (चित्रा 4 ए, डी) को लाइज करती है। 30 मिनट के लिए बायोफिल्म के साथ उन्हें इंजेक्ट करने के बाद गैर-पालन न्यूट्रोफिल को हटाने के लिए एक वॉश स्टेप के अलावा, बिना धोए गए समूह की तुलना में सिस्टम से मृत न्यूट्रोफिल का ~ 15% हटा दिया गया, जिसमें माइक्रोस्कोपी इनक्यूबेशन के 30 मिनट के तुरंत बाद की गई थी (चित्रा 4 डी)। एस ऑरियस के साथ बातचीत करने वाले न्यूट्रोफिल भी देखे गए (चित्रा 4 सी)। यह आकलन करने के लिए आगे के प्रयोगों की आवश्यकता है कि क्या एस ऑरियस न्यूट्रोफिल से घिरा हुआ है या न्यूट्रोफिल54 की कोशिका सतह से जुड़ा हुआ है। इमेजिंग न्यूट्रोफिल और बायोफिल्म डाउनस्ट्रीम कई न्यूट्रोफिल कार्यक्षमताओं का मूल्यांकन करने के लिए पहला कदम है, जैसे फागोसाइटोसिस और एनईटोसिस54,59। चरण 5.6 में सूचीबद्ध छवि विश्लेषण उपकरणों का उपयोग करके बायोफिल्म बायोमास, बायोफिल्म के संरचनात्मक परिवर्तन, और बायोफिल्म व्यवहार्यता को कई अन्य लोगों के बीच निर्धारित करके बायोफिल्म पर न्यूट्रोफिल के प्रभाव का भी आकलन किया जा सकता है। अंत में, न्यूट्रोफिल में दाता-से-दाता परिवर्तनशीलता मौजूद है; इस प्रकार, यह अनुशंसा की जाती है कि न्यूट्रोफिल से जुड़े अध्ययनों के लिए कम से कम तीन अलग-अलग दाताओं का उपयोग किया जाए।

कुल मिलाकर, न्यूट्रोफिल और बायोफिल्म के बीच बातचीत का आकलन करने के लिए मानकीकृत इन विट्रो परख ों को जोड़ा गया था। हालांकि ये परख एस ऑरियस का उपयोग करते हैं, वर्णित प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य रोगजनकों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जबकि मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए विवो मॉडल में विभिन्न हैं, वे महंगे और श्रम-गहन हो सकते हैं, खासकर अगर स्थितियों को अनुकूलित नहीं किया जाता है। मानकीकृत इन विट्रो परखों के साथ काम करने से प्रयोगात्मक स्थितियों को अनुकूलित करने और इनविवो सिस्टम में जाने से पहले टिप्पणियों की पुष्टि करने की अनुमति मिलती है। अंत में, विवो में बायोफिल्म-न्यूट्रोफिल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए विभिन्न पशु संक्रमण मॉडल का उपयोग किया गया है। हालांकि, मनुष्यों और पशु मॉडल60,61,62,63 के बीच प्रतिरक्षात्मक अंतर पर विचार करना महत्वपूर्ण है। इसके लिए इन जटिल मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए मनुष्यों से प्राप्त न्यूट्रोफिल का उपयोग करने की आवश्यकता होती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को डीजेडब्ल्यू के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी एंड इंफेक्शियस डिजीज (आर01एआई077628) और ईएसजी को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन करियर डेवलपमेंट अवार्ड (19सीडीए 34630005) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम यूएसए 300 एलएसी जीएफपी स्ट्रेन प्रदान करने के लिए डॉ पॉल स्टैंडली को धन्यवाद देते हैं। इसके अलावा, हम कैंपस माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सुविधा (सीएमआईएफ) और ओएसयू व्यापक कैंसर केंद्र (ओएसयूसीसी) माइक्रोस्कोपी साझा संसाधन (एमएसआर), ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी से संसाधनों को स्वीकार करते हैं। हम ब्लड ड्रॉ करने के लिए स्टैंडली लैब से अमेलिया स्टैट्स, पीटर बरबैक और लिसा कोलमैन को भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% sodium chloride irrigation, USP Baxter 2F7124 Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils
150 mL rapid-flow filter unit Thermo Scientific 565-0020
200 proof ethanol VWR 89125-188
3 mL syringe BD 309657 Used for blood draw
50 mL conical centrifuge tubes Thermo Scientific 339652
60 mL syringe BD 309653 Used for blood draw
Agar Fisher Bioreagents BP1423-2
Alcohol swab BD Used for blood draw
Band-aids Used for blood draw
BD Bacto Tryptic Soy Broth BD DF0370-07-5 Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar
Cell counter Bal Saupply 202C
CellTracker blue CMCH Invitrogen C2111 Blue CMAC Dye (BCD)
Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates Costar 3370
Cotton gauze Fisherbrand 13-761-52 Used for blood draw
Crystal violet Acros Organic 40583-0250
Culture tubes Fisherbrand 14-961-27 Borosilicate Glass 13 x 100 mm
D-(+)-glucose Sigma G-8270
Dextran from Leuconostoc spp. Sigma 31392-250G Used for isolation of neutrophils
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) 1x Gibco 14190-144
Ethidium homodimer-1 Invitrogen L3224 B
Ficoll-Paque plus Cytiva 17144003 Used for isolation of neutrophils (density gradient medium)
Hanks' balanced salt solution (HBSS) 1x Corning cellgro 21-022-CV without calcium, magnesium, and phenol red
Hemacytometer Bright Line
Heparin Novaplus NDC 63323-540-57 1000 USP units/mL, Used for blood draw
IMARIS 9.8 Oxford Instruments Microscopy image analysis software
Luminol Sigma A8511-5G
Minimal essential media (MEM) Alpha 1x Gibco 41061-029
Needle (23 G1) BD 305145 Used for blood draw
Nikon Eclipse Ti2 Nikon
NIS-Elements Nikon Quantification of dead neutrophils
Normal human serum Complement Technology NHS
Petri Dish (100 x 15 mm) VWR 25384-342
Phorbol 12-myristate 13-acetate
Poly-L-lysine solution Sigma P4707-50ML
Sodium chloride Fisher Bioreagents BP358-10 Used for neutrophil isolation
SoftMax Pro Software Molecular Devices Microplate reader software used for data acquisition
SpectraMax i3x Molecular Devices Microplate reader
Sterile water for irrigation, USP Baxter 2F7114 Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation
Surflo winged infusion set Terumo SC*19BLK 19 G x 3/4", used for blood draw
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Turnicate Used for blood draw
UltraPure distilled water Invitrogen 10977015
White opaque 96-well plates Falcon 353296 Tissue culture treated and flat bottom plate
μ-Slide VI 0.4 Ibidi 80601 μ-channel slide

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मानव न्यूट्रोफिल और <em>स्टेफिलोकोकस ऑरियस</em> बायोफिल्म के बीच बातचीत की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए मानकीकृत <em>इन विट्रो</em> परख
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Rana, P. S. J. B., Gloag, E. S.,… More

Rana, P. S. J. B., Gloag, E. S., Wozniak, D. J. Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms. J. Vis. Exp. (184), e63773, doi:10.3791/63773 (2022).

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