Summary
제1형 당뇨병, 체강 질병 및 코로나바이러스 질병 2019에 대한 스크리닝의 시급한 필요성에 따라 당사는 4개의 췌도 자가항체, 조직 트랜스글루타미나제 자가항체 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2의 수용체 결합 도메인에 대한 항체를 동시에 검출하기 위해 고처리량 6-Plex 전기화학 발광 분석을 개발했습니다.
Abstract
진행중인 임상 시험 인 어린이의자가 면역 검사 (ASK)는 미국에서 제 1 형 당뇨병 (T1D) 및 체강 질병에 대한 일반 인구를 대상으로 한 최초의 선별 연구입니다. 코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19) 대유행으로 일반 인구의 COVID-19 역학과 COVID-19 감염과 T1D 발달 간의 연관성에 대한 지식이 시급히 필요합니다. 방사성 결합 분석법(RBA)의 현재 표준 스크리닝 방법은 단일 분석 형식의 낮은 효율성과 스크리닝에서 생성되는 저친화성 항체의 비율이 높은 낮은 질병 특이도라는 두 가지 큰 과제를 해결했습니다. 이전에 구축한 멀티플렉스 전기화학발광(ECL) 분석의 플랫폼을 통해 단일 웰에서 인슐린에 대한 4개의 췌도 자가항체(IAbs), T1D에 대한 글루탐산 탈탄산효소(GAD65), 인슐린종 항원 2(IA-2) 및 아연 수송체 8(ZnT8), 체강 질병에 대한 트랜스글루타미나제 자가항체(TGA) 및 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 수용체 결합 도메인(RBD) 항체에 대한 항체를 결합하는 새로운 6-Plex ECL 분석법이 개발되었습니다. 코비드-19. 분석은 325개의 양성 샘플과 555개의 모든 항체 음성 샘플을 포함하여 ASK 연구의 880개 샘플을 사용하여 맹검에서 검증되었으며 표준 RBA 및 단일 ECL 분석과 비교되었습니다. 고효율, 저비용 및 낮은 혈청 부피의 장점으로 이 분석은 ASK 연구의 주요 스크리닝 도구로 채택되었습니다.
Introduction
전 세계적으로 대규모 역학 연구에 따르면 제1형 당뇨병(T1D)의 발병률은 매년 3%-5%씩 빠르게 증가하고 있으며 T1D의 유병률은 지난 20년 동안 특히어린 아이들에게서 두 배로 증가했습니다1,2. 췌도 자가항체 (IAbs)는 일반적으로 임상 증상이 나타나기 몇 년 전에 나타나며 현재 T1D3에 대한 가장 신뢰할 수 있는 예측 및 진단 바이오마커입니다. T1D 자가항체 스크리닝은 임상 T1D로 진행될 위험이 있는 사람들을 식별하고, 대중을 교육하고, 케톤산증의 생명을 위협하는 합병증을 크게 줄이고, 예방 요법을 위한 임상 시험에 도움이 될 수 있습니다. 전 세계적으로 T1D 예방 노력이 진행 중이며 임상 T1D로의 진행을 지연시키기 위해 IAbs 양성인 피험자를 대상으로 여러 중재적 시험이 수행되고 있으며, 바바라 데이비스 당뇨병 센터는 2016년 T1D 및 체강 질병에 대한 일반 인구를 대상으로 선별 검사에 대한 미국 최초의 임상 시험을 시작했습니다., 어린이를 위한 자가면역 검사(ASK)4 . 체강 질병 (CD)은 면역 및 유전 적 요인과 관련된 만성 장 염증성 질환입니다. T1D 소아에서 CD의 유병률은 최대 24.5%5에 달할 수 있습니다. CD를 가진 개인의 절반 이상이 발표6에서 전형적인 증상을 나타내지 않을 수 있으므로 체강 질병에 대한 혈청 검사가 매우 필요합니다.
코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)의 대유행이 시작된 이후 전 세계적으로 2억 건 이상의 사례가 보고되었으며 어린이는 실험실확인 사례의 최대 16%를 차지합니다7. 많은 연구에서 기존 T1D가 COVID-19감염의 중증도 및 치사율에 미치는 영향을 입증했지만 8, COVID-19 감염이 T1D 발달에 미치는 영향은 명확하지 않습니다. 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-COV-2) 항체의 결정에 의한 일반 인구의 COVID-19 감염률 조사와 COVID-19 감염과 T1D 자가면역 유발 또는 T1D 진행 가속화 사이의 연관성에 대한 연구는 시급히 필요하고 매우 중요하며, 진행 중인 ASK 연구는 이를 위한 훌륭한 플랫폼입니다. 단일 분석 형식과 많은 비율의 저친화성 항체 양성 생성으로 인해 표준 방사선 결합 분석(RBA)은 낮은 효율 및 낮은 질병특이성의 병목 현상을 충족했습니다9. 본 논문에서는 다중 플렉스 플레이트를 사용하는 이전 멀티플렉스 ECL 분석 플랫폼에 구축된 새로운 6-Plexed 전기화학발광(ECL) 분석을 제시하며, 인슐린(IAA), 글루탐산 디카복실라제-65(GADA), 인슐린종 항원-2(IA-2A) 및 아연 수송-8(ZnT8A), 체강 질병에 대한 트랜스글루타미나제(TGA)에 대한 자가항체, 트랜스글루타미나제(TGA)에 대한 자가항체, 및 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 (RBD) 항체 (COVID-19A). 이것은 4개의 주요 IAb로 구성된 완전한 패널을 모집하고 이를 TGA 및 COVID-19A와 추가로 결합한 최초의 멀티플렉스 분석입니다. ASK 연구에서 표준 RBA를 대체하는 기본 스크리닝 도구로 검증되고 공식적으로 승인되었습니다.
Protocol
연구 프로토콜은 콜로라도 다중 기관 검토위원회의 승인을 받았습니다.
1. 완충액 준비
- 400 mL의 증류수에 10x PBS 100 mL를 첨가하고 NaOH를 사용하여 pH를 7.9로 조정하여 표지 완충액(2x PBS, pH 7.9)을 준비한다.
- 3mM의 비오틴과 Ru 설포-NHS 만들기: 1μL의 라벨링 버퍼에 588mg의 비오틴을 녹이고 50μL의 라벨링 버퍼에 150nmol의 Ru 설포-NHS를 녹입니다.
- 항원 완충액(1% BSA)을 준비합니다: 5g의 소 혈청 알부민(BSA)을 500mL의 1x PBS에 녹입니다.
- 코팅 완충액 (3% 차단제 A)을 준비합니다: 15g의 차단제 A를 500mL의 1x PBS에 녹입니다.
- 첫 번째 세척 완충액(0.05% 트윈 20, PBST)을 준비한다: 5,000mL의 1x PBS에 2.5mL의 트윈 20을 혼합한다.
- 두 번째 세척액(0.4 M NaCl)을 준비한다: 575 mL의 증류수에 5 M NaCl 50 mL를 혼합하여 0.4 M NaCl 용액을 만든다.
알림: 효율적인 라벨링을 위해 항상 새로 준비된 비오틴 및 Ru Sulfo-NHS 용액을 사용하고 이전에 만든 용액을 보관하지 마십시오.
2. 비오틴과 Ru 설포-NHS를 별도로 사용한 항원 단백질 표지
참고: 더 높은 라벨링 효율을 위해 더 높은 농도의 항원 단백질 ≥0.5mg/mL가 권장됩니다.
- 프로인슐린, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG 및 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함한 6가지 표적 항원 단백질 용액을 준비합니다. 분자량에 따라 각 항원 단백질의 몰을 계산하고 비오틴 또는 Ru Sulfo-NHS의 적절한 몰비를 만드십시오. 비오틴 또는 Ru Sulfo-NHS의 합에 대한 항원의 비율은 프로 인슐린 단백질과 같은 소분자 항원 (분자량 ≤10kd)의 경우 1 : 5입니다. ZnT8과 같은 중간 분자 항원 (분자량 10-50 kd)의 경우 비율은 1:10으로 조정됩니다. GAD와 같은 큰 분자량 항원 (분자량 >50 kd)의 경우 몰비는 1:20입니다.
- 항원 단백질을 두 개의 동일한 부분으로 나누고 단계 2.1에서 계산 된 몰비를 사용하여 비오틴 및 Ru Sulfo-NHS와 별도로 혼합합니다. 혼합물을 실온(RT)에서 1.5시간 동안 배양하여 빛을 피합니다.
참고: 항원 단백질의 완충액에 있는 트리스 또는 글리신과 같은 모든 환원 화학물질은 2x PBS(pH 7.9)의 완충액으로 프라이밍된 사이징 스핀 컬럼에 의해 제거되어야 합니다. - 스핀 컬럼을 2x PBS로 프라이밍합니다(스핀 컬럼의 크기, 2mL 또는 5mL는 표지 항원 단백질의 부피에 따라 다름): 스핀 컬럼에 2x PBS 버퍼 1ml를 추가하고 1,000x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 단계를 2배 더 반복합니다.
- 항원 단백질-비오틴 또는 -Ru 설포-NHS 혼합물을 프라이밍된 스핀 컬럼 1x(컬럼을 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리)를 통과시켜 정제하고 표지 반응을 중지합니다.
- 스핀 컬럼으로부터 용출된 표지된 항원 단백질의 최종 부피를 측정하여, 비오틴- 또는 Ru Sulfo-NHS-표지된 항원 단백질의 농도를 계산한다. 표지된 항원 단백질(50μL/튜브)의 더 작은 분취량을 만들고 장기간 사용을 위해 -80°C에서 보관하십시오.
참고: 각 스핀 컬럼 이후의 단백질 커버리지는 대략 90%-95%의 유지율입니다.
3. 6-Plex ECL 분석(바둑판 분석)을 위한 비오틴 및 Ru 설포-NHS 표지 항원에 대한 최상의 농도 및 비율 정의
참고: 각 항원에 대한 바둑판 분석은 다중 분석에 통합되기 전에 필요합니다.
- 각 항원에 대해 개별적으로 바둑판 분석을 적용하십시오.
참고: 단계 3.2.-3.7. TGA를 간단한 예로 사용합니다. TGA 바둑판 분석 프로세스는 분석 프로세스를 시뮬레이션하는 것이지만 한 종류의 항원만 사용합니다. - 비오티닐화된 tTG 및 Ru설포-NHS 표지된 tTG의 연속 희석을 확인한다. 첫 번째 혼합물 용액의 권장 작업 농도는 비오티닐화 및 Ru 설포-NHS 표지 tTG 모두에 대해 240ng/mL부터 시작합니다. 원래 비오티닐화 및 Ru 설포-NHS 표지 tTG의 농도가 모두 1.0μg/μL라고 가정합니다. 원래 Ru 설포-NHS 표지 tTG를 10배 희석하고 원래 비오티닐화된 tTG를 5% BSA로 5배 희석합니다.
- 4μL의 비오틴화 tTG 단백질과 156μL의 5% BSA(항원 완충액) 및 240μL의 스트렙타비딘 접합 링커를 하나의 튜브에 혼합하고 RT에서 30분 동안 용액을 배양합니다. 그런 다음 160μL의 정지 용액을 추가하고 RT에서 30분 더 배양합니다. 혼합물 400μL를 취해 정지용액 2mL와 혼합한다. 혼합물에서 비오틴화 tTG의 농도는 240 ng/mL입니다.
- 비오틴 표지 된 ZnT8 항원에 대한 연속 희석을 위해 5 개의 새로운 튜브를 추가로 준비하고 3.3 단계에서 혼합물에서 분취량 1mL를 취하십시오. 새 튜브에 정지 용액 1mL와 혼합하고 120ng/mL 농도의 혼합물을 얻습니다. 이 단계를 반복하고 연속 1:1 희석을 한 다음 60ng/mL, 30ng/mL, 15ng/mL 및 7.5ng/mL에서 비오틴 표지 tTG를 얻습니다.
- 4 μL의 Ru 설포 -NHS 표지 tTG를 1.6 mL의 정지 용액과 함께 첨가하고 240 ng / mL의 농도에서 Ru 설포 -NHS 표지 tTG의 혼합물을 얻습니다. 3.4.의 동일한 단계로 직렬 1 : 1 희석을하고 8 ng / mL, 60 ng / mL, 30 ng / mL, 15 ng / mL, 7.5 ng / mL 및 3.75 ng / mL에서 Ru 설포 -NHS 표지 ZnT3.75 항원을 얻습니다. 마지막 농도는 0ng / mL이며 정지 용액 만 있고 Ru Sulfo-NHS 표지 항원은 없습니다.
- tTG 양성 대조군 및 음성 대조군 혈청 샘플(단일 ECL tTG 분석으로 사전 검증 및 표준화)과 96웰 PCR 플레이트를 준비합니다. 양성 및 음성 대조군 혈청 샘플을 플레이트의 왼쪽 절반 및 오른쪽 절반에 각각 분취하고, 각 웰에 7 μL를 가한다. 웰당 33μL의 플레이트에 1x PBS를 추가합니다.
- PCR 플레이트의 왼쪽 절반에 연속 희석된 비오틴 표지 tTG-링커 용액 24μL를 각 웰에 추가하고 한 컬럼을 가장 높은 농도에서 가장 낮은 농도로 추가합니다. 같은 방법으로 연속 희석 된 Ru Sulfo-NHS 표지 된 tTG 항원 16μL를 각 웰에 첨가하고 한 줄에 한 농도로 한 줄을 넣은 다음 완전히 혼합합니다. PCR 플레이트의 오른쪽 절반에서 단계를 반복합니다.
- 5.3.-9.1단계에 설명된 나머지 분석 단계를 계속합니다. 원시 계수 데이터를 얻을 때까지.
- 포지티브 제어 신호와 해당 네거티브 제어 신호의 비율을 계산합니다. 음성 대조군 샘플에 대해 더 높은 비율 값과 더 낮은 배경을 가진 비오틴 표지 항원 및 Ru Sulfo-NHS 표지 항원에 대한 최상의 농도를 결정하십시오. 비오틴 및 Ru Sulfo-NHS 표지 항원 단백질의 최적 작업 농도는 다음과 같습니다 : GAD65의 경우 16.0 ng / mL 및 8.0 ng / mL, SARS-CoV-2 RBD의 경우 18.8 ng / mL 및 9.4 ng / mL, IA-42.0의 경우 42.0 ng / mL 및 42.0 ng / mL, tTG의 경우 60.0 ng / mL 및 60.0 ng / mL, ZnT8의 경우 4.2 ng / mL 및 4.2 ng / mL, 프로 인슐린의 경우 31.3 ng / mL 및 31.3 ng / mL입니다.
4. 링커 결합 항원 용액 생성
- 비오틴- 및 Ru 설포-NHS-표지된 항원을 단계 3.9에 따라 최적의 작업 농도로 5% BSA로 희석한다.
- 미리 선택된 링커를 각 비오틴화 항원 단백질에 결합시킵니다. 하나의 96웰 플레이트 분석의 경우 4μL의 비오티닐화 GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 및 프로인슐린 항원 단백질을 1% BSA 156μL가 포함된 별도의 튜브에 추가하고 240μL의 해당 스트렙타비딘 접합 링커 1, 2, 3, 8, 9 및 10과 혼합합니다(그림 1). 혼합물을 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 각 튜브에 정지 용액 160 μL를 분취하고, 혼합물을 RT에서 30분 동안 인큐베이션한다. 각 튜브에서 400μL의 혼합 용액을 꺼내 함께 결합합니다.
- 위의 혼합물에 4μL의 Ru 설포-NHS 표지 GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 및 프로인슐린 항원을 추가한 다음 정지 용액 1.6mL와 1x PBS 3.2mL를 추가하고 혼합합니다. 이제 항원 용액을 분석에 사용할 준비가되었습니다.
5. 표지된 항원으로 혈청 샘플 배양
- 96-웰 PCR 플레이트에 대해 웰당 혈청 7μL를 분취하고, 밀봉 필름으로 덮는다. PCR 기계에서 혈청을 56°C에서 30분 동안 예열합니다. 플레이트를 100 x g 에서 1분 동안 간단히 원심분리합니다.
- 웰당 63 μL의 항원 용액(단계 4.4에서 제조됨)을 첨가하고, 혈청과 혼합한다. 빛을 피하기 위해 PCR 플레이트를 밀봉 호일로 덮으십시오.
- 플레이트를 셰이커 상에서 RT에서 450rpm으로 2시간 동안 흔든 다음, 플레이트를 4°C에서 18-24시간 동안 배양한다.
6. 6-플렉스 플레이트 준비
- 4°C 냉장고에서 6-Plex 플레이트를 꺼내 플레이트가 RT가 되도록 합니다. 150-Plex 플레이트의 각 웰에 3% 차단제 A 6μL를 추가합니다.
- 접시를 4°C 냉장고에 다시 넣고 빛을 피하면서 호일로 접시를 덮고 밤새 배양합니다.
참고: 1일차의 분석 단계에는 섹션 4.-6이 포함됩니다.
7. 혈청/항원 배양물을 6-Plex 플레이트로 옮깁니다.
- 다음날, 냉장고에서 배양 6-Plex 플레이트를 꺼내 플레이트에서 모든 버퍼를 버립니다. 접시를 종이 타월에 두드려 말리십시오.
- 매번 웰당 150μL의 세척 완충액으로 6-Plex 플레이트를 3회 세척합니다. 플레이트를 종이 타월로 건조시키고, 분취량 혈청/항원을 밤새 인큐베이션 PCR 플레이트의 각 웰로부터 6-Plex 플레이트의 2개의 웰(중복의 경우 웰당 30μL)로 인큐베이션한다.
- 플레이트를 호일로 덮은 다음 플레이트를 플레이트 셰이커에 놓고 RT에서 450rpm의 속도로 1시간 동안 흔듭니다.
8. 6-Plex 플레이트를 세척하고 판독 버퍼를 추가합니다.
- 용액을 6-Plex 플레이트에 버리고 매번 웰당 150μL의 0.4M NaCl 세척 완충액으로 플레이트를 3x 세척합니다.
- 세 번째 세척이 완료된 후 종이 타월로 플레이트를 말리고 각 웰에 150μL의 판독 버퍼를 추가합니다.
알림: 우물의 기포는 플레이트 리더 기계의 정확도에 영향을 미치므로 어떤 대가를 치르더라도 피해야 합니다.
9. 플레이트를 읽고 데이터를 분석하십시오.
- 전기화학발광 분석기에서 플레이트를 계수합니다. 판독 결과는 초당 카운트 (CPS) 값으로 표시됩니다. 각 특정 항체의 내부 표준 양성 및 음성 대조군의 CPS에 대해 판독기에서 얻은 원시 CPS를 사용하여 각 샘플의 상대 항체 지수를 계산합니다(인덱스 값 = [CPS(샘플) - CPS(음성 표준)] / [CPS(양성 표준) - CPS(음성 표준)]).
- ASK 연구에서 555 개의 음성 대조군 샘플의 99.5번째 에서 99.8번째 백분위 수에서 확립 된 컷오프 값을 사용하여 음성 또는 양성 항체 결과를 결정합니다 (당뇨병 또는 다른 유형의자가 면역 질환의 병력 또는 가족력이없는 모든 항체 음성 샘플).
참고: 2일차의 분석 단계에는 섹션 7-9가 포함됩니다.
Representative Results
표 1, 표 2, 및 표 3은 대표적인 결과를 예시한다. 판독기에서 얻은 원시 CPS는 표 1에 나와 있습니다. 표 2에서, 원시 CPS를 6개의 링커 및 상응하는 항체에 의해 배열하고 분류하였다. 표 3은 분석 프로토콜에 기재된 바와 같이 CPS로 계산된 인덱스 값을 나타낸다. 잘못된 중복으로 인한 잘못된 최종 인덱스 결과를 피하기 위해 모든 원시 계수 값을 확인해야 합니다. 표 1에는 불량 중복의 예가 나와 있으며, 이로 인해 표 3의 최종 인덱스 계산에 오류가 발생했습니다.
이 분석은 325개의 IAbs 양성 샘플과 555개의 모든 Abs 음성 샘플이 있는 ASK 연구에서 선택된 880개의 샘플을 사용하여 맹검 방식으로 검증되었습니다. 880개 샘플에 대한 6-Plex ECL 분석의 자가항체 수준을 해당 단일 ECL 분석(그림 2) 및 해당 단일 표준 RBA(그림 3)의 수준과 점별로 비교했습니다. 각 항체에 대한 컷오프, 민감도 및 특이도는 표 4 에 열거되어 있다. 이 ECL-COVID-19A 분석의 민감도와 특이도는 각각 100% 및 99.9%로 확인되었습니다10.
그림 1: 6-Plex ECL 분석의 그림. 혈청자가 항체는 Ru Sulfo-NHS 표지 항원을 특정 링커와 결합하여 항원-항체-항원-링커의 복합체를 형성하는 비오틴 화 항원에 연결합니다. 복합체는 각 특정 링커를 통해 6-Plex 플레이트의 특정 지점으로 캡처됩니다. 각 항원에 대해 GAD- 링커 -1, Covid-19- 링커 -2, IA-2- 링커 -3, tTG- 링커 -8, ZnT8- 링커 -9 및 프로 인 슬린 - 링커 -10과 같은 특정 링커 번호가 할당되었습니다. 이 그림은 He et al.11의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 단일 ECL 분석과 6-Plex ECL 분석 간의 ASK 연구에서 얻은 880개 샘플의 6개 항체 수준 비교. 패널은 각각 GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA 및 COVID-19A에 대한 항체 수준의 비교를 표시합니다(COVID-19A 지수는 (100 x 계산된 지수 값)으로 표시됨). 점선은 각 항체 분석에 대한 분석 컷오프를 나타냅니다. 이 그림은 He et al.11의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: RBA와 6-Plex ECL 분석 간의 ASK 연구에서 얻은 880개 샘플의 5가지 항체 수준 비교. 패널은 각각 GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A 및 TGA에 대한 항체 수준의 비교를 표시합니다. 점선은 각 항체 분석에 대한 분석 컷오프를 나타냅니다. 이 그림은 He et al.11의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 원시 CPS 카운트 (플레이트의 왼쪽 절반). 분석 플레이트의 왼쪽 절반에서 획득한 원시 CPS 카운트. 각 샘플은 중복으로 수행됩니다. 동일한 열(A1, A2, A3 등) 내의 각 CPS 카운트는 동일한 웰의 10개 스팟에서 판독 데이터를 나타냅니다(해당 링커 번호가 표시됨). 잘못된 중복의 예는 D-linker 3행 5열 및 6열에서 볼 수 있듯이 회색으로 강조 표시됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 6개의 링커로 정렬된 표 1 데이터의 배열. 표 1의 CPS 값을 재배열하여 CPS의 중복 판독값에 대한 평균값을 계산하고 링커 4 내지 7에 대해 사용되지 않은 값을 삭제했습니다. 각 자가항체 분석의 내부 표준 높은 양성, 낮은 양성 및 음성 대조군의 값은 진한 굵은 글씨로 표시됩니다. PC, 양성 대조군. NC, 음성 대조군. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 인덱스 값의 결과. 모든 6개의 항체에 대한 각각의 샘플에 대한 인덱스 값을 상응하는 양성 및 음성 대조군에 대해 계산하였다. 컷오프 값보다 큰 인덱스 값은 양수로 정의되었으며 어두운 굵게 표시되었습니다. 표 1의 잘못된 중복 CPS 값, 행 D-링커 3-열 5 및 6은 샘플 11의 IA-2A 인덱스 값(회색으로 강조 표시됨)으로 이어졌으며, 이는 아마도 위양성 결과였습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: 325개의 IAbs 양성 샘플과 555개의 모든 항체 음성 샘플을 포함하여 880개의 ASK 샘플 중 GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA 및 TGA에 대한 분석 컷오프, 민감도 및 특이성. GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA 및 TGA 분석의 최적 컷오프 지수 값은 555개의 정상 대조군 샘플 중 적어도 99번째 백분위수로 설정되었다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
T1D에 대한 개입은 T1D 이전 시대에 접어 들었고, T1D에 대한 국내 및 국제 대규모 스크리닝 프로그램이 진행되고 임상 T1D 12,13으로의 진행을 폐지하거나 늦추기 위해 1 단계 T1D에 호황을 누리고있는 임상 시험이 적용되고 있습니다. 단일 IAb 분석 형식의 현재 표준 RBA를 사용하여 4개의 IAb를 측정하는 것은 대량 스크리닝 프로그램에 힘들고 비효율적입니다. 고처리량 멀티플렉스 IAbs 분석에 대한 긴급한 요구로 인해 멀티플렉스 ECL 분석, 3-스크린 ICA ELISA 및 응집-PCR(ADAP)에 의한 항체 검출이 현재 경쟁력 있는 기술로 부상했습니다. 독일의 어린 아이들 집단에서 T1D를 스크리닝하는 Fr1da 연구에서, 3개의 IAbs(GADA, IA-2A 및 ZnT8A)를 조합한 3-스크린 ICA ELISA가 주요 테스트(14)로 사용되었다. 3-스크린 ICA ELISA의 주요 한계는 IAA가 없다는 것인데, 이는 대부분 T1D를 가진 어린 아이들에게 높은 유병률로 나타나는 최초의 IAb입니다. 또한, 분석은 3개의 IAb 중 어느 것이 양성 신호와 양성인지 구별할 수 없으며, 모든 양성 샘플은 확인을 위해 3개의 단일 분석으로 반복되어야 합니다. ADAP15는 GADA, IA-2A 및 IAA를 결합하고 IASP 워크숍에서 높은 분석 민감도와 특이성을 보여 주었지만 IASP 워크숍에서 결정할 수없는 T1D 연구에 대한 인구 기반 스크리닝에서 얼마나 예측되는지에 대한 데이터가 부족합니다. 본 연구의 멀티플렉스 ECL 분석은 TrailNet9,16, DAISY17,18,19 및 ASK 4,20,21과 같은 여러 임상 시험에서 현재 표준 RBA에 대해 검증된 단일 ECL 분석의 플랫폼을 기반으로 구축되었습니다. 공부. 본 분석은 ASK 연구 참가자의 880 혈청 샘플을 사용하여 RBA 및 단일 ECL 분석 모두에 대해 검증되었습니다. 그림 2 및 그림 3에서 볼 수 있듯이 6-Plex와 단일 ECL 사이 또는 6-Plex와 RBA 사이의 항체 수준은 항체의 양성에 대해 대부분 서로 일치했습니다. RBA와 6-Plex에서 테스트한 IAb의 일치율은 91.7%-97.8%였으며 단일 ECL 및 6-Plex에서 테스트한 IAb의 일치율은 95.3%-99.2%였습니다. ECL 분석과 RBA 사이의 불일치는 주로 단일 IAb를 가진 사람들에게서 발생했습니다. 6-Plex 및 단일 ECL (r = 0.6431-0.9434, 모든 p < 0.0001) 및 6-Plex 및 RBA (r = 0.5775-0.8576, 모든 p < 0.0001)로 테스트 한 IAb의 수준도 상관 관계가 높았습니다. 6-Plex 분석으로 테스트한 TGA는 RBA(99.4%) 및 단일 ECL 분석(99.4%)의 결과와 높은 상관관계가 있었습니다. 또한 6-Plex에서 테스트한 COVID-19A는 단일 ECL 분석 결과를 99.8% 준수했습니다.
그 결과, 6-Plex ECL 분석은 진행 중인 ASK 연구의 1차 스크리닝 방법으로 공식적으로 승인되었으며 표준 RBA22를 대체했습니다. 이 분석은 표준 RBA에 비해 더 높은 처리량, 더 낮은 비용 및 더 적은 양의 혈청으로 우수한 민감도와 특이성을 입증했습니다.
T1D 선별 연구에서 IAb 양성의 많은 부분을 차지하는 RBA에 의해 검출된 단일 IAb는 친화도가 낮고 질병 위험이 낮았으며 전반적으로 낮은 예측 값 19,21,23,24,25,26을 초래한 것으로 문서화되었습니다. 이러한 낮은 위험 예측은 후속 방문에 막대한 추가 비용을 초래하고 T1D 예방 연구에 어려움을 초래했습니다. 확립된 ECL 분석 플랫폼은 여러 임상 시험에서 RBA에 의해 생성된 고친화성 IAb와 저친화성 IAb를 구별하고 특히 단일 IAb 양성 16,17,18,21에서 4개의 IAb 모두에 대한 예측 값을 크게 향상시키는 것으로 입증되었습니다. . 멀티플렉스 ECL 분석 기술은 단일 ECL 분석의 플랫폼을 기반으로 구축되었으며, 고친화성 Abs 검출이라는 뚜렷한 이점이 있습니다. 본 연구에서, 6-Plex ECL 분석은 민감도 및 특이성에서 상응하는 단일 ECL 분석과의 유사성을 입증하였다.
여러 플렉스 플레이트를 사용하는 멀티플렉스 ECL 분석의 일부 제한 사항과 기술적 문제는 이전 간행물27,28에서 이미 다루었습니다. 하나의 웰에 6개의 표지된 항원이 있는 경우 서로 다른 항원 간에 약간의 영향이 있을 수 있으며 동일한 웰에서 멀티플렉싱을 위해 각 항체 분석을 추가할 때 분석 배경이 증가할 수 있습니다. 각 항체 분석에 대한 민감도와 특이성을 유지하기 위해 특히 각 항원에 대한 바둑판 분석을 기반으로 각 표지된 항원 단백질의 최종 농도를 조정하기 위해 분석 조건을 조정하려면 많은 양의 분석 최적화 작업이 필요합니다. 이전 연구27,28에서 언급했듯이 적은 수의 샘플 (<1 %)은 명확한 근본적인 이유없이 여러 Plex 플레이트에서 잘못된 양성을 초래합니다. 모든 양성 결과는 일상적인 실험실 품질 보증으로 단일 ECL 분석으로 반복되고 확인되어야합니다. 일반적으로 가양성은 제거됩니다. 이전 7-Plex ECL 분석27,28에서 관찰된 "프로존 효과"로 인한 위음성 결과는 본 연구에서 관찰되지 않았습니다. 여기에 설명된 분석에서, 혈청 샘플을 산 처리하는 단계를 이전 프로토콜로부터 제거하였고; 대신에, 혈청 샘플을 56°C에서 30분 동안 예열하였다(단계 5.1). 플레이트 세척 둘째 날에는 일반 세척 버퍼 대신 0.4M NaCl(단계 8.1)을 포함하는 세척 버퍼를 사용하여 플레이트를 보다 엄격하게 세척했습니다. 이러한 수정으로 인해 멀티플렉스 ECL 분석이 분석 감도를 잃지 않고 더 간단하고 배경이 낮아졌습니다.
결론적으로, 이 분석은 4개의 IAb, TGA 및 COVID-19A를 동시에 검출하는 데 탁월한 성능을 제공합니다. 멀티플렉싱 기능과 높은 처리량, 저렴한 비용 및 적은 혈청 부피 요구 사항은 일반 인구에서 T1D 및 수반되는 질병에 대한 대규모 스크리닝을 훨씬 더 실현 가능하게 만듭니다. T1D 또는자가 면역 질환이있는 환자는 다른자가 면역 질환에 걸릴 위험이 훨씬 높습니다. 멀티플렉스 ECL 분석은 T1D 및 여러 자가면역 질환을 동시에 스크리닝할 수 있는 우수한 플랫폼을 제공합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 JDRF 보조금 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, NIH 보조금 DK32083 및 당뇨병 연구 센터(DRC) 보조금 P30 DK116073의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mM NaCl | ThermoFisher | 1070832 | |
| 96-well Plate Shaker | VWR | 12620-926 | |
| 96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
| Biotin | ThermoFisher | PI21329 | |
| Blocker A | MSD | R93AA | |
| Bottle-Top 500 ml-Filter Units | Fisher | 0974064A | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
| GAD65 protein | Diamyd Medical | 10-65702-01 | |
| IA-2 protein (aa 605-979) | Creative BioMart | 283309 | |
| MESO QuickPlex SQ120 | MSD | R31QQ-3 | Electrochemiluminescence analyzer |
| PBS 10x | ThermoFisher | 70011044 | |
| PBS 1x | ThermoFisher | 10010023 | |
| Proinsulin protein | AmideBio | 20160118B3 | |
| Read buffer B | MSD | Y0800019 | |
| SARS-CoV-2 RBD protein | Creative Biomart | Spike-190V | |
| Stop Solution | MSD | Y0090019 | |
| Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
| tTG protein | Diarect AG | 15201 | |
| Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
| U-Plex 6-Assay SECTOR plate | MSD | Z00U0142E | 6-plex plate |
| U-PLEX Linker 1 | MSD | L0010022 | |
| U-PLEX Linker 10 | MSD | L0100020 | |
| U-PLEX Linker 2 | MSD | L0020015 | |
| U-PLEX Linker 3 | MSD | L0030018 | |
| U-PLEX Linker 8 | MSD | L0080018 | |
| U-PLEX Linker 9 | MSD | L0090014 | |
| ZeBa Column | ThermoFisher | 89892 | Spin columns |
| ZnT8 protein | Research Laboratory | n/a |
References
- Group, T. S. The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) Study. Annals of the New York Academy of Sciences. 1150, 1-13 (2008).
- Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
- Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
- Stahl, M. G., et al. Mass screening for celiac disease: The autoimmunity screening for kids study. The American Journal of Gastroenterology. 116 (1), 180-187 (2021).
- Al-Hussaini, A., Sulaiman, N., Al-Zahrani, M., Alenizi, A., El Haj, I. High prevalence of celiac disease among Saudi children with type 1 diabetes: A prospective cross-sectional study. BMC Gastroenterology. 12, 180 (2012).
- Agardh, D., et al. Clinical features of celiac disease: A prospective birth cohort. Pediatrics. 135 (4), 627-634 (2015).
- Jaime, G., Deville, E. S., Ouellette, C. P. COVID-19: Clinical manifestations and diagnosis in children. UpToDate. , Available from: https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print (2021).
- Barron, E., et al. Associations of type 1 and type 2 diabetes with COVID-19-related mortality in England: a whole-population study. The Lancet Diabetes & Endocrinology. 8 (10), 813-822 (2020).
- Miao, D., et al. Electrochemiluminescence assays for insulin and glutamic acid decarboxylase autoantibodies improve prediction of type 1 diabetes risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
- Jia, X., et al. Prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in children and adults with Type 1 diabetes. Diabetes Technology & Therapeutics. 23 (7), 517-521 (2021).
- He, L., et al. High-throughput multiplex electrochemiluminescence assay applicable to general population screening for type 1 diabetes and celiac disease. Diabetes Technology & Therapeutics. , (2022).
- McQueen, R. B., et al. Cost and cost-effectiveness of large-scale screening for type 1 diabetes in Colorado. Diabetes Care. 43 (7), 1496-1503 (2020).
- Insel, R. A., Dunne, J. L., Ziegler, A. G. General population screening for type 1 diabetes: has its time come. Current Opinion in Endocrinology & Diabetes and Obesity. 22 (4), 270-276 (2015).
- Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for high-throughput detection of beta cell autoantibodies in capillary blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
- Cortez, F. J., et al. Sensitive detection of multiple islet autoantibodies in type 1 diabetes using small sample volumes by agglutination-PCR. PLoS One. 15 (11), 0242049 (2020).
- Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA can identify high-risk single autoantibody-positive relatives in the TrialNet pathway to prevention study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
- Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
- Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
- Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: Nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
- Zhao, Z., et al. Higher sensitivity and earlier identification of celiac disease autoimmunity by a nonradioactive assay for transglutaminase autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 2904563 (2016).
- Jia, X., et al. High-affinity ZnT8 autoantibodies by electrochemiluminescence assay improve risk prediction for type 1 diabetes. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (12), 3455-3463 (2021).
- He, L., et al. A complete-panel islet autoantibody multiplex ECL assay. Diabetes. 70, Supplement 1 158 (2021).
- Achenbach, P., et al. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 114 (4), 589-597 (2004).
- Schlosser, M., et al. In insulin-autoantibody-positive children from the general population, antibody affinity identifies those at high and low risk. Diabetologia. 48 (9), 1830-1832 (2005).
- Mayr, A., et al. GAD autoantibody affinity and epitope specificity identify distinct immunization profiles in children at risk for type 1 diabetes. Diabetes. 56 (6), 1527-1533 (2007).
- Siljander, H., et al. Role of insulin autoantibody affinity as a predictive marker for type 1 diabetes in young children with HLA-conferred disease susceptibility. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 25 (7), 615-622 (2009).
- Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
- Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H., Yu, L. A high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases. Journal of Visualized Experiments. (159), e61160 (2020).
