In vivo Vasculaire letseluitlezingen in het netvlies van muizen om de reproduceerbaarheid te bevorderen

Dit protocol stelt de gebruiker in staat om klinisch analoge markers van schade in retinale beeldvorming van muizen kwantitatief te meten, wat de vertaalbaarheid van latere bevindingen versterkt. Deze methoden stellen ons in staat om de analyse te stroomlijnen en geven ons de mogelijkheid om op betrouwbare wijze beeldvorming tussen proefdieren te vergelijken. Hoewel deze methoden zijn ontwikkeld om een overzicht van muismodellen te bestuderen, kunnen ze zich gemakkelijk uitbreiden tot onderzoek naar netvliesaandoeningen die dezelfde beeldvormingstechnieken gebruiken.

Zet de retinale beeldvormende microscoop lichtbak, de optische coherentie tomografie machine en het verwarmde muis platform aan. Schakel de computer in en open het beeldbewerkingsprogramma. Voeg een druppel fenylefrine en tropicamide toe aan elk oog.

Injecteer 100 microliter 1% fluoresceïne intraperitoneaal. Plaats de muis op het platform. Pas de hoogte en hoek van het platform aan totdat het zicht op de retinale fundus duidelijk en gefocust is.

Maak een foto van de fundus. Open de software voor beeldvormende en optische coherentietomografie. In het optische coherentie tomografie programma nudge aanpassen aan 10.

Maak een optische coherentie tomografie afbeelding, voeg 75 micrometer distale van de brandwond toe. Herhaal dit voor de andere drie kwadranten van het netvlies. Schakel de camera over naar een filter van 488 nanometer.

Verhoog de camerawinst naar 5. Maak een foto van de fundus precies 5 minuten na fluoresceïne injectie. Open de fluoresceïneafbeelding in de beeldverwerkingssoftware.

Dupliceer de afbeelding. Gebruik een selectietool om de belangrijkste schepen zorgvuldig te traceren. Negeer alle schepen die zich van deze schepen vertakken.

Verwijder in de eerste afbeelding de selectie, waardoor alleen het vat overblijft. Sla deze gemaskeerde afbeelding op. Verplaats de selectie naar de tweede afbeelding, keer de selectie om en verwijder, waarbij de achtergrond wordt geïsoleerd.

Sla deze gemaskeerde afbeelding op. Open de achtergrondafbeelding en meet de geïntegreerde dichtheid. Open de afbeelding van de vaten, selecteer de omtrek van de vaten en meet vervolgens de gemiddelde intensiteit.

Deel de geïntegreerde dichtheid van de achtergrond door de gemiddelde intensiteit van de vaten, waardoor de lekkageverhouding voor het oog wordt gegenereerd. Noteer deze lekkageratio voor elk oog in een experimenteel cohort. Om de controle voor de achtergrond te bevorderen, normaliseert u experimentele ogen tot de gemiddelde lekkageratio van niet-gewonde controleogen.

Open het optische coherentietomografiebeeld in de beeldverwerkingssoftware. Traceer de randen van de ganglioncellaag, de binnenste plexiformlaag, de binnenste nucleaire laag, de buitenste plexiformlaag, de fotoreceptorlaag en de RPE-laag. Exporteer de bestanden als CSV.

Meet de gemiddelde dikte van elke laag en herhaal voor elk oog in het experimentele cohort. Open de optische coherentietomografieafbeelding in afbeelding J.Meet met behulp van het lijngereedschap de afstand waar de bovenrand van de buitenste plexiforme laag onduidelijk is. Meet horizontaal en behoud de breedtegraad waar de desorganisatie begint.

Bereken de som van de ongeorganiseerde afstanden in de afbeelding. Deel de lengte van de desorganisatie door de totale lengte van het netvlies om de verhouding van desorganisatie te verkrijgen. Herhaal de meting en berekening voor optische coherentietomografiebeelden van de andere drie kwadranten van het netvlies.

Neem het gemiddelde van de desorganisatieverhoudingen van de vier optische coherentietomografiebeelden. Dit getal vertegenwoordigt de gemiddelde desorganisatie voor het hele netvlies. Herhaal dit voor elk oog in het experimentele cohort.

De gemaskeerde beelden die worden gebruikt voor de berekening van de lekkageverhouding voor elk netvliesbeeld kunnen worden vergeleken met andere en geanalyseerd, waarbij de belangrijkste vasculatuur wordt gescheiden van andere delen van het netvlies. Fluoresceïnekwantificering maakt het mogelijk om de ernst van het letsel en de werkzaamheid van de behandeling te vergelijken, evenals de studie van veranderingen in lekkage gedurende het verloop van de letseltijd. Een afbakening van de lagen van het netvlies in een OCT-beeld wordt waargenomen.

De kwantificering van de dikte voor elke retinale laag laat zien dat de initiële oedemateuze respons een diepgaander effect heeft op de interne retinale lagen. Uit een analyse van een tijdsverloop van retinale ader occlusieschade, de initiële inflammatoire zwelling van retinale lagen en de uiteindelijke degeneratieve verdunning kan worden waargenomen. De binnenste nucleaire laag ervaart een veel grotere reactie op de initiële verwonding, maar de binnenste plexiforme laag vertoont ernstiger verdunning nadat het initiële oedeem is gestabiliseerd en keert terug naar de basislijn.

De desorganisatie van de binnenste retinale laag manifesteert zich als een verdwijning van de bovengrens van de buitenste plexiforme laag, waarbij de buitenste plexiforme en binnenste nucleaire lagen samenvloeien. De retinale desorganisatie van twee experimentele groepen werd vergeleken om de werkzaamheid van een remmer bij het beperken van retinale schade te onderzoeken. Beeldkwaliteit is van vitaal belang voor de analysekwaliteit.

Neem bij het verkrijgen van retinale beelden de tijd om ervoor te zorgen dat de fundus- en retinale lagen zo helder en gefocust mogelijk zijn. Deze niet-invasieve methoden kunnen longitudinaal en in combinatie met biochemische en immunohistochemische studie van weefsel worden gebruikt om meer veelzijdige en gedetailleerde ziekteprofielen te creëren. Deze techniek maakt de betrouwbare kwantificering mogelijk van in Vivo retinale beeldvormingsgegevens in modellen van neurovasculaire aandoeningen, zodat gegevens gemakkelijker kunnen worden vertaald naar menselijke ziekten.