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Immunology and Infection

टाइप 1 मधुमेह, सीलिएक रोगों और सीओवीआईडी -19 के लिए एक उच्च-थ्रूपुट मल्टीप्लेक्स स्क्रीनिंग

Published: July 5, 2022 doi: 10.3791/63787
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1, 1
1Barbara Davis Center for Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Endocrinology, Guangzhou First People’s Hospital, School of Medicine, South China University of Technology
* These authors contributed equally

Summary

टाइप 1 मधुमेह, सीलिएक रोग और कोरोनावायरस रोग 2019 के लिए स्क्रीनिंग की तत्काल आवश्यकता के अनुरूप, हमने एक उच्च थ्रूपुट 6-प्लेक्स इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस परख विकसित की है, जो एक साथ सभी चार आइलेट ऑटोएंटीबॉडी, ऊतक ट्रांसग्लूटामिनेज ऑटोएंटीबॉडीज और गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 के रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन के एंटीबॉडी का पता लगाती है।

Abstract

एक चल रहे नैदानिक परीक्षण, ऑटोइम्यूनिटी स्क्रीनिंग फॉर किड्स (एएसके), संयुक्त राज्य अमेरिका में टाइप 1 मधुमेह (टी 1 डी) और सीलिएक रोग के लिए सामान्य आबादी में पहला स्क्रीनिंग अध्ययन है। कोरोनावायरस रोग 2019 (सीओवीआईडी -19) महामारी के साथ, आम आबादी में सीओवीआईडी -19 की महामारी विज्ञान और सीओवीआईडी -19 संक्रमण और टी 1 डी विकास के बीच संबंध के बारे में ज्ञान की तत्काल आवश्यकता है। रेडियो-बाइंडिंग परख (आरबीए) की वर्तमान मानक स्क्रीनिंग विधि ने दो बड़ी चुनौतियों का सामना किया है: एकल परख प्रारूप के साथ कम दक्षता और स्क्रीनिंग में उत्पन्न कम-आत्मीयता एंटीबॉडी के एक बड़े अनुपात के साथ कम रोग विशिष्टता। मल्टीप्लेक्स इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस (ईसीएल) परख के मंच के साथ, एक नया 6-प्लेक्स ईसीएल परख विकसित किया गया था, जो एक ही कुएं में, सभी चार आइलेट ऑटोएंटीबॉडीज (आईएबीएस) को इंसुलिन, ग्लूटामिक एसिड डिकार्बोक्सिलेज (जीएडी 65), इंसुलिनोमा एंटीजन 2 (आईए -2), और जिंक ट्रांसपोर्टर 8 (जेडएनटी 8) को जोड़ता है। covid-19। एएसके अध्ययन से 880 नमूनों का उपयोग करके अंधे में परख को मान्य किया गया था, जिसमें 325 सकारात्मक नमूने और 555 सभी एंटीबॉडी-नकारात्मक नमूने शामिल थे, और मानक आरबीए और एक एकल ईसीएल परख के साथ तुलना की गई थी। उच्च दक्षता, कम लागत और कम सीरम मात्रा के फायदे के साथ, इस परख को एएसके अध्ययन के लिए प्राथमिक स्क्रीनिंग टूल के रूप में स्वीकार किया गया है।

Introduction

दुनिया भर में बड़े महामारी विज्ञान के अध्ययनों से पता चलता है कि टाइप 1 मधुमेह (टी 1 डी) की घटनाएं तेजी से 3% -5% सालाना बढ़ रही हैं, और टी 1 डी का प्रसार पिछले 20 वर्षों में दोगुना हो गया है, खासकर छोटे बच्चों में 1,2। आइलेट ऑटोएंटीबॉडीज (आईएबीएस) आमतौर पर नैदानिक लक्षणों से वर्षों पहले दिखाई देते हैं और वर्तमान में टी 1 डी3 के लिए सबसे विश्वसनीय पूर्वानुमान और नैदानिक बायोमार्कर हैं। टी 1 डी ऑटोएंटीबॉडी के लिए स्क्रीनिंग नैदानिक टी 1 डी में प्रगति के लिए जोखिम वाले लोगों की पहचान कर सकती है, जनता को शिक्षित कर सकती है, बड़े पैमाने पर कीटोएसिडोसिस की जीवन-धमकी देने वाली जटिलता को कम कर सकती है, और रोकथाम उपचारों के लिए नैदानिक परीक्षणों का लाभ उठा सकती है। टी 1 डी के लिए दुनिया भर में रोकथाम के प्रयास चल रहे हैं और नैदानिक टी 1 डी की प्रगति में देरी के लिए आईएबीएस पॉजिटिव वाले विषयों के बीच कई पारंपरिक परीक्षण किए जा रहे हैं, और बारबरा डेविस सेंटर फॉर डायबिटीज ने टी 1 डी और सीलिएक रोग के लिए 2016 में सामान्य आबादी में स्क्रीनिंग का पहला अमेरिकी नैदानिक परीक्षण शुरू किया, ऑटोइम्यूनिटी स्क्रीनिंग फॉर द किड्स (एएसके)4 . सीलिएक रोग (सीडी) प्रतिरक्षा और आनुवंशिक कारकों से संबंधित एक पुरानी आंतों की सूजन की बीमारी है। टी 1 डी वाले बच्चों में सीडी की व्यापकता 24.5% तक पहुंच सकती है। सीडी वाले आधे से अधिक व्यक्तियों में प्रस्तुति6 में विशिष्ट लक्षण नहीं हो सकते हैं, इसलिए सीलिएक रोग के लिए सीरोलॉजिकल स्क्रीनिंग काफी आवश्यक है।

कोरोनावायरस रोग 2019 (सीओवीआईडी -19) की महामारी शुरू होने के बाद से, वैश्विक स्तर पर 200 मिलियन से अधिक मामले सामने आए हैं, और प्रयोगशाला-पुष्टिकिए गए मामलों में से 16% तक बच्चे हैं। कई अध्ययनों ने कोविड-19 संक्रमण की गंभीरता और मृत्यु दर पर मौजूदा टी1डी के प्रभाव को प्रदर्शितकिया है, जबकि टी1डी विकास पर कोविड-19 संक्रमण का प्रभाव स्पष्ट नहीं है। गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) एंटीबॉडी के निर्धारण द्वारा सामान्य आबादी में कोविड-19 संक्रमण की कुल दर की जांच और कोविड-19 संक्रमण और टी 1 डी ऑटोइम्यूनिटी को ट्रिगर करने या टी 1 डी प्रगति में तेजी लाने के बीच संबंध का अध्ययन तत्काल आवश्यक और बहुत महत्वपूर्ण है, जबकि चल रहा एएसके अध्ययन इसके लिए एक उत्कृष्ट मंच है। एकल परख प्रारूप और कम-आत्मीयता एंटीबॉडी सकारात्मकता के एक बड़े अनुपात की पीढ़ी के कारण, मानक रेडियो-बाइंडिंग परख (आरबीए) ने कम दक्षता और कम रोग विशिष्टता 9 की अड़चन को पूराकिया है। वर्तमान पेपर में, हम एक मल्टीपल-प्लेक्स प्लेट का उपयोग करके हमारे पिछले मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख प्लेटफॉर्म पर निर्मित एक नया 6-प्लेक्स इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस (ईसीएल) परख प्रस्तुत करते हैं, जिसमें एक ही कुएं में छह ऑटोएंटीबॉडी परख शामिल हैं, जिसमें इंसुलिन (आईएए), ग्लूटामिक एसिड डीकार्बोक्सिलेज -65 (जीएडीए), इंसुलिनोमा एंटीजन -2 (आईए -2 ए), और जिंक ट्रांसपोर्ट -8 (जेडएनटी 8 ए), ट्रांसग्लूटामिनेज के लिए ऑटोएंटीबॉडी शामिल हैं। और सार्स-सीओवी-2 रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी) एंटीबॉडी (कोविड-19ए)। यह पहला मल्टीप्लेक्स परख है जिसने चार प्रमुख आईए के एक पूर्ण पैनल की भर्ती की और इसे टीजीए और सीओवीआईडी -19 ए के साथ जोड़ा। इसे एएसके अध्ययन में मानक आरबीए की जगह प्राथमिक स्क्रीनिंग टूल के रूप में मान्य और औपचारिक रूप से स्वीकार किया गया है।

Protocol

अनुसंधान प्रोटोकॉल कोलोराडो मल्टीपल इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. बफर तैयारी

  1. लेबलिंग बफर तैयार करें (2x PBS, pH 7.9): 10x PBS के 100 mL को 400 mL आसुत जल में जोड़ें और NaOH का उपयोग करके pH को 7.9 तक समायोजित करें।
  2. बायोटिन और आरयू सल्फो-एनएचएस के 3 एमएम बनाएं: लेबलिंग बफर के 588 μL में 1 मिलीग्राम बायोटिन को भंग करें और लेबलिंग बफर के 50 μL में Ru Sulfo-NHS के 150 nmol को भंग करें।
  3. एंटीजन बफर (1% बीएसए) तैयार करें: 1x PBS के 500 एमएल में 5 ग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) को भंग करें।
  4. कोटिंग बफर (3% ब्लॉकर ए) तैयार करें: 15 ग्राम ब्लॉकर ए को 500 एमएल 1 एक्स पीबीएस में भंग करें।
  5. पहला वाशिंग बफर तैयार करें (0.05% ट्वीन 20, पीबीएसटी): 1x PBS के 5,000 एमएल में ट्वीन 20 के 2.5 एमएल मिलाएं।
  6. दूसरा वाशिंग बफर (0.4 M NaCl): 575 mL आसुत जल में 50 mCl के 50 mCl को मिलाकर 0.4 M NaCl घोल बनाएं।
    नोट: कुशल लेबलिंग के लिए, हमेशा ताजा तैयार बायोटिन और आरयू सल्फो-एनएचएस समाधानों का उपयोग करें और पहले से बनाए गए संग्रहीत नहीं।

2. बायोटिन और आरयू सल्फो-एनएचएस के साथ एंटीजन प्रोटीन लेबलिंग अलग-अलग

नोट: उच्च लेबलिंग दक्षता के लिए एंटीजन प्रोटीन ≥0.5 मिलीग्राम / एमएल की उच्च सांद्रता की सिफारिश की जाती है।

  1. सार्स-सीओवी-2 के स्पाइक प्रोटीन के प्रोइन्सुलिन, जीएडी-65, आईए-2, जेडएनटी8, टीजी और रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी) सहित छह लक्षित एंटीजन प्रोटीन समाधान तैयार करें। प्रत्येक एंटीजन प्रोटीन के मोल्स को उसके आणविक भार के अनुसार गणना करें और बायोटिन या आरयू सल्फो-एनएचएस के उपयुक्त दाढ़ अनुपात बनाएं। बायोटिन या आरयू सल्फो-एनएचएस के योग के लिए एंटीजन का अनुपात छोटे आणविक एंटीजन (आणविक भार ≤10 केडी) के लिए 1: 5 होगा, जैसे कि प्रोइन्सुलिन प्रोटीन। मध्यम आणविक एंटीजन (आणविक भार 10-50 केडी), जैसे कि ZnT8 के लिए, अनुपात 1: 10 में समायोजित होगा। जीएडी जैसे बड़े आणविक भार एंटीजन (आणविक भार >50 केडी) के लिए, दाढ़ अनुपात 1: 20 होगा।
  2. एंटीजन प्रोटीन को दो समान भागों में विभाजित करें और चरण 2.1 में गणना किए गए दाढ़ अनुपात का उपयोग करके इसे बायोटिन और आरयू सल्फो-एनएचएस के साथ अलग-अलग मिलाएं। प्रकाश से बचते हुए मिश्रण को कमरे के तापमान (आरटी) पर 1.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: एंटीजन प्रोटीन के बफर में ट्राइस या ग्लाइसिन जैसे सभी कम करने वाले रसायनों को 2x PBS (pH 7.9) के बफर के साथ एक साइज़ स्पिन कॉलम द्वारा हटाने की आवश्यकता होती है।
  3. 2x PBS के साथ स्पिन कॉलम को प्राइम करें (स्पिन कॉलम का आकार, 2 एमएल या 5 एमएल, लेबलिंग एंटीजन प्रोटीन की मात्रा पर निर्भर करता है): स्पिन कॉलम में 2x PBS बफर का 1 मिलीलीटर जोड़ें, इसे 2 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और चरण 2x अधिक दोहराएं।
  4. एंटीजन प्रोटीन-बायोटिन या -रु सल्फो-एनएचएस मिश्रण को शुद्धिकरण और लेबलिंग प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्राइमेड स्पिन कॉलम 1एक्स (2 मिनट के लिए 1,000 x g पर कॉलम को सेंट्रीफ्यूज) के माध्यम से जाने दें।
  5. बायोटिन- या आरयू सल्फो-एनएचएस-लेबल एंटीजन प्रोटीन की सांद्रता की गणना करते हुए, स्पिन कॉलम से लेबल किए गए एंटीजन प्रोटीन की अंतिम मात्रा को मापें। लेबल एंटीजन प्रोटीन (50 μL / ट्यूब) के छोटे एलिकोट बनाएं और उन्हें दीर्घकालिक उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: प्रत्येक स्पिन कॉलम के बाद प्रोटीन का कवरेज लगभग 90% -95% प्रतिधारण दर होगी।

3. 6-प्लेक्स ईसीएल परख (चेकरबोर्ड परख) के लिए बायोटिन- और रु सल्फो-एनएचएस-लेबल एंटीजन के लिए सर्वोत्तम एकाग्रता और अनुपात परिभाषित करें

नोट: मल्टीप्लेक्स परख में एकीकरण से पहले प्रत्येक एंटीजन के लिए चेकरबोर्ड परख आवश्यक है।

  1. प्रत्येक एंटीजन के लिए चेकरबोर्ड परख को अलग से लागू करें।
    नोट: चरण 3.2.-3.7. एक संक्षिप्त उदाहरण के रूप में टीजीए का उपयोग करेंगे। टीजीए चेकरबोर्ड परख प्रक्रिया परख प्रक्रिया का अनुकरण करना है लेकिन केवल एक प्रकार के एंटीजन के साथ।
  2. बायोटिनिलेटेड टीटीजी और आरयू सल्फो-एनएचएस-लेबल टीटीजी का सीरियल कमजोर पड़ने का कारण बनाएं। पहले मिश्रण समाधान की अनुशंसित कार्यशील सांद्रता बायोटिनिलेटेड और आरयू सल्फो-एनएचएस-लेबल टीटीजी दोनों के लिए 240 एनजी / एमएल से शुरू होती है। मान लीजिए कि मूल बायोटिनिलेटेड और आरयू सल्फो-एनएचएस-लेबल टीटीजी दोनों की सांद्रता 1.0 μg/μL है। मूल Ru Sulfo-NHS-लेबल tTG का 10x कमजोर पड़ना और 5% BSA के साथ मूल बायोटिनाइलेटेड tTG का 5x कमजोर पड़ना बनाना।
  3. एक ट्यूब में 5% बीएसए (एंटीजन बफर) के 156 μL और स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित लिंकर के 240 μL के साथ बायोटिनाइलेटेड टीटीजी प्रोटीन के 4 μL मिलाएं और 30 मिनट के लिए RT पर घोल को इनक्यूबेट करें। फिर, स्टॉप समाधान के 160 μL जोड़ें, और एक और 30 मिनट के लिए RT पर इनक्यूबेट करें। मिश्रण का 400 μL लें और 2 mL स्टॉप घोल के साथ मिलाएं। मिश्रण में बायोटिनिलेटेड टीटीजी की सांद्रता 240 एनजी / एमएल है।
  4. बायोटिन-लेबल ZnT8 एंटीजन के लिए एक सीरियल कमजोर पड़ने के लिए, एक और पांच नई ट्यूब तैयार करें, चरण 3.3 में मिश्रण से 1 एमएल एलिकोट लें। और एक नई ट्यूब में 1 एमएल स्टॉप समाधान के साथ मिलाएं, और मिश्रण को 120 एनजी / एमएल की एकाग्रता के साथ प्राप्त करें। इस चरण को दोहराएं, सीरियल 1: 1 कमजोर पड़ने दें, और 60 एनजी / एमएल, 30 एनजी / एमएल, 15 एनजी / एमएल, और 7.5 एनजी / एमएल पर बायोटिन-लेबल टीटीजी प्राप्त करें।
  5. 1.6 एमएल स्टॉप समाधान के साथ आरयू सल्फो-एनएचएस-लेबल टीटीजी का 4 μL जोड़ें, और 240 ng / mL की एकाग्रता पर Ru Sulfo-NHS-लेबल tTG का मिश्रण प्राप्त करें। 3.4. के समान चरणों के साथ, सीरियल 1: 1 कमजोर पड़ने का निर्माण करें और 60 एनजी / एमएल, 30 एनजी / एमएल, 15 एनजी / एमएल, 7.5 एनजी / एमएल, और 3.75 एनजी / एमएल पर आरयू सल्फो-एनएचएस-लेबल जेडएनटी 8 एंटीजन प्राप्त करें। अंतिम एकाग्रता 0 एनजी / एमएल है, जिसमें केवल स्टॉप समाधान है और कोई आरयू सल्फो-एनएचएस-लेबल एंटीजन नहीं है।
  6. टीटीजी सकारात्मक नियंत्रण और नकारात्मक नियंत्रण सीरम नमूने (एकल ईसीएल टीटीजी परख द्वारा पूर्व-योग्य और मानकीकृत) और एक 96-वेल पीसीआर प्लेट तैयार करें। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सीरम नमूनों को क्रमशः प्लेट के बाएं आधे और दाएं आधे हिस्से में ले जाएं, जिसमें प्रत्येक कुएं में 7 μL हो। प्लेट में 1x PBS जोड़ें, जिसमें 33 μL प्रति अच्छी तरह से है।
  7. पीसीआर प्लेट के बाईं ओर, प्रत्येक कुएं में सीरियल पतला बायोटिन-लेबल टीटीजी-लिंकर समाधान का 24 μL जोड़ें, उच्चतम से निम्नतम के क्रम में एक एकाग्रता वाला एक कॉलम। इसी तरह, प्रत्येक कुएं में टीटीजी एंटीजन लेबल वाले सीरियल पतला आरयू सल्फो-एनएचएस के 16 μL जोड़ें, एक एकाग्रता के साथ एक पंक्ति, और फिर अच्छी तरह से मिलाएं। पीसीआर प्लेट के दाहिने आधे हिस्से पर चरण दोहराएं।
  8. चरण 5.3.-9.1 में वर्णित शेष परख चरणों को जारी रखें। जब तक कच्चे गिनती डेटा प्राप्त नहीं हो जाते।
  9. संबंधित नकारात्मक नियंत्रण संकेतों के लिए सकारात्मक नियंत्रण संकेतों के अनुपात की गणना करें। नकारात्मक नियंत्रण नमूने के लिए उच्च अनुपात मूल्यों और कम पृष्ठभूमि के साथ बायोटिन-लेबल एंटीजन और आरयू सल्फो-एनएचएस-लेबल एंटीजन के लिए सबसे अच्छी एकाग्रता निर्धारित करें। बायोटिन और आरयू सल्फो-एनएचएस लेबल एंटीजन प्रोटीन की इष्टतम कार्यशील सांद्रता नीचे दिखाई गई है: जीएडी 65 के लिए 16.0 एनजी/एमएल और 8.0 एनजी/एमएल, सार्स-सीओवी-2 आरबीडी के लिए 18.8 एनजी/एमएल और 9.4 एनजी/एमएल, आईए-2 के लिए 42.0 एनजी/एमएल और 42.0 एनजी/एमएल, 60.0 एनजी/एमएल के लिए 60.0 एनजी/एमएल, 4.2 एनजी/एमएल के लिए 4.2 एनजी/एमएल, 4.2 एनजी/एमएल के लिए 4.0 एनजी/एमएल, 4.2 एनजी/एमएल के लिए 60.0 एनजी/एमएल, 4.2 एनजी/एमएल के लिए 4.0 एनजी/एमएल, जीएडी65 के लिए 16.0 एनजी/एमएल और 8.0 एनजी/एमएल, सार्स-सीओवी-2 आरबीडी के लिए 18.8 एनजी/एमएल और 9.4 एनजी/एमएल, आईए-2 के लिए 42.0 एनजी/एमएल और 60.0 एनजी/एमएल, 4.0 एनजी/एमएल के लिए 4.0 एनजी/एमएल, 4.0 एनजी/एमएल के लिए 4.0 एनजी/एमएल, 4.0 एनजी/एमएल, 40.0 एनजी/एमएल, जीएडी65 के लिए 16.0 एनजी/एमएल और 8.0 एनजी/एमएल, सार्स-सीओवी-2 आरबीडी के लिए 18.8 एनजी/एमएल और 9.4 एनजी/एमएल, आईए-2 के लिए 42.0 एनजी/एमएल और 42.0 एनजी/एमएल, 60.0 एनजी/एमएल और 60.0 और प्रोइन्सुलिन के लिए 31.3 एनजी / एमएल और 31.3 एनजी / एमएल।

4. लिंकर-युग्मित एंटीजन समाधान बनाएं

  1. चरण 3.9 के अनुसार इष्टतम कार्य सांद्रता के लिए 5% बीएसए के साथ बायोटिन- और आरयू सल्फो-एनएचएस-लेबल एंटीजन को पतला करें।
  2. प्रत्येक बायोटिनिलेटेड एंटीजन प्रोटीन के लिए पूर्व-चयनित लिंकर को बांधें। एक 96-वेल प्लेट परख के लिए, बायोटिनिलेटेड जीएडी 65, सार्स-सीओवी-2 आरबीडी, आईए -2, टीटीजी, जेडएनटी 8, और प्रोइन्सुलिन एंटीजन प्रोटीन के 4 μL को एक अलग ट्यूब में जोड़ें जिसमें 1% बीएसए का 156 μL होता है और संबंधित स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित लिंकर 1, 2, 3, 8, 9, और 10 के 240 μL के साथ मिलाएं (चित्रा 1)। आरटी पर 30 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
  3. प्रत्येक ट्यूब में 160 μL स्टॉप घोल का एलिकोट करें और मिश्रण को 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। प्रत्येक ट्यूब से मिश्रण के घोल का 400 μL निकालें और उन्हें एक साथ मिलाएं।
  4. ऊपर दिए गए मिश्रण में जीएडी 65, सार्स-सीओवी-2 आरबीडी, आईए-2, टीटीजी, जेडएनटी8 और प्रोइन्सुलिन एंटीजन लेबल वाले आरयू सल्फो-एनएचएस का 4 μL जोड़ें, और फिर 1.6 एमएल स्टॉप घोल और 3.2 एमएल 1x PBS जोड़ें और मिलाएं। अब एंटीजन समाधान परख में उपयोग के लिए तैयार है।

5. लेबल एंटीजन के साथ सीरम नमूने को इनक्यूबेट करें

  1. 96-वेल पीसीआर प्लेट के लिए प्रति कुएं सीरम का 7 μL और सीलिंग फिल्म के साथ कवर करें। पीसीआर मशीन पर 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर सेरा को गर्म करें। संक्षेप में प्लेट को 1 मिनट के लिए 100 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. प्रति अच्छी तरह से एंटीजन समाधान (चरण 4.4 में तैयार) का 63 μL जोड़ें, और सेरा के साथ मिलाएं। प्रकाश से बचने के लिए पीसीआर प्लेट को सीलिंग पन्नी से कवर करें।
  3. प्लेट को 2 घंटे के लिए आरटी पर 450 आरपीएम पर एक शेकर पर हिलाएं और फिर प्लेट को 18-24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

6. 6-प्लेक्स प्लेट तैयार करें

  1. 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से 6-प्लेक्स प्लेट लें, जिससे प्लेट आरटी में आ सके। 6-प्लेक्स प्लेट के प्रत्येक कुएं में 3% ब्लॉकर ए का 150 μL जोड़ें।
  2. प्लेट को वापस 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रखें, प्लेट को पन्नी के साथ प्रकाश से बचाकर कवर करें, और रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: दिन 1 में परख चरणों में अनुभाग 4.-6 शामिल हैं।

7. सीरम/एंटीजन इनक्यूबेट को 6-प्लेक्स प्लेट में स्थानांतरित करें

  1. अगले दिन, रेफ्रिजरेटर से इनक्यूबेटिंग 6-प्लेक्स प्लेट लें और प्लेट से सभी बफर को बाहर फेंक दें। प्लेट को सूखने के लिए कागज के तौलिए पर थपथपाएं।
  2. 6-प्लेक्स प्लेट 3x को हर बार प्रति अच्छी तरह से 150 μL वाशिंग बफर के साथ धोएं। प्लेट को कागज के तौलिए पर सुखाएं, और रात भर पीसीआर प्लेट के प्रत्येक कुएं से एलिकोट सीरम/एंटीजन इनक्यूबेट को 6-प्लेक्स प्लेट के दो कुओं में सेक्यूबेट करें (डुप्लिकेट के लिए 30 μL प्रति कुआं)।
  3. प्लेट को पन्नी से कवर करें, फिर प्लेट को प्लेट शेकर पर रखें, और 1 घंटे के लिए आरटी पर 450 आरपीएम की गति से हिलाएं।

8. 6-प्लेक्स प्लेट को धो लें और रीडिंग बफर जोड़ें

  1. घोल को 6-प्लेक्स प्लेट में डंप करें और प्लेट को हर बार 0.4 एम एनएसीएल वॉशिंग बफर के 150 μL के साथ 3x धोएं।
  2. तीसरा धोने के बाद, पेपर टॉवल के खिलाफ प्लेट को सुखाएं और प्रत्येक कुएं में 150 μL रीडिंग बफर जोड़ें।
    नोट: अच्छी तरह से हवा के बुलबुले प्लेट रीडर मशीन की सटीकता को प्रभावित करते हैं और हर कीमत पर इससे बचा जाना चाहिए।

9. प्लेट पढ़ें और डेटा का विश्लेषण करें

  1. एक इलेक्ट्रोकैमिल्यूमिनेसेंस विश्लेषक पर प्लेट की गणना करें। पढ़ने के परिणाम प्रति सेकंड (सीपीएस) की गणना में मूल्यों के साथ प्रस्तुत किए जाएंगे। प्रत्येक विशिष्ट एंटीबॉडी के आंतरिक मानक सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के सीपीएस के खिलाफ रीडिंग मशीन से प्राप्त कच्चे सीपीएस का उपयोग करके प्रत्येक नमूने के सापेक्ष एंटीबॉडी सूचकांक की गणना करें (सूचकांक मूल्य = [सीपीएस (नमूना) - सीपीएस (नकारात्मक मानक)] / [सीपीएस (सकारात्मक मानक) - सीपीएस (नकारात्मक मानक)])।
  2. एएसके अध्ययन से 555 नकारात्मक नियंत्रण नमूनों के 99.5वें से 99.8वें प्रतिशत पर स्थापित कटऑफ मूल्यों का उपयोग करके नकारात्मक या सकारात्मक एंटीबॉडी परिणाम निर्धारित करें (मधुमेह या किसी अन्य प्रकार के ऑटोइम्यून बीमारी के इतिहास या पारिवारिक इतिहास के बिना सभी एंटीबॉडी नकारात्मक नमूने)।
    नोट: दिन 2 में परख चरणों में खंड 7-9 शामिल हैं।

Representative Results

तालिका 1, तालिका 2, और तालिका 3 प्रतिनिधि परिणामों को स्पष्ट करते हैं। रीडिंग मशीन से प्राप्त कच्चे सीपीएस को तालिका 1 में चित्रित किया गया है। तालिका 2 में, कच्चे सीपीएस को छह लिंकर और संबंधित एंटीबॉडी द्वारा व्यवस्थित और क्रमबद्ध किया गया था। तालिका 3 परख प्रोटोकॉल में वर्णित सीपीएस के साथ गणना किए गए सूचकांक मूल्यों को दर्शाती है। खराब डुप्लिकेट के कारण गलत अंतिम सूचकांक परिणामों से बचने के लिए सभी कच्चे गिनती मूल्यों की जांच की जानी चाहिए। तालिका 1 में, खराब डुप्लिकेट के उदाहरण दिए गए हैं, जिसके परिणामस्वरूप तालिका 3 में अंतिम सूचकांक गणना के लिए त्रुटि हुई।

इस परख को एएसके अध्ययन से 880 चयनित नमूनों का उपयोग करके अंधे तरीके से मान्य किया गया था, जिसमें 325 आईएबीएस सकारात्मक नमूने और 555 सभी एबीएस नकारात्मक नमूने थे। 880 नमूनों के लिए 6-प्लेक्स ईसीएल परख से ऑटोएंटीबॉडी के स्तर की तुलना संबंधित एकल ईसीएल परख (चित्रा 2) और संबंधित एकल मानक आरबीए (चित्रा 3) के स्तर के साथ बिंदु-दर-बिंदु की गई थी। प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए कटऑफ, संवेदनशीलता और विशिष्टता तालिका 4 में सूचीबद्ध हैं। इस ईसीएल-कोविड-19ए परख की संवेदनशीलता और विशिष्टता की पहचान क्रमशः 100% और 99.9%के रूप में की गई है।

Figure 1
चित्रा 1: 6-प्लेक्स ईसीएल परख का चित्रण। सीरम ऑटोएंटीबॉडीज आरयू सल्फो-एनएचएस-लेबल एंटीजन का बायोटिनिलेटेड एंटीजन से कनेक्शन बनाते हैं, जो एक विशिष्ट लिंकर के साथ युग्मित होता है और एंटीजन-एंटीबॉडी-एंटीजन-लिंकर का एक परिसर बनाता है। परिसरों को 6-प्लेक्स प्लेट में विशिष्ट स्थानों पर प्रत्येक विशिष्ट लिंकर के माध्यम से कैप्चर किया जाता है। प्रत्येक एंटीजन के लिए, विशिष्ट लिंकर नंबर सौंपे गए थे: जीएडी-लिंकर -1, कोविद -19-लिंकर -2, आईए -2-लिंकर -3, टीटीजी-लिंकर -8, जेडएनटी 8-लिंकर -9, और प्रोइंसुल्लिन-लिंकर -10। इस आंकड़े को He et al.11 की अनुमति से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एकल ईसीएल परख और 6-प्लेक्स ईसीएल परख के बीच एएसके अध्ययन से 880 नमूनों में छह एंटीबॉडी स्तरों की तुलना। पैनल क्रमशः जीएडीए, आईएए, आईए -2 ए, जेडएनटी 8 ए, टीजीए और सीओवीआईडी -19 ए के एंटीबॉडी स्तरों की तुलना प्रदर्शित करते हैं (सीओवीआईडी -19 ए का सूचकांक (100 x गणना सूचकांक मूल्य) के रूप में प्रस्तुत किया गया था)। डॉटेड लाइनें प्रत्येक एंटीबॉडी परख के लिए परख कटऑफ का प्रतिनिधित्व करती हैं। इस आंकड़े को He et al.11 की अनुमति से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: आरबीए और 6-प्लेक्स ईसीएल परख के बीच एएसके अध्ययन से 880 नमूनों में पांच एंटीबॉडी स्तरों की तुलना। पैनल क्रमशः जीएडीए, आईएए, आईए -2 ए, जेडएनटी 8 ए और टीजीए के लिए एंटीबॉडी स्तरों की तुलना प्रदर्शित करते हैं। डॉटेड लाइनें प्रत्येक एंटीबॉडी परख के लिए परख कटऑफ का प्रतिनिधित्व करती हैं। इस आंकड़े को He et al.11 की अनुमति से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: कच्चे सीपीएस गिनती (प्लेट का बायां आधा हिस्सा)। कच्चे सीपीएस की गणना एक परख प्लेट के बाएं आधे हिस्से से प्राप्त होती है। प्रत्येक नमूना डुप्लिकेट में किया जाता है। एक ही कॉलम (ए 1, ए 2, ए 3, आदि) के भीतर प्रत्येक सीपीएस गिनती एक ही कुएं में 10 स्थानों से पढ़ने वाले डेटा का प्रतिनिधित्व करती है (संबंधित लिंकर संख्याओं को चिह्नित किया जाता है)। खराब डुप्लिकेट के उदाहरण ग्रे में हाइलाइट किए गए हैं, जैसा कि पंक्ति डी-लिंकर 3 कॉलम 5 और कॉलम 6 में देखा गया है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: तालिका 1 डेटा की व्यवस्था, छह लिंकर के साथ क्रमबद्ध। तालिका 1 से सीपीएस मानों को फिर से व्यवस्थित किया गया था, सीपीएस के डुप्लिकेट रीडिंग के लिए औसत मूल्यों की गणना की गई थी और लिंकर 4-7 के लिए अप्रयुक्त मानों को हटा दिया गया था। प्रत्येक ऑटोएंटीबॉडी परख के आंतरिक मानक उच्च सकारात्मक, कम सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के मूल्यों को गहरे बोल्ड में चिह्नित किया गया है। पीसी, सकारात्मक नियंत्रण। एनसी, नकारात्मक नियंत्रण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: अनुक्रमणिका मानों के परिणाम. सभी छह एंटीबॉडी के लिए प्रत्येक नमूने के लिए सूचकांक मूल्यों की गणना संबंधित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणों के खिलाफ की गई थी। कटऑफ मान से अधिक सूचकांक मूल्य को सकारात्मक के रूप में परिभाषित किया गया था, जिसे डार्क बोल्ड में चिह्नित किया गया था। तालिका 1, पंक्ति डी-लिंकर 3-कॉलम 5 और 6 में खराब डुप्लिकेट सीपीएस मानों ने नमूना 11 (ग्रे में हाइलाइट किया गया) के सकारात्मक आईए -2 ए सूचकांक मूल्य को जन्म दिया, जो शायद एक गलत-सकारात्मक परिणाम था। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 4: 880 एएसके नमूनों के बीच जीएडीए, आईए -2 ए, जेडएनटी 8 ए, आईएए और टीजीए के लिए परख कटऑफ, संवेदनशीलता और विशिष्टता, जिसमें 325 आईएबी सकारात्मक नमूने और 555 सभी एंटीबॉडी नकारात्मक नमूने शामिल हैं। जीएडीए, आईए -2 ए, जेडएनटी 8 ए, आईएए और टीजीए परख का इष्टतम कटऑफ इंडेक्स मूल्य 555 सामान्य नियंत्रण नमूनों के कम से कम 99 वें प्रतिशत पर सेट किया गया था। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

टी 1 डी के लिए हस्तक्षेप पूर्व-टी 1 डी युग में प्रवेश कर गया है, टी 1 डी के लिए चल रहे राष्ट्रीय और अंतर्राष्ट्रीय बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग कार्यक्रम और नैदानिक टी 1 डी 12,13 की प्रगति को निरस्त करने या धीमा करने के लिए चरण 1 टी 1 डी में तेजी से नैदानिकपरीक्षणों को लागू किया जा रहा है। एकल आईएबी परख प्रारूप के साथ वर्तमान मानक आरबीए का उपयोग करके चार आईएबी का माप बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग कार्यक्रम के लिए श्रमसाध्य और अक्षम है। उच्च-थ्रूपुट मल्टीप्लेक्स आईएबीएस परख की तत्काल मांग के साथ, मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख, 3-स्क्रीन आईसीए एलिसा, और एग्लूटीनेशन-पीसीआर (एडीएपी) द्वारा एंटीबॉडी का पता लगाना वर्तमान में प्रतिस्पर्धी प्रौद्योगिकियों के रूप में उभरा है। जर्मनी में छोटे बच्चों की आबादी में टी 1 डी के लिए स्क्रीनिंग के Fr1da अध्ययन में, 3-स्क्रीन आईसीए एलिसा संयोजन 3 IAB (GADA, IA-2A, और ZnT8A) को मुख्य परीक्षण14 के रूप में उपयोग किया गया था। 3-स्क्रीन आईसीए एलिसा की एक बड़ी सीमा आईएए की कमी है, जो ज्यादातर टी 1 डी वाले छोटे बच्चों में उच्च प्रसार के साथ दिखाई देने वाला पहला आईएबी है। इसके अलावा, परख यह भेद करने में सक्षम नहीं है कि तीन आईएबीएस में से कौन सा सकारात्मक संकेत से सकारात्मक है, और प्रत्येक सकारात्मक नमूने को पुष्टि के लिए तीन एकल परखों के साथ दोहराया जाना चाहिए। एडीएपी15 जीएडीए, आईए -2 ए और आईएए को जोड़ता है और आईएएसपी कार्यशाला में उच्च परख संवेदनशीलता और विशिष्टता का चित्रण करता है, लेकिन टी 1 डी अध्ययनों के लिए जनसंख्या-आधारित स्क्रीनिंग में यह कितना पूर्वानुमानित है, जिसके बारे में डेटा का अभाव है, जिसे आईएएसपी कार्यशाला निर्धारित करने में सक्षम नहीं है। वर्तमान अध्ययन में मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख एक एकल ईसीएल परख के मंच पर बनाई गई है जिसे ट्रेलनेट 9,16, डेज़ी 17,18,19 और एएसके 4,20,21 जैसे कई नैदानिक परीक्षणों में वर्तमान मानक आरबीए के खिलाफ मान्य किया गया है। पढ। एएसके अध्ययन के प्रतिभागियों से 880 सीरम नमूनों का उपयोग करके आरबीए और एकल ईसीएल परख दोनों के खिलाफ वर्तमान परख को मान्य किया गया है। जैसा कि चित्रा 2 और चित्रा 3 में दिखाया गया है, 6-प्लेक्स और एकल ईसीएल के बीच या 6-प्लेक्स और आरबीए के बीच एंटीबॉडी का स्तर ज्यादातर एंटीबॉडी की सकारात्मकता के लिए एक दूसरे के साथ संगत था। आरबीए और 6-प्लेक्स द्वारा परीक्षण किए गए आईएबीएस की संयोग दर 91.7% -97.8% थी, और एकल ईसीएल और 6-प्लेक्स द्वारा परीक्षण किए गए आईएबीएस की संयोग दर 95.3% -99.2% थी। ईसीएल परख और आरबीए के बीच मतभेद मुख्य रूप से एकल आईएबी वाले लोगों से था। 6-प्लेक्स और एकल ईसीएल (आर = 0.6431-0.9434, सभी पी < 0.0001) और 6-प्लेक्स और आरबीए (आर = 0.5775-0.8576, सभी पी < 0.0001) द्वारा परीक्षण किए गए आईएबीएस के स्तर भी अच्छी तरह से सहसंबद्ध थे। 6-प्लेक्स परख द्वारा परीक्षण किए गए टीजीए आरबीए (99.4%) और एकल ईसीएल परख (99.4%) दोनों के परिणामों के साथ अत्यधिक सहसंबद्ध थे। इसके अतिरिक्त, 6-प्लेक्स द्वारा परीक्षण किए गए सीओवीआईडी -19 ए एकल ईसीएल परख के परिणामों के साथ 99.8% अनुपालन तक पहुंच गया।

नतीजतन, 6-प्लेक्स ईसीएल परख को औपचारिक रूप से चल रहे एएसके अध्ययन के लिए प्राथमिक स्क्रीनिंग विधि के रूप में स्वीकार किया गया है और मानक आरबीए22 को बदल दिया गया है। इस परख ने मानक आरबीए की तुलना में उच्च थ्रूपुट, कम लागत और सीरम की छोटी मात्रा के साथ अपनी उत्कृष्ट संवेदनशीलता और विशिष्टता का प्रदर्शन किया।

यह प्रलेखित किया गया है कि, टी 1 डी स्क्रीनिंग अध्ययन में, आरबीए द्वारा पता लगाए गए एकल आईएबी, जिसने आईएबी सकारात्मकता का एक बड़ा हिस्सा लिया, कम आत्मीयता के थे, कम बीमारी के जोखिम के साथ, और इसके परिणामस्वरूप समग्र कम पूर्वानुमान मूल्य 19,21,23,24,25,26 था। इस तरह के कम जोखिम की भविष्यवाणी ने अनुवर्ती यात्राओं की भारी अतिरिक्त लागत पैदा की और इसके परिणामस्वरूप टी 1 डी निवारक अध्ययनों के लिए कठिनाइयां हुईं। स्थापित ईसीएल परख मंच को कई नैदानिक परीक्षणों में आरबीए द्वारा उत्पन्न कम-आत्मीयता वाले आईएबी से उच्च-आत्मीयता आईएबी को अलग करने और सभी चार आईएबी के लिए पूर्वानुमानमूल्यों को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ाने के लिए प्रदर्शित किया गया है, विशेष रूप से एकल आईएबी सकारात्मकता 16,17,18,21 के साथ। . मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख तकनीक एकल ईसीएल परख के मंच पर बनाई गई थी, जिसमें उच्च-आत्मीयता एबीएस का पता लगाने का यह विशिष्ट लाभ था। वर्तमान अध्ययन में, 6-प्लेक्स ईसीएल परख ने संवेदनशीलता और विशिष्टता में संबंधित एकल ईसीएल परख के साथ अपनी समानता का चित्रण किया।

कई प्लेक्स प्लेटों का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख की कुछ सीमाओं और तकनीकी चिंताओं को पहले से ही पिछले प्रकाशनों27,28 में कवर किया गया है। एक कुएं में छह लेबल एंटीजन के साथ, विभिन्न एंटीजन के बीच कुछ प्रभाव हो सकते हैं, और एक ही कुएं में मल्टीप्लेक्सिंग के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी परख जोड़ते समय परख पृष्ठभूमि बढ़ सकती है। परख स्थितियों को समायोजित करने के लिए बड़ी मात्रा में परख अनुकूलन कार्य की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से प्रत्येक एंटीजन के लिए चेकरबोर्ड परख के आधार पर प्रत्येक लेबल एंटीजन प्रोटीन की अंतिम सांद्रता को समायोजित करने के लिए, प्रत्येक एंटीबॉडी परख के लिए संवेदनशीलता और विशिष्टता बनाए रखने के लिए। जैसा कि पिछलेअध्ययनों 27,28 में उल्लेख किया गया है, नमूनों की एक छोटी संख्या (<1%) के परिणामस्वरूप स्पष्ट अंतर्निहित कारण के बिना कई प्लेक्स प्लेट पर झूठी सकारात्मकता होती है। सभी सकारात्मक परिणामों को नियमित प्रयोगशाला गुणवत्ता आश्वासन के रूप में एकल ईसीएल परख द्वारा दोहराया और पुष्टि की जानी चाहिए; आमतौर पर, झूठी सकारात्मकता को हटा दिया जाएगा। पिछले 7-प्लेक्स ईसीएल परख27,28 में देखे गए "प्रोज़ोन प्रभाव" के कारण गलत-नकारात्मक परिणाम वर्तमान अध्ययन में नहीं देखे गए थे। यहां वर्णित परख में, हमने पिछले प्रोटोकॉल से सीरम नमूनों के एसिड उपचार के चरण को हटा दिया; इसके बजाय, हमने सीरम नमूनों को 30 मिनट (चरण 5.1.) के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट किया। प्लेट धोने के दूसरे दिन, हमने प्लेट को अधिक सख्ती से धोने के लिए नियमित वॉशिंग बफर के बजाय 0.4 एम एनएसीएल (चरण 8.1.) युक्त वॉशिंग बफर का उपयोग किया। इन संशोधनों ने परख संवेदनशीलता को खोए बिना मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख को सरल और कम पृष्ठभूमि बना दिया।

अंत में, इस परख में एक साथ चार आईएबी, टीजीए और सीओवीआईडी -19 ए का पता लगाने के लिए उत्कृष्ट प्रदर्शन है। मल्टीप्लेक्सिंग फीचर, साथ ही उच्च थ्रूपुट, कम लागत और छोटे सीरम वॉल्यूम की आवश्यकता, टी 1 डी और सहवर्ती बीमारियों के लिए बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग को सामान्य आबादी में बहुत अधिक संभव बनाती है। टी 1 डी या किसी भी ऑटोइम्यून बीमारियों वाले रोगियों में अन्य ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए बहुत अधिक जोखिम होता है। मल्टीप्लेक्स ईसीएल परख टी 1 डी और कई ऑटोइम्यून बीमारियों के लिए एक साथ स्क्रीन करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

अध्ययन को जेडीआरएफ अनुदान 2-एसआरए-2019-695-एस-बी, 2-एसआरए-2020-965-एस-बी, 1-एसआरए-2017-564-M_N, एनआईएच अनुदान डीके 32083 और मधुमेह अनुसंधान केंद्र (डीआरसी) अनुदान पी 30 डीके 116073 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mM NaCl ThermoFisher 1070832
96-well Plate Shaker VWR 12620-926
96-well round bottom plate Fisher 8408220
Biotin ThermoFisher PI21329
Blocker A MSD R93AA
Bottle-Top 500 ml-Filter Units Fisher 0974064A
Bovine Serum Albumin Sigma A-7906
GAD65 protein Diamyd Medical 10-65702-01
IA-2 protein (aa 605-979) Creative BioMart 283309
MESO QuickPlex SQ120 MSD R31QQ-3 Electrochemiluminescence analyzer
PBS 10x ThermoFisher 70011044
PBS 1x ThermoFisher 10010023
Proinsulin protein AmideBio 20160118B3
Read buffer B MSD Y0800019
SARS-CoV-2 RBD protein Creative Biomart Spike-190V
Stop Solution MSD Y0090019
Sulfo-TAG MSD R91AO-1
tTG protein Diarect AG 15201
Tween 20 Sigma P-1379
U-Plex 6-Assay SECTOR plate MSD Z00U0142E 6-plex plate
U-PLEX Linker 1 MSD L0010022
U-PLEX Linker 10 MSD L0100020
U-PLEX Linker 2 MSD L0020015
U-PLEX Linker 3 MSD L0030018
U-PLEX Linker 8 MSD L0080018
U-PLEX Linker 9 MSD L0090014
ZeBa Column ThermoFisher 89892 Spin columns
ZnT8 protein Research Laboratory n/a

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References

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Jia, X., He, L., Miao, D., Zhang, C., Rewers, M., Yu, L. A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19. J. Vis. Exp. (185), e63787, doi:10.3791/63787 (2022).

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