Summary
본 프로토콜은 호중구-생물막 상호작용의 연구를 기술한다. 황색포도상구 균 생물막은 시험관 내에서 확립되고 말초 혈액 유래 인간 호중구와 함께 배양됩니다. 호중구의 산화 파열 반응은 정량화되고 생물막 내의 호중구 국소화는 현미경으로 결정됩니다.
Abstract
호중구는 미생물 감염 중에 면역 체계에 의해 배치 된 첫 번째 방어선입니다. 생체 내에서 호중구는 식균 작용, 활성 산소 및 질소 종 (각각 ROS, RNS) 생성, NETosis (호중구 세포 외 트랩) 및 탈과립과 같은 과정을 사용하여 미생물을 죽이고 감염을 해결하는 감염 부위로 모집됩니다. 호중구와 플랑크톤 미생물 사이의 상호 작용은 광범위하게 연구되었습니다. 최근 몇 년 동안 생물막으로 인한 감염을 연구하는 데 관심이 높아지고 있습니다. 생물막은 호중구에 의한 살상에 대한 내성을 포함하여 플랑크톤으로 성장한 생물막과 구별되는 특성을 나타냅니다. 시험관 내 및 생체 내 생물막 모델의 성공적인 확립으로 이제 이러한 미생물 군집과 다른 면역 세포 간의 상호 작용을 조사할 수 있습니다. 여기에서 전통적인 생물막 모델과 잘 확립된 호중구 활성 분석의 조합을 사용하는 기술은 호중구 및 생물막 상호 작용을 연구하기 위해 특별히 맞춤화됩니다. 광시야 형광 현미경은 생물막에서 호중구의 국소화를 모니터링하는 데 사용됩니다. 이러한 생물막은 정적 조건에서 성장한 다음 인간 말초 혈액에서 유래한 호중구를 추가합니다. 샘플은 현미경으로 시각화하기 전에 적절한 염료로 염색됩니다. 또한 병원체에 대한 많은 호중구 반응 중 하나 인 ROS의 생성은 생물막이있는 상태에서 정량화됩니다. 이 확립된 시스템에 면역 세포를 추가하면 숙주-병원체 상호 작용에 대한 이해가 확장되는 동시에 이러한 프로세스를 정확하게 측정하기 위해 표준화되고 최적화된 조건을 사용할 수 있습니다.
Introduction
생물막은 세포외 고분자 물질(EPS)1,2에 둘러싸인 표면 관련 미생물 또는 부착되지 않은 응집체의 군집입니다. 이러한 군집은 항균제 및면역 체계에 대한 내성을 포함하여 환경 스트레스 요인으로부터 격리된 미생물을 보호합니다3. 몇몇 병원성 미생물 종은 만성 감염과 관련된 생물막을 형성합니다4. 생물막의 발달은 표면에 부착, EPS 생산, 세포 증식, 생물막 구조화 및 세포 박리를 포함하는 복잡한 과정입니다5. 세포가 분산되어 생물막을 형성하면 플랑크톤으로 남아 있거나 새로운 지층으로 전위되어 생물막 발달을 다시 시작합니다6.
기회주의적 병원체인 황색포도상구균은 부착, 증식, 성숙 및 분산을 포함한 생물막 발달의 일반적인 계획을따릅니다7. S. 아우레우스 생물막의 부착 과정은 소수성 상호작용, 테이코산 및 접착 매트릭스 분자(MSCRAMM)를 인식하는 미생물 표면 성분에 의해 결정됩니다.8,9. S. aureus의 증식이 시작되면 주로 다당류, 단백질, 세포 외 DNA 및 테이 코산으로 구성된 EPS가 생성됩니다5. EPS 성분이 생성됨에 따라 다양한 외효소 및 소분자도 생성되어 생물막 3차원 구조에 기여하고 박리5를돕습니다. S. aureus는 의료 기기10의 내재로 인한 감염을 포함하여 다양한 만성 감염을 확립하기 위해이 고도로 조정 된 생활 방식을 이용합니다.
메티실린 내성 S. 아우레우스(MRSA)는 중심 정맥 및 요로 카테터, 인공 관절, 심박 조율기, 기계적 심장 판막 및 자궁 내 장치와 같은 유치 의료 장치와 관련된 감염의 주요 원인 중 하나입니다(11). 이러한 감염 동안, 호중구는 여러 전략12를 통해 병원체와 싸우기 위해 감염 부위에 모집 된 최초의 숙주 면역 세포이다. 여기에는 식균 작용, 탈과립, 활성 산소 및 질소 종 (ROS / RNS) 생산 또는 병원체를 제거하기위한 호중구 세포 외 트랩 (NET)의 방출이 포함됩니다13.
미생물의 식균 작용에 따른 ROS의 생성은 호중구14에 의해 나타나는 주요 항미생물 반응 중 하나이다. 미생물이 옵소닌, 특히 면역글로불린 및 혈청15에서 발견되는 보체 성분으로 코팅되면 식균작용이 향상됩니다. 그런 다음 옵소닉된 미생물은 호중구의 세포 표면 수용체에 의해 인식되고 삼켜져 포식체15라고 하는 구획을 형성합니다. 호중구는 막 관련 NADPH- 산화 효소16을 통해 포식체에서 ROS를 생성하고 방출합니다. 이 다중 성분 효소 복합체는 전자를 분자 산소16으로 전달하여 슈퍼 옥사이드 음이온을 생성합니다. 추가적으로, 호중구는 또한 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)17의 발현을 통해 RNS를 생성한다. 포식체 내의 이러한 높은 과산화물 및 산화질소 라디칼은 광범위한 항균 활성을 가지고 있습니다. 그들은 효소의 금속 중심과 상호 작용하고 병원체18,19,20,21의 핵산, 단백질 및 세포막을 손상시킬 수 있습니다. 수많은 미생물이 생물막 생활 방식을 채택하고 ROS22,23에 의한 살상을 피하기 위해 다양한 전략을 사용합니다. 따라서 ROS를 정량화하기 위해 생물막과 호중구를 결합하는 표준화된 분석은 일관된 결과에 도움이 됩니다.
호중구 ROS 생산을 정량화하는 것과 같은 분석은 생물막에 대한 호중구의 반응에 대한 정보를 제공하지만 생물막 내에서 호중구의 상호 작용을 시각화하는 능력도 강력한 도구로 사용될 수 있습니다. 현미경 검사에 형광 염료를 사용하려면 현미경 이미징 분석에 사용할 수 있는 고품질 이미지를 얻기 위해 최적화가 필요한 경우가 많습니다. 일부 조건을 최적화하는 유연성은 호중구가 분리 후 세포 사멸을 겪을 수 있기 때문에 제한적입니다. 더욱이, 생물막은 전형적으로 호중구를 첨가하기 전에 실험 셋업으로부터 플랑크톤 집단을 제거하기 위해 세척된다. 세척하는 동안 생물막이 표면에 느슨하게 부착되는 경우 부분 바이오매스의 손실로 인해 복제 생물막 간의 가변성이 발생할 수 있습니다.
광범위하게, 호중구와 생물막 사이의 상호작용을 분석하기 위한 현장의 현재 방법은 주로 현미경, 유세포분석, 및 콜로니-형성 단위(CFU) 열거 24,25,26,27을 포함한다. 현미경 검사는 호중구 및 생물막을 직접 염색하거나 NET 형성, 탈과립 및 세포 사멸과 같은 미생물에 대한 다양한 호중구 반응을 표적으로 하는 염료의 사용을 포함합니다25,28. 호중구 세포 사멸 및 탈과립과 같은 이들 반응의 서브세트는 또한 유동 세포분석을 통해 분석될 수 있지만, 호중구는 생물막28,29에서 미생물의 큰 응집체와 우선적으로 연관되지 않아야 한다. 유동 세포분석은 또한 세포 생존율(27)과 같은 일부 생물막 파라미터를 정량화할 수 있다. 그러나, 이들 과정은 생물막 바이오매스의 파괴를 필요로 하며, 생물막 내의 호중구 및 그 성분의 공간적 분포와 같은 다른 중요한 상호작용을 시각화하는데 유용하지 않을 것이다(27,29,30).
본 프로토콜은 취급 동안 최소한의 변동성을 제공하도록 최적화된 생물막에 대한 호중구-생물막 상호작용을 연구하기 위해 전통적으로 사용된 방법 중 일부를 적응시키는 데 중점을 둡니다. 따라서 이 프로토콜은 생물막을 성장 및 정량화하고, 말초 혈액에서 1차 인간 호중구를 분리하고, ROS 생성을 정량화하고, 현미경을 통해 생물막-호중구 상호 작용을 시각화하는 표준화된 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 기증자 풀 간의 이질성을 고려하면서 생물막-호중구 상호 작용을 이해하기 위해 다양한 시스템에 적용할 수 있습니다.
Protocol
모든 절차는 오하이오 주립 대학 기관 검토위원회 (IRB) (2014H0154)의 승인을 받았습니다. 일차 인간 호중구를 분리하기 위해 말초 혈액을 수집하기 위해 모든 기증자로부터 정보에 입각 한 서면 동의를 얻었습니다. 황색포도상구균 (USA300 LAC)31 을 실험을 수행하기 위한 모델 유기체로 사용하였다. 실험은 혈액 매개 병원체에 대한 잠재적 노출로 인해 적절한 개인 보호 장비(PPE)로 수행되었습니다.
1. 체외 생물막의 제조
- 트립신 대두 한천 플레이트와 같은 영양이 풍부한 한천 플레이트 상의 줄무늬 플레이트 기술(32,33)을 사용하여 동결보존된 스톡(31)으로부터 S. 아우레우스의 단리된 콜로니를 수득한다(재료 표 참조).
- 96웰 플레이트의 개별 웰을 멸균H2O에 희석한 0.001%(v/v) 폴리-L-라이신(PLL) 100μL로 코팅하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 무균적으로, 진공 보조 흡인 트랩을 사용하여 PLL 용액을 흡인합니다. 우물을 실온에서 밤새 말리십시오.
알림: 프로토콜의 모든 흡인 단계는 달리 명시되지 않는 한 진공 보조 흡인 트랩을 사용하여 수행됩니다. - 2% 포도당이 보충된 최소 필수 배지 알파(MEMα)에 S. 아우레우스 의 콜로니를 접종하여 하룻밤 배양을 준비하고 37°C에서 배양하고 200rpm에서 16-18시간 동안 흔들어 배양합니다.
- 2% 포도당이 보충된 신선한 MEMα 5mL에 50μL를 옮겨 밤새 배양물을 희석하고, 일반적으로 0.5-0.8의 광학 밀도 600(OD600nm) 사이, 중간 대수상이 될 때까지 200rpm에서 흔들면서 37°C에서 배양합니다. MEMα를 사용하여 중간 로그 배양을 0.1의 OD600nm 로 정규화합니다.
- 150 μL의 정규화된 배양물을 PLL 처리된 96-웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 37 ° C의 가습 챔버에서 18-20 시간 동안 정적으로 배양합니다.
참고: 생물막은 μ채널 슬라이드와 같은 다른 형식으로도 성장할 수 있습니다( 재료 표 참조). - 상청액을 흡인하여 플랑크톤 세포를 제거합니다. 150μL의 행크스 밸런스드 솔트 용액(HBSS)으로 남은 바이오매스를 부드럽게 씻어 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 생물막이 파괴되지 않도록 HBSS를 적가하십시오.
알림: 세척 중에 상청액과 HBSS를 흡입하는 동안 생물막이 여전히 잠기도록 생물막이 포함된 웰에 충분한 액체(상청액 또는 HBSS)만 남겨 두십시오. 이는 HBSS가 생물막을 세척하기 위해 적하될 때 생물막 구조의 파괴를 방지합니다. - 1.6단계를 적어도 두 번 더 반복하여 모든 플랑크톤 세포를 제거합니다. 이 시점에서 생물막은 즉각적인 다운스트림 실험을 위한 준비가 되었습니다.
참고: 생물막이 호중구 실험에 사용되지 않는 경우 HBSS를 인산염 완충 식염수(PBS)로 대체할 수 있습니다. HBSS는 호중구 활성화를 위한 최적 조건을 제공하는 글루코스를 포함하는 성분을 함유하기 때문에 PBS보다 HBSS가 선호된다(34).
2. 생물막 바이오매스의 정량화
- 20 % (v / v) 에탄올과 80 % (v / v) H 2 O에 용해시켜 0.1 % (w / v) 크리스탈 바이올렛 (CV) 용액 (재료 표 참조)의 재고를 준비하십시오. H2O를 첨가하기 전에 CV가 에탄올에 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 용액을 필터 멸균하십시오.
- 세척된 생물막에 0.1% CV 용액 150μL를 첨가하고 실온에서 20분 동안 배양한다. 세 개 이상의 빈 웰을 미디어 전용 컨트롤로 사용합니다.
- 생물막으로부터 0.1% CV 용액을 흡인하고, 염색된 생물막을 200 μL의 1x PBS로 세척한다. 이 과정을 총 세 번 세척하여 웰에서 과도한 CV를 제거합니다.
- H2O로 희석한 33%(v/v) 빙초산 150μL를 추가합니다. 실온에서 50rpm으로 로커에서 30분 동안 배양하여 바이오매스에 결합된 CV가 완전히 용해되도록 합니다.
주의 : 빙초산은 부식성 화학 물질이므로 적절한 PPE가있는 층류 후드에서이 단계를 수행하십시오. - 그 동안 마이크로플레이트 리더( 재료 표 참조)를 설정하여 CV 얼룩 값을 읽으십시오. 빙초산 처리 후 595nm 파장에서 플레이트를 읽습니다.
참고 : CV의 OD를 측정하는 데 사용되는 파장은 500-600 nm35 범위 일 수 있습니다.
3. 호중구 분리
참고: 호중구는 경미한 변경36과 함께 이전에 발표된 방법에 따라 분리되었습니다. 이 분리 프로토콜은 먼저 밀도 구배 원심분리를 결합한 다음 3% 덱스트란 침강을 결합합니다. 이 섹션에서는 전체 호중구 분리 프로토콜만 다루며 게시된 프로토콜의 변경 사항에 중점을 둡니다. 또한, 아래에 요약된 프로토콜은 호중구를 분리할 수 있는 많은 방법 중 하나이며, 필요에 따라 치환될 수 있다. 호중구를 단리하기 위한 다른 방법은 세포 분리 배지 또는 자성 항체 세포 분리(37)의 사용을 포함한다.
- 기관 IRB에 설명된 프로토콜에 따라 정맥 천자를 통해 성인 기증자로부터 혈액을 채취합니다. 채혈하기 전에 주사기에 충분한 방부제가없는 헤파린이 있는지 확인하여 헤파린의 최종 농도가 20U / mL가되도록하십시오.
- 헤파린화 된 혈액을 실온에서 H2O 중 내 독소가없는 0.9 % NaCl (재료 표 참조)의 3/4 부피로 희석하십시오.
- 희석된 혈액 샘플 20mL마다 새로운 50mL 원추형 튜브에 시판되는 밀도 구배 배지( 재료 표 참조) 14mL를 분취합니다. 희석된 혈액 샘플을 밀도 구배 배지 위에 조심스럽게 놓습니다.
- 층상 혈액 샘플을 실온에서 40분 동안 400 x g 로 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 층을 방해하지 않도록 원심분리기가 천천히 끊어지는지 확인하십시오.
참고: 혈액 샘플에는 식염수와 혈장의 혼합물, 단핵 세포층, 밀도 구배 배지, 호중구 및 적혈구가 포함된 5개의 층이 있습니다. - 혈청 학적 피펫을 사용하여 호중구 및 적혈구 펠릿 위의 모든 층을 흡인 한 다음 H2O의 차가운 내 독소가없는 0.9 % NaCl에서 펠릿을 부드럽게 재현탁시킵니다. 20mL 혈액 샘플에서 생성된 각 펠릿에 대해 펠릿을 총 20mL 부피로 다시 재현탁합니다. 3 % 덱스 트란의 1 : 1 부피를 추가하십시오 ( 재료 표 참조). 얼음 위에서 18-20분 동안 튜브를 똑바로 세웁니다.
알림: 3% 덱스트란이H2O에서 내독소가 없는 0.9% NaCl로 만들어졌는지 확인하십시오. - 호중구와 일부 적혈구가 포함된 상층 20mL를 새로운 50mL 원추형 튜브에서 제거하고 355 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 부어 빨간색 펠릿을 남깁니다.
- 펠릿을 10mL의 차갑고 멸균 된 H2O에 30 초 동안 부드럽게 재현탁하여 나머지 적혈구를 용해시킵니다. 즉시 차가운 내 독소가없는 0.9 % 식염수 10mL를 혼합물에 첨가하여 긴장성을 회복시킵니다. 용액을 233 x g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리합니다.
- 상청액을 붓고 혈액 샘플 20mL당 1mL의 차가운 HBSS에 95%-97% 호중구가 포함된 펠릿을 재현탁합니다.
- 10 μL의 재현탁된 호중구를 90 μL의 0.4% 트리판 블루 배제 염료에 옮기고 혈구계를 사용하여 세포를 계수한다( 재료 표 참조).
참고: 비생존 세포는 트리판 블루 배제 염료가 생존 세포에서 불투과성이므로 파란색으로 염색됩니다. 이 프로토콜은 >99 % 세포 생존율37,38을 제공합니다. - 호중구의 최종 농도가 4 x 106 cells/mL가 되도록 HBSS를 추가합니다.
참고: 세포 생존율이 <99%인 경우 4 x 106 cells/mL의 최종 농도를 여전히 달성할 수 있습니다. 그러나 얻은 4 x 106 cells/mL를 포함하는 용액의 총 부피는 감소합니다. 호중구의 최종 농도는 사용자의 실험 요구에 따라 조정될 수 있다. 호중구를 하기에 기재된 모든 실험에 대해 4 x 106 cells/mL 최종 농도로 재현탁시켰다. 기증자 대 기증자 가변성을 설명하기 위해 호중구와 관련된 모든 실험을 적어도 세 명의 다른 기증자와 함께 수행하는 것이 좋습니다.
4. 호중구에 의해 생성되는 ROS의 측정
- 세척된 생물막에 100 μL의 20% 정상 인간 혈청(HBSS로 희석)을 적가하고(단계 1.6) 30분 동안 정적 조건 하에 37°C에서 배양하여 생물막을 옵소닉한다.
- 20% 혈청 용액을 흡인하고 150μL의 HBSS로 생물막을 한 번 적가합니다. HBSS를 흡인하여 옵소닉화된 생물막이 있는 우물을 남깁니다.
참고: 실험의 해석을 위해 (A) 호중구 + 생물막, (B) 호중구 + PMA(양성 대조군, 재료 표 참조), (C) 호중구 전용, (D) 생물막만 최소 4개 그룹이 권장됩니다. - 최종 루미놀 농도가 50μM이 되도록 4 x 106 cells/mL의 농도로 HBSS에 재현탁된 호중구에 루미놀(재료 표 참조)을 추가합니다. 이 솔루션은 그룹 (A) 및 (C)에 사용할 준비가 되었습니다. 루미놀과 혼합 된 4 x 105 호중구를 opsonized 생물막이있는 웰에 첨가하십시오.
- 별도의 튜브에서 호중구가 없는 HBSS에 50μM 루미놀 용액을 준비하고 생물막이 포함된 웰(그룹 D)에 추가합니다.
- 루미놀과 혼합된 호중구 350μL를 분취하고, 혼합물에 500ng/mL의 최종 농도로 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)를 첨가한다. 그룹 (B)의 경우,이 혼합물의 4 x 105 호중구를 생물막이없는 웰에 첨가하십시오. 이것은 긍정적 인 대조군으로 작용합니다.
참고: 이 단계에서 표시된 PMA 농도는 PMA 자극 호중구가 양성 대조군이므로 강력한 파열 반응을 보장하기 위해 상대적으로 높습니다. PMA는 실험에 따라 호중구를 활성화하기 위해 더 낮은 농도로 사용될 수 있습니다. - 플레이트를 270 x g 에서 4°C에서 30초 동안 원심분리합니다.
- 플레이트 리더가 37분 간격으로 60분 동안 발광 및 키네틱 판독 설정과 함께 3°C로 설정되어 있는지 확인합니다. 플레이트를 플레이트 리더에 놓고 60분 동안 호중구에 의한 ROS 생성을 측정합니다.
참고: 이 분석을 위해, 생물막은 발광 분석에 사용되는 백색 플레이트에서 성장시켰다. PMA는 산화적 파열 반응(39)에 대한 공지된 작용제이다. PMA와 관련된 연구를 수행 할 때 PMA가 즉시 버스트 반응을 시작하기 때문에 호중구가 포함 된 용액이 차가운 동안 마지막 단계에서 PMA가 추가되었는지 확인하십시오.
5. 영상화 생물막-호중구 상호작용
- 1.2-1.6 단계를 사용하여 생물막을 설정하십시오. 생물막 이미징을 용이하게 하려면 녹색 형광 단백질(GFP)40,41을 발현하는 USA300과 같은 S. 아우레우스의 형광 균주를 사용하여 현미경 이미징의 용이성을 높입니다.
참고: 시험관 내 생물막 모델을 시연하기 위해 96웰 플레이트 대신 6개의 μ채널 슬라이드(재료 표 참조)를 사용했습니다(1단계). - 4 x 106 cells/mL의 호중구를 100μM의 Blue CMAC(7-아미노-4-클로로메틸쿠마린) 염료(BCD, 재료 표 참조)와 함께 37°C 및 5%CO2의 로커에서 30분 동안 배양합니다. 샘플이 어둠 속에서 배양되었는지 확인하고 나머지 단계에서는 빛에 대한 노출을 제한하십시오.
- 과도한 BCD를 세척하려면 호중구를 270 x g 에서 5 분 동안 원심 분리하고 상청액을 흡인하십시오. 새로운 HBSS에서 호중구를 다시 중단하십시오. 이 시점에서 에티듐 동종이량체-1( 재료 표 참조)을 BCD 염색된 호중구에 최종 농도 4μM로 추가하여 호중구 및 박테리아 사멸을 모니터링합니다.
- 호중구 대 박테리아 비율이 1:30(호중구: 박테리아)이 되도록 μ 슬라이드에서 성장한 S. 아우레우스 생물막에 150μL의 호중구를 추가합니다. μ 슬라이드를 가습 챔버에서 30분 동안 배양합니다. 박테리아 세포의 수는 18 시간 생물막을 도금하여 얻은 세포 수를 기반으로합니다.
- 형광 염료/단백질의 여기 및 방출 파장에 해당하는 형광 채널을 사용하여 호중구-생물막 상호작용을 이미지화합니다.
참고: 본 연구에서 BCD는 353/466 nm, 에티듐 호모다이머-1은 528/617 nm, GFP는 395/509 nm입니다. 샘플의 광퇴색을 방지하기 위해 레이저 또는 빛에 대한 샘플의 노출을 제한하십시오. - 현미경 이미지 분석 소프트웨어 또는 FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ 및 BAIT와 같은 프로그램을 사용하여 이미지를 분석합니다.
알림: 얼룩으로 작업 할 때 사용중인 염료의 특이성을 고려하는 것이 중요합니다. 일부 얼룩은 원핵 세포와 진핵 세포에서 작동하는 반면 다른 얼룩은 하나에서만 작동합니다. 두 세포 유형을 모두 염색할 수 있는 염료를 사용하여 호중구와 생물막을 별도로 염색하는 경우 교차 염색을 방지하기 위해 호중구와 생물막을 결합하기 전에 남아 있는 염료를 씻어내야 합니다.
Representative Results
박테리아 생물막을 성장시키는 데 사용되는 배지는 호중구의 생존에 영향을 미칩니다. 호중구-생물막 상호작용을 연구하기 위한 호중구의 생존력에 대한 배지 단독의 영향을 줄이기 위해 다양한 배지를 테스트했습니다(그림 1). 트립틴 소이 브로스(Tryptic Soy Broth)와 같은 박테리아 성장 배지는 호중구의 생존력을 최소화하여 호중구의 ~60%가 37°C에서 5%CO2로 30분 배양 기간 후에 생존하도록 합니다. MEMα와 같은 포유류 세포 배양 배지는 호중구의 생존력에 영향을 미치지 않으며 S. 아우레우스 생물막의 성장을 지원합니다. 사실, 최소 배지는 다른 박테리아에서 생물막의 강력한 성장을 촉진합니다46,47.
플랑크톤 세포를 제거하기 위해 바이오매스를 세척한 후 생물막 성장 및 생물막 바이오매스 정량화의 가변성에 대한 배지의 효과를 평가하기 위해 18시간 S. 아우레우스 생물막을 96웰 플레이트에서 성장시켰고, 웰은 폴리-L-라이신으로 처리되거나 처리되지 않았습니다. 영양이 풍부한 (트립신 대두 국물 (TSB)) 및 최소 (MEMα) 배지를 그대로 사용하거나 2 % 포도당으로 보충했습니다. CV로 염색 된 생물막 바이오 매스는 2 % 포도당이 보충 된 MEMα에서 성장한 S. aureus 생물막이 모든 테스트 된 배지 중에서 가장 강력한 생물막을 생성한다는 것을 밝혀 냈습니다 (그림 2A). 더욱이, MEMα + 2% 글루코스를 함유하는 PLL 전처리된 웰에서 성장된 생물막은 MEMα + 2% 글루코스를 함유하는 PLL-처리되지 않은 웰에서의 생물막보다 더 적은 변동성을 나타내었다. 이러한 생물막은 바이오매스 정량을 위해 생물막을 정밀하게 취급한 후 도금했을 때 CV 분석35 및 CFU/mL를 통한 정량화의 변동성이 더 적었습니다. 이러한 생물막은 평균 1 x 108 CFU/mL를 함유했으며, 이는 3일 만에 생물막을 도금하여 입증되었습니다(그림 2B). 이 숫자는 호중구 기능 분석을 위해 생물막에 추가할 호중구의 수를 결정하는데 유용하다.
생물막에 반응하여 호중구에 의한 ROS 생산을 측정하기 위해, S. 아우레우스 생물막을 96-웰 플레이트에서 18-20시간 동안 정적으로 성장시켰다. 그런 다음 생물막을 옵소닉하고 호중구를 추가했습니다. 이어서, 60분 동안 ROS 생산을 측정하였다(도 3A). 곡선 아래의 면적은 호중구에 의한 총 ROS 생산을 정량화하기 위해 운동 곡선에서 계산됩니다. 대조군으로 사용되는 PMA와 같은 작용제로 치료된 호중구는 증가된 ROS 생산을 나타낸다. 생물막이없는 경우, PMA로 처리 된 호중구는 강력한 ROS 생산을 보였다. S. 아우 레 우스 생물막의 존재하에, PMA로 처리 된 호중구에 의한 전반적인 ROS 생산은 감소했다. PMA가 없는 경우, 호중구는 생물막과의 상호작용에만 의존하며, 이는 생성되는 ROS의 양을 더욱 감소시킨다(그림 3B).
형광 현미경을 사용하여 호중구-생물막 상호작용을 시각화하기 위해 살아있는 세포의 세포질과 죽은 세포의 DNA를 각각 염색하는 GFP 발현 균주인 S. 아우레우스, Blue CMAC 염료 및 에티듐 호모다이머-1을 사용했습니다. S. 아우레우스 생물막은 6개의 μ채널 슬라이드에서 18시간 동안 성장시켰다. 청색 CMAC 염료-표지된 호중구를 에티듐 동종이량체-1과 함께 세척된 생물막에 첨가하고, 이미징 전에 5%CO2로 37°C에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 광시야 형광 현미경 검사에서 많은 호중구가 S. aureus 생물막의 표면에 국한된 반면 일부는 생물막 내에 있음이 밝혀졌습니다(그림 4A). 호중구 내에서 S. aureus 세포 간의 상호 작용도 분명했습니다 (그림 4C). 호중구 (청록색)와 상호 작용하는 대부분의 S. aureus 세포는 죽었고 (자홍색), 일부는 살아있는 염색에 의해 결정된대로 살아 남았습니다 (노란색). 비교를 위해 GFP 발현 S. 아우레우스 생물막을 에티듐 동종이량체-1로 염색하여 생물막 내에서 죽은 S. 아우레우스 개체군의 일부를 나타냈습니다(그림 4B). 에티듐 동종이량체-1에 대해 양성인 생존 불가능한 호중구는 S. 아우레우스 생물막과 함께 배양한 후 분석 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 정량화되었습니다. 호중구의 약 48 %는 S. aureus 생물막으로 배양 한 후 30 분 이내에 이미 사망했습니다. 현미경 프로토콜을 최적화하는 동안 배양 30분 후 생물막과 호중구를 세척하여 부착되지 않은 호중구를 제거하는 효과도 평가하여 죽은 호중구의 약 33%가 여전히 생물막에 부착되어 있는 것으로 나타났습니다(그림 4D).
그림 1: LIVE-DEAD 분석은 박테리아와 포유류 성장 배지 간의 호중구 생존을 비교합니다. 호중구를 단리하고, HBSS, MEMα, TSB, 또는 0.1% SDS에서 30분 동안 인큐베이션하였다. LIVE-DEAD 염색은 칼세인 AM (라이브) 및 에티듐 호모다이머-1 (데드)을 사용하여 수행하였다. 살아있는 호중구의 퍼센트가 결정되었고, 여기서 HBSS-배양된 호중구는 100% 살아있는 호중구로 취급되었다. 결과는 두 개의 다른 기증자로부터 얻은 호중구와 함께 삼중으로 수행 된 2 개의 독립적 인 실험의 평균을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SD(*p < 0.05, ****p < 0.0001)로 표시됩니다. 단방향 분산 분석). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다양한 조건에서 생물막 바이오매스의 정량화 및 최적화된 조건에서 성장한 생물막의 박테리아 생존율 수. (A) S. 아우레우스를 폴리-L-라이신(PLL)으로 코팅하거나 코팅하지 않은 96웰 플레이트에 시딩하였다. 생물막은 TSB, MEMα 또는 18시간 동안 정적 조건 하에서 2% 포도당이 보충된 배지 중 하나에서 성장시켰다. 바이오매스를 염색하기 위해 크리스탈 바이올렛(CV) 염색을 수행하였다. 용리된 CV 염색을 1:10에 희석하고 마이크로플레이트 판독기에서 판독하였다. 결과는 삼중으로 수행된 3회의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 각 그룹에 대한 SD는 상이한 생물막 성장 조건 가변성을 입증하기 위해 하단에 도시되어 있다. (B) 박테리아 CFU 계수는 최적화 된 배지 (MEMα + 2 % 포도당)에서 성장한 생물막으로부터 얻어졌다. 18 시간 정적 생물막은 동일한 수의 세척에 이어 10 분 초음파 처리하여 생물막 바이오 매스를 풀고 도금 전에 응집체를 파괴하기 위해 22G 바늘을 통과했습니다. 결과는 삼중으로 수행된 3번의 반복실험을 나타냅니다. 데이터는 평균± SD로 제시된다(ns = 유의하지 않음. 단방향 분산 분석). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 화학발광 분석을 통한 호중구에 의한 ROS 생산의 정량화. (A) 호중구 (PMN)는 호중구에 의한 ROS 생산을 측정하기 위해 PMA의 존재 (닫힌 회색 삼각형) 또는 부재 (열린 회색 역삼각형)에서 HBSS 세척 된 S. 아우 레 우스 생물막 (BF)과 함께 배양되었다. 루미놀은 마이크로플레이트 리더에서 60분 동안 3분마다 ROS를 검출하는 데 사용되었습니다. 생물막이 없는 상태에서 PMA로 치료한 호중구(닫힌 검은색 원)가 양성 대조군으로 작용한 반면, 호중구 단독(열린 검은색 원) 및 생물막 단독(열린 회색 삼각형) 그룹은 음성 대조군으로 작용했습니다. 데이터는 2개의 상이한 공여자로부터 수득된 호중구를 삼중으로 수행된 2개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 데이터는 평균± SD로 제시된다. (B) (A)로부터의 곡선 아래 면적을 호중구에 의해 생성된 총 ROS를 정량화하기 위해 계산하였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. (***p < 0.0001. 단방향 분산 분석). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 광시야 형광 현미경을 사용한 S. 아우레우스 생물막과 호중구 간의 상호작용 시각화. 청색 CMAC 염료-표지된 호중구 (시안)를 18시간 S. 아우레우스 생물막(황색)과 함께 배양하기 전에 에티듐 호종이량체-1 (마젠타; 데드)로 보충하였다. 생물막-호중구 상호작용은 광시야 형광 현미경을 사용하여 이미지화하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리했습니다. 실험은 3 명의 다른 공여자와 함께 수행되었습니다. 대표적인 이미지는 (A) 살아있는 (청록색) 및 죽은 (자홍색, 흰색 화살표로 표시된 몇 개) 호중구가있는 S. 아우 레우스 생물막의 3D 뷰, (B) GFP (노란색)를 발현하는 살아있는 S. 아우 레 우스 또는 에티듐 동종 이량 체 -1 (자홍색)로 염색 된 죽은 S. 아우 레 우스가있는 호중구가없는 S. 아우 레우스 생물막의 3D 뷰, (C) S. 아우 레 우스의 직교도 및 XY, yz, 및 XZ 평면에 의해 묘사된 호중구 상호작용, 및 (D) 30분 후 즉시(미세척) 또는 HBSS로 3회 세척 후 부착되지 않은 호중구를 제거(세척)한 후 S. 아우레우스 생물막의 존재 하에 호중구 생존율의 정량화. 호중구 세포 사멸은 평균 ± SD (학생 t- 검정)로 제시됩니다. 스케일 바는 (A) 및 (B)에서 50μm, (C)에서 10μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
시험관 내48,49,50의 다운스트림 실험을 위해 견고하고 재현 가능한 S. 아우레우스 생물막을 성장시키기 위한 수많은 노력이 있었습니다. PLL의 양이온 특성을 활용하고 강력한 체외 S. 아우레우스 생물막의 성장을 위해 배지에 포도당을 보충하는 표준화된 프로토콜이 요약되어 있습니다. PLL을 첨가하면 음전하를 띤 박테리아 세포를 양전하를 띤 PLL 코팅 표면에 더 잘 부착할 수 있습니다. 10μg/mL 농도의 PLL은 24시간51분 동안 배양할 때 녹농균, 대장균 및 S. 아우레우스에 대해 항균 활성을 갖는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 동일한 농도가 표면을 코팅하는 데 사용됩니다. 그러나 과도한 PLL이 흡인되어 생물막 성장을 위해 파종할 때 PLL 농도가 10μg/mL 미만이 됩니다.
PLL은 2 % 포도당을 함유 한 MEMα와 같은 특정 성장 배지에서만 작동했으며, S. aureus 는 최소한의 변동성으로 강력한 생물막을 생성하는 것으로 관찰되었습니다 (그림 2A). 다른 매체 유형과 함께 사용되는 PLL 농도는 웰을 코팅하기 위해 증가된 PLL 농도를 사용하는 것과 같은 추가 최적화가 필요합니다. 또한, 이러한 조건은 단일종 S. 아우레우스 생물막에 대해 최적화되었다. 만성 상처 생물막은 종종 다균성이지만, 단일종 생물막과 호중구 및 기타 면역 세포와의 상호 작용을 연구하기 위한 분석을 표준화하는 것은 발병기전에 대한 기여도를 이해하는 데 중요합니다52. 이러한 표준화된 프로토콜은 다미생물 생물막 및 호중구와의 상호 작용을 유지하고 연구하기 위해 추가로 최적화될 수 있습니다.
또한 TSB와 같은 풍부한 박테리아 배양 배지가 호중구 생존력의 손실을 초래하는 것으로 관찰되었습니다(그림 1). 따라서, 포유류 세포 배양에 사용되는 MEMα에서 S. aureus 생물막의 성장 조건이 최적화되었다. 호중구와 관련된 연구의 경우이 배지는 호중구 생존력을 지원하고 S. aureus 성장을 촉진합니다. 배지가 호중구의 생존력에 영향을 미치는 것으로 관찰되었지만, 말초 인간 혈액에서 분리 된 호중구는 20 시간53 분까지 약 70 %의 세포 사멸 호중구로 생체 외 세포 사멸을 겪는다는 점도 중요합니다. 이를 위해서는 실험을 준비 할 때 호중구를 얼음에 보관하고, 내 독소가없는 시약을 사용하고, 호중구가있는 샘플의 소용돌이를 피하여 호중구의 활성화를 방지하는 등 적절한 취급이 필요합니다.
호중구의 산화 파열 평가는 병원체 14,54,55에 대한 호중구의 사멸 효과를 결정하기 위해 일상적으로 수행됩니다. 이러한 연구는 호중구가 첨가 된 플랑크톤 박테리아에서 자주 수행되며, 호중구에 의해 생성 된 슈퍼 옥사이드 음이온을 검출하는 루미놀 증폭 화학 발광을 사용하여 산화 적 파열 반응을 정량화합니다. 본 프로토콜은 플랑크톤 박테리아를 정적으로 성장된 18시간 S. 아우레우스 생물막으로 대체함으로써 변형된다. 따라서 호중구를 생물막에 직접 추가하여 활성화를 평가할 수 있습니다. 반면에 생물막의 박테리아는 ROS23,56을 해독하기 위해 카탈라아제 및 슈퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제와 같은 효소를 생성합니다. 포도상 구균 표피 생물막은 스트레스 하에서 플랑크톤보다 더 높은 카탈라아제를 생성합니다57. S. aureus 생물막에서 PMA 자극 호중구의 총 화학 발광은 생물막이없는 PMA 자극 호중구보다 현저히 낮습니다 (그림 2). 이것은 이러한 해독 효소의 활성 때문일 수 있습니다. 또한, S. 아우레우스 생물막은 호중구를 죽이는 류코시딘(leukocidins)이라고 하는 여러 기공 형성 독소를 생성한다58. 감소된 파열 반응은 또한 S. 아우레우스 생물막의 존재 하에 호중구의 감소된 생존력 때문일 가능성이 있다. 이 연구는 세포 내부와 외부에서 생성 된 총 ROS를 검출하는 루미놀을 사용하지만, CM-H 2 DCFDA (5- (and-6)- 클로로 메틸 -2'7'- 디클로로 디 하이드로 플루오레 세인 디 아세테이트) 또는 이소 루미 놀과 같은 다른 시약은 연구의 목표가 세포 내 또는 세포 외 ROS 생산을 구체적으로 연구하는 것이라면 고려해야합니다 14,53,54.
현미경을 통해 호중구-생물막 상호작용을 시각화하는 능력은 서로 존재하는 호중구와 생물막의 행동에 대해 유익할 수 있습니다. 형광 염료 및 단백질의 여기 및 방출 스펙트럼은 30분 배양 후 18시간 S. 아우레우스 생물막과 호중구 사이의 상호작용의 스냅샷을 나타낸다. 염색된 세포에서 신호를 효과적으로 캡처하려면 현미경 검사를 위해 샘플을 설정하는 동안 광원에 대한 샘플 노출을 제한하는 것이 중요합니다. 이미징하는 동안 Z 스택 높이 및 다른 채널에 대한 노출 시간과 같은 모든 매개 변수를 조정할 때 광원의 강도를 낮추어 샘플의 빠른 광 퇴색을 피할 수있었습니다.
이러한 간단한 관행은 생물막 내에 국한된 호중구가 거의 없다는 것이 관찰 된 적절한 현미경 이미징을 허용했습니다 (그림 4A). 이는 2% 글루코스로 MEMα에서 성장한 18시간 S. 아우레우스 생물막이 표면을 균일하게 덮지 않기 때문에 생물막 내에 존재하는 공간 때문일 수 있다(도 4B). 그러나 다른 연구에서는 풍부한 배지를 사용하여 S. aureus 생물막 성장과 백혈구가 생물막30,58을 관통하는 균일 한 잔디를 보여주었습니다. 또한, 호중구58을 용해시키는 S. 아우레우스 생물막 생성 류코시딘으로 인해 S. 아우레우스 생물막과 함께 배양 한 후 30분 후에 호중구 세포 사멸이 있었던 것도 관찰됩니다(그림 4A, D). 30분 동안 생물막과 함께 배양한 후 부착되지 않은 호중구를 제거하기 위한 세척 단계를 추가하여 세척되지 않은 그룹에 비해 시스템에서 죽은 호중구의 ~15%를 제거했으며, 여기서 현미경 검사는 30분 배양 직후에 수행되었습니다(그림 4D). S. 아우레우스와 상호작용하는 호중구도 관찰되었다(도 4C). S. aureus가 호중구에 의해 삼켜 졌는지 또는 호중구54의 세포 표면에 부착되었는지 여부를 평가하기 위해서는 추가 실험이 필요합니다. 호중구 및 생물막을 영상화하는 것은 식균 작용 및 NETosis54,59와 같은 다운스트림의 여러 호중구 기능을 평가하는 첫 번째 단계입니다. 생물막에 대한 호중구의 영향은 또한 단계 5.6에 나열된 이미지 분석 도구를 사용하여 생물막 바이오매스, 생물막의 구조적 변화 및 생물막 생존율을 정량화함으로써 평가할 수 있습니다. 마지막으로, 기증자 대 기증자 가변성은 호중구에 존재합니다. 따라서 호중구와 관련된 연구에 적어도 세 명의 다른 기증자를 사용하는 것이 좋습니다.
전반적으로, 표준화된 시험관 내 분석을 결합하여 호중구와 생물막 사이의 상호작용을 평가하였다. 이러한 분석은 S. aureus를 사용하지만 설명 된 프로토콜은 다른 병원체를 연구하는 데 쉽게 적용 할 수 있습니다. 숙주-병원체 상호 작용을 연구하기 위한 다양한 생체 내 모델이 있지만, 특히 조건이 최적화되지 않은 경우 비용이 많이 들고 노동 집약적일 수 있습니다. 표준화된 체외 분석으로 작업하면 실험 조건을 최적화하고 in vivo 시스템으로 이동하기 전에 관찰을 확인할 수 있습니다. 마지막으로, 생체 내에서 생물막-호중구 상호작용을 연구하기 위해 다양한 동물 감염 모델이 사용되었습니다. 그러나, 인간과 동물 모델60,61,62,63 사이의 면역학적 차이를 고려하는 것이 중요하다. 이를 위해서는 이러한 복잡한 숙주-병원체 상호 작용을 연구하기 위해 인간에서 추출한 호중구를 사용해야합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (R01AI077628)가 DJW에, 미국 심장 협회 경력 개발 상 (19CDA34630005)이 ESG에 자금을 지원했습니다. USA 300 LAC GFP 균주를 제공해 주신 Paul Stoodley 박사에게 감사드립니다. 또한 캠퍼스 현미경 및 이미징 시설(CMIF)과 OSU 종합 암 센터(OSUCCC) 현미경 공유 리소스(MSR), 오하이오 주립 대학의 리소스를 인정합니다. 또한 채혈을 수행한 Stoodley 연구소의 Amelia Staats, Peter Burback 및 Lisa Coleman에게도 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils |
| 150 mL rapid-flow filter unit | Thermo Scientific | 565-0020 | |
| 200 proof ethanol | VWR | 89125-188 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Used for blood draw |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | Used for blood draw |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-2 | |
| Alcohol swab | BD | Used for blood draw | |
| Band-aids | Used for blood draw | ||
| BD Bacto Tryptic Soy Broth | BD | DF0370-07-5 | Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar |
| Cell counter | Bal Saupply | 202C | |
| CellTracker blue CMCH | Invitrogen | C2111 | Blue CMAC Dye (BCD) |
| Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates | Costar | 3370 | |
| Cotton gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | Used for blood draw |
| Crystal violet | Acros Organic | 40583-0250 | |
| Culture tubes | Fisherbrand | 14-961-27 | Borosilicate Glass 13 x 100 mm |
| D-(+)-glucose | Sigma | G-8270 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392-250G | Used for isolation of neutrophils |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | L3224 B | |
| Ficoll-Paque plus | Cytiva | 17144003 | Used for isolation of neutrophils (density gradient medium) |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) 1x | Corning cellgro | 21-022-CV | without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hemacytometer | Bright Line | ||
| Heparin | Novaplus | NDC 63323-540-57 | 1000 USP units/mL, Used for blood draw |
| IMARIS 9.8 | Oxford Instruments | Microscopy image analysis software | |
| Luminol | Sigma | A8511-5G | |
| Minimal essential media (MEM) Alpha 1x | Gibco | 41061-029 | |
| Needle (23 G1) | BD | 305145 | Used for blood draw |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon | ||
| NIS-Elements | Nikon | Quantification of dead neutrophils | |
| Normal human serum | Complement Technology | NHS | |
| Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-342 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | |||
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P4707-50ML | |
| Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-10 | Used for neutrophil isolation |
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices | Microplate reader software used for data acquisition | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
| Sterile water for irrigation, USP | Baxter | 2F7114 | Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SC*19BLK | 19 G x 3/4", used for blood draw |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Turnicate | Used for blood draw | ||
| UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| White opaque 96-well plates | Falcon | 353296 | Tissue culture treated and flat bottom plate |
| μ-Slide VI 0.4 | Ibidi | 80601 | μ-channel slide |
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