Summary
Im Einklang mit dem dringenden Bedarf an Screening auf Typ-1-Diabetes, Zöliakie und Coronavirus-Krankheit 2019 haben wir einen 6-Plex-Elektrochemilumineszenz-Assay mit hohem Durchsatz entwickelt, um alle vier Inselautoantikörper, Gewebetransglutaminase-Autoantikörper und Antikörper gegen die Rezeptorbindungsdomäne des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 gleichzeitig nachzuweisen.
Abstract
Eine laufende klinische Studie, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), ist die erste Screening-Studie in der Allgemeinbevölkerung für Typ-1-Diabetes (T1D) und Zöliakie in den Vereinigten Staaten. Mit der Coronavirus-Pandemie 2019 (COVID-19) werden die Epidemiologie von COVID-19 in der Allgemeinbevölkerung und das Wissen über den Zusammenhang zwischen COVID-19-Infektion und T1D-Entwicklung dringend benötigt. Die derzeit übliche Screening-Methode des Radio-Binding-Assays (RBA) hat zwei große Herausforderungen gemeistert: geringe Effizienz mit einem einzigen Assay-Format und geringe Krankheitsspezifität mit einem großen Anteil an Antikörpern mit niedriger Affinität, die im Screening erzeugt werden. Mit der Plattform des zuvor etablierten Multiplex-Elektrochemilumineszenz-Assays (ECL) wurde ein neuartiger 6-Plex-ECL-Assay entwickelt, der in einer einzigen Vertiefung alle vier Inselautoantikörper (IAbs) gegen Insulin, Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD65), Insulinom-Antigen 2 (IA-2) und Zinktransporter 8 (ZnT8) für T1D, Transglutaminase-Autoantikörper (TGA) für Zöliakie und Antikörper gegen das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Rezeptor-bindende Domäne (RBD) für COVID-19. Der Assay wurde blind mit 880 Proben aus der ASK-Studie validiert, darunter 325 positive Proben und 555 alle Antikörper-negativen Proben, und mit den Standard-RBAs und einem einzelnen ECL-Assay verglichen. Mit den Vorteilen einer hohen Effizienz, niedrigen Kosten und eines geringen Serumvolumens wurde dieser Assay als primäres Screening-Tool für die ASK-Studie akzeptiert.
Introduction
Große epidemiologische Studien weltweit zeigen, dass die Inzidenz von Typ-1-Diabetes (T1D) rapide um 3%-5% jährlich zugenommen hat, und die Prävalenz von T1D hat sich in den letzten 20 Jahren verdoppelt, insbesondere bei Kleinkindern 1,2. Inselautoantikörper (IAbs) treten in der Regel Jahre vor klinischen Symptomen auf und sind derzeit die zuverlässigsten prädiktiven und diagnostischen Biomarker für T1D3. Das Screening auf T1D-Autoantikörper kann Menschen mit einem Risiko für den Übergang zu klinischem T1D identifizieren, die Öffentlichkeit aufklären, die lebensbedrohliche Komplikation der Ketoazidose weitgehend reduzieren und klinischen Studien für Präventionstherapien zugute kommen. Weltweite Präventionsbemühungen für T1D sind im Gange und mehrere interventionelle Studien werden unter Probanden mit IAbs-positiven durchgeführt, um das Fortschreiten zu klinischem T1D zu verzögern, und das Barbara Davis Center for Diabetes startete 2016 die erste klinische US-Studie zum Screening in der Allgemeinbevölkerung für T1D und Zöliakie, Autoimmunity Screening for the Kids (ASK)4 . Zöliakie (CD) ist eine chronische entzündliche Darmerkrankung, die mit Immun- und genetischen Faktoren zusammenhängt. Die Prävalenz von CD bei Kindern mit T1D kann bis zu 24,5% erreichen5. Mehr als die Hälfte der Personen mit CD haben möglicherweise keine typischen Symptome bei Präsentation6, so dass ein serologisches Screening auf Zöliakie durchaus notwendig ist.
Seit Beginn der Pandemie der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) wurden weltweit über 200 Millionen Fälle gemeldet, und Kinder machen bis zu 16% der im Labor bestätigten Fälle aus7. Viele Studien haben die Auswirkungen bestehender T1D auf den Schweregrad und die Todesfolge einer COVID-19-Infektion gezeigt8, während die Auswirkungen einer COVID-19-Infektion auf die T1D-Entwicklung nicht klar sind. Die Untersuchung der Gesamtrate der COVID-19-Infektion in der Allgemeinbevölkerung durch die Bestimmung von Antikörpern gegen das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-COV-2) und die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen COVID-19-Infektion und der Auslösung einer T1D-Autoimmunität oder einer Beschleunigung der T1D-Progression sind dringend notwendig und sehr wichtig, während die laufende ASK-Studie hierfür eine hervorragende Plattform darstellt. Aufgrund des Single-Assay-Formats und der Erzeugung eines großen Anteils an Antikörperpositivität mit niedriger Affinität hat der Standard-Radiobindungstest (RBA) einen Engpass von geringer Effizienz und geringer Krankheitsspezifität erreicht9. In der vorliegenden Arbeit präsentieren wir einen neuartigen 6-Plexed Electrochemiluminescence (ECL) Assay, der auf unserer vorherigen Multiplex-ECL-Assay-Plattform unter Verwendung einer Multiple-Plex-Platte aufbaut und sechs Autoantikörper-Assays in einer einzigen Vertiefung kombiniert, einschließlich aller vier Haupt-IAbs gegen Insulin (IAA), Glutaminsäure-Decarboxylase-65 (GADA), Insulinom-Antigen-2 (IA-2A) und Zinktransport-8 (ZnT8A), Autoantikörper gegen Transglutaminase (TGA) für Zöliakie, und SARS-CoV-2-Rezeptor-bindende Domäne (RBD)-Antikörper (COVID-19A). Dies ist der erste Multiplex-Test, der ein komplettes Panel von vier großen IAbs rekrutierte und dies weiter mit TGA und COVID-19A kombinierte. Es wurde validiert und offiziell als primäres Screening-Tool akzeptiert, das die Standard-RBA in der ASK-Studie ersetzt.
Protocol
Das Forschungsprotokoll wurde vom Colorado Multiple Institutional Review Board genehmigt.
1. Puffervorbereitung
- Den Markierungspuffer vorbereiten (2x PBS, pH 7,9): 100 mL 10x PBS auf 400 mL destilliertes Wasser geben und den pH-Wert mit NaOH auf 7,9 einstellen.
- Machen Sie 3 mM Biotin und Ru Sulfo-NHS: Lösen Sie 1 mg Biotin in 588 μL Markierungspuffer und lösen Sie 150 nmol Ru Sulfo-NHS in 50 μL Markierungspuffer.
- Antigenpuffer (1% BSA) vorbereiten: 5 g Rinderserumalbumin (BSA) in 500 ml 1x PBS auflösen.
- Beschichtungspuffer vorbereiten (3% Blocker A): 15 g Blocker A in 500 mL 1x PBS auflösen.
- Bereiten Sie den ersten Waschpuffer (0,05 % Tween 20, PBST) vor: Mischen Sie 2,5 mL Tween 20 in 5.000 mL 1x PBS.
- Bereiten Sie den zweiten Waschpuffer (0,4 M NaCl) vor: Mischen Sie 50 mL 5 M NaCl in 575 mL destilliertem Wasser, um die 0,4 M NaCl-Lösung herzustellen.
HINWEIS: Für eine effiziente Kennzeichnung verwenden Sie immer frisch zubereitete Biotin- und Ru Sulfo-NHS-Lösungen und keine zuvor gelagerten.
2. Antigenproteinmarkierung mit Biotin und Ru Sulfo-NHS separat
HINWEIS: Eine höhere Konzentration von Antigenprotein ≥0,5 mg / ml wird für eine höhere Markierungseffizienz empfohlen.
- Bereiten Sie sechs zielgerichtete Antigenproteinlösungen vor, einschließlich Proinsulin, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG und Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des Spike-Proteins von SARS-CoV-2. Berechnen Sie die Mole jedes Antigenproteins nach seinem Molekulargewicht und machen Sie geeignete molare Verhältnisse von Biotin oder Ru Sulfo-NHS. Das Verhältnis von Antigen zur Summe von Biotin oder Ru Sulfo-NHS beträgt 1:5 für kleinmolekulare Antigene (Molekulargewicht ≤10 kd), wie Proinsulinprotein. Für mittelmolekulare Antigene (Molekulargewicht 10-50 kd) wie ZnT8 passt sich das Verhältnis auf 1:10 an. Für Antigene mit großem Molekulargewicht (Molekulargewicht >50 kd) wie GAD beträgt das molare Verhältnis 1:20.
- Teilen Sie das Antigenprotein in zwei gleiche Teile und mischen Sie es separat mit Biotin und Ru Sulfo-NHS unter Verwendung des berechneten Molverhältnisses in Schritt 2.1. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur (RT) für 1,5 h und vermeiden Sie dabei Licht.
HINWEIS: Alle reduzierenden Chemikalien wie Tris oder Glycin im Puffer des Antigenproteins müssen durch eine mit einem Puffer von 2x PBS (pH 7,9) grundierte Größenspinsäule entfernt werden. - Grundieren Sie die Spinsäulen mit 2x PBS (die Größe der Spin-Säule, 2 mL oder 5 ml, hängt vom Volumen des markierenden Antigenproteins ab): Geben Sie 1 ml 2x PBS-Puffer in die Spin-Säule, zentrifugieren Sie sie bei 1.000 x g für 2 min und wiederholen Sie den Schritt 2x weiter.
- Lassen Sie das Antigen-Protein-Biotin oder -Ru-Sulfo-NHS-Gemisch 1x durch die grundierte Spin-Säule gehen (zentrifugieren Sie die Säule bei 1.000 x g für 2 min) zur Reinigung und stoppen Sie die Markierungsreaktion.
- Messen Sie das Endvolumen des markierten Antigenproteins, das aus den Spinsäulen eluiert wird, und berechnen Sie die Konzentrationen des Biotin- oder Ru-Sulfo-NHS-markierten Antigenproteins. Stellen Sie kleinere Aliquots des markierten Antigenproteins (50 μL/Röhrchen) her und lagern Sie sie bei −80 °C für den Langzeitgebrauch.
HINWEIS: Die Abdeckung des Proteins nach jeder Spin-Säule beträgt eine Retentionsrate von ungefähr 90% -95%.
3. Definition der besten Konzentration und Verhältnisse für Biotin- und Ru-Sulfo-NHS-markierte Antigene für den 6-Plex ECL-Assay (Schachbrett-Assay)
HINWEIS: Der Schachbretttest für jedes Antigen ist vor der Integration in den Multiplex-Assay erforderlich.
- Wenden Sie den Schachbretttest für jedes Antigen separat an.
HINWEIS: Schritte 3.2.-3.7. wird TGA als kurzes Beispiel verwenden. Der TGA-Schachbrett-Assay-Prozess soll den Assay-Prozess simulieren, jedoch nur mit einer Art von Antigen. - Machen Sie die serielle Verdünnung des biotinylierten tTG und Ru Sulfo-NHS-markierten tTG. Die empfohlenen Arbeitskonzentrationen der ersten Mischungslösung beginnen bei 240 ng/ml sowohl für biotinyliertes als auch für Ru Sulfo-NHS-markiertes tTG. Nehmen wir an, die Konzentrationen sowohl des ursprünglichen biotinylierten als auch des Ru-Sulfo-NHS-markierten tTG betragen 1,0 μg / μL. Machen Sie eine 10-fache Verdünnung des ursprünglichen Ru Sulfo-NHS-markierten tTG und eine 5-fache Verdünnung des ursprünglichen biotinylierten tTG mit 5% BSA.
- Mischen Sie 4 μL biotinyliertes tTG-Protein mit 156 μL 5% BSA (Antigenpuffer) und 240 μL des Streptavidin-konjugierten Linkers in einem Röhrchen und inkubieren Sie die Lösung bei RT für 30 min. Dann fügen Sie 160 μL Stopplösung hinzu und inkubieren Sie bei RT für weitere 30 Minuten. Nehmen Sie 400 μL der Mischung und mischen Sie sie mit 2 ml Stopplösung. Die Konzentration des biotinylierten tTG in der Mischung beträgt 240 ng/ml.
- Um eine serielle Verdünnung für das Biotin-markierte ZnT8-Antigen herzustellen, bereiten Sie weitere fünf neue Röhrchen vor und nehmen Sie 1 ml eines Aliquots aus der Mischung in Schritt 3.3. und mischen Sie mit 1 ml Stop-Lösung in einem neuen Röhrchen und erhalten Sie die Mischung mit einer Konzentration von 120 ng / ml. Wiederholen Sie diesen Schritt, machen Sie serielle 1: 1-Verdünnungen und erhalten Sie das Biotin-markierte tTG bei 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml und 7,5 ng / ml.
- Fügen Sie 4 μL Ru Sulfo-NHS-markiertes tTG mit 1,6 ml Stopplösung hinzu und erhalten Sie eine Mischung aus Ru Sulfo-NHS-markiertem tTG in einer Konzentration von 240 ng / ml. Mit den gleichen Schritten von 3.4. werden serielle 1:1-Verdünnungen vorgenommen und das Ru Sulfo-NHS-markierte ZnT8-Antigen bei 60 ng/ml, 30 ng/ml, 15 ng/ml, 7,5 ng/ml und 3,75 ng/ml erhalten. Die letzte Konzentration beträgt 0 ng/ml, mit nur Stopplösung und ohne Ru Sulfo-NHS-markiertes Antigen.
- Vorbereitung von tTG-Positivkontroll- und Negativkontrollserumproben (vorqualifiziert und standardisiert durch einen einzigen ECL-tTG-Assay) und einer 96-Well-PCR-Platte. Aliquot der positiven und negativen Kontrollserumproben in die linke bzw. rechte Hälfte der Platte mit jeweils 7 μL Vertiefung. Geben Sie 1x PBS auf die Platte, mit 33 μL pro Vertiefung.
- Auf der linken Hälfte der PCR-Platte werden 24 μL der seriell verdünnten Biotin-markierten tTG-Linkerlösung in jede Vertiefung gegeben, eine Säule mit einer Konzentration in der Reihenfolge von der höchsten zur niedrigsten. Auf die gleiche Weise werden 16 μL des seriell verdünnten Ru-Sulfo-NHS-markierten tTG-Antigens in jede Vertiefung, eine Reihe mit einer Konzentration gegeben und dann gründlich gemischt. Wiederholen Sie den Schritt auf der rechten Hälfte der PCR-Platte.
- Setzen Sie die restlichen Untersuchungsschritte fort, die in den Schritten 5.3.-9.1 beschrieben sind. bis die Rohzähldaten erhalten sind.
- Berechnen Sie das Verhältnis von positiven Steuersignalen zu entsprechenden negativen Steuersignalen. Bestimmen Sie die beste Konzentration für das Biotin-markierte Antigen und das Ru-Sulfo-NHS-markierte Antigen mit höheren Verhältniswerten und niedrigerem Hintergrund für die negative Kontrollprobe. Die optimalen Arbeitskonzentrationen von Biotin und Ru Sulfo-NHS-markiertem Antigenprotein sind unten aufgeführt: 16,0 ng/ml und 8,0 ng/ml für GAD65, 18,8 ng/ml und 9,4 ng/ml für SARS-CoV-2 RBD, 42,0 ng/ml und 42,0 ng/ml für IA-2, 60,0 ng/ml und 60,0 ng/ml für tTG, 4,2 ng/ml und 4,2 ng/ml für ZnT8, und 31,3 ng/ml und 31,3 ng/ml für Proinsulin.
4. Linker-gekoppelte Antigenlösung erstellen
- Die Biotin- und Ru-Sulfo-NHS-markierten Antigene werden mit 5% BSA auf die optimalen Arbeitskonzentrationen gemäß Schritt 3.9 verdünnt.
- Binden Sie vorselektierte Linker an jedes biotinylierte Antigenprotein. Für einen 96-Well-Plattentest werden 4 μL biotinyliertes GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 und Proinsulinantigenprotein in ein separates Röhrchen mit 156 μL 1% BSA gegeben und mit 240 μL der entsprechenden Streptavidin-konjugierten Linker 1, 2, 3, 8, 9 und 10 gemischt (Abbildung 1). Inkubieren Sie die Mischung für 30 min bei RT.
- Aliquot 160 μL Stopplösung in jedes Röhrchen geben und die Mischung bei RT für 30 min inkubieren. Nehmen Sie 400 μL der Mischungslösung aus jedem Röhrchen heraus und kombinieren Sie sie.
- Fügen Sie 4 μL Ru Sulfo-NHS markiert GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 und Proinsulinantigen zu der obigen Mischung hinzu und fügen Sie dann 1,6 ml Stopplösung und 3,2 ml 1x PBS hinzu und mischen Sie. Jetzt ist die Antigenlösung bereit für den Einsatz im Assay.
5. Serumproben mit dem markierten Antigen inkubieren
- Aliquot 7 μL Serum pro Vertiefung für eine 96-Well-PCR-Platte und Abdeckung mit Siegelfolie. Die Seren auf einem PCR-Gerät für 30 min bei 56 °C vorheizen. Zentrifugieren Sie die Platte kurz bei 100 x g für 1 min.
- 63 μL Antigenlösung (hergestellt in Schritt 4.4) pro Vertiefung zugeben und mit den Seren mischen. Decken Sie die PCR-Platte mit Siegelfolie ab, um Licht zu vermeiden.
- Schütteln Sie die Platte auf einem Shaker bei 450 U/min bei RT für 2 h und inkubieren Sie dann die Platte bei 4 °C für 18-24 h.
6. Bereiten Sie die 6-Plex-Platte vor
- Nehmen Sie eine 6-Plex-Platte aus dem 4 °C-Kühlschrank, damit die Platte zu RT kommen kann. Fügen Sie 150 μL 3% Blocker A zu jeder Vertiefung der 6-Plex-Platte hinzu.
- Stellen Sie den Teller wieder in den Kühlschrank bei 4 °C, decken Sie den Teller mit lichtvermeidender Folie ab und brüten Sie über Nacht.
HINWEIS: Die Analyseschritte in Tag 1 umfassen die Abschnitte 4.-6.
7. Serum/Antigen in die 6-Plex-Platte überführen
- Nehmen Sie am nächsten Tag die brütende 6-Plex-Platte aus dem Kühlschrank und lassen Sie den gesamten Puffer aus dem Teller fallen. Tupfen Sie den Teller auf Papiertücher, um ihn auszutrocknen.
- Waschen Sie die 6-Plex-Platte jeweils 3x mit 150 μL Waschpuffer pro Vertiefung. Trocknen Sie die Platte auf Papiertüchern, und aliquotes Serum/Antigen inkubiert aus jeder Vertiefung der über Nacht inkubierenden PCR-Platte in zwei Vertiefungen der 6-Plex-Platte (30 μL pro Vertiefung für Duplikate).
- Decken Sie die Platte mit Folie ab, legen Sie die Platte dann auf einen Plattenschüttler und schütteln Sie sie mit einer Geschwindigkeit von 450 U/min bei RT für 1 h.
8. Waschen Sie die 6-Plex-Platte und fügen Sie Lesepuffer hinzu
- Die Lösung in die 6-Plex-Platte geben und die Platte jeweils 3x mit 150 μL 0,4 M NaCl-Waschpuffer pro Vertiefung waschen.
- Nachdem die dritte Wäsche abgeschlossen ist, trocknen Sie die Platte gegen das Papiertuch und geben Sie 150 μL Lesepuffer in jede Vertiefung.
HINWEIS: Luftblasen im Bohrloch beeinträchtigen die Genauigkeit der Plattenlesemaschine und sollten unbedingt vermieden werden.
9. Lesen Sie die Platte und analysieren Sie die Daten
- Zählen Sie die Platte auf einem Elektrochemilumineszenz-Analysator. Die Leseergebnisse werden mit den Werten in Anzahl pro Sekunde (CPS) dargestellt. Berechnen Sie den relativen Antikörperindex jeder Probe unter Verwendung des vom Lesegerät erhaltenen Roh-CPS gegen den CPS der internen Standard-Positiv- und Negativkontrollen jedes spezifischen Antikörpers (Indexwert = [CPS (Probe) - CPS (negativer Standard)] / [CPS (positiver Standard) - CPS (negativer Standard)]).
- Bestimmen Sie negative oder positive Antikörperergebnisse unter Verwendung der Cutoff-Werte, die an den 99,5. bis 99,8. Perzentilen von 555 negativen Kontrollproben aus der ASK-Studie festgelegt wurden (alle Antikörper-negativen Proben ohne eine Vorgeschichte oder Familiengeschichte von Diabetes oder einer anderen Art von Autoimmunerkrankung).
HINWEIS: Die Analyseschritte in Tag 2 umfassen die Abschnitte 7-9.
Representative Results
Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3 veranschaulichen die repräsentativen Ergebnisse. Die von der Lesemaschine erhaltenen CPS sind in Tabelle 1 dargestellt. In Tabelle 2 wurden rohe CPS nach den sechs Linkern und entsprechenden Antikörpern geordnet und sortiert. Tabelle 3 zeigt die berechneten Indexwerte mit CPS wie im Assay-Protokoll beschrieben. Alle Rohzählwerte sollten überprüft werden, um falsche Endindexergebnisse durch fehlerhafte Duplikate zu vermeiden. In Tabelle 1 sind Beispiele für fehlerhafte Duplikate aufgeführt, die zu einem Fehler bei der endgültigen Indexberechnung in Tabelle 3 führten.
Dieser Assay wurde blind anhand von 880 ausgewählten Proben aus der ASK-Studie mit 325 IAbs-positiven Proben und 555 vollständig ABS-negativen Proben validiert. Die Konzentrationen von Autoantikörpern aus dem 6-Plex ECL-Assay für die 880 Proben wurden Punkt für Punkt mit den Konzentrationen der entsprechenden einzelnen ECL-Assays (Abbildung 2) und mit der entsprechenden Einzelstandard-RBA (Abbildung 3) verglichen. Der Cutoff, die Sensitivität und die Spezifität für jeden Antikörper sind in Tabelle 4 aufgeführt. Die Sensitivität und Spezifität dieses ECL-COVID-19A-Assays wurde mit 100% bzw. 99,9%10% identifiziert.
Abbildung 1: Abbildung des 6-Plex ECL-Assays. Serum-Autoantikörper stellen die Verbindung des Ru-Sulfo-NHS-markierten Antigens mit dem biotinylierten Antigen her, das mit einem spezifischen Linker gekoppelt ist und einen Komplex aus Antigen-Antikörper-Antigen-Linkern bildet. Die Komplexe werden durch jeden spezifischen Linker auf die spezifischen Punkte in der 6-Plex-Platte erfasst. Für jedes Antigen wurden die spezifischen Linkernummern vergeben: GAD-Linker-1, Covid-19-Linker-2, IA-2-Linker-3, tTG-Linker-8, ZnT8-Linker-9 und Proinslulin-Linker-10. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von He et al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vergleich von sechs Antikörperspiegeln in 880 Proben aus der ASK-Studie zwischen dem einzelnen ECL-Assay und dem 6-Plex-ECL-Assay. Die Panels zeigen Vergleiche der Antikörperspiegel für GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA und COVID-19A (Index von COVID-19A wurde als (100 x berechneter Indexwert) dargestellt). Die gestrichelten Linien stellen die Assay-Cutoffs für jeden Antikörper-Assay dar. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von He et al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Vergleich von fünf Antikörperspiegeln in 880 Proben aus der ASK-Studie zwischen der RBA und dem 6-Plex ECL-Assay. Die Panels zeigen Vergleiche der Antikörperspiegel für GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A und TGA. Die gestrichelten Linien stellen die Assay-Cutoffs für jeden Antikörper-Assay dar. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von He et al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Roh-CPS-Zahlen (linke Hälfte der Platte). Rohe CPS-Zählungen, die von der linken Hälfte einer Assay-Platte erfasst wurden. Jede Probe wird in zweifacher Ausfertigung durchgeführt. Jede CPS-Zählung innerhalb derselben Spalte (A1, A2, A3 usw.) stellt die Lesedaten der 10 Punkte in derselben Vertiefung dar (entsprechende Linkernummern sind markiert). Beispiele für fehlerhafte Duplikate sind grau hervorgehoben, wie in Zeile D-Linker 3 Spalte 5 und Spalte 6 zu sehen ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Anordnung der Daten der Tabelle 1, sortiert nach sechs Linkern. CPS-Werte aus Tabelle 1 wurden neu angeordnet, wobei die Mittelwerte für doppelte CPS-Messwerte berechnet und nicht verwendete Werte für Linker 4-7 gelöscht wurden. Die Werte der internen Standardkontrollen für hohe positive, niedrig positive und negative Kontrollen jedes Autoantikörpertests sind dunkel fett markiert. PC, Positivkontrolle. NC, Negativkontrolle. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Ergebnisse der Indexwerte. Die Indexwerte für jede Probe für alle sechs Antikörper wurden gegen die entsprechenden Positiv- und Negativkontrollen berechnet. Ein Indexwert, der größer als der Cutoff-Wert war, wurde als positiv definiert und dunkel fett markiert. Die fehlerhaften doppelten CPS-Werte in Tabelle 1, Zeile D-Linker 3-Spalten 5 und 6, führten zu einem positiven IA-2A-Indexwert der Stichprobe 11 (grau hervorgehoben), was wahrscheinlich ein falsch-positives Ergebnis war. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4: Assay-Cutoff, Sensitivität und Spezifität für GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA und TGA in 880 ASK-Proben, darunter 325 IAbs-positive Proben und 555 negative Antikörperproben. Der optimale Cutoff-Indexwert von GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA und TGA-Assay wurde auf mindestens das 99. Perzentil der 555 normalen Kontrollproben festgelegt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Discussion
Die Intervention für T1D ist in die Prä-T1D-Ära eingetreten, mit laufenden nationalen und internationalen groß angelegten Screening-Programmen für T1D und boomenden klinischen Studien, die in Stadium 1 T1D angewendet werden, um das Fortschreiten zu klinischem T1D12,13 aufzuheben oder zu verlangsamen. Messungen von vier IAbs mit dem aktuellen Standard RBA mit einem einzigen IAb-Assay-Format sind mühsam und ineffizient für ein Massenscreening-Programm. Mit der dringenden Nachfrage nach einem Multiplex-IAbs-Assay mit hohem Durchsatz haben sich der gemultiplexte ECL-Assay, der 3-Screen-ICA-ELISA und der Antikörpernachweis mittels Agglutinations-PCR (ADAP) zu derzeit wettbewerbsfähigen Technologien entwickelt. In der Fr1da-Studie zum Screening auf T1D in einer Population von Kleinkindern in Deutschland wurde der 3-Screen ICA ELISA, der 3 IAbs (GADA, IA-2A und ZnT8A) kombiniert, als Haupttestverwendet 14. Eine wesentliche Einschränkung des 3-Screen-ICA-ELISA ist das Fehlen von IAA, die meist die erste IAb ist, die mit einer hohen Prävalenz bei kleinen Kindern mit T1D auftritt. Darüber hinaus ist der Assay nicht in der Lage zu unterscheiden, welcher der drei IAbs positiv von einem positiven Signal ist, und jede positive Probe muss mit drei einzelnen Assays zur Bestätigung wiederholt werden. ADAP15 kombiniert GADA, IA-2A und IAA und veranschaulichte eine hohe Assay-Sensitivität und Spezifität im IASP-Workshop, aber es fehlen Daten darüber, wie prädiktiv es im populationsbasierten Screening für T1D-Studien ist, was der IASP-Workshop nicht bestimmen kann. Der Multiplex-ECL-Assay in der vorliegenden Studie basiert auf der Plattform eines einzigen ECL-Assays, der in mehreren klinischen Studien wie TrailNet9,16, DAISY17,18,19 und ASK 4,20,21 gegen aktuelle Standard-RBA validiert wurde. studieren. Der vorliegende Assay wurde sowohl gegen den RBA- als auch gegen den einzelnen ECL-Assay unter Verwendung von 880 Serumproben von Teilnehmern der ASK-Studie validiert. Wie in Abbildung 2 und Abbildung 3 gezeigt, waren die Antikörperspiegel zwischen 6-Plex und Single ECL oder zwischen 6-Plex und RBA für die Positivität von Antikörpern meist kongruent miteinander. Die Koinzidenzraten von IAbs, die von RBA und 6-Plex getestet wurden, betrugen 91,7% -97,8% und die Koinzidenzraten von IAbs, die mit Single ECL und 6-Plex getestet wurden, betrugen 95,3% -99,2%. Die Diskrepanz zwischen dem ECL-Assay und der RBA war hauptsächlich von Personen mit einem einzigen IAb herrührend. Die mit 6-Plex und Single ECL getesteten IAbs-Werte (r = 0,6431-0,9434, alle p < 0,0001) und 6-Plex und RBA (r = 0,5775-0,8576, alle p < 0,0001) waren ebenfalls gut korreliert. Die TGA, die mittels 6-Plex-Assay getestet wurden, korrelierten stark mit den Ergebnissen sowohl des RBA- (99,4%) als auch des Single ECL-Assays (99,4%). Darüber hinaus erreichte die von 6-Plex getestete COVID-19A eine Übereinstimmung von 99,8% mit den Ergebnissen des einzelnen ECL-Assays.
Infolgedessen wurde der 6-Plex ECL-Assay offiziell als primäre Screening-Methode für die laufende ASK-Studie akzeptiert und ersetzte den Standard RBA22. Dieser Assay zeigte seine ausgezeichnete Sensitivität und Spezifität mit höherem Durchsatz, niedrigeren Kosten und kleinerem Serumvolumen im Vergleich zu Standard-RBA.
Es wurde dokumentiert, dass in der T1D-Screening-Studie einzelne IAb, die von RBA entdeckt wurden, die einen großen Anteil an IAb-Positivitäten ausmachten, von geringer Affinität waren, mit geringem Krankheitsrisiko und insgesamt zu einem niedrigen prädiktiven Wertführten 19,21,23,24,25,26. Eine solche Vorhersage mit geringem Risiko verursachte enorme zusätzliche Kosten für Folgebesuche und führte zu Schwierigkeiten für T1D-Präventionsstudien. Die etablierte ECL-Assay-Plattform wurde in mehreren klinischen Studien gezeigt, um hochaffine IAbs von niedrigaffinen IAbs zu unterscheiden, die von RBA erzeugt wurden, und die prädiktiven Werte für alle vier IAbs signifikant zu verbessern, insbesondere bei Einzel-IAb-Positivität16,17,18,21 . Die Multiplex-ECL-Assay-Technologie wurde auf der Plattform des Single ECL-Assays aufgebaut, mit diesem entscheidenden Vorteil der Detektion von hochaffinen Abs. In der vorliegenden Studie zeigte der 6-Plex ECL-Assay seine Ähnlichkeit mit den entsprechenden einzelnen ECL-Assays in Sensitivität und Spezifität.
Einige Einschränkungen und die technischen Bedenken des Multiplex-ECL-Assays unter Verwendung mehrerer Plex-Platten wurden bereits in früheren Veröffentlichungenbehandelt 27,28. Mit sechs markierten Antigenen in einer Vertiefung kann es einige Einflüsse zwischen verschiedenen Antigenen geben, und der Assay-Hintergrund könnte zunehmen, wenn jeder Antikörper-Assay zum Multiplexen in derselben Vertiefung hinzugefügt wird. Eine große Menge an Assay-Optimierungsarbeit ist erforderlich, um die Assay-Bedingungen anzupassen, insbesondere für die Anpassung der Endkonzentrationen jedes markierten Antigenproteins basierend auf dem Schachbrett-Assay für jedes Antigen, um die Sensitivität und Spezifität für jeden Antikörper-Assay zu erhalten. Wie in früheren Studien27,28 erwähnt, führt eine kleine Anzahl von Proben (<1%) zu einer falschen Positivität auf der multiplen Plex-Platte ohne einen klaren Grund. Alle positiven Ergebnisse sollten wiederholt und durch einen einzigen ECL-Test als routinemäßige Qualitätssicherung im Labor bestätigt werden; In der Regel werden die Fehlalarme entfernt. Falsch-negative Ergebnisse, die durch den im vorherigen 7-Plex-ECL-Test27,28 beobachteten "Prozoneneffekt" verursacht wurden, wurden in der vorliegenden Studie nicht beobachtet. In dem hier beschriebenen Assay haben wir den Schritt der sauren Behandlung von Serumproben aus dem vorherigen Protokoll entfernt; stattdessen haben wir die Serumproben bei 56 °C für 30 min vorgewärmt (Schritt 5.1.). Am zweiten Tag der Plattenwäsche verwendeten wir einen Waschpuffer mit 0,4 M NaCl (Schritt 8.1.) anstelle eines normalen Waschpuffers, um die Platte strenger zu waschen. Diese Modifikationen machten den Multiplex-ECL-Assay einfacher und reduzierten den Hintergrund, ohne die Assay-Empfindlichkeit zu verlieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Assay eine hervorragende Leistung beim gleichzeitigen Nachweis von vier IAbs, TGA und COVID-19A aufweist. Die Multiplexing-Funktion sowie der hohe Durchsatz, die niedrigen Kosten und der geringe Serumvolumenbedarf machen ein groß angelegtes Screening auf T1D und Begleiterkrankungen in der Allgemeinbevölkerung viel praktikabler. Patienten mit T1D oder anderen Autoimmunerkrankungen haben ein viel höheres Risiko für andere Autoimmunerkrankungen. Der Multiplex-ECL-Assay bietet eine hervorragende Plattform für das gleichzeitige Screening auf T1D und mehrere Autoimmunerkrankungen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Studie wurde durch den JDRF-Zuschuss 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, NIH-Zuschuss DK32083 und den Zuschuss des Diabetes Research Center (DRC) P30 DK116073 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mM NaCl | ThermoFisher | 1070832 | |
| 96-well Plate Shaker | VWR | 12620-926 | |
| 96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
| Biotin | ThermoFisher | PI21329 | |
| Blocker A | MSD | R93AA | |
| Bottle-Top 500 ml-Filter Units | Fisher | 0974064A | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
| GAD65 protein | Diamyd Medical | 10-65702-01 | |
| IA-2 protein (aa 605-979) | Creative BioMart | 283309 | |
| MESO QuickPlex SQ120 | MSD | R31QQ-3 | Electrochemiluminescence analyzer |
| PBS 10x | ThermoFisher | 70011044 | |
| PBS 1x | ThermoFisher | 10010023 | |
| Proinsulin protein | AmideBio | 20160118B3 | |
| Read buffer B | MSD | Y0800019 | |
| SARS-CoV-2 RBD protein | Creative Biomart | Spike-190V | |
| Stop Solution | MSD | Y0090019 | |
| Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
| tTG protein | Diarect AG | 15201 | |
| Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
| U-Plex 6-Assay SECTOR plate | MSD | Z00U0142E | 6-plex plate |
| U-PLEX Linker 1 | MSD | L0010022 | |
| U-PLEX Linker 10 | MSD | L0100020 | |
| U-PLEX Linker 2 | MSD | L0020015 | |
| U-PLEX Linker 3 | MSD | L0030018 | |
| U-PLEX Linker 8 | MSD | L0080018 | |
| U-PLEX Linker 9 | MSD | L0090014 | |
| ZeBa Column | ThermoFisher | 89892 | Spin columns |
| ZnT8 protein | Research Laboratory | n/a |
References
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