Summary
Denne protokollen beskriver studiet av nøytrofil-biofilm-interaksjoner. Staphylococcus aureus biofilmer er etablert in vitro og inkuberes med perifere blodavledede humane nøytrofiler. Den oksidative burstresponsen fra nøytrofiler kvantifiseres, og nøytrofillokaliseringen i biofilmen bestemmes ved mikroskopi.
Abstract
Neutrofiler er den første forsvarslinjen som brukes av immunsystemet under mikrobiell infeksjon. In vivo rekrutteres nøytrofiler til infeksjonsstedet der de bruker prosesser som fagocytose, produksjon av reaktive oksygen- og nitrogenarter (henholdsvis ROS, RNS), NETosis (nøytrofil ekstracellulær felle) og degranulering for å drepe mikrober og løse infeksjonen. Interaksjoner mellom nøytrofiler og planktoniske mikrober har blitt grundig studert. Det har vært nye interesser i å studere infeksjoner forårsaket av biofilm de siste årene. Biofilmer viser egenskaper, inkludert toleranse for drap av nøytrofiler, forskjellig fra deres planktonisk dyrkede kolleger. Med den vellykkede etableringen av både in vitro og in vivo biofilmmodeller, kan interaksjoner mellom disse mikrobielle samfunnene med forskjellige immunceller nå undersøkes. Her er teknikker som bruker en kombinasjon av tradisjonelle biofilmmodeller og veletablerte nøytrofile aktivitetsanalyser skreddersydd spesielt for å studere nøytrofile og biofilminteraksjoner. Bredfeltfluorescensmikroskopi brukes til å overvåke lokalisering av nøytrofiler i biofilmer. Disse biofilmene dyrkes under statiske forhold, etterfulgt av tilsetning av nøytrofiler avledet fra humant perifert blod. Prøvene er farget med passende fargestoffer før visualisering under mikroskopet. I tillegg kvantifiseres produksjonen av ROS, som er en av de mange nøytrofile responsene mot patogener, i nærvær av en biofilm. Tilsetningen av immunceller til dette etablerte systemet vil utvide forståelsen av vertspatogeninteraksjoner samtidig som det sikres bruk av standardiserte og optimaliserte forhold for å måle disse prosessene nøyaktig.
Introduction
En biofilm er et fellesskap av overflateassosierte mikrober eller ikke-vedlagte aggregater innkapslet i en ekstracellulær polymer substans (EPS)1,2. Disse samfunnene beskytter de innkapslede mikroorganismer mot miljøstressorer, inkludert toleranse for antimikrobielle midler og immunsystemet. Flere patogene mikrobielle arter danner biofilmer som har vært assosiert med kroniske infeksjoner4. Utviklingen av biofilm er en intrikat prosess som involverer festing til overflater, EPS-produksjon, celleproliferasjon, biofilmstrukturering og celleløsning5. Når celler sprer seg for å danne en biofilm, forblir de planktoniske eller translokerer til et nytt substratum og gjenopptar biofilmutvikling6.
Staphylococcus aureus, et opportunistisk patogen, følger en generell ordning for biofilmutvikling, inkludert vedlegg, spredning, modning og spredning7. Festeprosessen i S. aureus biofilmer dikteres av hydrofobe interaksjoner, teichoic syrer og mikrobielle overflatekomponenter som gjenkjenner klebende matrisemolekyler (MSCRAMMs)8,9. Når spredning av S. aureus begynner, produseres EPS, som hovedsakelig består av polysakkarider, proteiner, ekstracellulært DNA og teichoic syrer, 5. Etter hvert som EPS-komponenter produseres, produseres også forskjellige eksoenzymer og små molekyler, noe som bidrar til biofilmens 3-dimensjonale struktur og hjelper til med løsrivelse5. S. aureus utnytter denne svært koordinerte livsstilen for å etablere ulike kroniske infeksjoner, inkludert infeksjoner på grunn av inneboende medisinsk utstyr10.
Meticillinresistent S. aureus (MRSA) er en av de viktigste årsakene til infeksjoner relatert til inneliggende medisinsk utstyr, som sentrale vene- og urinkatetre, proteser, pacemakere, mekaniske hjerteventiler og intrauterin utstyr11. Under slike infeksjoner er nøytrofiler de første vertsimmuncellene som rekrutteres til infeksjonsstedet for å bekjempe patogener via flere strategier12. Disse inkluderer fagocytose, degranulering, produksjon av reaktive oksygen- og nitrogenarter (ROS / RNS), eller frigjøring av nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) for å eliminere patogener13.
Generering av ROS ved fagocytose av mikrober er en av de viktigste antimikrobielle responsene som utvises av nøytrofiler14. Fagocytose forsterkes hvis mikrober er belagt med opsoniner, spesielt immunglobuliner og komplementkomponenter som finnes i serum15. De opsoniserte mikrober blir deretter gjenkjent av celleoverflatereseptorer på nøytrofiler og oppslukt, og danner et rom kalt fagosomet15. Nøytrofiler genererer og frigjør ROS i fagosomet via membranassosiert NADPH-oksidase16. Dette multikomponentenzymkomplekset genererer superoksidanioner ved å overføre elektroner til molekylært oksygen16. I tillegg genererer nøytrofiler også RNS gjennom ekspresjon av induserbar nitrogenoksidsyntase (iNOS)17. Disse høye superoksid- og nitrogenoksidradikalene i fagosomet har brede antimikrobielle aktiviteter. De kan samhandle med metallsentre i enzymer og skade nukleinsyrer, proteiner og cellemembraner av patogenet 18,19,20,21. Mange mikrober vedtar en biofilm-livsstil og bruker forskjellige strategier for å unngå drap med ROS22,23. Dermed er standardiserte analyser som par biofilmer med nøytrofiler for å kvantifisere ROS gunstig for konsistente resultater.
Mens analyser, for eksempel kvantifisering av nøytrofil ROS-produksjon, gir informasjon om responsene til nøytrofiler til biofilmer, kan evnen til å visualisere samspillet mellom nøytrofiler i en biofilm også tjene som et kraftig verktøy. Bruken av fluorescerende fargestoffer for mikroskopi krever ofte optimalisering for å oppnå bilder av høy kvalitet som kan brukes til mikroskopiavbildningsanalyse. Fleksibiliteten til å optimalisere noen forhold er begrenset da nøytrofiler kan gjennomgå celledød etter isolasjon. Videre vaskes biofilmer vanligvis for å fjerne den planktoniske populasjonen fra det eksperimentelle oppsettet før tilsetning av nøytrofiler. Under vask kan variabilitet mellom replikerende biofilmer oppstå på grunn av tap av delvis biomasse hvis biofilmer er løst festet til overflaten.
I stor grad inkluderer nåværende metoder i feltet for å analysere interaksjoner mellom nøytrofiler og biofilmer hovedsakelig mikroskopi, flowcytometri og kolonidannende enheter (CFU) oppregning 24,25,26,27. Mikroskopi innebærer bruk av fargestoffer som enten direkte flekker nøytrofile og biofilmer, eller retter seg mot forskjellige nøytrofile responser mot mikrober som NET-dannelse, degranulering og celledød25,28. En undergruppe av disse responsene, som nøytrofil celledød og degranulering, kan også analyseres via flowcytometri, men krever at nøytrofiler fortrinnsvis ikke er assosiert med store mengder mikrober i en biofilm28,29. Flowcytometri kan også kvantifisere noen biofilmparametere, for eksempel cellens levedyktighet27. Disse prosessene krever imidlertid forstyrrelse av biofilmbiomassen og vil ikke være nyttige for å visualisere andre viktige interaksjoner som romlig fordeling av nøytrofiler og deres komponenter i en biofilm27,29,30.
Den nåværende protokollen fokuserer på å tilpasse noen av de tradisjonelt brukte metodene for å studere nøytrofil-biofilminteraksjoner på biofilmer som er optimalisert for å gi minimal variasjon under håndtering. Denne protokollen gir dermed standardiserte metoder for å vokse og kvantifisere biofilmer, isolere primære humane nøytrofiler fra perifert blod, kvantifisere ROS-produksjon og visualisere biofilm-nøytrofile interaksjoner via mikroskopi. Denne protokollen kan tilpasses forskjellige systemer for å forstå biofilm-nøytrofile interaksjoner mens man vurderer heterogeniteten mellom donorbassenger.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av Ohio State University Institutional Review Board (IRB) (2014H0154). Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle giverne for å samle inn perifert blod for å isolere primære humane nøytrofiler. Staphylococcus aureus (USA300 LAC)31 ble brukt som modellorganisme for å utføre forsøkene. Forsøkene ble utført med riktig personlig verneutstyr (PPE) på grunn av potensiell eksponering for et blodbårent patogen.
1. Tilberedning av in vitro biofilm
- Oppnå isolerte kolonier av S. aureus fra en kryopreservert bestand 31 ved hjelp av en strekplateteknikk32,33 på en næringsrik agarplate, for eksempel Tryptic Soy Agar (se Materialtabell).
- Belegg individuelle brønner av en 96-brønns plate med 100 μL 0,001% (v / v) poly-L-lysin (PLL) fortynnet i steril H2O og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Aseptisk, aspirer PLL-løsningen ved hjelp av en vakuumassistert aspirasjonsfelle. La brønnene tørke over natten ved romtemperatur.
MERK: Alle aspirasjonstrinn i protokollen utføres ved hjelp av en vakuumassistert aspirasjonsfelle med mindre annet er oppgitt. - Forbered en nattkultur ved å inokulere en koloni av S. aureus i minimal essensiell media alfa (MEMα) supplert med 2% glukose og inkuber ved 37 ° C, risting ved 200 o / min i 16-18 timer.
- Fortynn nattkulturen ved å overføre 50 μL til 5 ml fersk MEMα supplert med 2% glukose og inkuber ved 37 ° C, risting ved 200 o / min, til midten av logaritmisk fase, vanligvis mellom optisk tetthet 600 (OD600 nm) på 0,5-0,8. Bruk MEMα til å normalisere mellomlogaritmisk kultur til en OD600 nm på 0,1.
- Overfør 150 μL normalisert kultur til hver brønn i PLL-behandlet 96-brønnplate. Inkuber statisk i 18-20 timer i et fuktet kammer ved 37 °C.
MERK: Biofilmene kan også dyrkes i andre formater som μ-kanals lysbilder (se Materialtabell). - Aspirer supernatanten for å fjerne de planktoniske cellene. Vask forsiktig gjenværende biomasse med 150 μL Hanks balanserte saltløsning (HBSS) for å fjerne de ufestede cellene. Legg HBSS dråpevis for å unngå å forstyrre biofilmen.
MERK: Mens du aspirerer supernatanten og HBSS under vask, la det være akkurat nok væske (supernatant eller HBSS) i brønnene som inneholder biofilm slik at biofilmen fortsatt er nedsenket. Dette forhindrer forstyrrelse av biofilmstrukturen når HBSS tilsettes dråpevis for å vaske biofilmen. - Gjenta trinn 1.6 minst to ganger til for å fjerne alle planktoniske celler. På dette tidspunktet er biofilmer klare for umiddelbare nedstrømseksperimenter.
MERK: Hvis biofilmene ikke brukes til nøytrofile eksperimenter, kan HBSS erstattes med fosfatbufret saltvann (PBS). HBSS foretrekkes fremfor PBS da HBSS inneholder komponenter, inkludert glukose, som gir optimale forhold for nøytrofilaktivering34.
2. Kvantifisering av biofilmbiomasse
- Forbered et lager av 0,1% (w / v) Crystal Violet (CV) løsning (se tabell over materialer) ved å oppløse i 20% (v / v) etanol og 80% (v / v) H 2 O.Forsikre deg om at CVen er fullstendig oppløst i etanol før tilsetning av H2O. Filtersteriliser løsningen.
- Tilsett 150 μL 0,1% CV-løsning til den vasket biofilmen og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur. Bruk minst tre tomme brønner som bare mediekontroller.
- Aspirer 0,1% CV-løsningen fra biofilmene og vask de fargede biofilmene med 200 μL 1x PBS. Gjenta denne prosessen i totalt tre vasker for å fjerne overflødig CV fra brønnene.
- Tilsett 150 μL av 33% (v / v) iseddiksyre fortynnet med H2O. Inkuber ved romtemperatur på en rocker ved 50 o / min i 30 minutter for å la CVen bundet til biomassen oppløses helt.
FORSIKTIG: Utfør dette trinnet i en laminær strømningshette med passende PPE, da iseddik er et etsende kjemikalie. - I mellomtiden setter du opp mikroplateleseren (se Materialtabell) for å lese av CV-flekkverdiene. Etter iseddikbehandling, les platen ved 595 nm bølgelengde.
MERK: Bølgelengden som brukes til å måle OD av CV kan variere fra 500-600 nm35.
3. Nøytrofil isolasjon
MERK: Nøytrofile ble isolert etter en tidligere publisert metode med mindre endringer36. Denne isolasjonsprotokollen kombinerer tetthetsgradient sentrifugering først, etterfulgt av 3% dextran sedimentering. Denne delen dekker bare den generelle nøytrofile isolasjonsprotokollen, med fokus på endringene som er gjort i den publiserte protokollen. Videre er protokollen som er skissert nedenfor en av de mange metodene som kan isolere nøytrofiler, og kan erstattes etter behov. Andre metoder for å isolere nøytrofiler inkluderer bruk av celleseparasjonsmedier eller magnetisk antistoffcelleseparasjon37.
- Tegn blod fra en voksen donor via venepunksjon, i henhold til protokollen som er skissert i den institusjonelle IRB. Før blodprøvetaking, sørg for at sprøyten har tilstrekkelig konserveringsfri heparin, slik at den endelige konsentrasjonen av heparin er 20 U / ml.
- Fortynn det hepariniserte blodet med 3/4 volumet av endotoksinfritt 0,9% NaCl (se materialtabell) i H2O ved romtemperatur.
- For hver 20 ml av den fortynnede blodprøven, aliquot 14 ml av et kommersielt tilgjengelig tetthetsgradientmedium (se tabell over materialer) i et friskt 50 ml konisk rør. Legg den fortynnede blodprøven forsiktig på toppen av tetthetsgradientmediet.
- Sentrifuger den lagdelte blodprøven ved 400 x g i 40 minutter ved romtemperatur. Forsikre deg om at sentrifugen har en langsom pause for å unngå å forstyrre laget når sentrifugeringen er fullført.
MERK: Blodprøven vil ha fem lag som inneholder en blanding av saltvann og plasma, et mononukleært cellelag, tetthetsgradientmedium, nøytrofiler og erytrocytter. - Ved hjelp av en serologisk pipette aspirerer du alle lagene over nøytrofile og erytrocytpellet, etterfulgt av en mild resuspendering av pelleten i kaldt endotoksinfritt 0,9% NaCl i H2O. For hver pellet generert fra en 20 ml blodprøve, resuspend pelleten tilbake til 20 ml volum totalt. Legg til 1: 1 volum på 3% dextran (se materialtabell). Inkuber røret oppreist i 18-20 min på is.
MERK: Sørg for at 3% dextran er laget med endotoksinfri 0,9% NaCl i H2O. - Fjern 20 ml av det øvre laget som inneholder nøytrofiler og noen erytrocytter på et nytt 50 ml konisk rør og sentrifuger det ved 355 x g i 10 minutter ved 4 °C. Hell av supernatanten og etterlatt en rød pellet.
- Resuspender pelleten forsiktig i 10 ml kald, steril H2O i 30 s for å lyse de resterende erytrocyttene. Tilsett umiddelbart 10 ml kaldt endotoksinfritt 0,9% saltvann til blandingen for å gjenopprette tonicitet. Sentrifuge løsningen ved 233 x g i 3 min ved 4 °C.
- Hell av supernatanten og resuspendere pelleten som inneholder 95% -97% nøytrofiler i 1 ml kald HBSS per 20 ml blodprøve.
- Overfør 10 μL av de resuspenderte nøytrofile i 90 μL på 0,4% trypan blå eksklusjonsfargestoff og telle cellene ved hjelp av et hemocytometer (se materialtabell).
MERK: Ikke-levedyktige celler er farget blå som trypan blå eksklusjonsfarge er ugjennomtrengelig i levedyktige celler. Denne protokollen gir >99% celle levedyktighet37,38. - Tilsett ytterligere HBSS slik at den endelige konsentrasjonen av nøytrofiler er 4 x 106 celler / ml.
MERK: For eksempel med <99% celle levedyktighet, kan den endelige konsentrasjonen på 4 x 106 celler / ml fortsatt oppnås; Det totale volumet av oppløsninger som inneholder 4 x 106 celler/ml som er oppnådd, vil imidlertid reduseres. Den endelige konsentrasjonen av nøytrofiler kan justeres i henhold til brukerens eksperimentelle behov. Nøytrofile granulocytter ble resuspendert ved en 4 x 106 celler/ml endelig konsentrasjon for alle forsøkene beskrevet nedenfor. For å ta hensyn til donor-til-donor-variabilitet, anbefales det sterkt at alle eksperimenter involvert med nøytrofiler utføres med minst tre forskjellige givere.
4. Måling av ROS produsert av nøytrofiler
- Tilsett 100 μL 20 % normalt humant serum (fortynnet i HBSS) dråpevis til den vaskede biofilmen (trinn 1.6) og inkuber ved 37 °C under statisk tilstand i 30 minutter for å opsonisere biofilmen.
- Aspirer 20% serumoppløsning og vask biofilmene dråpevis med 150 μL HBSS en gang. Aspirer HBSS, etterlater brønner med opsoniserte biofilmer.
MERK: For tolkning av eksperimentet anbefales minst fire grupper: (A) Neutrofiler + Biofilm, (B) Neutrofiler + PMA (positiv kontroll, se Materialtabell), (C) Kun nøytrofiler og (D) Kun biofilm. - Legg luminol (se materialtabell) til nøytrofile resuspendert i HBSS ved en konsentrasjon på 4 x 106 celler / ml slik at den endelige luminolkonsentrasjonen er 50 μM. Denne løsningen er klar til bruk for gruppene (A) og (C). Tilsett 4 x 105 nøytrofiler blandet med luminol til brønnene med opsoniserte biofilmer.
- I et separat rør, lag 50 μM luminoloppløsning i HBSS uten nøytrofiler og tilsett den til brønnen som inneholder biofilm (gruppe D).
- Aliquot 350 μL nøytrofiler blandet med luminol og tilsett phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) ved en endelig konsentrasjon på 500 ng / ml til blandingen. For gruppe (B), tilsett 4 x 105 nøytrofiler fra denne blandingen i brønner uten biofilm. Dette fungerer som en positiv kontroll.
MERK: Konsentrasjonen av PMA som er angitt i dette trinnet er relativt høy for å sikre robust utbruddsrespons, da PMA-stimulerte nøytrofiler er en positiv kontroll. PMA kan brukes i en lavere konsentrasjon for å aktivere nøytrofiler, avhengig av forsøket. - Sentrifuge platen ved 270 x g i 30 s ved 4 °C.
- Forsikre deg om at plateleseren er satt til 37 °C sammen med innstillingen for luminescens og kinetisk avlesning i 60 minutter med 3 minutters intervaller. Plasser platen i plateleseren for å måle ROS-produksjonen av nøytrofiler i 60 minutter.
MERK: For denne analysen ble biofilmer dyrket i hvite plater som ble brukt til luminescensanalyser. PMA er en kjent agonist for oksidativ burstrespons39. Når du utfører studier som involverer PMA, må du sørge for at PMA tilsettes på det siste trinnet mens løsningen som inneholder nøytrofiler er kald, siden PMA umiddelbart starter burstresponsen.
5. Imaging biofilm-nøytrofile interaksjoner
- Sett opp en biofilm ved hjelp av trinn 1.2-1.6. For å lette biofilmavbildning, bruk en fluorescerende stamme av S. aureus, for eksempel USA300 som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) 40,41, for å øke enkel mikroskopiavbildning.
MERK: Et lysbilde på 6 μ (se materialtabell) ble brukt i stedet for en 96-brønnsplate for å demonstrere in vitro biofilmmodellen (trinn 1). - Inkuber 4 x 106 celler/ml nøytrofiler med 100 μM blå CMAC (7-amino-4-klormetylcoumarin) fargestoff (BCD, se materialtabell) i 30 minutter i en rocker ved 37 °C og 5 % CO2. Sørg for at prøvene inkuberes i mørket og begrens eksponeringen for lys for de resterende trinnene.
- For å vaske overflødig BCD, sentrifuger nøytrofiler ved 270 x g i 5 minutter og aspirerer supernatanten. Resuspend nøytrofile stoffer i fersk HBSS. På dette tidspunktet legger du til ethidium homodimer-1 (se materialtabell) til BCD-fargede nøytrofiler ved en endelig konsentrasjon på 4 μM for å overvåke nøytrofil og bakteriell død.
- Tilsett 150 μL nøytrofiler til S. aureus biofilm som har blitt dyrket i μ-lysbilder, slik at nøytrofil til bakterieforholdet er 1:30 (nøytrofil: bakterier). Inkuber μ-lysbildene i et fuktet kammer i 30 minutter. Antall bakterieceller er basert på celletallene oppnådd ved plating av en 18 timers biofilm.
- Bilde nøytrofil-biofilminteraksjonen ved bruk av fluorescerende kanaler som tilsvarer eksitasjons- og utslippsbølgelengdene til de fluorescerende fargestoffene / proteinene.
MERK: For denne studien er BCD 353/466 nm, ethidium homodimer-1 er 528/617 nm, og GFP er 395/509 nm. Begrens eksponeringen av prøven til laseren eller lyset for å forhindre fotobleking av prøvene. - Analyser bildene ved hjelp av mikroskopi bildeanalyse programvare eller programmer som FIJI / ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ og BAIT, blant mange flere42,43,44,45.
NOTAT: Når du arbeider med flekker, er det viktig å vurdere spesifisiteten til fargestoffene som er i bruk. Noen flekker fungerer på prokaryote og eukaryote celler, mens andre bare fungerer på en. Hvis nøytrofiler og biofilmer er separat farget ved hjelp av fargestoffer som kan flekke begge celletyper, må du vaske av gjenværende fargestoff før du kombinerer nøytrofiler og biofilmer for å forhindre kryssfarging.
Representative Results
Mediene som brukes til å dyrke bakterielle biofilmer påvirker overlevelsen av nøytrofiler. Ulike medier ble testet for å redusere effekten av media alene på levedyktigheten til nøytrofiler for å studere nøytrofil-biofilm-interaksjoner (figur 1). Bakterielle vekstmedier som tryptisk soyabuljong minimerer levedyktigheten til nøytrofiler, slik at ~ 60% av nøytrofile er i live etter en 30 minutters inkubasjonsperiode ved 37 ° C med 5% CO2. Pattedyrcellekulturmedier, som MEMα, påvirker ikke levedyktigheten til nøytrofiler og støtter veksten av S. aureus biofilmer. Faktisk fremmer minimale medier robust vekst av biofilmer i andre bakterier46,47.
For å vurdere effekten av media på biofilmvekst og variabilitet i biofilmbiomassekvantifisering etter vask av biomassen for å eliminere planktoniske celler, ble en 18 timers S. aureus biofilm dyrket i en 96-brønns plate, med brønner behandlet eller ubehandlet med poly-L-lysin. En næringsrik (tryptisk soyabuljong (TSB)) og minimal (MEMα) media ble brukt som den er eller supplert med 2% glukose. Biofilmbiomassen farget med CV viste at S. aureus biofilm dyrket i MEMα supplert med 2% glukose produserte den mest robuste biofilmen blant alle testede medier (figur 2A). Videre viste biofilmer dyrket i PLL forbehandlede brønner som inneholdt MEMα + 2% glukose mindre variabilitet enn biofilmer i PLL-ubehandlede brønner som inneholdt MEMα + 2% glukose. Disse biofilmene viste mindre variasjon i kvantifisering via CV-analyse35 og CFU/ml når de ble belagt etter nøyaktig håndtering av biofilm for kvantifisering av biomasse. Disse biofilmene inneholdt i gjennomsnitt 1 x 108 CFU/ml, som vist ved plating av biofilmene på 3 separate dager (figur 2B). Dette tallet er nyttig for å bestemme antall nøytrofiler som skal legges til biofilmene for nøytrofile funksjonsanalyser.
For å måle ROS-produksjon av nøytrofiler som svar på biofilmer, ble S. aureus biofilmer dyrket statisk i 18-20 timer i en 96-brønnplate. Biofilmer ble deretter opsonisert, og nøytrofiler ble tilsatt. ROS-produksjonen ble deretter målt i 60 min (figur 3A). Arealet under kurven beregnes ut fra den kinetiske kurven for å kvantifisere total ROS-produksjon med nøytrofiler. Neutrofiler behandlet med en agonist, som PMA, brukt som kontroll, viser økt ROS-produksjon. I fravær av biofilm viste nøytrofiler behandlet med PMA robust ROS-produksjon. I nærvær av S. aureus biofilm ble den totale ROS-produksjonen av nøytrofiler behandlet med PMA redusert. I fravær av PMA er nøytrofiler utelukkende avhengige av samspillet med biofilmen, noe som ytterligere reduserer mengden ROS produsert (figur 3B).
For å visualisere nøytrofil-biofilm-interaksjonene ved bruk av fluorescensmikroskopi, ble en GFP-uttrykkende stamme av S. aureus, Blue CMAC-fargestoff og ethidium homodimer-1, som flekker cytoplasmaet til henholdsvis levende celler og DNA fra døde celler, brukt. S. aureus biofilm ble dyrket i 18 timer i et 6 μ-kanals lysbilde. Blå CMAC fargestoffmerkede nøytrofiler ble tilsatt sammen med ethidium homodimer-1 til de vaskede biofilmene og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C med 5% CO2 før avbildning. Vidvinkelfluorescerende mikroskopi viste at mange nøytrofiler var lokalisert til overflaten av S. aureus biofilm, mens noen få er innenfor biofilmen (figur 4A). Interaksjonen mellom S. aureus-celler i nøytrofiler var også tydelig (figur 4C). De fleste av S. aureus-cellene som interagerer med nøytrofiler (cyan) var døde (magenta), mens noen få forble i live (gule) som bestemt av levende døde flekker (figur 4C). Til sammenligning ble GFP-uttrykkende S. aureus biofilmer farget med ethidium homodimer-1, som avslørte en brøkdel av den døde S. aureus-populasjonen i biofilmen (figur 4B). Ikke-levedyktige nøytrofiler som var positive for ethidium homodimer-1 ble kvantifisert ved hjelp av analyseprogramvare (se Materialtabell) etter inkubasjon med S. aureus biofilm. Omtrent 48% av nøytrofile var allerede døde innen 30 minutter etter inkubasjon med S. aureus biofilm. Under optimalisering av mikroskopiprotokollen ble effekten av å vaske biofilm og nøytrofiler etter 30 minutters inkubasjon for å fjerne ikke-adhererte nøytrofiler også vurdert, og avslørte rundt 33% av døde nøytrofiler som fortsatt er festet til biofilmen (figur 4D).
Figur 1: LIVE-DEAD assay sammenligner nøytrofil overlevelse mellom bakterielle og pattedyrs vekstmedier. Nøytrofiler ble isolert og inkubert i HBSS, MEMα, TSB eller 0,1 % SDS i 30 minutter. LIVE-DEAD farging ble utført ved bruk av Calcein AM (live) og ethidium homodimer-1 (død). Prosent av levende nøytrofiler ble bestemt, hvor HBSS-inkuberte nøytrofiler ble behandlet som 100% levende nøytrofiler. Resultatene representerer i gjennomsnitt to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer, med nøytrofiler oppnådd fra to forskjellige givere. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD (*p < 0,05, ****p < 0,0001. Enveis ANOVA). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kvantifisering av biofilmbiomasse under ulike forhold og bakteriell levedyktighet for biofilm dyrket under optimaliserte forhold. (A) S. aureus ble sådd i en 96-brønns plate enten belagt eller ubestrøket med poly-L-lysin (PLL). Biofilmer ble dyrket i TSB, MEMα eller et av mediene supplert med 2% glukose under statiske forhold i 18 timer. Krystallfiolett (CV) farging ble utført for å beise biofilmbiomasse. Den eluerte CV-flekken ble fortynnet kl. 01.10 og lest i en mikroplateleser. Resultatene representerer i gjennomsnitt tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD. SD for hver gruppe er vist nederst for å demonstrere forskjellig variasjon i biofilmvekstforhold. (B) Bakterielle CFU-tall ble oppnådd fra biofilmer dyrket i et optimalisert medium (MEMα + 2% glukose). De 18 timers statiske biofilmene ble utsatt for samme antall vasker etterfulgt av en 10 minutters sonikering for å løsne biofilmbiomassen og passert gjennom en 22G-nål for å forstyrre aggregatene før plating. Resultatene representerer tre replikasjoner utført i tre eksemplarer. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD (ns = ikke signifikant. Enveis ANOVA). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av ROS-produksjon med nøytrofiler via kjemiluminescensanalyse. (A) Neutrofiler (PMN) ble inkubert med HBSS-vasket S. aureus biofilm (BF) enten i nærvær (lukket grå trekant) eller fravær (åpen grå invertert trekant) av PMA for å måle ROS-produksjon av nøytrofiler. Luminol ble brukt til å oppdage ROS hvert 3. minutt i 60 minutter i en mikroplateleser. Mens nøytrofiler behandlet med PMA i fravær av en biofilm (lukket svart sirkel) fungerte som en positiv kontroll, fungerte nøytrofile bare (åpen svart sirkel) og biofilm bare (åpen grå trekant) grupper som negative kontroller. Data representerer i gjennomsnitt to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer med nøytrofiler oppnådd fra to forskjellige givere. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD. (B) Arealet under kurven fra (A) ble beregnet for å kvantifisere den totale ROS generert av nøytrofilene. Dataene er representert som gjennomsnitt ± SD. (***p < 0,0001. Enveis ANOVA). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Visualisering av samspillet mellom S. aureus biofilm og nøytrofiler ved bruk av bredfelt fluorescensmikroskopi. Blå CMAC fargestoff-merkede nøytrofiler (cyan) ble supplert med ethidium homodimer-1 (magenta; død) før inkubering med en 18 timers S. aureus biofilm (gul). Biofilm-nøytrofile interaksjoner ble avbildet ved hjelp av bredfelt fluorescerende mikroskopi og bilder behandlet ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare. Eksperimenter ble utført med tre forskjellige givere. Representative bilder presenteres som (A) 3D-visning av S. aureus biofilm med levende (cyan) og død (magenta; noen få indikert med hvite piler) nøytrofiler, (B) 3D-visning av en S. aureus biofilm i fravær av nøytrofiler med enten levende S. aureus som uttrykker GFP (gul) eller død S. aureus farget med ethidium homodimer-1 (magenta), (C) et ortogonalt syn på S. aureus og nøytrofil interaksjon som avbildet av xy-, yz- og xz-planene, og (D) kvantifisering av nøytrofil levedyktighet i nærvær av S. aureus biofilm etter 30 minutter enten umiddelbart (uvasket) eller etter tre runder med vask med HBSS for å fjerne ikke-adhererte nøytrofiler (vasket). Nøytrofil celledød er presentert som gjennomsnitt ± SD (Student t-test). Skalalinjen indikerer 50 μm i (A) og (B) og 10 μm i (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Det har vært mange anstrengelser for å vokse robuste og reproduserbare S. aureus biofilmer for nedstrøms eksperimenter in vitro48,49,50. En standardisert protokoll er skissert som utnytter PLLs kationiske natur, samt supplerer media med glukose for vekst av robuste in vitro S. aureus biofilmer. Tilsetningen av PLL muliggjør bedre festing av den negativt ladede bakteriecellen til de positivt ladede PLL-belagte overflatene. Det er viktig å merke seg at PLL ved en konsentrasjon på 10 μg / ml har antimikrobiell aktivitet mot Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli og S. aureus når den inkuberes i 24 timer51. Den samme konsentrasjonen brukes til å belegge overflater; Imidlertid aspireres overflødig PLL, noe som gjør konsentrasjonen av PLL lavere enn 10 μg / ml ved såing for biofilmvekst.
Det er viktig å merke seg at PLL kun har virket i spesifikke vekstmedier som MEMα med 2% glukose, hvor det ble observert at S. aureus produserte robuste biofilmer med minimal variabilitet (figur 2A). PLL-konsentrasjon som skal brukes sammen med andre medietyper vil kreve ytterligere optimalisering, for eksempel bruk av økt konsentrasjon av PLL for å belegge brønnene. I tillegg er disse forholdene optimalisert for en monospecies S. aureus biofilm. Mens kroniske sårbiofilmer ofte er polymikrobielle, er standardiseringsanalyser for å studere monospecies biofilm og dets interaksjoner med nøytrofiler og andre immunceller nøkkelen til å forstå deres bidrag til patogenese52. Disse standardiserte protokollene kan optimaliseres videre for å opprettholde og studere polymikrobielle biofilmer og deres interaksjoner med nøytrofiler.
Det ble også observert at rike bakteriekulturmedier, som TSB, førte til tap av nøytrofil levedyktighet (figur 1). Derfor ble vekstforholdene for S. aureus biofilmer i MEMα, brukt til pattedyrcellekulturer, optimalisert. For studier som involverer nøytrofiler, støtter dette mediet nøytrofil levedyktighet og fremmer S. aureus vekst. Mens det ble observert at media påvirker levedyktigheten til nøytrofiler, er det også viktig å vurdere at nøytrofiler isolert fra perifert humant blod gjennomgår apoptose ex vivo med ca. 70% apoptotiske nøytrofiler innen 20 timer53. Dette krever riktig håndtering, for eksempel lagring av nøytrofile på is når du forbereder eksperimenter, ved bruk av endotoksinfrie reagenser og forhindrer aktivering av nøytrofiler ved å unngå vortexing av prøver med nøytrofiler.
Vurderingen av oksidativt utbrudd i nøytrofiler utføres rutinemessig for å bestemme drapseffekten av nøytrofiler på patogenet14,54,55. Disse studiene utføres ofte med planktoniske bakterier hvor nøytrofiler tilsettes, og den oksidative burstresponsen kvantifiseres ved hjelp av luminolforsterket kjemiluminescens som oppdager superoksidanioner produsert av nøytrofiler. Den nåværende protokollen modifiseres ved å erstatte planktoniske bakterier med statisk dyrket 18 timers S. aureus biofilm. Som sådan kan nøytrofiler legges direkte til biofilmen for å vurdere aktiveringen. På den annen side produserer bakterier i biofilmer enzymer, som katalase og superoksiddismutase for å avgifte ROS23,56. Staphylococcus epidermidis biofilmer produserer høyere katalase enn sin planktoniske motpart under stress57. Den totale kjemiluminescensen av PMA-stimulerte nøytrofiler i en S. aureus-biofilm er signifikant lavere enn de PMA-stimulerte nøytrofile der biofilm er fraværende (figur 2). Dette kan skyldes aktiviteten til disse avgiftende enzymene. Videre produserer S. aureus biofilmer flere poredannende toksiner kalt leukocidiner som dreper nøytrofiler58. Den reduserte burstresponsen skyldes sannsynligvis også den reduserte levedyktigheten til nøytrofiler i nærvær av S. aureus biofilm. Mens denne studien bruker luminol som oppdager den totale ROS produsert både i og utenfor cellene, må andre reagenser, som CM-H 2 DCFDA (5-(og-6)-klormetyl-2'7'-diklordihydrofluorescein diacetat) eller isoluminol, vurderes hvis målet med arbeidet er å studere intracellulær eller ekstracellulær ROS-produksjon14,53,54 spesifikt.
Evnen til å visualisere nøytrofil-biofilm-interaksjoner via mikroskopi kan være informativ om oppførselen til nøytrofiler og biofilmer i nærvær av hverandre. Eksitasjons- og utslippsspektrene til fluorescerende fargestoffer og proteiner representerer et øyeblikksbilde av samspillet mellom en 18 timers S. aureus biofilm og nøytrofiler etter en 30 minutters inkubasjon. For å effektivt fange opp signaler fra fargede celler, er det viktig å begrense eksponeringen av prøvene til lyskilder mens du setter opp prøvene for mikroskopi. Under avbildning ble rask fotobleking av prøvene unngått ved å senke lyskildens intensitet ved justering av alle parametrene som Z-stackhøyde og eksponeringstid for forskjellige kanaler.
Disse enkle praksisene tillot riktig mikroskopiavbildning der det ble observert at få nøytrofiler er lokalisert i biofilmen (figur 4A). Dette kan skyldes mellomrom som er tilstede i biofilmen, da 18 timers S. aureus biofilm dyrket i MEMα med 2% glukose ikke dekker overflaten jevnt (figur 4B). Andre studiers bruk av rike medier har imidlertid vist en ensartet plen av S. aureus biofilmvekst og leukocytter som trenger gjennom biofilmen30,58. Videre er det også observert at det var nøytrofil celledød etter 30 minutters inkubasjon med S. aureus biofilmer på grunn av S. aureus biofilmproduserte leukocidiner som lyse nøytrofiler58 (figur 4A,D). Tilsetning av et vasketrinn for å fjerne ikke-festede nøytrofiler etter inkubering med biofilm i 30 minutter fjernet ~ 15% av døde nøytrofiler fra systemet sammenlignet med den uvaskede gruppen, hvor mikroskopi ble utført umiddelbart etter 30 minutters inkubasjon (figur 4D). Det ble også observert nøytrofiler som interagerer med S. aureus (figur 4C). Ytterligere eksperimenter er nødvendig for å vurdere om S. aureus er oppslukt av nøytrofiler eller festet til celleoverflaten til nøytrofiler54. Imaging nøytrofiler og biofilmer er det første trinnet for å evaluere flere nøytrofile funksjoner nedstrøms, for eksempel fagocytose og NETosis54,59. Effekten av nøytrofiler på biofilm kan også vurderes ved å kvantifisere biofilmbiomassen, strukturelle endringer i biofilmen og biofilmens levedyktighet, blant mange andre, ved hjelp av bildeanalyseverktøy oppført i trinn 5.6. Til slutt eksisterer donor-til-donor-variabilitet i nøytrofiler; Det anbefales derfor at minst tre forskjellige donorer brukes til studier som involverer nøytrofiler.
Samlet sett ble standardiserte in vitro-analyser kombinert for å vurdere interaksjoner mellom nøytrofiler og biofilmer. Selv om disse analysene bruker S. aureus, kan de beskrevne protokollene lett tilpasses for å studere andre patogener. Mens det finnes ulike in vivo-modeller for å studere vertspatogeninteraksjoner, kan de være dyre og arbeidsintensive, spesielt hvis forholdene ikke er optimalisert. Arbeid med standardiserte in vitro-analyser gjør det mulig å optimalisere eksperimentelle forhold og bekrefte observasjoner før man går over til et in vivo-system. Endelig har ulike dyreinfeksjonsmodeller blitt brukt til å studere biofilm-nøytrofile interaksjoner in vivo. Det er imidlertid viktig å vurdere immunologiske forskjeller mellom mennesker og dyremodeller60,61,62,63. Dette nødvendiggjør bruk av nøytrofiler avledet fra mennesker for å studere disse komplekse vertspatogeninteraksjonene.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01AI077628) til DJW og en American Heart Association Career Development Award (19CDA34630005) til ESG. Vi takker Dr. Paul Stoodley for å gi oss USA 300 LAC GFP stamme. Videre anerkjenner vi ressurser fra Campus Microscopy and Imaging Facility (CMIF) og OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR), Ohio State University. Vi takker også Amelia Staats, Peter Burback og Lisa Coleman fra Stoodley-laboratoriet for å utføre blodtrekk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils |
| 150 mL rapid-flow filter unit | Thermo Scientific | 565-0020 | |
| 200 proof ethanol | VWR | 89125-188 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Used for blood draw |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | Used for blood draw |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-2 | |
| Alcohol swab | BD | Used for blood draw | |
| Band-aids | Used for blood draw | ||
| BD Bacto Tryptic Soy Broth | BD | DF0370-07-5 | Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar |
| Cell counter | Bal Saupply | 202C | |
| CellTracker blue CMCH | Invitrogen | C2111 | Blue CMAC Dye (BCD) |
| Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates | Costar | 3370 | |
| Cotton gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | Used for blood draw |
| Crystal violet | Acros Organic | 40583-0250 | |
| Culture tubes | Fisherbrand | 14-961-27 | Borosilicate Glass 13 x 100 mm |
| D-(+)-glucose | Sigma | G-8270 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392-250G | Used for isolation of neutrophils |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | L3224 B | |
| Ficoll-Paque plus | Cytiva | 17144003 | Used for isolation of neutrophils (density gradient medium) |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) 1x | Corning cellgro | 21-022-CV | without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hemacytometer | Bright Line | ||
| Heparin | Novaplus | NDC 63323-540-57 | 1000 USP units/mL, Used for blood draw |
| IMARIS 9.8 | Oxford Instruments | Microscopy image analysis software | |
| Luminol | Sigma | A8511-5G | |
| Minimal essential media (MEM) Alpha 1x | Gibco | 41061-029 | |
| Needle (23 G1) | BD | 305145 | Used for blood draw |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon | ||
| NIS-Elements | Nikon | Quantification of dead neutrophils | |
| Normal human serum | Complement Technology | NHS | |
| Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-342 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | |||
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P4707-50ML | |
| Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-10 | Used for neutrophil isolation |
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices | Microplate reader software used for data acquisition | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
| Sterile water for irrigation, USP | Baxter | 2F7114 | Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SC*19BLK | 19 G x 3/4", used for blood draw |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Turnicate | Used for blood draw | ||
| UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| White opaque 96-well plates | Falcon | 353296 | Tissue culture treated and flat bottom plate |
| μ-Slide VI 0.4 | Ibidi | 80601 | μ-channel slide |
References
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- Alhede, M., et al. Phenotypes of non-attached Pseudomonas aeruginosa aggregates resemble surface attached biofilm. PLoS One. 6 (11), 27943 (2011).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews: Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Schilcher, K., Horswill, A. R. Staphylococcal biofilm development: structure, regulation, and treatment strategies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (3), 0002 (2020).
- Kaplan, J. B. Biofilm dispersal: mechanisms, clinical implications, and potential therapeutic uses. Journal of Dental Research. 89 (3), 205-218 (2010).
- Otto, M.
- Moormeier, D. E., Bayles, K. W. Staphylococcus aureus biofilm: a complex developmental organism. Molecular Microbiology. 104 (3), 365-376 (2017).
- Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infection and Immunity. 69 (5), 3423-3426 (2001).
- Zheng, Y., He, L., Asiamah, T. K., Otto, M. Colonization of medical devices by staphylococci. Environmental Microbiology. 20 (9), 3141-3153 (2018).
- Donlan, R. M.
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Chen, Y., Junger, W. G.
- van Kessel, K. P., Bestebroer, J., van Strijp, J. A.
- Nguyen, G. T., Green, E. R., Mecsas, J. Neutrophils to the ROScue: Mechanisms of NADPH oxidase activation and bacterial resistance. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 373 (2017).
- Saini, R., Singh, S. Inducible nitric oxide synthase: An asset to neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 105 (1), 49-61 (2019).
- Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: lessons from a model bacterium. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).
- Segal, A. W. The function of the NADPH oxidase of phagocytes and its relationship to other NOXs in plants, invertebrates, and mammals. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (4), 604-618 (2008).
- Fang, F. C. Antimicrobial reactive oxygen and nitrogen species: concepts and controversies. Nature Reviews Microbiology. 2 (10), 820-832 (2004).
- Bogdan, C. Nitric oxide and the immune response. Nature Immunology. 2 (10), 907-916 (2001).
- Chua, S. L., et al. Reactive oxygen species drive evolution of pro-biofilm variants in pathogens by modulating cyclic-di-GMP levels. Open Biology. 6 (11), 160162 (2016).
- El Haj, C., Lichtenberg, M., Nielsen, K. L., Bjarnsholt, T., Jensen, P. O. Catalase protects biofilm of Staphylococcus aureus against daptomycin activity. Antibiotics. 10 (5), 511 (2021).
- Ghimire, N., et al. Direct microscopic observation of human neutrophil-Staphylococcus aureus interaction in vitro suggests a potential mechanism for initiation of biofilm infection on an implanted medical device. Infection and Immunity. 87 (12), 00745 (2019).
- Bhattacharya, M., et al. Leukocidins and the nuclease nuc prevent neutrophil-mediated killing of Staphylococcus aureus biofilms. Infection and Immunity. 88 (10), 00372 (2020).
- Bogachev, M. I., et al. Fast and simple tool for the quantification of biofilm-embedded cells sub-populations from fluorescent microscopic images. PLoS One. 13 (5), 0193267 (2018).
- Kerstens, M., et al. A flow cytometric approach to quantify biofilms. Folia Microbiologica. 60 (4), 335-342 (2015).
- Meyle, E., et al. Destruction of bacterial biofilms by polymorphonuclear neutrophils: relative contribution of phagocytosis, DNA release, and degranulation. The International Journal of Artificial Organs. 33 (9), 608-620 (2010).
- Oveisi, M., et al. Novel assay to characterize neutrophil responses to oral biofilms. Infection and Immunity. 87 (2), 00790 (2019).
- Leid, J. G., Shirtliff, M. E., Costerton, J. W., Stoodley, P. Human leukocytes adhere to, penetrate, and respond to Staphylococcus aureus biofilms. Infection and Immunity. 70 (11), 6339-6345 (2002).
- Fey, P. D., et al. A genetic resource for rapid and comprehensive phenotype screening of nonessential Staphylococcus aureus genes. mBio. 4 (1), 00537 (2013).
- Cody, W. L., et al. Skim milk enhances the preservation of thawed -80 degrees C bacterial stocks. Journal of Microbiological Methods. 75 (1), 135-138 (2008).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, 3064 (2012).
- Freitas, M., Porto, G., Lima, J. L., Fernandes, E. Optimization of experimental settings for the analysis of human neutrophils oxidative burst in vitro. Talanta. 78 (4-5), 1476-1483 (2009).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 1 Unit 1B 1 (2005).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (7), 1065-1074 (2012).
- Quach, A., Ferrante, A. The application of dextran sedimentation as an initial step in neutrophil purification promotes their stimulation, due to the presence of monocytes. Journal of Immunology Research. 2017, 1254792 (2017).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
- Staats, A., et al. Rapid aggregation of Staphylococcus aureus in synovial fluid is influenced by synovial fluid concentration, viscosity, and fluid dynamics, with evidence of polymer bridging. mBio. , 0023622 (2022).
- Chiu, I. M., et al. Bacteria activate sensory neurons that modulate pain and inflammation. Nature. 501 (7465), 52-57 (2013).
- Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. 102 (1), 14-15 (2013).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
- Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
- Luo, T. L., et al. Introducing BAIT (Biofilm Architecture Inference Tool): a software program to evaluate the architecture of oral multi-species biofilms. Microbiology. 165 (5), 527-537 (2019).
- Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. Journal of Applied Microbiology. 105 (2), 585-590 (2008).
- Eze, E. C., El Zowalaty, M. E. Combined effects of low incubation temperature, minimal growth medium, and low hydrodynamics optimize Acinetobacter baumannii biofilm formation. Infection and Drug Resistance. 12, 3523-3536 (2019).
- Harris, L. G., Tosatti, S., Wieland, M., Textor, M., Richards, R. G. Staphylococcus aureus adhesion to titanium oxide surfaces coated with non-functionalized and peptide-functionalized poly(L-lysine)-grafted-poly(ethylene glycol) copolymers. Biomaterials. 25 (18), 4135-4148 (2004).
- Miao, J., et al. Biofilm formation of Staphylococcus aureus under food heat processing conditions: first report on cml production within biofilm. Scientific Reports. 9 (1), 1312 (2019).
- Lade, H., et al. Biofilm formation by Staphylococcus aureus clinical isolates is differentially affected by glucose and sodium chloride supplemented culture media. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1853 (2019).
- Guzel Kaya, G., et al. Antibacterial activity of linezolid against gram-negative bacteria: utilization of epsilon-Poly-l-Lysine capped silica xerogel as an activating carrier. Pharmaceutics. 12 (11), 1126 (2020).
- Clinton, A., Carter, T. Chronic wound biofilms: pathogenesis and potential therapies. Laboratory Medicine. 46 (4), 277-284 (2015).
- Scheel-Toellner, D., et al. Reactive oxygen species limit neutrophil life span by activating death receptor signaling. Blood. 104 (8), 2557-2564 (2004).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006842 (2018).
- Guerra, F. E., et al. Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1005-1010 (2016).
- Suo, Y., Huang, Y., Liu, Y., Shi, C., Shi, X. The expression of superoxide dismutase (SOD) and a putative ABC transporter permease is inversely correlated during biofilm formation in Listeria monocytogenes 4b G. PLoS One. 7 (10), 48467 (2012).
- Olwal, C. O., Ang'ienda, P. O., Ochiel, D. O. Alternative sigma factor B (sigma(B)) and catalase enzyme contribute to Staphylococcus epidermidis biofilm's tolerance against physico-chemical disinfection. Scientific Reports. 9 (1), 5355 (2019).
- Bhattacharya, M., et al. Staphylococcus aureus biofilms release leukocidins to elicit extracellular trap formation and evade neutrophil-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7416-7421 (2018).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Dworsky, E. M., et al. Novel in vivo mouse model of implant related spine infection. Journal of Orthopaedic Research. 35 (1), 193-199 (2017).
- Pletzer, D., Mansour, S. C., Wuerth, K., Rahanjam, N., Hancock, R. E. New mouse model for chronic infections by gram-negative bacteria enabling the study of anti-infective efficacy and host-microbe interactions. mBio. 8 (1), 00140 (2017).
- Davis, M. M. A prescription for human immunology. Immunity. 29 (6), 835-838 (2008).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
