Summary
Hier presenteren we drie data-analyseprotocollen voor fluoresceïneangiografie (FA) en optische coherentietomografie (OCT) beelden in de studie van Retinal Vein Occlusion (RVO).
Abstract
Vooruitgang in oogheelkundige beeldvormingstools biedt een ongekend niveau van toegang tot onderzoekers die werken met diermodellen van neurovasculair letsel. Om deze grotere vertaalbaarheid goed te benutten, is het nodig om reproduceerbare methoden te ontwikkelen om kwantitatieve gegevens uit deze afbeeldingen te halen. Optische coherentie tomografie (OCT) beeldvorming kan retinale histologie met micrometerresolutie oplossen en functionele verschillen in vasculaire bloedstroom onthullen. Hier schetsen we niet-invasieve vasculaire uitlezingen die we gebruiken om pathologische schade na vasculaire belediging te karakteriseren in een geoptimaliseerd muismodel van retinale ader occlusie (RVO). Deze uitlezingen omvatten live beeldvormingsanalyse van retinale morfologie, desorganisatie van retinale binnenste lagen (DRIL) meting van capillaire ischemie en fluoresceïneangiografie metingen van retinaal oedeem en vasculaire dichtheid. Deze technieken komen rechtstreeks overeen met die welke worden gebruikt om patiënten met netvliesaandoeningen in de kliniek te onderzoeken. Het standaardiseren van deze methoden maakt directe en reproduceerbare vergelijking van diermodellen met klinische fenotypen van oogheelkundige aandoeningen mogelijk, waardoor de translationele kracht van vasculaire letselmodellen toeneemt.
Introduction
Neurovasculaire ziekte is een groot gezondheidsprobleem dat verantwoordelijk is voor ischemische beroertes, een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit, en retinale vaatziekten die leiden tot verlies van het gezichtsvermogen 1,2. Om neurovasculaire ziekte te modelleren, gebruiken we een muismodel van retinale ader occlusie (RVO). Dit model is niet-invasief en maakt gebruik van vergelijkbare in vivo beeldvormingstechnieken als die worden gebruikt om mensen met retinale vaatziekten in een klinische setting te onderzoeken. Het gebruik van dit model verhoogt dus het translationele potentieel van studies die dit model gebruiken. Zoals bij alle muismodellen is het van cruciaal belang om de reproduceerbaarheid van het model te maximaliseren.
Retinale vaatziekten zijn een belangrijke oorzaak van verlies van het gezichtsvermogen bij mensen jonger dan 70 jaar. RVO is de tweede meest voorkomende retinale vaatziekte na diabetische retinopathie3. Klinische kenmerken die kenmerkend zijn voor RVO zijn ischemisch letsel, retinaal oedeem en verlies van het gezichtsvermogen als gevolg van neuronaal verlies 3,4. Muismodellen van RVO met behulp van laserfotocoagulatie van belangrijke vaten zijn ontwikkeld en verfijnd om belangrijke klinische pathologieën te repliceren die zijn waargenomen in humane RVO 5,6,7. Vooruitgang in oogheelkundige beeldvorming maakt ook replicatie mogelijk van niet-invasieve diagnostische hulpmiddelen die bij mensen worden gebruikt, namelijk fluoresceïneangiografie (FA) en optische coherentietomografie (OCT)6. Fluoresceïneangiografie maakt het mogelijk om lekkage te observeren als gevolg van de afbraak van de bloed-retinale barrière (BRB) en de bloedstroomdynamiek in het netvlies, inclusief plaatsen van occlusie, met behulp van de injectie van fluoresceïne, een kleine fluorescerende kleurstof 8,9. OCT-beeldvorming maakt het mogelijk om hoge resolutie dwarsdoorsnedebeelden van het netvlies te verkrijgen en de dikte en organisatie van retinale lagente bestuderen 10. Analyse van FA-beelden is historisch gezien grotendeels kwalitatief geweest, wat het potentieel voor directe en reproduceerbare vergelijking tussen studies beperkt. Onlangs zijn een aantal methoden ontwikkeld voor de kwantificering van laagdikte in OCT-beeldvorming, hoewel er momenteel geen gestandaardiseerd analyseprotocol is en de plaats van OCT-beeldacquisitie varieert11. Om deze tools goed te kunnen benutten, zijn gestandaardiseerde, kwantitatieve en repliceerbare data-analysemethodologie nodig. In dit artikel presenteren we drie van dergelijke vasculaire uitlezingen die worden gebruikt om pathologische schade te evalueren in een muismodel van RVO-fluoresceïnelekkage, OCT-laagdikte en desorganisatie van retinale lagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek. Knaagdierexperimenten werden goedgekeurd en gecontroleerd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Columbia University.
OPMERKING: Beeldvorming werd gedaan op 2 maanden oude C57BL / 6J mannelijke muizen die ongeveer 23 g wogen.
1. Bereiding van reagentia voor retinale beeldvorming
- Bereiding van injecteerbare fluoresceïne-oplossing.
OPMERKING: Fluoresceïne is zeer lichtgevoelig. Bescherm tegen licht en gebruik het kort na bereiding.- Verdun fluoresceïne tot een concentratie van 1% in steriele zoutoplossing.
- Bereiding van Ketamine/Xylazine
- Verdun Ketamine en Xylazine in steriele zoutoplossing dienovereenkomstig voor de volgende concentratie: Ketamine (80-100 mg / kg) en Xylazine (5-10 mg / kg).
- Steriele zoutoplossing
- Bereid een spuit van 5 ml met een naald van 26 g met steriele zoutoplossing.
2. Beeldvorming van LGO en fluoresceïne
- Zet de retinale microscoop lightbox, de OCT-machine en het verwarmde muisplatform AAN.
- Schakel de computer IN en open het beeldbewerkingsprogramma.
- Voeg een druppel fenylefrine en tropicamide toe aan elk oog.
- Injecteer 150 μL anesthesie (Ketamine (80-100 mg/kg) en Xylazine (5-10 mg/kg)) intraperitoneaal (IP). Bepaal de diepte van de anesthesie door teen te knijpen en wacht tot het dier niet reageert. Breng oogheelkundige zalf of kunstmatige tranen aan op beide ogen.
- Plaats de muis op het platform.
- Pas de hoogte en hoek van het platform aan totdat het zicht op de retinale fundus duidelijk en gefocust is. Maak een foto van de fundus.
- Open de imaging- en OCT-software. Pas in het OCT-programma de nudge aan op 5.
- Maak een OCT-afbeelding op 75 μm distal van de brandwond. Herhaal dit voor de andere drie kwadranten van het netvlies.
- Injecteer 100 μL 1% fluoresceïne IP.
- Schakel de camera over naar een 488 nm-filter. Verhoog de camerawinst naar 5.
- Maak een foto van de fundus op precies 5 min na fluoresceïne injectie.
OPMERKING: Vermijd langdurige blootstelling van het oog aan het cameralicht bij maximale instelling, omdat fluoresceïne retinale fotoschade kan verergeren. Houd de lichtbron uit totdat de wachttijd van 5 minuten is verstreken en de muis klaar is voor beeldvorming.
3. Nazorg
- Injecteer 1 ml steriel zoutoplossing IP. Breng glijmiddel oogdruppels aan op beide ogen. Breng oogheelkundige zalf of kunstmatige tranen aan op beide ogen.
- Observeer de muis terwijl deze herstelt van anesthesie. Keer alleen terug naar de kooi met andere dieren wanneer ze volledig zijn hersteld, meestal na ongeveer 40 minuten.
4. Beoordeling voor uitsluitingscriteria
- Open de fundusfoto die 24 uur na de procedure is gemaakt om te beoordelen op uitsluitingscriteria. Sluit het oog uit als een van de volgende criteria wordt vastgesteld.
- Beoordeel of de afbeelding nul occlusies heeft
- Evalueer de afbeelding voor het aantal afgesloten vaten.
OPMERKING: Een succesvolle occlusie heeft meestal wat paarse pigmentatie op of rond de brandwond, een zeer dun of discontinu vat door de brandwond, een zwak of niet-bestaand vaat buiten het brandwondengebied en retinale verkleuring door hypoxie. Als het hele vat door de witte verbranding door de laser kan worden gezien, kon het vat niet afsluiten. Soms lijkt het vat gedeeltelijk belemmerd, maar als het er buiten de brandwond ononderbroken uitziet, heeft het vat waarschijnlijk niet afgesloten. - Voor dubbelzinnige gevallen gebruikt u FA-beeldvorming op hetzelfde moment om occlusies te evalueren. In deze beelden zal een occlusie verschijnen als een breuk in de continuïteit van een vat, vaak met een taps toelopen van het omringende vat.
- Als er nul occlusies worden geïdentificeerd, sluit u het oog uit van analyse, omdat de RVO als ineffectief wordt beschouwd.
OPMERKING: Occlusies verdwijnen meestal met 48-72 h na RVO en de aanwezigheid van occlusies mag op deze tijdstippen niet langer als exclusiecriterium worden gebruikt.
- Evalueer de afbeelding voor het aantal afgesloten vaten.
- Beoordeel de fundus- en OCT-beelden op overmatige netvliesloslating
OPMERKING: Subretinale vochtophoping komt vaak voor na inductie van RVO en veroorzaakt scheiding van neuraal netvlies van RPE. Uitsluitingscriteria voor overmatige netvliesloslating worden als volgt gedefinieerd: OCT zal ofwel volledig onaanzichtbaar zijn, of sommige lagen zullen ongelooflijk vervormd lijken. De beeldkwaliteit is slecht, met een verlies van resolutie van buitenste plexiform- en RPE-lagen. De scheiding tussen het neurale netvlies en het vaatvlies is groter dan wat het OCT-gezichtsveld toestaat. Op de fundusafbeelding zal de retina-toon bijna volledig wit zijn, met wat paarse vlekken. Een deel van het netvlies kan vervormd en onscherp lijken. Dit komt omdat het is losgemaakt en zich op een andere brandpuntsafstand bevindt dan de rest van het netvlies.- Als de beoordeling van de beelden van een oog perifere of volledige loslating van het netvlies bepaalt, sluit het oog dan uit van de analyse.
- Sluit afbeeldingen uit met bewijs van hoornvliesstaar
OPMERKING: Een hoornvlies cataract verschijnt als een ondoorzichtige witte stip op het hoornvlies van de muis. Cataract treedt meestal op als gevolg van onvoldoende smering van de ogen terwijl het dier wordt verdoofd en kan grotendeels worden vermeden door ervoor te zorgen dat oogzalf royaal wordt aangebracht. Cataract kan over het algemeen worden geïdentificeerd voordat het dier wordt afgebeeld door het dier te inspecteren. Muizen die staar hebben ontwikkeld, moeten worden uitgesloten van de dataset zonder het beeldvormingsproces te hoeven ondergaan. Bij beeldvorming zal cataract het netvlies van de camera verbergen en zal de OCT krom lijken. - Beoordeel het beeld op overmatige bloeding
OPMERKING: Overmatige bloeding kan worden geïdentificeerd als hoeveelheden rode vloeistof in de afbeelding, meestal verduisterend retinale achtergrond, vaat en brandwonden. Deze gebieden van rode vloeistof zullen een helderder, opaquer rood zijn dan de paarse vlekken die normaal zijn in succesvolle RVO. Bloedingen verschijnen bij de ganglioncellaag op OCT-beeldvorming en interfereren met het vermogen om andere retinale lagen onder de bloeding te visualiseren.- Als wordt vastgesteld dat het beeld een overmatige bloeding heeft, sluit u het oog uit van de analyse.
5. Fluoresceïne beeldverwerking
- Open het fluoresceïnebeeld in de beeldverwerkingssoftware.
- De afbeelding dupliceren
- Gebruik een selectietool om de belangrijkste schepen zorgvuldig te traceren.
- De belangrijkste vaten zijn de dikkere aderen en slagaders die uitstralen vanuit de optische schijf. Negeer alle schepen die zich van deze schepen vertakken.
- Als lekkage voorkomt dat de omtrek van het vat in de buurt van de occlusieplaats wordt gezien, traceer dan door de lekkage in de geschatte locatie van het vat (behoud de dikte, verbind het laatste zichtbare punt met het volgende zichtbare punt).
- Verwijder in de eerste afbeelding de selectie en laat alleen de achtergrond over. Sla deze gemaskeerde afbeelding op.
- Verplaats de selectie naar de tweede afbeelding, keer de selectie om en verwijder, waarbij de vaten worden geïsoleerd. Sla deze gemaskeerde afbeelding op.
- Open de twee afbeeldingen in ImageJ. Open de achtergrondafbeelding en meet de geïntegreerde dichtheid.
- Open de afbeelding van het vat, selecteer de omtrek van de vaten en meet vervolgens de gemiddelde intensiteit.
- Deel de geïntegreerde dichtheid van de achtergrond door de gemiddelde intensiteit van de vaten, waardoor de lekkageverhouding voor het oog wordt gegenereerd.
- Noteer deze lekkageratio voor elk oog in een experimenteel cohort.
- Om de controle voor de achtergrond te bevorderen, normaliseert u experimentele ogen tot de gemiddelde lekkageratio van niet-gewonde controleogen.
OPMERKING: Om een gestandaardiseerde kwantificering van fluoresceïnelekkage in het FA-beeld te creëren, gebruikt deze berekening een verhouding van de achtergronddichtheid (waar de lekkage aanwezig zal zijn) met de helderheid van de belangrijkste vaten om resultaten te creëren die de variatie in helderheid van beeld tot beeld regelen en betrouwbaar kunnen worden gekwantificeerd. Ogen die onbeschadigd zijn, hebben geen lekkage en zouden theoretisch verhoudingen van nul moeten hebben. De verhoudingen berekend uit deze onbeschadigde controleogen vertegenwoordigen daarom achtergrondgeluid, en deze waarde wordt gebruikt om experimentele waarden verder te normaliseren.
6. Retinale laagdikte
- Open de OCT-afbeelding in de beeldverwerkingssoftware.
- Traceer de randen van de ganglioncellaag, de binnenste plexiformlaag, de binnenste nucleaire laag, de buitenste plexiformlaag, de fotoreceptorlaag en de RPE-laag. Meet de gemiddelde dikte van elke laag.
- Herhaal dit voor OCT-beelden van de andere drie kwadranten van het netvlies. Gemiddelde van de gemiddelde laagdiktes over de vier kwadranten om de gemiddelde dikte van elke retinale laag voor het oog te verkrijgen.
- Herhaal dit voor elk oog in het experimentele cohort.
7. Desorganisatie van retinale binnenste lagen (DRIL)
- Open de OCT-afbeelding in ImageJ.
- Meet met het lijngereedschap de afstand waar de bovenrand van de buitenste plexiforme laag onduidelijk is.
OPMERKING: Het is belangrijk om onderscheid te maken tussen DRIL en gebieden met een slechte zichtbaarheid van lagen veroorzaakt door beeldartefacten. Een slechte OCT-beeldkwaliteit kan oog voor DRIL-analyse ongeldig maken als voldoende beeldresolutie niet mogelijk is. Afbeeldingen met DRIL hebben meestal andere regio's of retinale lagen die duidelijk zijn opgelost en georganiseerd, wat een goede indicator kan zijn voor voldoende beeldkwaliteit.- Meet horizontaal vanaf de breedtegraad waar de desorganisatie begint tot de breedtegraad waar de bovenrand van de buitenste plexiforme laag weer zichtbaar wordt, of helemaal niet. Zelfs als de buitenste plexiforme laag verticaal naar boven of naar beneden verschuift, meet perfect horizontaal.
- Er kunnen meerdere gebieden van desorganisatie zijn, gescheiden door gebieden zonder desorganisatie. Meet deze individueel en bereken de som van de afstanden.
- Deel de lengte van de desorganisatie door de totale lengte van het netvlies dat zichtbaar is in elke OCT-afbeelding om de verhouding van desorganisatie voor het beeld te verkrijgen.
- Herhaal de meting en berekening voor OCT-beelden van de andere drie kwadranten van het netvlies.
- Neem het gemiddelde van de desorganisatieverhoudingen uit de vier OCT-afbeeldingen. Dit getal vertegenwoordigt de gemiddelde desorganisatie voor het hele netvlies. Herhaal dit voor elk oog in het experimentele cohort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze analysemethoden maken de kwantificering van retinale pathologie mogelijk die is vastgelegd door FA- en OCT-beeldvorming. De experimenten waaruit de representatieve gegevens worden geëxtraheerd, gebruikten C57BL / 6J mannelijke muizen die ofwel dienden als ongedeerde controles of de RVO-procedure ondergingen en ofwel Pen1-XBir3-behandelingsoogdruppels of Pen1-Saline voertuigoogdruppels ontvingen. Het RVO-verwondingsmodel omvatte de laserbestraling (532 nm) van de belangrijkste aderen in elk oog van een verdoofde muis na een staartaderinjectie van rose bengal, een fotoactivatorkleurstof12. Drie laserpulsen werden afgeleverd op een gemiddelde afstand van 375 μm van het oogzenuwcentrum om fotocoagulatie te induceren en de bloedvaten af te sluiten12. Effectief gebruik van de RVO-procedure is aangetoond in Avrutsky et al.12, en verdere details over RVO-methode-optimalisatie worden gedetailleerd beschreven in Colón Ortiz et al.13. Figuur 1A toont voorbeelden van FA- en OCT-afbeeldingen van beide groepen. Vanwege de variabele aard van occlusievorming en stabilisatie door het fotocoagulatieproces, kunnen verschillende gradaties van schade worden waargenomen. In sommige netvliezen introduceert de schade veroorzaakt door de RVO-procedure oogheelkundige pathologieën die de retinale beelden ongeschikt maken voor analyse. Na de overname moeten afbeeldingen eerst worden geëvalueerd op uitsluitingscriteria om een optimale analyse en betrouwbare resultaten te garanderen. Deze exclusiecriteria, afgebakend in figuur 1B, omvatten netvliesloslating, bloeding en staar. Zoals kan worden waargenomen in de voorbeeld fundus- en OCT-beelden, verhinderen deze pathologieën duidelijke OCT-beeldvorming, waardoor de netvliezen ongeschikt zijn voor data-analyse. Bovendien is het mogelijk dat sommige netvliezen geen stabiele occlusies bevatten; deze beelden modelleren niet nauwkeurig ischemisch-hypoxische schade en moeten worden uitgesloten van de analyse.
De afbraak van de bloed-retinale barrière draagt bij aan de pathogenese van RVO14,15. Het evalueren van de hoeveelheid lekkage uit vaten is een nuttige indicator van door letsel veroorzaakte vatdoorlaatbaarheid. FA-beeldvorming maakt visualisatie van deze lekkage mogelijk, maar een aantal factoren, zoals verschillen in de circulatiesnelheid, beïnvloeden de ruwe intensiteit van FA-beelden en maken consistente kwantificering16,17. Onze methode controleert op deze variabiliteit door de waargenomen intensiteit in het netvlies te normaliseren tot de gemiddelde intensiteit van de belangrijkste vasculatuur. Dit biedt een verhouding van lekkage voor elk netvliesbeeld dat kan worden vergeleken met anderen en geanalyseerd. Figuur 2A toont de gemaskeerde beelden die voor deze berekening worden gebruikt, waarbij de belangrijkste vasculatuur wordt gescheiden van de andere delen van het netvlies. Het vermogen om fluoresceïne te kwantificeren maakt het mogelijk om de ernst van het letsel en de werkzaamheid van de behandeling te vergelijken, evenals de studie van veranderingen in lekkage gedurende het letseltijdverloop (figuur 2B), wat een te subtiel effect kan zijn om alleen met kwalitatieve rapportage aan te tonen.
OCT-beeldvorming maakt de analyse mogelijk van de impact van RVO op individuele retinale lagen en de totale retinale dikte. Figuur 3A toont een afbakening van de lagen van het netvlies in een OCT-afbeelding. Het traceren van de grenzen van elke laag (figuur 3B) maakt verschillende analysemogelijkheden mogelijk. De kwantificering van de dikte voor elke retinale laag blijkt nuttig, omdat de initiële oedemateuze respons een diepgaander effect heeft op de binnenste retinale lagen. Sporen maken ook de studie van de totale netvliesdikte en gescheiden analyse van de binnenste versus buitenste retinale lagen mogelijk. Figuur 3C geeft een analyse van een tijdsverloop van RVO-schade, waarbij de initiële inflammatoire zwelling van retinale lagen en de uiteindelijke degeneratieve verdunning kan worden waargenomen. Het plotten van de dikte van elke laag in de loop van de tijd onthult verschillende dynamieken voor de binnenste plexiforme en binnenste nucleaire lagen, waarbij de binnenste nucleaire laag een veel grotere reactie op de initiële verwonding ervaart, maar de binnenste plexiforme laag ernstige verdunning vertoont nadat het initiële oedeem is gestabiliseerd en terugkeert naar de basislijn (figuur 3D ). Dit geeft een nauwkeuriger inzicht in de drijfveren van respons op verschillende tijdstippen. We hebben ook de effectiviteit van een caspaseremmer getest bij het verminderen van zwelling en het beschermen tegen eventuele degeneratie, waarbij analyse verschillende effecten in individuele lagen aan het licht bracht.
De desorganisatie van de binnenste retinale lagen (DRIL) is een ander OCT-kenmerk dat wordt gebruikt als een diagnostische maat voor ischemie bij diabetische retinopathie, evenals een voorspellende maat voor gezichtsscherpte in RVO18,19. In OCT-beeldvorming manifesteert DRIL zich als een verdwijning van de bovengrens van de buitenste plexiforme laag12, waarbij de buitenste plexiforme en binnenste nucleaire lagen samenvloeien (figuur 4A). Figuur 4B toont twee voorbeelden van OCT-afbeeldingen met gemarkeerde gebieden van DRIL. We drukken DRIL uit als een verhouding van de totale retinale lengte, gemiddeld over vier OCT-doorsneden. Deze maatregel stelt ons in staat om experimentele groepen kwantitatief te vergelijken; Figuur 4C presenteert een voorbeeldanalyse, waarbij de retinale desorganisatie van twee experimentele groepen werd vergeleken om de werkzaamheid van een remmer bij het beperken van retinale schade in RVO te onderzoeken.
Figuur 1: Beelden verkregen uit fluoresceïneangiografie (FA) en optische coherentietomografie (OCT) beeldvorming. (A) Voorbeelden van FA- en OCT-beelden van netvliezen 24 uur na RVO en niet-gewonde controles. (B) Fundus- en OCT-beeldvorming van de verschillende exclusiecriteria: overmatige netvliesloslating, bloeding, hoornvlies cataract en geen occlusies. De afstand van oct-acquisitie wordt aangegeven door de groene richtlijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kwantificering van fluoresceïnelekkage. (A) Scheiding van het FA-beeld in de vaten en achtergrond voor analyse (B) Kwantificering van fluoresceïnelekkage uit ogen van C57BL/6J retinale ader occluded (RVO) muizen die ofwel 10 mg Pen1-XBir3-remmer oogdruppels (N = 17) of Pen1-Zout voertuig oogdruppels (N = 13) krijgen na 24 uur en 48 uur na de procedure. Intensiteitsmeting van het achtergrondbeeld wordt genormaliseerd naar de gemiddelde intensiteitsaflezing van het beeld van het vat. Het gemiddelde van de intensiteitsmeting voor RVO-muizen wordt verder genormaliseerd naar ongedeerde controles. Foutbalken tonen gemiddelde met SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van de dikte van de retinale laag in OCT-afbeeldingen. (A) Ongedeerd netvlies met de individuele retinale lagen gelabeld: Ganglion Cell Layer, Inner Plexiform Layer, Inner Nuclear Layer, Outer Plexiform Layer, Photoreceptor Layer, RPE en Choroid. (B) Voorbeeld van laagsporen van OCT-beelden van niet-gewonde controle en 24 uur post-RVO C57/BL6-muizen. (C) Kwantificering van verandering in totale retinale dikte en intraretinale dikte waargenomen in OCT-beeldvorming van C57BL / 6J-muizen netvliezen op 4 h, 24 h, 48 h, 72 h en 8 dagen na RVO. (D) Kwantificering van dikteverandering in binnenste plexiforme en binnenste nucleaire lagen van C57BL/6J muizen netvliezen op 24 h, 48 h en 8 dagen na RVO voor C57BL/6J muizen die ofwel 10 mg Pen1-XBir3 remmer oogdruppels (N = 14) of Pen1-Saline voertuig oogdruppels (N = 15) onmiddellijk na de RVO-procedure en 24-h post-RVO ontvangen. Foutbalken tonen gemiddelde met SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kwantificering van de desorganisatie van de binnenste retinale lagen (DRIL) waargenomen in OCT-beelden na RVO. In OCT-beelden wordt DRIL aangegeven door het verlies van een duidelijke afbakening tussen de binnenste nucleaire en buitenste plexivormlagen. (A) Voorbeelden van delen van het netvlies met en zonder DRIL in OCT-beeldvorming. (B) Gebieden van DRIL in OCT-beeldvorming van twee regio's in een C57BL/6J-muis 24 uur post-RVO, aangegeven met witte lijnen. DRIL wordt horizontaal over het beeld gemeten in plaats van de vorm van het netvlies te volgen. (C) Kwantificering van het aandeel van de retinale lengte waar DRIL werd waargenomen op 24 uur en 48 uur post-RVO voor de ogen van C57BL/6J-muizen die na de RVO-procedure 2,5 mg Pen1-XBir3-remmer oogdruppels (N = 19) of Pen1-Zout voertuig oogdruppels (N = 21) kregen. Foutbalken tonen gemiddelde met SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Niet-invasieve retinale beeldvorming van knaagdieren biedt een manier om pathologie te bestuderen en interventies te ontwikkelen. Eerdere studies hebben een muismodel van RVO ontwikkeld en geoptimaliseerd, waardoor variabiliteit wordt beperkt en een betrouwbare vertaling van veel voorkomende klinische pathologieën in het muizennetvliesmogelijk is 5,7,13. Ontwikkelingen in oogheelkundige beeldvormingstechnologie maken het gebruik van klinische in vivo beeldvormingstechnieken zoals FA en OCT bij proefdieren verder mogelijk, waardoor muismodellen kunnen worden vergeleken met profielen van menselijke ziekten 6,12,15. Om echter de informatie die uit deze afbeeldingen kan worden geëxtraheerd en het algehele translationele potentieel van het model te maximaliseren, is er behoefte aan gestandaardiseerde, reproduceerbare en rigoureuze kwantitatieve methoden voor het analyseren van afbeeldingen. Hier presenteren we analysemethoden die kwantitatieve representaties van de ernst van de schade mogelijk maken, waardoor nauwkeurigere en betrouwbaardere vergelijkingen tussen muizen en tussen experimentele groepen mogelijk zijn. Deze analyses omvatten lekkwantificering in FA-afbeeldingen, kwantificering van de gemiddelde laagdikte en gebieden van DRIL in OCT-afbeeldingen.
Een kritische factor in een succesvolle analyse ligt in de kwaliteit van de verkregen beelden. Slecht opgeloste OCT-afbeeldingen kunnen leiden tot problemen bij het traceren van afzonderlijke lagen en een onvermogen om innerlijke retinale desorganisatie te onderscheiden van slechte beeldkwaliteit. Bij beeldvorming is het belangrijk om voorzichtig te zijn bij de positionering van de muis op het platform, zodat het fundusbeeld scherp is, de oogzenuw relatief gecentreerd is en de retinale doorsnede horizontaal over het beeld is. Consistente smering van de ogen terwijl het dier wordt verdoofd is ook belangrijk, vooral wanneer hetzelfde dier meerdere dagen in beeld wordt gebracht. Onvoldoende smering kan leiden tot hoornvliesstaar, waardoor het netvlies wordt verduisterd en ongeschikt wordt voor beeldvorming. Verschillende retinale pathologieën kunnen voorkomen bij RVO-beeldvorming, waardoor beelden ongeschikt zijn voor analyse. Deze omvatten overmatige netvliesloslating en overmatige bloeding, die, samen met het sterk in gevaar brengen van de kwaliteit van de beeldvorming, ook een mate van schade vertegenwoordigen die te ernstig is om als model van RVO te gebruiken. Het is bovendien mogelijk voor alle afgesloten schepen om kort na het letsel volledig te reperfuseren, wat RVO-schade niet nauwkeurig zal modelleren en als uitsluitingscriterium moet worden gebruikt. Het is echter belangrijk op te merken dat succesvolle occlusies van nature zullen verdwijnen na 48-72 uur na het letsel, en de aanwezigheid van occlusies als exclusiecriterium kan het beste worden gebruikt op of vóór 24 uur na de procedure. Colón Ortiz et al.13 beschrijven best practices voor het beperken van variabiliteit en het kalibreren van letsel in een geoptimaliseerd model voor RVO-procedure. De identificatie en beoordeling van uitsluitingscriteria is ook een cruciale stap in beeldanalyse. Aangezien dit grotendeels aan het oordeel van de beoordelaar is, is het belangrijk dat beoordelaars blind zijn voor behandelingsgroepen en consistentie oefenen in het oordeel over de ernst van de pathologie. Er zijn enkele beperkingen in de toepassing van deze methoden, met name in de praktijk van het in beeld brengen van dezelfde muis op meerdere tijdstippen. Er is een limiet aan de frequentie waarmee een muis kan worden verdoofd voor beeldvorming, waardoor het testen en aanpassen van tijdspunten nodig is om een optimaal tijdsverloop te bepalen. Onze studies maken gebruik van beeldvormingstijdpunten op 4 h, 24 h, 48 h en 8 dagen, waarvan we hebben vastgesteld dat ze stadia van initieel letsel, acute ontstekingsreactie en letsel op langere termijn hebben gevonden12. Bovendien zijn bepaalde muizenstammen meer vatbaar voor de ontwikkeling van hoornvliesstaar, waaronder verschillende diabetische muismodellen, wat kan leiden tot een groot aantal uitsluitingen of onvolledige tijdscursussen 20,21. Studies die dergelijke muislijnen gebruiken, moeten mogelijk de experimentele groepsgrootte of beeldtijdpunten aanpassen, afhankelijk van de gevoeligheid van het hoornvlies.
Fluoresceïne-angiografie beeldvorming is grotendeels kwalitatief gebruikt om retinale pathologieën zoals lekkage te observeren en te rangschikken, evenals patronen van veranderde bloedstroom RVO6. Onlangs zijn er inspanningen geleverd om een kwantitatieve analyse van FA in diermodellen te ontwikkelen, zoals berekening van vasculair gebied en tortuositeit16 en lineaire regressieanalyse van beeldintensiteit temporaliteit17. Segmentatie van de belangrijkste vaten vanaf de fundusachtergrond is eerder gebruikt, maar in een pixelanalyse van vul- en vervaldynamiek, wat getuigt van de variabiliteit in beeldintensiteit bij verschillende muizen17. Bovendien werd het potentieel voor bias opgemerkt in de interpretatie van fluoresceïnepooling17. De hier besproken kwantitatieve methode richt zich op het lekken van fluoresceïne uit de belangrijkste retinale vasculatuur, wat wijst op de afbraak van de BRB, waarvan is aangetoond dat deze een rol speelt bij RVO-letsel 11,12,14. Een alternatieve analyse van lekkage kwantificeert kleurstoflekkage op retinale flat mounts22. Invasieve postmortemanalyses zijn echter minder geschikt voor studies van de tijdlijn van RVO-letsel binnen een enkele muis, waarbij de lekkage op meerdere tijdstippen wordt bestudeerd. Analyses van het fluoresceïnelekkagegebied in verschillende stadia van de retinale ziekte zijn eerder gebruikt in klinische studies en gecorreleerd met andere waargenomen ziektepathologieën23. Deze methode maakt een vergelijkbaar gebruik van FA-beelden mogelijk om scheepslekkage in vivo te bestuderen, waardoor de lekdynamiek binnen de tijdlijn van RVO-letsel kan worden bestudeerd. Aangezien de selectie van het lekgebied afhankelijk is van de selectie van een regio door beoordelaars, introduceert het mogelijk een grotere hoeveelheid variabiliteit via subjectiviteit. Verder, aangezien de hier besproken studies van het RVO-letselmodel lekkage in het netvlies onderzoeken, hebben we er in plaats daarvan voor gekozen om een maskeringstechniek te gebruiken voor berekening. Deze lekmethode weerspiegelt een ander facet van RVO-schade dan die onthuld door DRIL- en OCT-laagtraceringsanalyse, en correlatie met deze maatregelen maakt het mogelijk om een nauwkeuriger ziekteprofiel te creëren.
We presenteren twee methoden voor de evaluatie van OCT-afbeeldingen. Acute ontsteking en daaropvolgende degeneratie van de retinale lagen is een kenmerk van RVO-letsel 6,12. De OCT-laagtraceringsmethodologie die hier wordt beschreven, maakt de nauwkeurige studie van individuele lagen mogelijk en onthult meer subtiele effecten en verschillen in dynamiek in verschillende regio's van het netvlies. Deze analysetechniek bouwt voort op andere veelgebruikte protocollen voor de kwantificering van retinale laagdikte in OCT-beeldvorming. Deze methode richt zich op de variatie tussen protocollen in het gebied dat wordt gebruikt om de laagdikte te schatten, evenals het aantal metingen dat in de afbeelding is uitgevoerd11. Omdat verdunning niet uniform is binnen elke retinale laag, is het onwaarschijnlijk dat methoden met minder puntmetingen een volledig beeld geven van letseleffecten. Meta-analyse van meerdere meetstrategieën voor retinale laagdikte meldde dat protocollen die gemiddeld over grotere delen van het OCT-beeld een hogere correlatie vertoonden met de ernst van de ziekte, evenals een grotere herhaalbaarheid11. Door het gemiddelde over het hele beeld te nemen, legt deze methode een nauwkeurigere weergave vast van de retinale verdunning die aanwezig is bij langdurig RVO-letsel. Studies verschillen ook in termen van de locatie waar OCT-beelden worden genomen - veel studies centreren beeldvorming op de oogzenuw. Daarentegen centreert de gepresenteerde methode ten opzichte van de occlusies. Een recente ontwikkeling in de analyse van menselijke OCT-beeldvorming is het gebruik van machine learning-algoritmen om functies te classificeren en te kwantificeren24. Dergelijke analyses kunnen een veelbelovende toekomstige richting zijn voor de analyse van beeldvorming van het netvlies van dieren.
Daarnaast presenteren we een vertaling van DRIL, een klinische maat voor capillaire ischemie, in een knaagdiermodel. Bij mensen is DRIL een voorspeller gebleken van gezichtsscherpteverlies en retinale dikteverschillen en heeft het een hoge diagnostische gevoeligheid en specificiteit aangetoond18,19. Het kwantificeren van de DRIL bij muizen door het meten van het aandeel van het netvlies dat ongeorganiseerd is, heeft correlatie aangetoond met de fractie van afgesloten aderen, ERG b-golfamplitude na 7 dagen na RVO en retinale verdunning op 8 dagen na RVO12. Een alternatief voor DRIL-meting is het gebruik van HYPOX-4 om retinale hypoxie en ischemische schade te meten. HYPOX-4 voegt zich bij pimonidazol anime hydrochloride, een hypoxie marker, met een fluorescerende sonde om retinale hypoxie25 te detecteren. De meeste protocollen die HYPOX-4 gebruiken, zijn invasief en vereisen retinale flat mount-analyse, wat mogelijk minder geschikt is voor het bouwen van letseltijdlijnen, hoewel een in vivo beeldvormingsprotocol met behulp van een HYPOX-4-sonde onlangs is getest25. DRIL-analyse is ook nuttig als een snelle uitlezing van retinale schade, omdat afzonderlijke metingen in elk OCT-beeld tijdsefficiënter zijn dan analyses zoals retinale laagtracering. Er moet echter worden opgemerkt dat deze maatregelen niet uitwisselbaar zijn en verschillende retinale pathologieën onthullen. In plaats daarvan moeten ze in overleg worden gebruikt, waarbij DRIL kan worden gebruikt als een eerste uitlezing voor effectgrootte of interventie-werkzaamheid, en laagtracering kan vervolgens worden gebruikt voor een grondige analyse van meer subtiele effecten in de retinale lagen.
Deze methoden zijn orthogonaal van aard, wat het mogelijk maakt om voor elk proefpersoon een ziekteprofiel te maken. Omdat de pathologieën die door elk van deze methoden worden gerapporteerd, verschillend zijn, is het niet gegarandeerd dat ze proportioneel zullen schalen, en het verkrijgen van een meer holistisch beeld van pathologie zal een rigoureuzer onderzoek van de verschillende manifestatieconfiguraties van RVO-schade mogelijk maken. Het vermogen om de hoeveelheid informatie die kan worden geëxtraheerd uit de beeldvorming van elk proefdier te maximaliseren, zal het aantal dieren verminderen dat nodig is om significante conclusies te trekken, waardoor de efficiëntie van het experimentele proces wordt verbeterd. Het toepassen van deze methoden op recent verfijnde RVO-protocollen zorgt voor een grotere reproduceerbaarheid en studie van de vertaling van klinische fenotypen in diermodellen. Naast de studie van RVO-modellen, heeft het gebruik van deze methoden toepassingen voor andere modellen van retinale ziekten die FA- en OCT-beeldvorming gebruiken. Voorbeelden van dergelijke muismodellen zijn die voor leeftijdsgebonden macula-oedeem (AMD)26, diabetisch macula-oedeem (DME)23, choroïdale neovascularisatie (CNV)27, experimentele auto-immuun uveoretinitis (EAU)28 en retinopathie van prematuriteit (ROP)15. Deze methoden kunnen verder worden gegeneraliseerd naar studies met behulp van FA- en OCT-beeldvorming bij het bestuderen van modellen van deze ziekten bij andere soorten. Deze kwantificeringen zijn ook gevoelig voor meer subtiele veranderingen in het ziektemechanisme, waardoor ze nuttig zijn bij de evaluatie van de werkzaamheid van de behandeling, zoals in figuur 3D en figuur 4C. Nut strekt zich ook uit tot het gebruik van beeldvorming bij toxiciteitstests in verdraagbaarheidsstudies van geneesmiddelenverbindingen. De standaardisatie en reproduceerbaarheid van deze analyseprotocollen kan dienen om de translationele validiteit van diermodellen te verbeteren en ons begrip van de pathogenese en pathofysiologie van de retinovasculaire ziekte uit te breiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) subsidie DGE - 1644869 (aan CKCO), het National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (aan AMP), het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (RO1 NS081333, R03 NS099920 aan CMT) en het Department of Defense Army / Air Force (DURIP aan CMT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-Fluor 10% | Akorn | NDC: 17478-253-10 | light-sensitive |
| Carprofen | Rimadyl | NADA #141-199 | keep at 4 °C |
| GenTeal | Alcon | 00658 06401 | |
| Image J | NIH | ||
| InSight 2D | Phoenix Technology Group | OCT analysis software | |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Phenylephrine | Akorn | NDCL174478-201-15 | |
| Phoenix Micron IV | Phoenix Technology Group | Retinal imaging microscope | |
| Phoenix Micron Meridian Module | Phoenix Technology Group | Laser photocoagulator software | |
| Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module | Phoenix Technology Group | OCT imaging software | |
| Phoenix Micron StreamPix Module | Phoenix Technology Group | Fundus imaging and acquisition targeting | |
| Photoshop | Adobe | ||
| Refresh | Allergan | 94170 | |
| Tropicamide | Akorn | NDC: 174478-102-12 | |
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Tong, X., et al. The burden of cerebrovascular disease in the united states. Preventing Chronic Disease. 16, 180411 (2019).
- Nakahara, T., Mori, A., Kurauchi, Y., Sakamoto, K., Ishii, K. Neurovascular interactions in the retina: physiological and pathological roles. Journal of Pharmacological Sciences. 123 (2), 79-84 (2013).
- Jaulim, A., Ahmed, B., Khanam, T., Chatziralli, I. Branch retinal vein occlusion: epidemiology, pathogenesis, risk factors, clinical features, diagnosis, and complications. An update of the literature. Retina. 33 (5), 901-910 (2013).
- Ho, M., Liu, D. T. L., Lam, D. S. C., Jonas, J. B. Retinal vein occlusions, from basics to the latest treatment. Retina. 36 (3), 432-448 (2016).
- Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
- Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
- Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
- Cavallerano, A.
- Laatikainen, L. The fluorescein angiography revolution: a breakthrough with sustained impact. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 82 (4), 381-392 (2004).
- Huang, D., et al.
- Oberwahrenbrock, T., et al. Reliability of intra-retinal layer thickness estimates. PLoS One. 10 (9), 0137316 (2015).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colón Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J., Smart, J., Troy, C. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (174), e62980 (2021).
- Schmidt-Erfurth, U., et al. Guidelines for the management of retinal vein occlusion by the European society of retina specialists (EURETINA). Ophthalmologica. 242 (3), 123-162 (2019).
- Yoshimura, T., et al. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4 (12), 8158 (2009).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Hui, F., et al. Quantitative spatial and temporal analysis of fluorescein angiography dynamics in the eye. PLoS One. 9 (11), 111330 (2014).
- Berry, D., Thomas, A. S., Fekrat, S., Grewal, D. S. Association of disorganization of retinal inner layers with ischemic index and visual acuity in central retinal vein occlusion. Ophthalmology. Retina. 2 (11), 1125-1132 (2018).
- Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
- Obrosova, I., Chung, S., Kador, P. Diabetic cataracts: mechanisms and management. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 26 (3), 172-180 (2010).
- Hegde, K., Henein, M., Varma, S. Establishment of the mouse as a model animal for the study of diabetic cataracts. Ophthalmic Research. 35 (1), 12-18 (2003).
- Takahashi, H., et al. Time course of collateral vessel formation after retinal vein occlusion visualized by OCTA and elucidation of factors in their formation. Heliyon. 7 (1), 05902 (2021).
- Haj Najeeb, B., et al. Fluorescein angiography in diabetic macular edema: A new approach to its etiology. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (10), 3986-3990 (2017).
- Alam, M., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography features for objective classification and staging of diabetic retinopathy. Retina. 40 (2), 322-332 (2020).
- Uddin, M., Jayagopal, A., McCollum, G., Yang, R., Penn, J. In vivo imaging of retinal hypoxia using HYPOX-4-dependent fluorescence in a mouse model of laser-induced retinal vein occlusion (RVO). Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3818-3824 (2017).
- Qiang, W., Wei, R., Chen, Y., Chen, D. Clinical pathological features and current animal models of type 3 macular neovascularization. Frontiers in Neuroscience. 15, 734860 (2021).
- Park, J., et al. Imaging laser-induced choroidal neovascularization in the rodent retina using optical coherence tomography angiography. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 331 (2016).
- Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C., Caspi, R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8 (5), 63904 (2013).
