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Medicine

मानव शुक्राणु कार्यात्मक दोषों का पता लगाने के लिए बायोमार्कर का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63790
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Toxicology, College of Preventive Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University), 2Department of Chemical Defense Medicine, College of Military Preventive Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University)

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक व्यावहारिक समाधान प्रदान करता है जो एक एकल साइटोमीटर के साथ मानव शुक्राणु में एपोप्टोसिस, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और डीएनए क्षति के माप की अनुमति देता है।

Abstract

पारंपरिक वीर्य पैरामीटर विश्लेषण व्यापक रूप से पुरुष प्रजनन क्षमता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, अध्ययनों में पाया गया है कि ~ 15% बांझ रोगी पारंपरिक वीर्य मापदंडों में कोई असामान्यता नहीं दिखाते हैं। इडियोपैथिक बांझपन की व्याख्या करने और सूक्ष्म शुक्राणु दोषों का पता लगाने के लिए अतिरिक्त तकनीकों की आवश्यकता होती है। वर्तमान में, शुक्राणु एपोप्टोसिस, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमएमपी), और डीएनए क्षति सहित शुक्राणु समारोह के बायोमार्कर, आणविक स्तर पर शुक्राणु शरीर विज्ञान को प्रकट करते हैं और पुरुष प्रजनन क्षमता की भविष्यवाणी करने में सक्षम हैं।

फ्लो साइटोमेट्री (एफसीएम) तकनीकों के साथ, इनमें से प्रत्येक मार्कर को मानव वीर्य के नमूनों में तेजी से, सटीक और सटीक रूप से मापा जा सकता है, लेकिन समय की लागत काफी बढ़ जाती है और परिणाम बाधित हो सकते हैं यदि सभी बायोमाकर्स को एक ही साइटोमीटर के साथ परीक्षण करने की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, द्रवीकरण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संग्रह और तत्काल इनक्यूबेशन के बाद, वीर्य के नमूनों का एनेक्सीन वी-फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी)/प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) धुंधला होने का उपयोग करके शुक्राणु एपोप्टोसिस के लिए आगे विश्लेषण किया गया। एमएमपी को 5,5', 6,6'-टेट्राक्लोरो-1,1', 3,3'-टेट्राइथाइल-बेंजिमिडाज़ोलिलकार्बोसाइनिन आयोडाइड (जेसी -1) जांच के साथ लेबल किया गया था, और डीएनए क्षति का आकलन शुक्राणु क्रोमैटिन संरचना परख (एससीएसए) का उपयोग करके किया गया था। इस प्रकार, शुक्राणु समारोह मार्करों का प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण बांझपन के निदान और बेंच और बिस्तर दोनों पर शुक्राणु समारोह के मूल्यांकन के लिए एक व्यावहारिक और विश्वसनीय टूलकिट हो सकता है।

Introduction

बांझपन एक सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या बन गई है, जिसमें पुरुष बांझपनसभी मामलों में 40% -50% का योगदान देता है। यद्यपि पारंपरिक वीर्य गुणवत्ता विश्लेषण पुरुष प्रजनन क्षमता का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, बांझपन वाले लगभग 15% रोगियों में शुक्राणुओं की संख्या, गतिशीलता और आकृति विज्ञानजैसे सामान्य शुक्राणु पैरामीटर होते हैं। इसके अलावा, नियमित शुक्राणु परीक्षाओं में खराब पुनरावृत्ति होती है, शुक्राणु समारोह पर सीमित जानकारी प्रदान करते हैं, और पुरुष प्रजनन क्षमता का सटीक मूल्यांकन नहीं दे सकते हैं या शुक्राणु के सूक्ष्म दोषों को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। शुक्राणु समारोह का परीक्षण करने के लिए कई तकनीकें विकसित की गई हैं, जैसे कि हेमिज़ोना परख (एचजेडए), शुक्राणु प्रवेश परख, हाइपो-आसमाटिक सूजन परीक्षण, एंटीस्पर्म एंटीबॉडी परीक्षण, लेकिन ये विधियां समय लेने वाली हैं और ऑपरेटरों के व्यक्तिपरक प्रभावों के प्रति संवेदनशील हैं। इसलिए, शुक्राणु समारोह विश्लेषण के लिए तेजी से और सटीक तरीके विकसित करना आवश्यक है।

एफसीएम 1970 के दशक में विकसित एक तेज़, एकल-कोशिका विश्लेषण तकनीक है, जिसका व्यापक रूप से सेल जीव विज्ञान और चिकित्सा के विभिन्न क्षेत्रों में उपयोग किया गया है। एफसीएम शुक्राणु समारोह के मूल्यांकन के लिए एक मजबूत उपकरण है जो एक विशिष्ट प्रतिदीप्ति जांच4 के साथ लेबल किए गए शुक्राणुओं का विश्लेषण करता है। शुक्राणु एकल या बहु-चैनल लेजर से गुजरते हैं, और बिखरे हुए प्रकाश और उत्सर्जित प्रतिदीप्ति एक लेजर बीम द्वारा निर्मित होते हैं। बिखरे हुए प्रकाश में आगे बिखरे हुए प्रकाश (एफएससी) और साइड बिखरे हुए प्रकाश (एसएससी) शामिल हैं, जो परीक्षण किए गए सेल के आकार और सेल ग्रैन्यूलैरिटी या आंतरिक संरचना को दर्शाता है। इन संकेतों को कंप्यूटर सिस्टम द्वारा एकत्र, प्रदर्शित और विश्लेषण किया जाता है, और, परिणामस्वरूप, शुक्राणुओं से विशेषताओं की एक श्रृंखला को जल्दी और सटीक रूप से मापा जाता है। इसलिए, एफसीएम एक तेज, उद्देश्यपूर्ण, बहु-आयामी और उच्च-थ्रूपुट तकनीक है जिसने शुक्राणु विश्लेषण के क्षेत्र में बढ़ते ध्यान को आकर्षित किया है। एफसीएम का आवेदन पारंपरिक तरीकों में कमियों को पूरा कर सकता है और शुक्राणु आंतरिक संरचना और कार्य का पता लगाने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है।

शुक्राणु एपोप्टोसिस पुरुष प्रजनन क्षमतासे निकटता से संबंधित है। शुक्राणु एपोप्टोसिस का पता लगाना आणविक स्तर पर शुक्राणु समारोह का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण सूचकांक है। एफसीएम को व्यापक रूप से एनेक्सीन वी-एफआईटीसी / पीआई स्टेनिंग का उपयोग करके शुक्राणु एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय और संवेदनशील विधि के रूप में मान्यता प्राप्त है। मूल सिद्धांत यह है कि एपोप्टोसिस के प्रारंभिक चरण में फॉस्फेटिडिलसेरिन (पीएस) कोशिका झिल्ली की आंतरिक परत से इसकी बाहरी परत में स्थानांतरित हो जाता है। एनेक्सिन वी एक सीए2 + -निर्भर फॉस्फोलिपिड प्रोटीन (आमतौर पर एफआईटीसी द्वारा लेबल) है जिसमें पीएस के लिए एक उच्च संबंध है, इस प्रकार, कोशिका झिल्ली6 की बाहरी सतह के संपर्क में आने वाले पीएस का पता लगाता है। नेक्रोसिस और एपोप्टोसिस को पीएल स्टेनिंग के साथ संयोजन में अलग किया जा सकता है। इसलिए, एनेक्सीन वी-एफआईटीसी / पीआई डबल स्टेनिंग की विधि का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह विभिन्न एपोप्टोटिक शुक्राणु कोशिकाओं का पता लगाने के लिए तेज़, सरल और आसान है।

एक परिपक्व स्तनधारी शुक्राणु में लगभग 72-80 माइटोकॉन्ड्रिया7 होते हैं, जो शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रिया8 के प्रतिधारण के लिए जैविक कारण का सुझाव देते हैं। शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रिया शुक्राणु गतिशीलता औरप्रजनन क्षमता को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते पाए गए हैं। जेसी -1 दाग, जिसे विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में एमएमपी के संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि मूल्यांकन10 के लिए सबसे लोकप्रिय फ्लोरोक्रोम में से एक है। जेसी -1 एक धनिक डाई है जो संभावित रूप से माइटोकॉन्ड्रिया में जमा होता है। जेसी -1 में 525 एनएम (हरा) पर अधिकतम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन होता है और उच्च क्षमता वाले झिल्ली से बंधने पर जे-समुच्चय 11 बनाता है ( 80-100 एमवी), जिसके परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति उत्सर्जन ~ 590 एनएम (नारंगी-लाल) में बदलाव होता है। नतीजतन, शुक्राणु माइटोकॉन्ड्रियल विध्रुवण लाल / हरे प्रतिदीप्ति तीव्रता अनुपात में कमी से संकेत मिलता है, और एफसीएम का उपयोग मानव वीर्य के नमूनों में एमएमपी के स्तर का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।

एससीएसए पद्धति का आविष्कार इवनसन एट अल.12 द्वारा किया गया था, और इसे 1,024 × 1,024 चैनल स्केल 13 पर अद्वितीय दोहरे-पैरामीटर डेटा (लाल बनाम हरे रंग की प्रतिदीप्ति) के साथ एक सटीक और दोहराने योग्य परीक्षण माना जाता है। क्षतिग्रस्त शुक्राणु में, शुक्राणु नाभिक में डीएनए और परिवर्तित प्रोटीन को एओ द्वारा लेबल किया जाता है, और डीएनए स्ट्रैंड के टूटने को लाल प्रतिदीप्ति द्वारा मापा जाता है, जबकि बरकरार डबल स्ट्रैंड एफसीएम14 में हरे रंग की प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करते हैं। आजकल, शुक्राणु डीएनए अखंडता का अनुमान लगाने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। हालांकि, एससीएसए के विपरीत, ये परख अक्सर श्रम-गहन होते हैं और पुरुष बांझपन के निदान की क्षमता की कमी होती है। एससीएसए परीक्षण के परिणाम मानव डीएनए गर्भावस्था और गर्भपात के साथ महत्वपूर्ण रूप से सहसंबंधित हैं, सम्मोहक सबूत प्रदान करते हैं कि एससीएसए मानव वीर्य विश्लेषण में उपयोगी हो सकता है, और बांझपन चिकित्सकों के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में काम करसकता है।

क्रोमैटिन अखंडता, एमएमपी और एपोप्टोसिस शुक्राणु समारोह के विभिन्न पहलुओं को दर्शाते हैं, और इस प्रकार, इन बायोमाकर्स का संयोजन शुक्राणु की स्थिति में अधिक व्यापक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। एफसीएम का उपयोग मानव वीर्य नमूनों में क्रोमैटिन अखंडता, एमएमपी या एपोप्टोसिस के अलग-अलग माप के लिए किया जा सकता है। यद्यपि एफसीएम की लागत और रंगों की लागत ने प्रजनन स्वास्थ्य के लिए नैदानिक प्रयोगशालाओं में इन तकनीकों के व्यापक अनुप्रयोग को सीमित कर दिया है, लेकिन प्रजनन अनुमान के लिए उनके मूल्य को स्वीकार किया जा रहा है।

हालांकि, चूंकि प्रत्येक प्रयोग के लिए शुक्राणु के नमूनों की पूर्व-चिकित्सा की आवश्यकता होती है, और सभी पूर्वउपचारित नमूनों को जल्द से जल्द परीक्षण करने की आवश्यकता होती है, एक ही एफसीएम के साथ एक नमूने के लिए सभी तीन बायोमाकर्स के एक साथ माप से कुछ प्रयोगों के लिए लंबा इंतजार करना पड़ सकता है और परिणामों की विश्वसनीयता में बाधा उत्पन्न हो सकती है। ऐसा इसलिए है क्योंकि प्रतीक्षा प्रक्रिया के दौरान शुक्राणुओं को अतिरिक्त क्षति प्राप्त होती है, अगर प्रोटोकॉल को पूरी तरह से ध्यान में रखते हुए सभी तीन प्रयोगों को ठीक से व्यवस्थित नहीं किया जाता है। यह पेपर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो लंबे समय तक प्रतीक्षा समय से प्रेरित प्रयोग की गुणवत्ता के पर्याप्त समझौते के बिना एक ही साइटोमेट्री में सभी तीन बायोमाकर्स के धाराप्रवाह माप का एहसास करता है।

Protocol

नोट: फ्लो साइटोमेट्री द्वारा शुक्राणु समारोह क्षति के लिए बायोमार्कर का पता लगाने के लिए वर्कफ़्लो में (1) सेल तैयारी, (2) फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों के साथ धुंधलापन, और (3) फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण और डेटा व्याख्या (चित्रा 1) शामिल हैं। प्रोटोकॉल आर्मी मेडिकल यूनिवर्सिटी (1.0/2013.4-12) की आचार समितियों के दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. सेल की तैयारी

  1. प्लास्टिक नैदानिक नमूना जार में हस्तमैथुन द्वारा मानव वीर्य के नमूने प्राप्त करें, अधिमानतः संयम के 3-5 दिनों के बाद।
  2. वीर्य के नमूनों को तुरंत 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें और नमूनों को पूरी तरह से द्रवित करें (1 घंटे तक)।

2. कंप्यूटर एडेड शुक्राणु विश्लेषण (CASA) का उपयोग करके शुक्राणु कोशिकाओं की गणना

  1. तरलीकृत वीर्य के नमूनों को अच्छी तरह से मिलाएं।
  2. शुक्राणु गिनती कक्ष में वीर्य के 10 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. शुक्राणु वर्ग विश्लेषक ( सामग्री की तालिका देखें) में स्लाइड स्कैन करें, और शुक्राणु एकाग्रता के अनुमान के लिए कम से कम छह क्षेत्रों और 400 शुक्राणुओं की गणना करें।
    नोट: शुक्राणु एपोप्टोसिस और एमएमपी विश्लेषण के लिए वीर्य के नमूने ताजा होने चाहिए, जमे हुए नहीं।

3. शुक्राणु कोशिकाओं को धुंधला करना

  1. एनेक्सीन वी-एफआईटीसी/पीआई स्टेनिंग का उपयोग करके शुक्राणु एपोप्टोसिस का पता लगाना
    1. 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1 ×10 6 शुक्राणु कोशिकाओं को जोड़ें।
    2. कोशिकाओं को 500 μL ठंडे फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ धोएं।
    3. शुक्राणु कोशिका निलंबन को 7 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    4. शुक्राणु कोशिकाओं को 1x बाइंडिंग बफर के 200 μL में पुन: निलंबित करें।
    5. एफआईटीसी एनेक्सिन वी के 2 μL और पीआई के 2 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    6. कोशिकाओं को धीरे से भंवर करें, अंधेरे में कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और विश्लेषण के लिए उन्हें तुरंत प्रवाह साइटोमीटर में रखें।
  2. जेसी -1 जांच का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का विश्लेषण
    1. 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 2 × 106 शुक्राणु कोशिकाओं को जोड़ें और 5 मिनट के लिए 600 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. जेसी -1 कामकाजी समाधान के 1 एमएल में शुक्राणु कोशिका निलंबन को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. धीरे से कोशिकाओं को भंवर करें और अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. 5 मिनट के लिए 600 × ग्राम पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    5. प्रत्येक 5 मिनट के लिए 600 × ग्राम की गति से 1 एमएल पीबीएस के साथ गोली को दो बार धोएं।
    6. प्रवाह साइटोमीटर ट्यूबों में पीबीएस के 1 एमएल में रंगे हुए शुक्राणु कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और विश्लेषण के लिए ट्यूबों को तुरंत प्रवाह साइटोमीटर में रखें।
    7. कार्बोनिल साइनाइड एम-क्लोरोफिनाइल हाइड्राज़ोन (सीसीसीपी) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में करें। सीसीसीपी वर्किंग सॉल्यूशन के 1 एमएल में शुक्राणु कोशिकाओं (जैसा कि पहले चरण 3.2.1 में वर्णित है) को पुन: निलंबित करें ( सामग्री की तालिका देखें), और धीरे से कोशिकाओं को भंवर करें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 5 मिनट के लिए 600 × ग्राम पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। चरण 3.2.2-3.2.6 दोहराएँ।
  3. शुक्राणु क्रोमैटिन संरचना परख
    1. तरलीकृत कच्चे वीर्य (0.25 एमएल) का एक एलिकोट एक क्रायोट्यूब में रखें, और तुरंत तरल नाइट्रोजन (-196 डिग्री सेल्सियस) में वीर्य के नमूनों को फ्रीज करें जब तक कि एससीएसए के लिए तैयार न हो।
    2. वीर्य के नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघलाएं और उन्हें टीएनई बफर ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ 1-2 × 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता तक पतला करें।
    3. एक प्रवाह साइटोमीटर टेस्ट ट्यूब में पतला नमूने के 200 μL जोड़ें और इसे 30 s के लिए 400 μL एसिड समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ मिलाएं।
    4. नमूनों को 1.2 एमएल एओ धुंधला समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ दाग दें और विश्लेषण के लिए तुरंत प्रवाह साइटोमीटर में रखें।
    5. साइटोमीटर सेट-अप और अंशांकन प्रवाह के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में एक संदर्भ नमूने का उपयोग करें। 4 डिग्री सेल्सियस टीएनई बफर के साथ संदर्भ नमूने को 1-2 × 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता तक पतला करें। चरण 3.3.1-3.3.4 दोहराएँ।
      नोट: सभी समाधान और बफर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं। (1) फ्लैश फ्रीजिंग से पहले वीर्य को पतला नहीं किया जाना चाहिए। प्रवाह साइटोमेट्री माप के समय कच्चे वीर्य के नमूनों को टीएनई बफर के साथ पिघलाया और पतला किया जाना चाहिए। (2) बांझपन क्लीनिक के लिए, ~ 0.25 एमएल कच्चे वीर्य को अल्ट्राकोल्ड फ्रीजर या एलएन 2 टैंक में फ्लैश-जमे हुए होना चाहिए। इन जमे हुए एलिकोट को तब सूखी बर्फ पर या एलएन 2 ड्राई शिपर में एससीएसए नैदानिक प्रयोगशाला में भेजा जा सकता है। (3) एक मानव स्खलन नमूना जो डीएनए अखंडता की विषमता को प्रदर्शित करता है (उदाहरण के लिए, 15% डीएनए विखंडन सूचकांक [डीएफआई]) का उपयोग आंतरिक मानक संदर्भ के रूप में किया गया था।

4. फ्लो साइटोमीटर सेटअप

नोट: फ्लो साइटोमीटर शुरू करने से पहले, विश्लेषणात्मक प्रदर्शन को सत्यापित करने के लिए उपकरण की सिस्टम जांच की जानी चाहिए। सभी जांच पूरी होने और पारित होने के बाद नमूने चलाएं।

  1. फ्लो साइटोमीटर सॉफ्टवेयर खोलें और साइटोमीटर शुरू करें।
  2. नमूना डेटा एकत्रित करें.
    1. सबसे पहले, प्रवाह साइटोमीटर पर एक नियंत्रण नमूना लोड करें, और डेटा संग्रह शुरू करने के लिए चलाएं पर क्लिक करें (यदि आवश्यक हो तो सेटिंग्स समायोजित करें)। उपकरण के नमूने को स्कैन करना शुरू करने की प्रतीक्षा करें और पता लगाई गई घटनाओं का वास्तविक समय पूर्वावलोकन प्रदान करें।
      नोट: नियंत्रण नमूना: शुक्राणु एपोप्टोसिस के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण (बिना दाग वाले शुक्राणु कोशिकाएं); एमएमपी के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण (सीसीसीपी-उपचारित कोशिकाएं); एससीएसए के लिए एक संदर्भ नमूना।
    2. डेटा देखने के लिए डॉट प्लॉट बनाएं और x/y-अक्ष पैरामीटर (जैसे FSC, SSC) का चयन करें और डेटा निर्दिष्ट करने के लिए रैखिक प्रदर्शित होते हैं। विश्लेषण के लिए शुक्राणु आबादी को चित्रित करने के लिए एक बहुभुज द्वार का चयन करें और लागू करें, और ताकि उपकरण वास्तविक समय में घटनाओं का पता लगा सके।
    3. क्षेत्र के भीतर शुक्राणु की घटनाओं का विश्लेषण करें।
      1. शुक्राणु एपोप्टोसिस के लिए, एफएल 1 को एक्स-अक्ष के रूप में और एफएल 2 को एक्स-अक्ष के रूप में सेट करें। जीवित, एपोप्टोटिक या नेक्रोटिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए, शुक्राणु आबादी को चार विशिष्ट आबादी तक उप-समूह करने के लिए क्वाड्रंट गेट को टैप और खींचें।
      2. एमएमपी के लिए, एफएल 1 को एक्स-अक्ष के रूप में और एफएल 2 को वाई-अक्ष के रूप में सेट करें। शुक्राणु आबादी को दो विशिष्ट आबादी तक उप-समूह करने के लिए एक बहुभुज द्वार बनाएं।
      3. एससीएसए के लिए, एफएल 4 को एक्स-अक्ष (लाल प्रतिदीप्ति, 125/1,024 फ्लो साइटोमेट्री चैनल) और एफएल 1 को वाई-अक्ष (ग्रीन फ्लोरेसेंस, 475/1,024 फ्लो साइटोमेट्री चैनल) के रूप में सेट करें। सेलुलर मलबे संकेतों को बाहर करने के लिए 45 ° कोण पर गेट खींचें।
    4. डेटा एकत्र करना कब बंद करना है, यह इंगित करने के लिए रन सीमा सेट करें. शुक्राणु एपोप्टोसिस, एमएमपी और एससीएसए विश्लेषण के लिए प्रत्येक नमूने के लिए कुल 10,000 शुक्राणु कोशिकाओं की गणना करें।
    5. सेल संख्याओं के आधार पर फ्लुइडिक्स दर (धीमी, मध्यम और तेज, या कस्टम फ्लुइडिक्स दर) सेट करें।
      नोट: एससीएसए विश्लेषण के लिए, शुक्राणु सांद्रता निर्धारित करने के लिए, जमे हुए कच्चे नमूने को पिघलाएं और इसे एफसीएम पर चलाएं। यदि प्रवाह दर > 250 / सेकंड है, तो नमूने को सही प्रवाह दर में पतला करें। सभी नमूनों को स्वतंत्र रूप से दो बार मापें, और औसत मूल्यों की गणना करें। एक संदर्भ नमूने का परीक्षण किया गया था जब प्रत्येक 10-15 नमूने को दिन-प्रतिदिन उपकरण के मानकीकरण और स्थिरता को सुनिश्चित करने के लिए मापा गया था।
    6. सेल नमूनों से मलबे और शोर को खत्म करने के लिए दहलीज निर्धारित करें। प्रयोग में सभी नमूनों के लिए ये सेटिंग्स लागू करें।
    7. यदि आवश्यक हो, तो प्रतिदीप्ति स्पिलओवर को सही करने के लिए रंग मुआवजा सेट करें।
    8. फ्लो साइटोमीटर पर लोड करने से पहले नमूनों को धीरे से बैक-पिपेट करें, नमूने को नाम दें, और नमूने चलाएं।
    9. एक बार सभी नमूने चलाए जाने के बाद, नमूना डेटा को आगे के सॉफ़्टवेयर विश्लेषण के लिए एक फ़ाइल नाम देकर एफसीएस फ़ाइलों के रूप में सहेजें। भविष्य के रन (वैकल्पिक) में पुनर्प्राप्ति के लिए वर्तमान प्रयोग के कार्य टेम्पलेट को सहेजें।

5. डेटा विश्लेषण

  1. प्रवाह साइटोमीटर के लिए डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में डेटा आयात करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. कार्यस्थान में पहला नमूना डबल-क्लिक करें. एक ग्राफ विंडो खुलने तक प्रतीक्षा करें, जो एफएससी बनाम एसएससी मापदंडों के साथ घटनाओं का एक प्लॉट दिखाता है। एक गेट बनाएं जो गेट के भीतर शामिल शुक्राणु आबादी को अलग करता है, घटनाओं के मूल सेट से 'बच्चे' की आबादी का उत्पादन करता है।
  3. गेटेड क्षेत्र के भीतर डबल-क्लिक करें, और केवल शुक्राणु घटनाओं वाली एक नई ग्राफ विंडो खोलें। फ्लोरोसेंट चैनल का चयन करने के लिए एक्स- और वाई-अक्ष पैरामीटर सेट करें।
  4. गेट उपकरण का चयन करें। गेट दिखाई देने के लिए प्लॉट के भीतर क्लिक करें, ताकि बनाए गए गेट विभिन्न सेल आबादी को अलग कर सकें।
  5. हाइलाइट की गई पंक्तियों में से किसी पर राइट-क्लिक करें (या नियंत्रण-क्लिक करें), और समूहीकृत करने के लिए विश्लेषण की प्रतिलिपि बनाएँ का चयन करें. समूह के भीतर सभी नमूनों पर गेटिंग ट्री लागू करें।
  6. डेटा तालिका सहेजें और निर्यात करें.

Representative Results

चित्रा 2 एनेक्सिन वी-एफआईटीसी / पीआई स्टेनिंग का उपयोग करके शुक्राणु एपोप्टोसिस के माप को दर्शाता है। एफआईटीसी सिग्नल (ग्रीन फ्लोरेसेंस) को एफएल 1 चैनल में मापा गया था, और पीआई सिग्नल (लाल प्रतिदीप्ति) को एफएल 2 चैनल में मापा गया था। एनेक्सिन वी / पीआई द्विभिन्नरूपी विश्लेषण में, क्वाड्रंट निर्माताओं ने चार विशिष्ट शुक्राणु आबादी की पहचान की। परिणामों को एनेक्सीन वी-/पीआई-शुक्राणु (व्यवहार्य या जीवित कोशिकाएं), एनेक्सिन वी+/पीआई− शुक्राणु (प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाएं या एपोप्टोटिक कोशिकाएं), एनेक्सिन वी+/पीआई+ शुक्राणु (देर से एपोप्टोटिक कोशिकाएं), और एनेक्सिन वी-/पीआई+ शुक्राणु (नेक्रोटिक कोशिकाएं) 16,17 (चित्रा 2बी) के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया था। मुआवजे और क्वाड्रेंट्स (चित्रा 2 ए) को स्थापित करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण (बिना दाग वाले शुक्राणु कोशिकाओं) का भी उपयोग किया गया था।

चित्रा 3 मानव शुक्राणु में जेसी -1 जांच का उपयोग करके एमएमपी के माप को दर्शाता है। एमएमपी % को साइटोग्राम का विश्लेषण करके नारंगी-लाल/ (हरा + नारंगी-लाल) प्रतिदीप्ति अनुपात के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। एक अच्छी गुणवत्ता वाला वीर्य नमूना आमतौर पर उच्च नारंगी-लाल प्रतिदीप्ति और कम हरे रंग की प्रतिदीप्ति (सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया, ऊपरी-बाएं चतुर्थांश) दिखाता है (चित्रा 3 ए)। इसके विपरीत, एक खराब गुणवत्ता वाला वीर्य नमूना आमतौर पर कम नारंगी-लाल प्रतिदीप्ति और उच्च हरे रंग की प्रतिदीप्ति (निष्क्रिय माइटोकॉन्ड्रिया, निचले-दाएं चतुर्थांश) दिखाता है, संभवतः माइटोकॉन्ड्रियल व्यवधान के कारण (चित्रा 3 बी)।

चित्र 4 एससीएसए13,14 के डेटा को दर्शाता है। ये विशिष्ट एससीएसए साइटोग्राम दो अलग-अलग नमूनों से प्राप्त किए गए थे। नमूना A एक उपजाऊ आदमी से आया था और नमूना B एक आदमी से आया था। फ्लोजो सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्रिक डेटा का विश्लेषण किया गया था। साइटोग्राम एससीएसए डेटा के प्रत्येक घटक का स्रोत दिखाते हैं। एक्स-अक्ष (लाल प्रतिदीप्ति के 1,024 उन्नयन के साथ लाल प्रतिदीप्ति) खंडित डीएनए को इंगित करता है; वाई-अक्ष (1,024 उन्नयन के साथ हरी प्रतिदीप्ति) देशी डीएनए दाग को इंगित करता है। y = 750 पर बिंदीदार रेखा सामान्य शुक्राणु की सीमा का प्रतिनिधित्व करती है। वाई = 750 की उस रेखा के ऊपर आंशिक रूप से असंघनित क्रोमैटिन वाले शुक्राणु हैं, जिन्हें अपरिपक्व शुक्राणु के रूप में निर्धारित किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: फ्लो साइटोमेट्री द्वारा शुक्राणु समारोह क्षति के लिए बायोमार्कर का पता लगाने के लिए वर्कफ़्लो। प्रोटोकॉल चरण 1 में वर्णित के रूप में वीर्य के नमूने प्राप्त किए गए और पूर्वनिर्धारित किए गए। (1) सेल तैयारी, (2) फ्लोरोसेंट अभिकर्मकों के साथ धुंधलापन, और (3) फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण और डेटा व्याख्या। संक्षेप: एमएमपी = माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता; एससीएसए = शुक्राणु क्रोमैटिन संरचना परख; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; एओ = एक्रिडीन नारंगी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एनेक्सिन वी-एफआईटीसी / पीआई धुंधला का उपयोग करके शुक्राणु एपोप्टोसिस के प्रतिनिधि परिणाम। निचले बाएं क्वाड्रंट में एनेक्सीन वी-/पीआई - शुक्राणु (व्यवहार्य या जीवित कोशिकाएं) होते हैं, निचले दाएं क्वाड्रंट में एनेक्सीन वी + / पीआई - शुक्राणु (प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाएं या एपोप्टोटिक कोशिकाएं) दिखाई देती हैं, ऊपरी दाएं चतुर्थांश एनेक्सिन वी + / पीआई + शुक्राणु (देर से एपोप्टोटिक कोशिकाएं) का प्रतिनिधित्व करता है, और ऊपरी बाएं चतुर्थांश में एनेक्सिन वी -/ पीआई + शुक्राणु (नेक्रोटिक कोशिकाएं) होता है। (ए) नकारात्मक नियंत्रण (बिना दाग वाले शुक्राणु कोशिकाएं); (बी) शुक्राणु एपोप्टोसिस के साथ एक नमूना। संक्षेप: एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; पीआई = प्रोपिडियम आयोडाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: जेसी -1 जांच का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का माप । (ए) उच्च एमएमपी के साथ शुक्राणु उप-जनसंख्या। (बी) कम एमएमपी के साथ शुक्राणु उप-जनसंख्या। एफएल 1-ए और एफएल 2-ए को क्रमशः एक्स अक्ष (हरी प्रतिदीप्ति) और वाई-अक्ष (नारंगी-लाल प्रतिदीप्ति) के रूप में सेट करें। संक्षेप: एमएमपी = माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: शुक्राणु क्रोमैटिन संरचना परख का उपयोग करके मानव शुक्राणु में डीएनए क्षति का पता लगाना। (ए) सामान्य क्रोमैटिन संरचना के साथ एक वीर्य का नमूना। (बी) असामान्य क्रोमैटिन संरचना के साथ शुक्राणुओं के उच्च अनुपात के साथ एक वीर्य का नमूना। फ्लोजो सॉफ्टवेयर का उपयोग सेल आबादी के चारों ओर कंप्यूटर गेट बनाने के लिए किया गया था: 1) सामान्य शुक्राणु, 2) एचडीएस शुक्राणु, 3) डीएफआई शुक्राणु, और 4) सेल मलबे, और एचडीएस और डीएफआई शुक्राणु के प्रतिशत की गणना की गई थी। संक्षिप्त नाम: एससीएसए = शुक्राणु क्रोमैटिन संरचना परख; एचडीएस = उच्च डीएनए दाग; डीएफआई = डीएनए विखंडन सूचकांक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

क्रोमैटिन अखंडता, एमएमपी, और मानव शुक्राणुओं के एपोप्टोसिस को प्रजनन परिणामों के मूल्यवान भविष्यवक्ता के रूप में पाया गया है। मानव वीर्य की जांच और प्रसंस्करण के लिए नवीनतम जारी डब्ल्यूएचओ प्रयोगशाला मैनुअल (छठा संस्करण) ने इनमें से कुछ संकेतकों (क्रोमैटिन अखंडता और एपोप्टोसिस) को शुक्राणुओं की संख्या18 जैसे नियमित मापदंडों की बुनियादी परीक्षा से परे विस्तारित परीक्षाओं के रूप में भी उजागर किया। हाल के प्रकाशनों से यह भी पता चलता है कि ये संकेतक बाहरी खतरनाक जोखिमों की प्रतिक्रिया के अधिक संवेदनशील मार्कर हो सकते हैं, जो पहले चरण19,20 में प्रजनन क्षति की पहचान के लिए उनकी क्षमता का संकेत देते हैं। नियमित परीक्षाओं के साथ इन संकेतकों का संयोजन शुक्राणु शिथिलता की प्रोफ़ाइल और आबादी में पुरुष प्रजनन क्षति की जटिलता के बारे में अधिक व्यापक समझ प्रदान कर सकता है।

कई प्रमुख मुद्दे हैं जो एफसीएम के साथ शुक्राणु विश्लेषण की सफलता को काफी हद तक निर्धारित करते हैं। सबसे पहले, शुक्राणु एमएमपी और एपोप्टोसिस के माप के लिए वीर्य को तरलीकृत करने के बाद तत्काल परीक्षा की आवश्यकता होती है। समय लागत को कम करने के लिए, दो तकनीशियन अलग से एमएमपी और एक नमूने के एपोप्टोसिस विश्लेषण के पूर्व-उपचार का प्रभार ले सकते हैं। चूंकि एपोप्टोसिस की प्रथागत सरल है, यह एमएमपी विश्लेषण की तुलना में तेजी से प्रवाह-साइटोमेट्रिक चरण में स्थानांतरित हो जाएगा। एससीएसए विश्लेषण के लिए, ताजा वीर्य के नमूनों को द्रवीकरण के बाद उपलब्धता पर तुरंत क्रायोसंरक्षित किया जाना चाहिए। शुक्राणु के नमूने तब अपेक्षाकृत लंबी अवधि के लिए तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किए जा सकते हैं और तत्काल परीक्षा की आवश्यकता नहीं होती है।

तदनुसार, प्रयोग की इन-साइट समय लागत को 40 मिनट तक संपीड़ित किया जा सकता है, जो एमएमपी विश्लेषण की अवधि और शुक्राणु विश्लेषण का प्रवाह-साइटोमेट्रिक चरण है। दूसरा, फ्लो साइटोमेट्रिक प्लेटफॉर्म में गेटिंग का सेटअप नमूने के प्रत्येक बैच के लिए अलग से तय किया जाना चाहिए। स्कैटर प्लॉट में स्पष्ट सेल उपसमूहों वाले शुक्राणु के नमूने को गेटिंग क्षेत्र को खींचने के लिए संदर्भ के रूप में चुना जा सकता है। तीसरा, चूंकि इस प्रयोग के संकेतकों के लिए कोई व्यापक रूप से स्वीकृत नैदानिक संदर्भ मूल्य नहीं हैं, ऐतिहासिक परिणामों का उपयोग गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में किया जा सकता है। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण ों को माप के प्रत्येक बैच में सेट करने के लिए भी प्रोत्साहित किया जाता है, खासकर एससीएसए और एमएमपी के लिए।

यहां प्रदान किए गए शुक्राणु विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम एक Accuri C6 का उपयोग करके प्राप्त किए गए हैं। हालांकि, तकनीक को मामूली संशोधन के साथ अन्य वाणिज्यिक प्लेटफार्मों पर लागू किया जा सकता है। आमतौर पर, सभी संकेतकों के माप के लिए आवश्यकता को पूरा करने के लिए कुल 5 × 106 शुक्राणु कोशिकाओं की आवश्यकता होगी। यदि एक नमूने की शुक्राणु एकाग्रता औसत स्तर से बहुत कम है, तो वीर्य की मात्रा की आवश्यकता बढ़ जाएगी।

नियमित शुक्राणु मापदंडों के समान, क्रोमैटिन अखंडता, एमएमपी और मानव शुक्राणु21 के एपोप्टोसिस में ध्यान देने योग्य इंट्राइंडिविजुअल भिन्नता भी है। तदनुसार, अलग-अलग समय पर एकत्र किए गए नमूनों के कई परीक्षण शुक्राणु समारोह क्षति स्तर का अधिक सटीक अनुमान प्रदान कर सकते हैं। हालांकि फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए शुक्राणु के नमूने से पहले संयम की कोई अनुशंसित अवधि नहीं है, डब्ल्यूएचओ द्वारा नियमित शुक्राणु विश्लेषण के लिए सुझाए गए 2-7 दिनों के स्खलन संयम को अपनाया जा सकता है। यह प्रयोगशालाओं के बीच और एक ही आदमी से एकत्र किए गए विभिन्न नमूनों के बीच परिणामों की तुलनात्मकता में सुधार करने में मदद कर सकता है।

इस विधि की एक बड़ी सीमा यह है कि तीन परीक्षण किए गए बायोमाकर्स में से दो - एपोप्टोसिस और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता - ताजा वीर्य के नमूने की आवश्यकता होती है। यह उनके आवेदन को उन पुरुषों तक सीमित कर सकता है जो प्रयोगशाला में वीर्य के नमूने प्रदान कर सकते हैं। डीएनए क्षति (एससीएसए) के परीक्षण के लिए, प्रवाह साइटोमीटर को कैलिब्रेट करने के लिए प्रयोग से पहले संदर्भ नमूने तैयार किए जाने चाहिए। ध्यान दें, वर्तमान प्रोटोकॉल के आवेदन के लिए प्रयोगशाला में एक एफसीएम उपकरण की आवश्यकता होती है, जो अभी भी कई नैदानिक प्रयोगशालाओं के लिए काफी चुनौती है, हालांकि कुछ क्षेत्रों में तीसरे पक्ष की सेवा के साथ सहयोग एक वैकल्पिक विकल्प हो सकता है।

इसके अतिरिक्त, रंजक और अन्य अभिकर्मकों का खर्च भी पुरुषों के लिए एक वित्तीय कारक है जिन्हें परीक्षा की आवश्यकता हो सकती है। अंत में, प्रोटोकॉल को संशोधन की आवश्यकता हो सकती है यदि बायोमाकर्स की जांच के लिए एफसीएम के विभिन्न ब्रांडों या संस्करणों का उपयोग किया जाता है। सारांश में, यह पेपर एकल प्रवाह साइटोमेट्री मशीन द्वारा मानव शुक्राणुक्षति के तीन बायोमाकर्स का अनुमान लगाने के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। यह पुरुष प्रजनन स्वास्थ्य के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकता है और नियमित शुक्राणु परीक्षा का पूरक हो सकता है।

Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की है कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम सभी फील्डवर्कर्स को उनकी मदद के लिए और साक्षात्कारकर्ताओं को उनके सहयोग के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M citric acid buffer Sigma-Aldrich Chemical Co., USA 251275-5G Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C.
0.2 M Na2PO4 buffer Sigma-Aldrich Chemical Co., USA V900061-500G Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C.
10 mM CCCP stock solution Sigma-Aldrich Chemical Co., USA C2759 Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C.
10 µM CCCP working solution Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM.
1 mM JC-1 stock solution Sigma-Aldrich Chemical Co., USA T4069 JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL  aliquot and store at −20 °C.
37 °C incubator Thermo Scientific, USA
5 µM JC-1 working solution Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly.
Accuri C6 Flow cytometer BD Pharmingen, San Diego, CA, United States
Acid solution, pH 1.2 Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl.
Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL Polysciences, Inc, Warrington, Pa 65-61-2 Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL.
AO staining solution (working solution) Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer.
Biological safety hood Airtech, USA
Computer-aided sperm analysis system (CASA ) Microptic, Barcelona, Spain Sperm Class Analyzer 5.3.00
Sperm Counting Chamber Goldcyto, Spain
Equipments
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences, San Jose, CA 556547 Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze.
FlowJo 10 Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA
Horizontal centrifuge Thermo Scientific, USA
liquid nitrogen tank Thermolyne, USA
Materials
PBS Beyotime, Shanghai, China C0221A Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature
Staining buffer, pH 6.0 Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution.
The reference sample for SCSA analysis The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels.
TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4).
TNE buffer, 10x, pH 7.4 Perfemiker, Shanghai, China PM11733 Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C.

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References

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फ्लो साइटोमेट्री बायोमाकर्स शुक्राणु कार्यात्मक दोष पारंपरिक वीर्य पैरामीटर इडियोपैथिक बांझपन शुक्राणु एपोप्टोसिस माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमएमपी) डीएनए क्षति एफसीएम तकनीक एनेक्सिन वी-फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी)/प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) धुंधला 5,5 और 8242;,6,6 और 8242;-टेट्राक्लोरो-1,1 और 8242;,3,3 और 8242;-टेट्राइथाइल-बेंजिमिडाज़ोलिलकार्बोसाइनिन आयोडाइड (जेसी -1) जांच शुक्राणु क्रोमैटिन संरचना परख (एससीएसए) एक्रिडीन ऑरेंज (एओ) धुंधला
मानव शुक्राणु कार्यात्मक दोषों का पता लगाने के लिए बायोमार्कर का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण
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Ling, X., Zou, P., Ao, L., Zhou, N., Wang, X., Sun, L., Yang, H., Liu, J., Cao, J., Chen, Q. Flow Cytometric Analysis of Biomarkers for Detecting Human Sperm Functional Defects. J. Vis. Exp. (182), e63790, doi:10.3791/63790 (2022).

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