Summary
O presente protocolo fornece uma solução prática que permite a medição de apoptose, potencial de membrana mitocondrial e danos ao DNA em espermatozoides humanos com um único citômetro.
Abstract
A análise convencional de parâmetros seminais é amplamente utilizada para avaliar a fertilidade masculina. No entanto, estudos descobriram que ~15% das pacientes inférteis não apresentam anormalidades nos parâmetros do sêmen convencional. Tecnologias adicionais são necessárias para explicar a infertilidade idiopática e detectar defeitos sutis do esperma. Atualmente, biomarcadores da função espermática, incluindo apoptose espermática, potencial de membrana mitocondrial (MMP) e danos ao DNA, revelam a fisiologia espermática em nível molecular e são capazes de predizer a fertilidade masculina.
Com técnicas de citometria de fluxo (FCM), cada um desses marcadores pode ser medido de forma rápida, precisa e precisa em amostras de sêmen humano, mas os custos de tempo aumentam substancialmente e os resultados podem ser obstruídos se todos os biomarcadores precisarem ser testados com um único citômetro. Neste protocolo, após a coleta e incubação imediata a 37 °C para liquefação, amostras de sêmen foram posteriormente analisadas para apoptose espermática usando a coloração de isotiocianato de fluoresceína Anexina V (FITC)/iodeto de propídio (PI). A MMP foi marcada com sonda de 5,5′,6,6′-tetracloro-1,1′,3,3′-tetraetil-benzimidazolilcarbocianina iodeto (JC-1), e os danos ao DNA foram avaliados usando o ensaio de estrutura da cromatina espermática (SCSA) com coloração de laranja de acridina (AO). Assim, a análise por citometria de fluxo de marcadores de função espermática pode ser uma ferramenta prática e confiável para o diagnóstico de infertilidade e avaliação da função espermática tanto na bancada quanto no leito.
Introduction
A infertilidade tornou-se um problema de saúde pública, sendo que a infertilidade masculina contribui com 40%-50% de todos os casos 1,2. Embora a análise convencional da qualidade do sêmen desempenhe um papel importante na determinação do potencial de fertilidade masculina, aproximadamente 15% das pacientes com infertilidade apresentam parâmetros espermáticos normais, como contagem de espermatozoides, motilidade e morfologia3. Além disso, os exames de rotina do esperma têm pouca repetibilidade, fornecem informações limitadas sobre a função espermática e não podem fornecer uma avaliação precisa da fertilidade masculina ou refletir os defeitos sutis dos espermatozoides. Várias técnicas foram desenvolvidas para testar a função espermática, como o ensaio de hemizona (HZA), o ensaio de penetração espermática, o teste de inchaço hipo-osmótico, o teste de anticorpos antiespermatozoides, mas esses métodos são demorados e vulneráveis a influências subjetivas dos operadores. Portanto, é necessário desenvolver métodos rápidos e precisos para análise da função espermática.
A FCM é uma tecnologia de análise rápida e unicelular desenvolvida na década de 1970, que tem sido amplamente utilizada em vários campos da biologia celular e da medicina. A MCF é uma ferramenta robusta para a avaliação da função espermática que analisa espermatozoides marcados com sonda de fluorescência específica4. Os espermatozoides passam através de lasers de canal único ou multicanal, e a luz espalhada e a fluorescência emitida são produzidas por um feixe de laser. A luz espalhada inclui luz espalhada direta (FSC) e luz espalhada lateral (SSC), que reflete o tamanho da célula testada e a granularidade ou estrutura interna da célula. Esses sinais são coletados, exibidos e analisados pelo sistema computacional e, consequentemente, uma série de características dos espermatozoides são medidas de forma rápida e precisa. Portanto, o FCM é uma técnica rápida, objetiva, multidimensional e de alto rendimento que tem ganhado cada vez mais atenção no campo da análise espermática. A aplicação do FCM pode compensar deficiências nos métodos tradicionais e fornece uma nova abordagem para a detecção da estrutura e função interna dos espermatozoides.
A apoptose espermática está intimamente relacionada à fertilidade masculina5. A detecção de apoptose espermática é um índice importante para avaliar a função espermática em nível molecular. O FCM é amplamente reconhecido como um método confiável e sensível para detectar a apoptose espermática usando a coloração Annexin V-FITC/PI. O princípio básico é que a fosfatidilserina (PS) é transferida da camada interna da membrana celular para sua camada externa no estágio inicial da apoptose. A anexina V é uma proteína fosfolipídica Ca2+ dependente (geralmente marcada por FITC) que tem alta afinidade pelo SP, detectando, assim, o SF exposto à superfície externa da membrana celular6. Necrose e apoptose podem ser distinguidas em combinação com coloração de Pl. Portanto, o método de dupla coloração da anexina V-FITC/PI é amplamente utilizado, pois é rápido, simples e fácil de detectar diferentes espermatozoides apoptóticos.
Um espermatozoide maduro de mamíferos contém aproximadamente 72-80 mitocôndrias7, sugerindo uma razão biológica para a retenção de espermatozoides mitocôndrias8. Descobriu-se que as mitocôndrias espermáticas desempenham papéis importantes na manutenção da motilidade e fertilidade espermáticas9. A coloração JC-1, que pode ser usada como indicador de MMP em uma variedade de tipos celulares, é um dos fluorocromos mais populares para avaliação da atividade mitocondrial espermática10. JC-1 é um corante catiônico que se acumula potencial-dependente nas mitocôndrias. O JC-1 tem uma emissão máxima de fluorescência em 525 nm (verde) e forma agregados J 11 quando se liga a membranas com alto potencial (ΔΨm, 80-100 mV), resultando em um deslocamento na emissão de fluorescência para ~590 nm (laranja-vermelho). Consequentemente, a despolarização mitocondrial espermática é indicada por uma diminuição na razão de intensidade de fluorescência vermelho/verde, e FCM pode ser usado para detectar os níveis de MMP em amostras de sêmen humano.
A metodologia SCSA foi inventada por Evenson et al.12, sendo considerada um teste preciso e repetível com dados únicos de dois parâmetros (fluorescência vermelha vs verde) em uma escala de 1.024 × 1.024canais13. Em espermatozoides danificados, o DNA e as proteínas alteradas nos núcleos dos espermatozoides são marcados por AO, e as quebras da fita de DNA são medidas por fluorescência vermelha, enquanto fitas duplas intactas emitem fluorescência verde no FCM14. Atualmente, muitos métodos têm sido desenvolvidos para estimar a integridade do DNA espermático. No entanto, ao contrário da SCSA, esses ensaios são frequentemente trabalhosos e não têm a capacidade de um diagnóstico de infertilidade masculina. Os resultados do teste SCSA correlacionam-se significativamente com gravidez e aborto espontâneo do DNA humano, fornecem evidências convincentes de que a SCSA pode ser útil na análise de sêmen humano e pode servir como uma ferramenta valiosa para os clínicos de infertilidade15.
A integridade da cromatina, a MMP e a apoptose refletem diferentes aspectos da função espermática e, portanto, a combinação desses biomarcadores pode fornecer uma visão mais abrangente sobre o status do espermatozoide. O FCM pode ser usado para medições separadas de integridade da cromatina, MMP ou apoptose em amostras de sêmen humano. Embora o custo da FCM e o custo dos corantes tenham limitado a ampla aplicação dessas técnicas em laboratórios clínicos de saúde reprodutiva, seu valor para estimativa da fecundidade está sendo aceito.
No entanto, como cada um dos experimentos requer pré-tratamento de amostras de espermatozoides, e todas as amostras pré-tratadas precisam ser testadas o mais rápido possível, a medição simultânea de todos os três biomarcadores para uma amostra com um único FCM pode levar a um longo tempo de espera para alguns dos experimentos e obstruir a confiabilidade dos resultados. Isso ocorre porque os espermatozoides recebem danos adicionais durante o processo de espera, se o protocolo não for organizado adequadamente levando todos os três experimentos inteiramente em consideração. Este trabalho apresenta um protocolo que realiza a mensuração fluente de todos os três biomarcadores em uma única citometria sem comprometer substancialmente a qualidade do experimento induzida por tempos de espera prolongados.
Protocol
NOTA: O fluxo de trabalho para a detecção de biomarcadores para danos à função espermática por citometria de fluxo inclui (1) preparação celular, (2) coloração com reagentes fluorescentes e (3) análise por citometria de fluxo e interpretação de dados (Figura 1). O protocolo segue as diretrizes dos Comitês de Ética da Universidade de Medicina do Exército (1.0/2013.4-12).
1. Preparação celular
- Obter amostras de sêmen humano por masturbação em frascos de espécimes clínicos plásticos, preferencialmente após 3-5 dias de abstinência.
- Incubar imediatamente as amostras de sémen numa estufa a 37 °C e liquefazer completamente as amostras (até 1 h).
2. Espermatozoides contados usando análise de espermatozoides auxiliada por computador (CASA)
- Misture bem as amostras de sêmen liquefeito.
- Adicionar 10 μL de sémen numa câmara de contagem de espermatozoides (ver Tabela de Materiais).
- Digitalize as lâminas no Analisador de Classes de Esperma (consulte a Tabela de Materiais) e conte pelo menos seis áreas e 400 espermatozoides para estimar a concentração de espermatozoides.
NOTA: As amostras de sêmen devem ser frescas, não congeladas, para análise de apoptose espermática e MMP.
3. Coloração de espermatozoides
- Detecção de apoptose espermática pela coloração Annexin V-FITC/PI
- Adicionar 1 × 106 espermatozoides a um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
- Lavar as células com 500 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada.
- Centrifugar a suspensão de espermatozoides a 300 × g por 7 min e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender os espermatozoides em 200 μL de 1x Binding Buffer.
- Adicionar 2 μL de FITC Annexin V e 2 μL de PI (ver Tabela de Materiais).
- Vorbitar suavemente as células, incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente (25 °C) no escuro e colocá-las no citómetro de fluxo imediatamente para análise.
- Análise do potencial de membrana mitocondrial utilizando sonda JC-1
- Adicionar 2 × 106 espermatozoides a um tubo de centrífuga de 1,5 ml e centrifugar a 600 × g durante 5 minutos.
- Ressuspender a suspensão de espermatozoides em 1 mL de solução de trabalho JC-1 (consulte a Tabela de Materiais).
- Vórtice suavemente as células e incube durante 20 minutos a 37 °C no escuro.
- Centrifugar a suspensão a 600 × g durante 5 min e eliminar o sobrenadante.
- Lavar o pellet duas vezes com 1 mL de PBS a uma velocidade de 600 × g por 5 min cada.
- Ressuspender os espermatozoides tingidos em 1 mL de PBS em tubos de citômetro de fluxo e colocá-los no citômetro de fluxo imediatamente para análise.
- Utilizar cianeto de carbonila m-clorofenil hidrazona (CCCP) como controlo positivo. Ressuspender os espermatozoides (conforme descrito anteriormente na etapa 3.2.1) em 1 ml de solução de trabalho CCCP (ver Tabela de Materiais), e agitar suavemente as células e incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar a suspensão a 600 × g por 5 min e descartar o sobrenadante. Repita as etapas 3.2.2-3.2.6.
- Ensaio de estrutura da cromatina espermática
- Colocar uma alíquota de sémen cru liquefeito (0,25 ml) num criotubo e congelar imediatamente as amostras de sémen em azoto líquido (-196 °C) até estarem prontas para a SCSA.
- Descongelar as amostras de sémen em banho-maria a 37 °C e diluí-las com tampão TNE (ver Tabela de Materiais) até uma concentração de 1-2 × 106 células/ml.
- Adicionar 200 μL da amostra diluída a um tubo de ensaio com citómetro de fluxo e misturá-la com 400 μL de solução ácida (ver quadro de materiais) durante 30 s.
- Manchar as amostras com 1,2 mL de solução corante AO (ver Tabela de Materiais) e colocar no citômetro de fluxo imediatamente para análise.
- Use uma amostra de referência como padrão interno para configuração e calibração de citômetros de fluxo. Diluir a amostra de referência com tampão TNE a 4 °C para uma concentração de 1-2 × 106 células/ml. Repita as etapas 3.3.1-3.3.4.
NOTAS: Todas as soluções e tampões são armazenados a 4 °C. (1) O sémen não deve ser diluído antes da congelação rápida. As amostras de sémen bruto devem ser descongeladas e diluídas com tampão TNE no momento das medições por citometria de fluxo. (2) Para clínicas de infertilidade, ~0,25 mL de sêmen cru deve ser congelado em um freezer ultrafrio ou em um tanque LN2. Essas alíquotas congeladas podem então ser enviadas para um laboratório de diagnóstico SCSA em gelo seco ou em um carregador seco LN2. (3) Uma amostra de ejaculado humano que demonstra heterogeneidade da integridade do DNA (por exemplo, 15% de índice de fragmentação do DNA [DFI]) foi usada como referência padrão interno.
4. Configuração do citômetro de fluxo
NOTA: Antes de iniciar o citômetro de fluxo, a verificação do sistema do instrumento deve ser realizada para verificar o desempenho analítico. Execute as amostras depois que todas as verificações tiverem sido concluídas e aprovadas.
- Abra o software do citômetro de fluxo e inicie o citômetro.
- Coletar dados de amostra.
- Primeiro, carregue uma amostra de controle no citômetro de fluxo e clique em EXECUTAR para iniciar a coleta de dados (ajuste as configurações, se necessário). Aguarde até que o instrumento comece a aspirar a amostra e forneça uma visualização em tempo real dos eventos detectados.
NOTA: A amostra de controlo: um controlo negativo (espermatozoides não corados) para apoptose espermática; um controle positivo (células tratadas com CCCP) para MMP; uma amostra de referência para SCSA. - Crie gráficos de pontos para exibir dados e selecione os parâmetros do eixo x/y (como FSC, SSC) e lineares para especificar que os dados sejam exibidos. Selecione e aplique uma porta poligonal para delinear a população de espermatozoides para análise, e para que o instrumento plote eventos detectados em tempo real.
- Analise os eventos espermáticos dentro da região.
- Para apoptose espermática, defina o FL1 como o eixo x e o FL2 como o eixo x. Para isolar as células vivas, apoptóticas ou necróticas, toque e arraste a porta do quadrante para subdefinir as populações de espermatozoides para quatro populações específicas.
- Para MMP, defina o FL1 como o eixo x e o FL2 como o eixo y. Crie uma porta poligonal para subdefinir as populações de espermatozoides em duas populações específicas.
- Para SCSA, defina o FL4 como eixo x (fluorescência vermelha, 125/1.024 canais de citometria de fluxo) e o FL1 como eixo y (fluorescência verde, 475/1.024 canais de citometria de fluxo). Desenhe as portas em um ângulo de 45° para excluir sinais de detritos celulares.
- Defina um limite de execução para indicar quando parar de coletar dados. Calcule um total de 10.000 espermatozoides para cada amostra para análises de apoptose espermática, MMP e SCSA.
- Defina a taxa fluídica (lenta, média e rápida, ou uma taxa fluídica personalizada), dependendo dos números de células.
NOTAS: Para a análise SCSA, para determinar as concentrações de espermatozoides, descongele a amostra bruta congelada e execute-a no FCM. Se o caudal for de >250/s, diluir a amostra ao caudal correcto. Meça todas as amostras independentemente duas vezes e calcule os valores médios. Uma amostra de referência foi testada quando cada 10-15 amostras foram medidas para garantir a padronização e estabilidade do instrumento no dia-a-dia. - Defina o limite para eliminar detritos e ruído de amostras de células. Aplique essas configurações a todas as amostras do experimento.
- Se necessário, defina a compensação de cor para corrigir o transbordamento de fluorescência.
- Volte suavemente a pipetar as amostras antes de carregá-las no citômetro de fluxo, nomeie a amostra e execute as amostras.
- Depois que todas as amostras tiverem sido executadas, salve os dados de amostra como arquivos FCS, dando-lhes um nome de arquivo para análise de software adicional. Salve o modelo de trabalho do experimento atual para recuperação em execuções futuras (opcional).
- Primeiro, carregue uma amostra de controle no citômetro de fluxo e clique em EXECUTAR para iniciar a coleta de dados (ajuste as configurações, se necessário). Aguarde até que o instrumento comece a aspirar a amostra e forneça uma visualização em tempo real dos eventos detectados.
5. Análise dos dados
- Importe os dados para o software de análise de dados para o citômetro de fluxo (consulte a Tabela de Materiais).
- Clique duas vezes no primeiro exemplo no espaço de trabalho. Aguarde até que uma janela do Gráfico seja aberta, mostrando um gráfico de eventos ao longo dos parâmetros FSC versus SSC. Crie um portão que isole a população de espermatozoides incluída dentro do portão, produzindo uma população "filho" do conjunto pai de eventos.
- Clique duas vezes dentro da área fechada e abra uma nova janela do Gráfico contendo apenas os eventos de esperma. Defina os parâmetros dos eixos x e y para selecionar o canal fluorescente.
- Selecione a ferramenta Portão . Clique dentro do gráfico para fazer com que os portões apareçam, de modo que os portões criados isolem as diferentes populações de células.
- Clique com o botão direito do mouse (ou clique com a tecla Control pressionada) em qualquer uma das linhas realçadas e selecione Copiar análise para agrupar. Aplique a árvore de vedação a todas as amostras dentro do grupo.
- Salve e exporte a tabela de dados.
Representative Results
A Figura 2 mostra a medida da apoptose espermática pela coloração Annexin V-FITC/PI. O sinal FITC (fluorescência verde) foi medido no canal FL1, e o sinal PI (fluorescência vermelha) foi medido no canal FL2. Na análise bivariada da Anexina V/PI, os marcadores identificaram quatro populações distintas de espermatozoides. Os resultados foram expressos como as porcentagens de espermatozoides de Anexina V-/PI− (células viáveis ou vivas), Anexina V+/PI− espermatozoides (células apoptóticas precoces ou células apoptóticas), espermatozoides de Anexina V+/PI+ (células apoptóticas tardias) e espermatozoides de Anexina V−/PI+ (células necróticas)16,17 (Figura 2B). Um controle negativo (espermatozoides não corados) também foi utilizado para montar a compensação e os quadrantes (Figura 2A).
A Figura 3 mostra a dosagem de MMP utilizando a sonda JC-1 em espermatozoides humanos. A MMP % é apresentada como a razão de fluorescência laranja-vermelho/(verde + laranja-vermelho) pela análise do citograma. Uma amostra de sêmen de boa qualidade geralmente mostra alta fluorescência vermelho-alaranjada e baixa fluorescência verde (mitocôndrias ativas, quadrante superior esquerdo) (Figura 3A). Por outro lado, uma amostra de sêmen de baixa qualidade geralmente mostra baixa fluorescência vermelho-alaranjada e alta fluorescência verde (mitocôndrias inativas, quadrante inferior direito), possivelmente devido à ruptura mitocondrial (Figura 3B).
A Figura 4 mostra os dados da SCSA13,14. Esses citogramas típicos de SCSA foram obtidos de duas amostras individuais. A amostra A veio de um homem fértil e a amostra B de um homem infértil. A análise dos dados de citometria de fluxo foi realizada por meio do software FlowJo. Os citogramas mostram a fonte de cada componente dos dados SCSA. O eixo x (fluorescência vermelha com 1.024 gradações de fluorescência vermelha) indica DNA fragmentado; o eixo y (fluorescência verde com 1.024 gradações) indica a coloração do DNA nativo. A linha pontilhada em y = 750 representa o limite do esperma normal. Acima dessa linha de y = 750 estão espermatozoides com cromatina parcialmente não condensada, que foram determinados como espermatozoides imaturos.
Figura 1: Fluxo de trabalho para detecção de biomarcadores para danos à função espermática por citometria de fluxo. Amostras de sêmen foram obtidas e pré-tratadas conforme descrito na etapa 1 do protocolo. (1) Preparação celular, (2) coloração com reagentes fluorescentes e (3) análise por citometria de fluxo e interpretação dos dados. Abreviações: MMP = potencial de membrana mitocondrial; SCSA = ensaio de estrutura da cromatina espermática; PBS = solução salina tamponada com fosfato; AO = laranja acridina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados representativos da apoptose espermática usando a coloração Annexin V-FITC/PI. O quadrante inferior esquerdo contém espermatozoides de Anexina V-/PI− (células viáveis ou vivas), o quadrante inferior direito mostra espermatozoides de Anexina V+/PI− (células apoptóticas precoces ou células apoptóticas), o quadrante superior direito representa espermatozoides de Anexina V+/PI+ (células apoptóticas tardias) e o quadrante superior esquerdo contém espermatozoides de Anexina V−/PI+ (células necróticas). (A) Controle negativo (espermatozoides não corados); (B) uma amostra com apoptose espermática. Abreviaturas: FITC = isotiocianato de fluoresceína; IP = iodeto de propídio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Mensuração do potencial de membrana mitocondrial utilizando sonda JC-1 . (A) A subpopulação espermática com alta MMP. (B) A subpopulação espermática com baixa MMP. Defina FL1-A e FL2-A como o eixo x (fluorescência verde) e o eixo y (fluorescência laranja-vermelho), respectivamente. Abreviações: MMP = potencial de membrana mitocondrial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Detecção de danos ao DNA em espermatozoides humanos usando ensaio de estrutura da cromatina espermática. (A) Uma amostra de sêmen com estrutura de cromatina normal. (B) Amostra de sêmen com alta proporção de espermatozoides com estrutura anormal da cromatina. O software FlowJo foi usado para fazer portas de computador ao redor das populações celulares identificadas como: 1) espermatozoides normais, 2) espermatozoides HDS, 3) espermatozoides DFI e 4) restos celulares, e porcentagens de espermatozoides HDS e DFI foram calculadas. Abreviação: SCSA = ensaio de estrutura da cromatina espermática; HDS = alta coloração do DNA; DFI = índice de fragmentação do DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
A integridade da cromatina, a MMP e a apoptose dos espermatozoides humanos têm se mostrado preditores valiosos de desfechos reprodutivos. O último manual laboratorial da OMS para o exame e processamento de sêmen humano (sexta edição) também destacou alguns desses indicadores (integridade da cromatina e apoptose) como exames estendidos além do exame básico de parâmetros de rotina, como a contagem de espermatozoides18. Publicações recentes também sugerem que esses indicadores podem ser marcadores mais sensíveis de resposta a exposições externas perigosas, indicando seu potencial para a identificação de danos reprodutivos em um estágio mais precoce19,20. A combinação desses indicadores com exames de rotina também pode proporcionar uma compreensão mais abrangente sobre o perfil de disfunção espermática e a complexidade dos danos reprodutivos masculinos na população.
Existem várias questões-chave que determinam substancialmente o sucesso da análise espermática com FCM. Primeiro, a dosagem de MMP e apoptose espermática requer exame imediato após a liquefeito do sêmen. Para minimizar o custo do tempo, dois técnicos podem se encarregar separadamente do pré-tratamento de MMP e da análise de apoptose de uma amostra. Como o pré-tratamento da apoptose é mais simples, ela seria transferida para a etapa de citometria de fluxo mais rapidamente do que a análise de MMP. Para a análise SCSA, as amostras de sêmen fresco devem ser criopreservadas imediatamente após a disponibilidade após a liquefação. As amostras de esperma podem então ser armazenadas em nitrogênio líquido por um período relativamente longo e não precisam de exame imediato.
Assim, o custo do tempo no local do experimento pode ser comprimido para 40 min, que é a duração da análise de MMP mais a etapa de citometria de fluxo da análise espermática. Em segundo lugar, a configuração do confinamento na plataforma de citometria de fluxo deve ser decidida para cada lote de amostras separadamente. As amostras de espermatozoides com subgrupos de células claras no gráfico de dispersão podem ser selecionadas como referência para desenhar a área de confinamento. Em terceiro lugar, como não há valores de referência clínica amplamente aceitos para os indicadores deste experimento, os resultados históricos podem ser usados como uma importante ferramenta para o controle de qualidade. Controles positivos e negativos também são encorajados a serem estabelecidos em cada lote de medições, especialmente para SCSA e MMP.
Os resultados representativos da análise espermática fornecidos aqui são derivados usando um Accuri C6. No entanto, a técnica poderia ser aplicada a outras plataformas comerciais com pequenas modificações. Normalmente, um total de 5 × 106 espermatozoides seriam necessários para atender ao requisito para a medição de todos os indicadores. Se a concentração espermática de uma amostra for muito menor do que o nível médio, a necessidade do volume de sêmen aumentaria.
Semelhante aos parâmetros espermográficos de rotina, também é notável variação intraindividual na integridade da cromatina, MMP e apoptose dos espermatozoides humanos21. Assim, múltiplos testes de amostras coletadas em momentos diferentes podem fornecer uma estimativa mais precisa do nível de dano à função espermática. Embora não haja um período recomendado de abstinência antes da coleta de espermatozoides para a análise por citometria de fluxo, 2-7 dias de abstinência ejaculatória, sugeridos para análise espermática de rotina pela OMS, podem ser adotados. Pode ajudar a melhorar a comparabilidade dos resultados entre laboratórios e entre diferentes amostras coletadas dos mesmos homens.
Uma grande limitação deste método é que dois dos três biomarcadores testados - a apoptose e o potencial de membrana mitocondrial - requerem amostras de sêmen fresco. Isso pode limitar sua aplicação a homens que podem fornecer amostras de sêmen para o laboratório. Para o teste de danos ao DNA (SCSA), amostras de referência devem ser preparadas antes do experimento para calibrar o citômetro de fluxo. Vale ressaltar que a aplicação do presente protocolo requer um instrumento de FCM no laboratório, o que ainda é um desafio considerável para muitos laboratórios clínicos, embora a cooperação com um serviço terceirizado possa ser uma opção alternativa em algumas regiões.
Além disso, o gasto com os corantes e outros reagentes também é um fator financeiro para os machos que podem precisar do exame. Por fim, o protocolo pode precisar de modificação se diferentes marcas ou versões do FCM forem usadas para examinar os biomarcadores. Em resumo, este trabalho apresenta uma abordagem prática para estimar três biomarcadores de danos aos espermatozoides humanos por uma única máquina de citometria de fluxo. Isso pode fornecer informações valiosas sobre a saúde reprodutiva masculina e complementar o exame de rotina de espermatozoides.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos a todos os trabalhadores de campo pela ajuda e aos entrevistados pela colaboração.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
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