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Immunology and Infection

Una detección multiplexada de alto rendimiento para diabetes tipo 1, enfermedades celíacas y COVID-19

Published: July 5, 2022 doi: 10.3791/63787
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1, 1
1Barbara Davis Center for Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Endocrinology, Guangzhou First People’s Hospital, School of Medicine, South China University of Technology
* These authors contributed equally

Summary

En línea con la necesidad urgente de detección de diabetes tipo 1, enfermedad celíaca y enfermedad por coronavirus 2019, desarrollamos un ensayo de electroquimioluminiscencia 6-Plex de alto rendimiento para detectar simultáneamente los cuatro autoanticuerpos de los islotes, los autoanticuerpos de transglutaminasa tisular y los anticuerpos contra el dominio de unión al receptor del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo.

Abstract

Un ensayo clínico en curso, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), es el primer estudio de detección en la población general para la diabetes tipo 1 (DT1) y la enfermedad celíaca en los Estados Unidos. Con la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), se necesita urgentemente la epidemiología de COVID-19 en la población general y el conocimiento sobre la asociación entre la infección por COVID-19 y el desarrollo de DT1. El método de cribado estándar actual del ensayo de unión radioeléctrica (RBA) ha superado dos grandes desafíos: baja eficiencia con un formato de ensayo único y baja especificidad de la enfermedad con una gran proporción de anticuerpos de baja afinidad generados en el cribado. Con la plataforma del ensayo de electroquimioluminiscencia múltiple (ECL) que establecimos anteriormente, se desarrolló un nuevo ensayo ECL 6-Plex que combina, en un solo pocillo, los cuatro autoanticuerpos de islotes (IAbs) contra insulina, ácido glutámico descarboxilasa (GAD65), antígeno de insulinoma 2 (IA-2) y transportador de zinc 8 (ZnT8) para DT1, autoanticuerpos de transglutaminasa (TGA) para la enfermedad celíaca y anticuerpos del dominio de unión al receptor (RBD) del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) para COVID-19. El ensayo se validó en ciego utilizando 880 muestras del estudio ASK, incluidas 325 muestras positivas y 555 muestras negativas para todos los anticuerpos, y se comparó con los RBA estándar y un solo ensayo ECL. Con las ventajas de alta eficiencia, bajo costo y bajo volumen sérico, este ensayo ha sido aceptado como la principal herramienta de detección para el estudio ASK.

Introduction

Grandes estudios epidemiológicos en todo el mundo demuestran que la incidencia de diabetes tipo 1 (DT1) ha aumentado rápidamente en un 3% -5% anual, y la prevalencia de DT1 se ha duplicado en los últimos 20 años, especialmente en niños pequeños 1,2. Los autoanticuerpos de los islotes (IAbs) suelen aparecer años antes que los síntomas clínicos y actualmente son los biomarcadores predictivos y diagnósticos más fiables para la DT13. La detección de autoanticuerpos contra la DT1 puede identificar a las personas en riesgo de progresar a la DT1 clínica, educar al público, reducir en gran medida la complicación potencialmente mortal de la cetoacidosis y beneficiar los ensayos clínicos para las terapias de prevención. Los esfuerzos de prevención en todo el mundo para la DT1 están en marcha y se están llevando a cabo múltiples ensayos de intervención entre sujetos con IAbs positivo para retrasar la progresión a la DT1 clínica, y el Centro Barbara Davis para la Diabetes lanzó el primer ensayo clínico estadounidense de detección en la población general en 2016 para la DT1 y la enfermedad celíaca, Autoimmunity Screening for the Kids (ASK)4 . La enfermedad celíaca (EC) es una enfermedad inflamatoria intestinal crónica relacionada con factores inmunes y genéticos. La prevalencia de EC en niños con DT1 puede alcanzar hasta el 24,5%5. Más de la mitad de los individuos con EC pueden no tener síntomas típicos en la presentación6, por lo que el cribado serológico de la enfermedad celíaca es bastante necesario.

Desde que comenzó la pandemia de enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), se han notificado más de 200 millones de casos en todo el mundo, y los niños representan hasta el 16% de los casos confirmados por laboratorio7. Muchos estudios han demostrado el impacto de la DT1 existente en la gravedad y la mortalidad de la infección por COVID-198, mientras que el impacto de la infección por COVID-19 en el desarrollo de la DT1 no está claro. La investigación de la tasa total de infección por COVID-19 en la población general mediante la determinación de anticuerpos contra el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-COV-2) y el estudio de la asociación entre la infección por COVID-19 y el desencadenamiento de la autoinmunidad contra la DT1 o la aceleración de la progresión de la DT1 son urgentemente necesarios y muy importantes, mientras que el estudio ASK en curso es una excelente plataforma para esto. Debido al formato de ensayo único y a la generación de una gran proporción de positividad de anticuerpos de baja afinidad, el ensayo estándar de unión radioeléctrica (RBA) ha encontrado un cuello de botella de baja eficiencia y baja especificidad de la enfermedad9. En el presente artículo, presentamos un nuevo ensayo de electroquimioluminiscencia 6-plexada (ECL) construido en nuestra plataforma de ensayo ECL multiplex anterior utilizando una placa múltiple-Plex, combinando seis ensayos de autoanticuerpos en un solo pocillo, incluidos los cuatro IAb principales a la insulina (IAA), ácido glutámico descarboxilasa-65 (GADA), antígeno de insulinoma-2 (IA-2A) y transporte de zinc-8 (ZnT8A), autoanticuerpos contra transglutaminasa (TGA) para la enfermedad celíaca, y anticuerpos del dominio de unión al receptor (RBD) del SARS-CoV-2 (COVID-19A). Este es el primer ensayo multiplex que reclutó un panel completo de cuatro IAb principales y combinó esto con TGA y COVID-19A. Ha sido validado y aceptado formalmente como la herramienta de detección primaria que reemplaza el RBA estándar en el estudio ASK.

Protocol

El protocolo de investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional Múltiple de Colorado.

1. Preparación del tampón

  1. Prepare el tampón de etiquetado (2x PBS, pH 7.9): Agregue 100 ml de 10x PBS a 400 ml de agua destilada y ajuste el pH usando NaOH a 7.9.
  2. Hacer 3 mM de biotina y Ru Sulfo-NHS: Disuelva 1 mg de biotina en 588 μL de tampón de etiquetado y disuelva 150 nmol de Ru Sulfo-NHS en 50 μL de tampón de etiquetado.
  3. Preparar el tampón antígeno (BSA al 1%): Disolver 5 g de albúmina sérica bovina (BSA) en 500 mL de 1x PBS.
  4. Prepare el tampón de recubrimiento (3% Bloqueador A): Disuelva 15 g de Bloqueador A en 500 ml de 1x PBS.
  5. Preparar el primer tampón de lavado (0,05 % Tween 20, PBST): Mezclar 2,5 ml de Tween 20 en 5.000 ml de 1x PBS.
  6. Prepare el segundo tampón de lavado (0,4 M NaCl): Mezcle 50 ml de 5 M NaCl en 575 ml de agua destilada para hacer la solución de 0,4 M NaCl.
    NOTA: Para un etiquetado eficiente, siempre use soluciones de biotina recién preparadas y Ru Sulfo-NHS y no almacenadas hechas previamente.

2. Etiquetado de proteínas de antígeno con biotina y Ru Sulfo-NHS por separado

NOTA: Se recomienda una mayor concentración de proteína antígeno ≥0.5 mg / ml para una mayor eficiencia de etiquetado.

  1. Prepare seis soluciones de proteínas de antígeno dirigidas, incluyendo proinsulina, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG y dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína espiga del SARS-CoV-2. Calcular los moles de cada antígeno proteico según su peso molecular y hacer proporciones molares apropiadas de biotina o Ru Sulfo-NHS. La relación entre el antígeno y la suma de biotina o Ru Sulfo-NHS será de 1:5 para antígenos moleculares pequeños (peso molecular ≤10 kd), como la proteína proinsulina. Para antígenos moleculares medios (peso molecular 10-50 kd), como ZnT8, la relación se ajustará a 1:10. Para antígenos de gran peso molecular (peso molecular >50 kd), como GAD, la relación molar será de 1:20.
  2. Divida la proteína antígeno en dos partes iguales y mézclela por separado con biotina y Ru Sulfo-NHS utilizando la relación molar calculada en el paso 2.1. Incubar la mezcla a temperatura ambiente (RT) durante 1,5 h, evitando la luz.
    NOTA: Todos los productos químicos reductores, como el Tris o la glicina, en el tampón de la proteína antígeno, deben eliminarse mediante una columna de espín de tamaño preparada con un tampón de 2x PBS (pH 7.9).
  3. Prepare las columnas de espín con 2x PBS (el tamaño de la columna de espín, 2 ml o 5 ml, depende del volumen de la proteína del antígeno de marcado): agregue 1 ml de tampón PBS 2x a la columna de espín, centrifugarla a 1,000 x g durante 2 min y repita el paso 2 veces más.
  4. Deje que el antígeno proteína-biotina o la mezcla -Ru Sulfo-NHS pase a través de la columna de centrifugado 1x (centrifugar la columna a 1,000 x g durante 2 min) para purificar y detener la reacción de etiquetado.
  5. Mida el volumen final de la proteína de antígeno marcada eluida de las columnas de espín, calculando las concentraciones de proteína de antígeno marcada con biotina o Ru Sulfo-NHS. Hacer alícuotas más pequeñas de proteína antígeno marcada (50 μL/tubo) y almacenarlas a -80 °C para su uso a largo plazo.
    NOTA: La cobertura de proteína después de cada columna de espín será una tasa de retención aproximada del 90% al 95%.

3. Definir la mejor concentración y proporciones para antígenos marcados con biotina y Ru Sulfo-NHS para el ensayo 6-Plex ECL (ensayo de tablero de ajedrez)

NOTA: El ensayo de tablero de ajedrez para cada antígeno es necesario antes de la integración en el ensayo multiplexado.

  1. Aplique el ensayo de tablero de ajedrez para cada antígeno por separado.
    NOTA: Pasos 3.2.-3.7. usará TGA como un breve ejemplo. El proceso de ensayo de tablero de ajedrez TGA es simular el proceso de ensayo pero con un solo tipo de antígeno.
  2. Realice la dilución en serie de la tTG biotinilada y la tTG marcada con Ru Sulfo-NHS. Las concentraciones de trabajo recomendadas de la primera solución de mezcla comienzan a partir de 240 ng / ml para tTG biotinilada y marcada con Ru Sulfo-NHS. Supongamos que las concentraciones de tTG original biotinilado y marcado con Ru Sulfo-NHS son 1.0 μg / μL. Haga una dilución 10x del tTG original marcado con Ru Sulfo-NHS y una dilución 5x del tTG biotinilado original con 5% de BSA.
  3. Mezclar 4 μL de proteína tTG biotinilada con 156 μL de BSA (tampón antígeno) al 5% y 240 μL del enlazador conjugado con estreptavidina en un tubo e incubar la solución en RT durante 30 min. Luego, agregue 160 μL de solución de parada e incube a RT durante otros 30 minutos. Tome 400 μL de la mezcla y mezcle con 2 ml de solución de parada. La concentración del tTG biotinilado en la mezcla es de 240 ng/mL.
  4. Para hacer una dilución seriada para el antígeno ZnT8 marcado con biotina, prepare otros cinco tubos nuevos, tome 1 ml de una alícuota de la mezcla en el paso 3.3. y mezclar con 1 ml de solución de parada en un tubo nuevo, y obtener la mezcla con una concentración de 120 ng / ml. Repita este paso, haga diluciones seriadas 1: 1 y obtenga el tTG marcado con biotina a 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml y 7.5 ng / ml.
  5. Agregue 4 μL de tTG marcado con Ru Sulfo-NHS con 1.6 ml de solución de parada y obtenga una mezcla de tTG marcado con Ru Sulfo-NHS a una concentración de 240 ng / ml. Con los mismos pasos de 3.4., haga diluciones seriadas 1: 1 y obtenga el antígeno ZnT8 marcado con Ru Sulfo-NHS a 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml, 7.5 ng / ml y 3.75 ng / ml. La última concentración es de 0 ng / ml, con solo solución de parada y sin antígeno marcado con Ru Sulfo-NHS.
  6. Preparar muestras de suero de control positivo y control negativo de tTG (precalificadas y estandarizadas por un solo ensayo de tTG ECL) y una placa de PCR de 96 pocillos. Alícuota las muestras de suero control positivo y negativo en la mitad izquierda y mitad derecha de la placa, respectivamente, con 7 μL en cada pocillo. Agregue 1x PBS a la placa, con 33 μL por pocillo.
  7. En la mitad izquierda de la placa de PCR, agregue 24 μL de la solución de enlazador de tTG marcada con biotina diluida en serie a cada pocillo, una columna con una concentración en orden de mayor a menor. De la misma manera, agregue 16 μL del antígeno tTG marcado con Ru Sulfo-NHS diluido en serie a cada pocillo, una fila con una concentración, y luego mezcle bien. Repita el paso en la mitad derecha de la placa de PCR.
  8. Continuar con el resto de los pasos del ensayo descritos en los pasos 5.3.-9.1. hasta que se obtengan los datos brutos de conteo.
  9. Calcule las relaciones entre las señales de control positivo y las señales de control negativo correspondientes. Determine la mejor concentración para el antígeno marcado con biotina y el antígeno marcado con Ru Sulfo-NHS con valores de relación más altos y antecedentes más bajos para la muestra de control negativo. Las concentraciones óptimas de trabajo de biotina y proteína antígeno marcada con Ru Sulfo-NHS se muestran a continuación: 16.0 ng / ml y 8.0 ng / ml para GAD65, 18.8 ng / ml y 9.4 ng / ml para SARS-CoV-2 RBD, 42.0 ng / ml y 42.0 ng / ml para IA-2, 60.0 ng / ml y 60.0 ng / ml para tTG, 4.2 ng / ml y 4.2 ng / ml para ZnT8, y 31,3 ng/ml y 31,3 ng/ml para la proinsulina.

4. Crear una solución de antígeno acoplado al enlazador

  1. Diluir los antígenos marcados con biotina y Ru Sulfo-NHS con BSA al 5% hasta las concentraciones óptimas de trabajo de acuerdo con el paso 3.9.
  2. Unir enlazadores preseleccionados a cada proteína de antígeno biotinilado. Para un ensayo en placa de 96 pocillos, agregue 4 μL de GAD65 biotinilada, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 y proteína antígeno de proinsulina en un tubo separado que contenga 156 μL de BSA al 1% y mezcle con 240 μL de los enlazadores conjugados con estreptavidina correspondientes 1, 2, 3, 8, 9 y 10 (Figura 1). Incubar la mezcla durante 30 min a RT.
  3. Alícuota 160 μL de solución de parada en cada tubo e incubar la mezcla a RT durante 30 min. Saque 400 μL de la solución de mezcla de cada tubo y combínelos.
  4. Agregue 4 μL de Ru Sulfo-NHS marcado con GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 y antígeno de proinsulina a la mezcla anterior, y luego agregue 1.6 ml de solución de parada y 3.2 ml de 1x PBS y mezcle. Ahora la solución de antígeno está lista para su uso en el ensayo.

5. Incubar muestras de suero con el antígeno marcado

  1. Alícuota 7 μL de suero por pocillo para una placa de PCR de 96 pocillos y cubrir con film de sellado. Precaliente el suero a 56 °C durante 30 min en una máquina de PCR. Centrifugar brevemente la placa a 100 x g durante 1 min.
  2. Añadir 63 μL de solución de antígeno (preparada en la etapa 4.4) por pocillo y mezclar con los sueros. Cubra la placa de PCR con una lámina de sellado para evitar la luz.
  3. Agitar la placa en una coctelera a 450 rpm a RT durante 2 h y, a continuación, incubar la placa a 4 °C durante 18-24 h.

6. Prepare la placa 6-Plex

  1. Tome una placa 6-Plex del refrigerador a 4 °C, permitiendo que la placa llegue a RT. Agregue 150 μL de bloqueador A al 3% a cada pocillo de la placa 6-Plex.
  2. Vuelva a colocar el plato en nevera a 4 °C, cubra el plato con papel de aluminio evitando la luz e incube durante la noche.
    NOTA: Los pasos del ensayo en el Día 1 incluyen las secciones 4.-6.

7. Transfiera el suero/antígeno incubado a la placa 6-Plex

  1. Al día siguiente, saque la placa de incubación 6-Plex del refrigerador y retire todo el amortiguador de la placa. Dé palmaditas en el plato sobre toallas de papel para que se seque.
  2. Lave la placa 6-Plex 3x con 150 μL de tampón de lavado por pocillo cada vez. Seque la placa en toallas de papel y el suero/antígeno alícuota se incuba de cada pocillo de la placa de PCR de incubación durante la noche en dos pocillos de la placa 6-Plex (30 μL por pocillo para duplicados).
  3. Cubra el plato con papel de aluminio, luego coloque el plato en un agitador de platos y agite con una velocidad de 450 rpm a RT durante 1 h.

8. Lave la placa 6-Plex y agregue un búfer de lectura

  1. Vierta la solución en la placa 6-Plex y lave la placa 3 veces con 150 μL de tampón de lavado de NaCl 0,4 M por pocillo cada vez.
  2. Después de completar el tercer lavado, seque la placa contra la toalla de papel y agregue 150 μL de tampón de lectura en cada pocillo.
    NOTA: Las burbujas de aire en el pozo afectan la precisión de la máquina lectora de placas y deben evitarse a toda costa.

9. Lee la placa y analiza los datos

  1. Cuente la placa en un analizador de electroquimioluminiscencia. Los resultados de la lectura se presentarán con los valores en recuentos por segundo (CPS). Calcular el índice de anticuerpos relativo de cada muestra utilizando el CPS bruto obtenido de la máquina lectora contra el CPS de los controles positivos y negativos estándar internos de cada anticuerpo específico (Valor del índice = [CPS (muestra) - CPS (estándar negativo)] / [CPS (estándar positivo) - CPS (estándar negativo)]).
  2. Determinar los resultados negativos o positivos de anticuerpos utilizando los valores de corte que se han establecido en los percentiles 99.5a 99.8 de 555 muestras de control negativo del estudio ASK (todas las muestras negativasde anticuerpos sin antecedentes o antecedentes familiares de diabetes o cualquier otro tipo de enfermedad autoinmune).
    NOTA: Los pasos del ensayo en el Día 2 incluyen las secciones 7-9.

Representative Results

La Tabla 1, la Tabla 2 y la Tabla 3 ilustran los resultados representativos. Los CPS brutos obtenidos de la máquina lectora se ilustran en la Tabla 1. En la Tabla 2, los CPS crudos fueron ordenados y ordenados por los seis enlazadores y los anticuerpos correspondientes. La Tabla 3 muestra los valores índice calculados con CPS como se describe en el protocolo de ensayo. Todos los valores de recuento bruto deben verificarse para evitar resultados de índice finales incorrectos causados por duplicados incorrectos. En la Tabla 1, se dan ejemplos de duplicados incorrectos, que resultaron en un error para el cálculo final del índice en la Tabla 3.

Este ensayo se validó de manera ciega utilizando 880 muestras seleccionadas del estudio ASK con 325 muestras positivas de IAbs y 555 muestras negativas de ABS. Los niveles de autoanticuerpos del ensayo ECL 6-Plex para las 880 muestras se compararon punto por punto con los niveles de los ensayos ECL únicos correspondientes (Figura 2) y con el RBA estándar único correspondiente (Figura 3). El punto de corte, la sensibilidad y la especificidad para cada anticuerpo se enumeran en la Tabla 4. La sensibilidad y la especificidad de este ensayo ECL-COVID-19A se han identificado como 100% y 99.9%, respectivamente10.

Figure 1
Figura 1: Ilustración del ensayo ECL de 6 plex . Los autoanticuerpos séricos hacen la conexión del antígeno marcado con Ru Sulfo-NHS al antígeno biotinilado, que se acopla con un ligador específico y forma un complejo de antígeno-anticuerpo-antigen-enlazador. Los complejos se capturan a través de cada enlazador específico en los puntos específicos de la placa 6-Plex. Para cada antígeno, se asignaron los números de enlazador específicos: GAD-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9 y Proinslulin-linker-10. Esta cifra ha sido modificada con permiso de He et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Comparación de seis niveles de anticuerpos en 880 muestras del estudio ASK entre el ensayo ECL único y el ensayo ECL 6-Plex. Los paneles muestran comparaciones de los niveles de anticuerpos para GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA y COVID-19A, respectivamente (el índice de COVID-19A se presentó como (100 x valor de índice calculado)). Las líneas punteadas representan los puntos de corte del ensayo para cada ensayo de anticuerpos. Esta cifra ha sido modificada con permiso de He et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Comparación de cinco niveles de anticuerpos en 880 muestras del estudio ASK entre el RBA y el ensayo 6-Plex ECL. Los paneles muestran comparaciones de los niveles de anticuerpos para GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A y TGA, respectivamente. Las líneas punteadas representan los puntos de corte del ensayo para cada ensayo de anticuerpos. Esta cifra ha sido modificada con permiso de He et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Recuentos de CPS brutos (mitad izquierda de la placa). Recuentos de CPS brutos adquiridos de la mitad izquierda de una placa de ensayo. Cada muestra se realiza por duplicado. Cada recuento de CPS dentro de la misma columna (A1, A2, A3, etc.) representa los datos de lectura de los 10 puntos en el mismo pozo (se marcan los números de enlace correspondientes). Los ejemplos de duplicados incorrectos se resaltan en gris, como se ve en la fila D-linker 3 columna 5 y columna 6. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Disposición de los datos de la Tabla 1, ordenados con seis enlazadores. Los valores de CPS de la Tabla 1 se reorganizaron, calculando los valores medios para lecturas duplicadas de CPS y eliminando los valores no utilizados para los enlazadores 4-7. Los valores de los controles estándar internos alto positivo, bajo positivo y negativo de cada ensayo de autoanticuerpos están marcados en negrita oscura. PC, control positivo. NC: control negativo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Resultados de los valores del índice. Los valores índice para cada muestra para los seis anticuerpos se calcularon contra los controles positivos y negativos correspondientes. Un valor de índice mayor que el valor de corte se definió como positivo, marcado en negrita oscura. Los valores duplicados incorrectos de CPS en la Tabla 1, fila D-linker 3-columnas 5 y 6, llevaron a un valor positivo del índice IA-2A de la muestra 11 (resaltado en gris), que probablemente fue un resultado falso positivo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Corte de ensayo, sensibilidad y especificidad para GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA y TGA entre 880 muestras de ASK, incluidas 325 muestras positivas de IAbs y 555 muestras negativas de todos los anticuerpos. El valor óptimo del índice de corte del ensayo GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA y TGA se estableció en al menos el percentil 99 de las 555 muestras de control normales. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

La intervención para la DT1 ha entrado en la era pre-DT1, con programas de detección a gran escala nacionales e internacionales en curso para la DT1 y ensayos clínicos en auge que se aplican en la etapa 1 de la DT1 para abrogar o retrasar la progresión a la DT1 clínica12,13. Las mediciones de cuatro BAI utilizando el RBA estándar actual con un solo formato de ensayo IAb son laboriosas e ineficientes para un programa de detección masiva. Con la demanda urgente de un ensayo IAbs multiplexado de alto rendimiento, el ensayo ECL multiplexado, ICA ELISA de 3 pantallas y la detección de anticuerpos por aglutinación-PCR (ADAP) han surgido como tecnologías actualmente competitivas. En el estudio Fr1da de detección de DT1 en una población de niños pequeños en Alemania, se utilizó ICA ELISA de 3 pantallas que combina 3 BAI (GADA, IA-2A y ZnT8A) como prueba principal14. Una limitación importante del ELISA ICA de 3 pantallas es la falta de IAA, que es principalmente la primera IAb que aparece con una alta prevalencia en niños pequeños con DT1. Además, el ensayo no es capaz de distinguir cuál de los tres IAb es positivo de una señal positiva, y cada muestra positiva debe repetirse con tres ensayos individuales para su confirmación. ADAP15 combina GADA, IA-2A e IAA e ilustró la alta sensibilidad y especificidad del ensayo en el taller de IASP, pero carece de datos sobre cuán predictivo es en la detección poblacional para estudios de DT1, que el taller de IASP no puede determinar. El ensayo ECL multiplex en el presente estudio se basa en la plataforma de un único ensayo ECL que ha sido validado contra el RBA estándar actual en múltiples ensayos clínicos como TrailNet9,16, DAISY17,18,19 y ASK 4,20,21 estudiar. El presente ensayo ha sido validado contra el ensayo RBA y ECL único utilizando 880 muestras de suero de participantes del estudio ASK. Como se muestra en la Figura 2 y la Figura 3, los niveles de anticuerpos entre 6-Plex y ECL simple o entre 6-Plex y RBA fueron en su mayoría congruentes entre sí para la positividad de los anticuerpos. Las tasas de coincidencia de IAbs probados por RBA y 6-Plex fueron 91.7% -97.8%, y las tasas de coincidencia de IAbs probados por ECL único y 6-Plex fueron 95.3% -99.2%. La discordancia entre el ensayo ECL y el RBA se debió principalmente a aquellos con IAb único. Los niveles de IAbs probados por 6-Plex y ECL simple (r = 0.6431-0.9434, todos p < 0.0001) y 6-Plex y RBA (r = 0.5775-0.8576, todos p < 0.0001) también estaban bien correlacionados. La TGA probada por el ensayo 6-Plex se correlacionó altamente con los resultados tanto del ensayo RBA (99,4%) como del ensayo ECL único (99,4%). Además, COVID-19A probado por 6-Plex alcanzó el 99.8% de cumplimiento con los resultados del ensayo ECL único.

Como resultado, el ensayo ECL 6-Plex ha sido aceptado formalmente como el método de detección primario para el estudio ASK en curso y reemplazó al RBA22 estándar. Este ensayo demostró su excelente sensibilidad y especificidad con un mayor rendimiento, menor costo y menor volumen de suero en comparación con el RBA estándar.

Se ha documentado que, en el estudio de cribado de DT1, la IAb única detectada por el RBA, que ocupó una gran proporción de las positividad de la IAb, fue de baja afinidad, con bajo riesgo de enfermedad y dio lugar a un valor predictivo global bajo 19,21,23,24,25,26. Tal predicción de bajo riesgo causó enormes costos adicionales de las visitas de seguimiento y dio lugar a dificultades para los estudios preventivos de DT1. La plataforma de ensayo ECL establecida se ha demostrado en múltiples ensayos clínicos para discriminar IAbs de alta afinidad de IAbs de baja afinidad generados por RBA y mejorar significativamente los valores predictivos para los cuatro IAbs, especialmente con positividad IAb única16,17,18,21 . La tecnología de ensayo ECL multiplex se construyó sobre la plataforma del ensayo ECL único, con esta clara ventaja de la detección de Abs de alta afinidad. En el presente estudio, el ensayo ECL 6-Plex ilustró su similitud con los ensayos ECL únicos correspondientes en sensibilidad y especificidad.

Algunas limitaciones y las preocupaciones técnicas del ensayo ECL multiplex utilizando múltiples placas Plex ya han sido cubiertas en publicaciones anteriores27,28. Con seis antígenos marcados en un pocillo, puede haber algunas influencias entre diferentes antígenos, y el fondo del ensayo podría aumentar al agregar cada ensayo de anticuerpos para la multiplexación en el mismo pocillo. Se necesita una gran cantidad de trabajo de optimización del ensayo para ajustar las condiciones del ensayo, especialmente para ajustar las concentraciones finales de cada proteína de antígeno marcada en función del ensayo de tablero de ajedrez para cada antígeno, para mantener la sensibilidad y la especificidad de cada ensayo de anticuerpos. Como se mencionó en estudios previos27,28, un pequeño número de muestras (<1%) resulta en una falsa positividad en la placa múltiple de Plex sin una razón subyacente clara. Todos los resultados positivos deben repetirse y confirmarse mediante un único ensayo ECL como garantía de calidad rutinaria de laboratorio; Por lo general, se eliminarán los falsos positivos. Los resultados falsos negativos causados por el "efecto prozona" observado en el ensayo anterior 7-Plex ECL27,28 no se observaron en el presente estudio. En el ensayo descrito aquí, eliminamos el paso del tratamiento ácido de muestras de suero del protocolo anterior; en su lugar, precalentamos las muestras de suero a 56 °C durante 30 min (paso 5.1.). En el segundo día de lavado de la placa, utilizamos un tampón de lavado que contenía 0,4 M de NaCl (paso 8.1.) en lugar de un tampón de lavado regular para lavar la placa de manera más estricta. Estas modificaciones hicieron que el ensayo ECL multiplex fuera más simple y con un fondo más bajo sin perder la sensibilidad del ensayo.

En conclusión, este ensayo tiene un rendimiento sobresaliente para detectar cuatro IAbs, TGA y COVID-19A simultáneamente. La función de multiplexación, así como el alto rendimiento, el bajo costo y el pequeño requerimiento de volumen sérico, hacen que la detección a gran escala de DT1 y enfermedades concomitantes sea mucho más factible en la población general. Los pacientes con DT1 o cualquier enfermedad autoinmune tienen un riesgo mucho mayor de otras enfermedades autoinmunes. El ensayo ECL multiplex proporciona una excelente plataforma para detectar DT1 y múltiples enfermedades autoinmunes simultáneamente.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El estudio fue apoyado por la subvención JDRF 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, la subvención DK32083 de los NIH y la subvención P30 DK116073 del Centro de Investigación de la Diabetes (DRC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mM NaCl ThermoFisher 1070832
96-well Plate Shaker VWR 12620-926
96-well round bottom plate Fisher 8408220
Biotin ThermoFisher PI21329
Blocker A MSD R93AA
Bottle-Top 500 ml-Filter Units Fisher 0974064A
Bovine Serum Albumin Sigma A-7906
GAD65 protein Diamyd Medical 10-65702-01
IA-2 protein (aa 605-979) Creative BioMart 283309
MESO QuickPlex SQ120 MSD R31QQ-3 Electrochemiluminescence analyzer
PBS 10x ThermoFisher 70011044
PBS 1x ThermoFisher 10010023
Proinsulin protein AmideBio 20160118B3
Read buffer B MSD Y0800019
SARS-CoV-2 RBD protein Creative Biomart Spike-190V
Stop Solution MSD Y0090019
Sulfo-TAG MSD R91AO-1
tTG protein Diarect AG 15201
Tween 20 Sigma P-1379
U-Plex 6-Assay SECTOR plate MSD Z00U0142E 6-plex plate
U-PLEX Linker 1 MSD L0010022
U-PLEX Linker 10 MSD L0100020
U-PLEX Linker 2 MSD L0020015
U-PLEX Linker 3 MSD L0030018
U-PLEX Linker 8 MSD L0080018
U-PLEX Linker 9 MSD L0090014
ZeBa Column ThermoFisher 89892 Spin columns
ZnT8 protein Research Laboratory n/a

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References

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Inmunología e infección Número 185 Ensayo de electroquimioluminiscencia ensayo de autoanticuerpos múltiples diabetes tipo 1 enfermedad autoinmune COVID-19 detección predicción
Una detección multiplexada de alto rendimiento para diabetes tipo 1, enfermedades celíacas y COVID-19
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Jia, X., He, L., Miao, D., Zhang,… More

Jia, X., He, L., Miao, D., Zhang, C., Rewers, M., Yu, L. A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19. J. Vis. Exp. (185), e63787, doi:10.3791/63787 (2022).

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