Summary
Det nuvarande protokollet ger en praktisk lösning som möjliggör mätning av apoptos, mitokondriell membranpotential och DNA-skador i mänskliga spermier med en enda cytometer.
Abstract
Den konventionella spermaparameteranalysen används ofta för att bedöma manlig fertilitet. Studier har dock visat att ~15 % av infertila patienter inte uppvisar några avvikelser i konventionella spermaparametrar. Ytterligare tekniker behövs för att förklara den idiopatiska infertiliteten och upptäcka subtila spermiedefekter. För närvarande avslöjar biomarkörer för spermiefunktion, inklusive spermieapoptos, mitokondriell membranpotential (MMP) och DNA-skador, spermiefysiologi på molekylär nivå och kan förutsäga manlig fertilitet.
Med flödescytometri (FCM) kan var och en av dessa markörer mätas snabbt, exakt och exakt i mänskliga spermaprover, men tidskostnaderna ökar avsevärt och resultaten kan hindras om alla biomarkörer behöver testas med en enda cytometer. I detta protokoll, efter insamling och omedelbar inkubation vid 37 °C för kondensering, analyserades spermaprover ytterligare med avseende på spermieapoptos med hjälp av Annexin V-fluoresceinisotiocyanat (FITC)/propidiumjodid (PI) färgning. MMP märktes med 5,5′,6,6′-tetraklor-1,1′,3,3′-tetraetyl-benzimidazolylkarbocyaninjodid (JC-1) sond, och DNA-skador bedömdes med hjälp av spermiekromatinstrukturanalysen (SCSA) med akridinorange (AO) färgning. Flödescytometrisk analys av spermiefunktionsmarkörer kan därför vara en praktisk och tillförlitlig verktygslåda för diagnos av infertilitet och utvärdering av spermiefunktion vid både bänk och säng.
Introduction
Infertilitet har blivit ett folkhälsoproblem, där manlig infertilitet bidrar till 40–50 % av alla fall 1,2. Även om konventionell spermakvalitetsanalys spelar en viktig roll för att bestämma manlig fertilitetspotential, har cirka 15 % av patienterna med infertilitet normala spermieparametrar som spermieantal, motilitet och morfologi3. Dessutom har rutinmässiga spermieundersökningar dålig repeterbarhet, ger begränsad information om spermiernas funktion och kan inte ge en korrekt utvärdering av manlig fertilitet eller återspegla spermiernas subtila defekter. Flera tekniker har utvecklats för att testa spermiernas funktion, såsom hemizona-analysen (HZA), spermiepenetrationsanalysen, hypoosmotiskt svullnadstest, antispermieantikroppstestningen, men dessa metoder är tidskrävande och sårbara för subjektiv påverkan från operatörerna. Därför är det nödvändigt att utveckla snabba och exakta metoder för analys av spermiernas funktion.
FCM är en snabb, encellsanalysteknik som utvecklades på 1970-talet och som har använts i stor utsträckning inom olika områden av cellbiologi och medicin. FCM är ett robust verktyg för utvärdering av spermiers funktion som analyserar spermier märkta med en specifik fluorescenssond4. Spermierna passerar genom en- eller flerkanalslasrar, och spritt ljus och emitterad fluorescens produceras av en laserstråle. Det spridda ljuset inkluderar framåtspritt ljus (FSC) och sidospritt ljus (SSC), som återspeglar storleken på den testade cellen och cellens granularitet eller inre struktur. Dessa signaler samlas in, visas och analyseras av datorsystemet, och följaktligen mäts en rad egenskaper från spermierna snabbt och exakt. Därför är FCM en snabb, objektiv, flerdimensionell och högkapacitetsteknik som har fått allt större uppmärksamhet inom spermieanalys. Användningen av FCM kan kompensera för brister i traditionella metoder och ger ett nytt tillvägagångssätt för detektion av spermiernas inre struktur och funktion.
Spermapoptos är nära besläktad med manlig fertilitet5. Detektion av spermieapoptos är ett viktigt index för att utvärdera spermiernas funktion på molekylär nivå. FCM är allmänt erkänd som en pålitlig och känslig metod för att upptäcka spermapoptos med hjälp av Annexin V-FITC/PI-färgning. Grundprincipen är att fosfatidylserin (PS) överförs från det inre lagret av cellmembranet till dess yttre skikt i det tidiga stadiet av apoptos. Annexin V är ett Ca2+-beroende fosfolipidprotein (vanligtvis märkt av FITC) som har en hög affinitet för PS, och därmed detekterar PS exponerat för den yttre ytan av cellmembranet6. Nekros och apoptos kan särskiljas i kombination med Pl-färgning. Därför används metoden för Annexin V-FITC/PI dubbelfärgning i stor utsträckning, eftersom det är snabbt, enkelt och lätt att upptäcka olika apoptotiska spermier.
En mogen däggdjursspermie innehåller cirka 72-80 mitokondrier7, vilket tyder på en biologisk orsak till att spermier stannar kvar8. Spermiermitokondrier har visat sig spela viktiga roller för att upprätthålla spermiernas rörlighet och fertilitet9. JC-1-färgen, som kan användas som en indikator på MMP i en mängd olika celltyper, är en av de mest populära fluorokromerna för bedömning av spermiernas mitokondriella aktivitet10. JC-1 är ett katjoniskt färgämne som potentiellt ackumuleras i mitokondrierna. JC-1 har en maximal fluorescensemission vid 525 nm (grön) och bildar J-aggregat 11 när de binder till membran med hög potential (ΔΨm, 80-100 mV), vilket resulterar i en förskjutning av fluorescensemissionen till ~590 nm (orange-röd). Följaktligen indikeras spermiemitokondriell depolarisering av en minskning av det röda/gröna fluorescensintensitetsförhållandet, och FCM kan användas för att detektera MMP-nivåer i mänskliga spermaprover.
SCSA-metoden uppfanns av Evenson et al.12 och anses vara ett exakt och repeterbart test med unika dubbelparameterdata (röd vs grön fluorescens) på en skala på 1 024 × 1 024 kanaler 13. I skadade spermier märks DNA och förändrade proteiner i spermiekärnor med AO, och brott på DNA-strängen mäts med röd fluorescens, medan intakta dubbelsträngar avger grön fluorescens i FCM14. Nuförtiden har många metoder utvecklats för att uppskatta spermiernas DNA-integritet. Men till skillnad från SCSA är dessa analyser ofta arbetsintensiva och saknar möjlighet att diagnostisera manlig infertilitet. SCSA-testresultaten korrelerar signifikant med mänsklig DNA-graviditet och missfall, ger övertygande bevis för att SCSA kan vara användbart vid mänsklig spermaanalys och kan fungera som ett värdefullt verktyg för infertilitetskliniker15.
Kromatinintegritet, MMP och apoptos återspeglar olika aspekter av spermiernas funktion, och därmed kan kombinationen av dessa biomarkörer ge en mer omfattande inblick i spermiestatus. FCM kan användas för separata mätningar av antingen kromatinintegritet, MMP eller apoptos i humana spermaprover. Även om kostnaden för FCM och kostnaden för färgämnen har begränsat den breda tillämpningen av dessa tekniker i kliniska laboratorier för reproduktiv hälsa, accepteras deras värde för uppskattning av fruktsamhet.
Eftersom vart och ett av försöken kräver förbehandling av spermaprover, och alla förbehandlade prover måste testas så snart som möjligt, kan samtidig mätning av alla tre biomarkörerna för ett prov med ett enda FCM leda till en lång väntetid för vissa av experimenten och hindra resultatens tillförlitlighet. Detta beror på att spermierna får ytterligare skada under vänteprocessen, om protokollet inte är korrekt ordnat med hänsyn till alla tre experimenten. Denna artikel presenterar ett protokoll som realiserar en flytande mätning av alla tre biomarkörerna i en enda cytometri utan betydande kompromiss med experimentkvaliteten inducerad av förlängda väntetider.
Protocol
OBS: Arbetsflödet för detektion av biomarkörer för spermiefunktionsskada genom flödescytometri inkluderar (1) cellberedning, (2) färgning med fluorescerande reagenser och (3) flödescytometrisk analys och datatolkning (figur 1). Protokollet följer de riktlinjer som fastställts av Arméns medicinska universitets etiska kommittéer (1.0/2013.4-12).
1. Förberedelse av celler
- Ta spermaprover från människa genom onani i kliniska provburkar av plast, helst efter 3-5 dagars avhållsamhet.
- Inkubera omedelbart spermaproverna i en inkubator vid 37 °C och gör proverna helt flytande (upp till 1 timme).
2. Spermier räknade med hjälp av datorstödd spermaanalys (CASA)
- Blanda de flytande spermaproverna noggrant.
- Tillsätt 10 μl sperma i en spermieräkningskammare (se materialtabellen).
- Skanna objektglasen i spermieklassanalysatorn (se materialtabellen) och räkna minst sex områden och 400 spermier för uppskattning av spermiekoncentrationen.
OBS: Spermaprover måste vara färska, inte frysta, för spermapoptos och MMP-analys.
3. Färgning av spermier
- Detektion av spermapoptos med hjälp av Annexin V-FITC/PI-färgning
- Tillsätt 1 × 106 spermier till ett 1,5 ml centrifugrör.
- Tvätta cellerna med 500 μl kallfosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Centrifugera spermiesuspensionen med en temperatur på 300 × g i 7 minuter och kassera supernatanten.
- Återsuspendera spermierna i 200 μl 1x bindningsbuffert.
- Tillsätt 2 μl FITC-bilaga V och 2 μL PI (se materialtabellen).
- Virvla försiktigt cellerna, inkubera dem i 15 minuter i rumstemperatur (25 °C) i mörker och placera dem omedelbart i flödescytometern för analys.
- Analys av mitokondriell membranpotential med hjälp av JC-1-sond
- Tillsätt 2 × 106 spermier till ett 1,5 ml centrifugrör och centrifugera vid 600 × g i 5 minuter.
- Återsuspendera spermiesuspensionen i 1 ml JC-1 arbetslösning (se materialtabellen).
- Virvla försiktigt cellerna och inkubera i 20 minuter vid 37 °C i mörker.
- Centrifugera suspensionen vid 600 × g i 5 minuter och kassera supernatanten.
- Tvätta pelleten två gånger med 1 ml PBS med en hastighet av 600 × g i 5 minuter vardera.
- Återsuspendera de färgade spermierna i 1 ml PBS i flödescytometerrör och placera rören omedelbart i flödescytometern för analys.
- Använd karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP) som en positiv kontroll. Återsuspendera spermierna (som tidigare beskrivits i steg 3.2.1) i 1 ml CCCP-arbetslösning (se materialtabellen) och virvla försiktigt om cellerna och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur. Centrifugera suspensionen vid 600 × g i 5 minuter och kassera supernatanten. Upprepa steg 3.2.2-3.2.6.
- Analys av spermiekromatinstruktur
- Placera en alikvot flytande rå sperma (0,25 ml) i ett kryorör och frys omedelbart spermaproverna i flytande kväve (-196 °C) tills de är redo för SCSA.
- Tina spermaproverna i ett 37 °C vattenbad och späd dem med TNE-buffert (se materialtabellen) till en koncentration av 1-2 × 106 celler/ml.
- Tillsätt 200 μl av det utspädda provet till ett flödescytometerprovrör och blanda det med 400 μl sur lösning (se materialtabellen) i 30 s.
- Färga proverna med 1.2 ml AO-färgningslösning (se materialtabellen) och placera omedelbart i flödescytometern för analys.
- Använd ett referensprov som en intern standard för inställning och kalibrering av flödescytometrar. Späd referensprovet med 4 °C TNE-buffert till en koncentration av 1–2 × 106 celler/ml. Upprepa steg 3.3.1-3.3.4.
ANMÄRKNINGAR: Alla lösningar och buffertar förvaras vid 4 °C. (1) Sperman får inte spädas före blixtfrysning. Råa spermaprover bör tinas och spädas med TNE-buffert vid tidpunkten för flödescytometrimätningar. (2) För infertilitetskliniker bör ~0,25 ml rå sperma snabbfrysas i en ultrakall frys eller en LN2-tank. Dessa frysta alikvoter kan sedan skickas till ett SCSA-diagnostiskt laboratorium på torris eller i en LN2-torrspeditör. (3) Ett humant ejakulatprov som visar heterogenitet i DNA-integriteten (t.ex. 15 % DNA-fragmenteringsindex [DFI]) användes som intern standardreferens.
4. Inställning av flödescytometer
OBS: Innan flödescytometern startas bör instrumentets systemkontroll utföras för att verifiera analytisk prestanda. Kör exemplen när alla kontroller har slutförts och godkänts.
- Öppna flödescytometerns programvara och starta cytometern.
- Samla in exempeldata.
- Ladda först ett kontrollample på flödescytometern och klicka på KÖR för att starta datainsamlingen (justera inställningarna om det behövs). Vänta tills instrumentet börjar aspirera sample och ge en förhandsvisning i realtid av upptäckta händelser.
OBS: Kontrollprovet: en negativ kontroll (ofärgade spermier) för spermieapoptos; En positiv kontroll (CCCP-behandlade celler) för MMP. ett referensprov för SCSA. - Skapa punktdiagram för att visa data och välj x/y-axelparametrar (t.ex. FSC, SSC) och linjär för att ange att data ska visas. Välj och använd en polygonal grind för att avgränsa spermiepopulationen för analys, och så att instrumentet plottar upptäckta händelser i realtid.
- Analysera spermiehändelserna inom regionen.
- För spermieapoptos ställer du in FL1 som x-axel och FL2 som x-axel. För att isolera de levande, apoptotiska eller nekrotiska cellerna, tryck och dra kvadrantgrinden för att dela upp spermiepopulationerna till fyra specifika populationer.
- För MMP anger du FL1 som x-axel och FL2 som y-axel. Skapa en polygonal grind för att dela upp spermiepopulationerna till två specifika populationer.
- För SCSA ställer du in FL4 som x-axeln (röd fluorescens, 125/1 024 flödescytometrikanaler) och FL1 som y-axeln (grön fluorescens, 475/1 024 flödescytometrikanaler). Rita grindarna i 45° vinkel för att utesluta cellulära skräpsignaler.
- Ange en körningsgräns för att ange när du ska sluta samla in data. Beräkna totalt 10 000 spermier för varje prov för spermieapoptos-, MMP- och SCSA-analyser.
- Ställ in fluidikhastigheten (långsam, medium och snabb, eller en anpassad fluidikhastighet), beroende på cellnumren.
ANMÄRKNINGAR: För SCSA-analys, för att bestämma spermiekoncentrationer, tina det frysta råa sample och kör den på FCM. Om flödet är >250/s, späd sample till rätt flödeshastighet. Mät alla prover oberoende av varandra två gånger och beräkna medelvärdena. Ett referensprov testades när var 10-15:e prov mättes för att säkerställa standardisering och stabilitet av instrumentet från dag till dag. - Ställ in tröskeln för att eliminera skräp och brus från cellprover. Använd de här inställningarna för alla exempel i experimentet.
- Om det behövs kan du ställa in färgkompensationen för att korrigera fluorescensspill.
- Pipettera försiktigt tillbaka samples innan du laddar dem på flödescytometern, namnge sample och kör samples.
- När alla exempel har körts sparar du exempeldata som FCS-filer genom att ge dem ett filnamn för ytterligare programvaruanalys. Spara arbetsmallen för det aktuella experimentet för hämtning i framtida körningar (valfritt).
- Ladda först ett kontrollample på flödescytometern och klicka på KÖR för att starta datainsamlingen (justera inställningarna om det behövs). Vänta tills instrumentet börjar aspirera sample och ge en förhandsvisning i realtid av upptäckta händelser.
5. Analys av data
- Importera data till dataanalysprogramvaran för flödescytometern (se materialtabellen).
- Dubbelklicka på det första exemplet på arbetsytan. Vänta tills ett graffönster öppnas som visar ett diagram över händelser längs FSC- och SSC-parametrar. Skapa en grind som isolerar spermiepopulationen som ingår i grinden, vilket skapar en "underordnad" population från den överordnade uppsättningen händelser.
- Dubbelklicka inom det inhägnade området och öppna ett nytt graffönster som endast innehåller spermiehändelserna. Ställ in x- och y-axelparametrarna för att välja fluorescerande kanal.
- Välj verktyget Port . Klicka i diagrammet för att få grindarna att visas, så att de skapade grindarna isolerar de olika cellpopulationerna.
- Högerklicka (eller Ctrl-klicka) på någon av de markerade raderna och välj Kopiera analys för att gruppera. Tillämpa grindträdet på alla exempel i gruppen.
- Spara och exportera datatabellen.
Representative Results
Figur 2 visar mätningen av spermiernas apoptos med hjälp av Annexin V-FITC/PI-färgning. FITC-signalen (grön fluorescens) mättes i FL1-kanalen och PI-signalen (röd fluorescens) mättes i FL2-kanalen. I den bivariata analysen av Annexin V/PI identifierade kvadranttillverkarna fyra distinkta spermiepopulationer. Resultaten uttrycktes som procentandelen Annexin V-/PI− spermier (livsdugliga eller levande celler), Annexin V+/PI− spermier (tidiga apoptotiska celler eller apoptotiska celler), Annexin V+/PI+ spermier (sena apoptotiska celler) och Annexin V−/PI+ spermier (nekrotiska celler)16,17 (Figur 2B). En negativ kontroll (ofärgade spermier) användes också för att ställa in kompensation och kvadranter (Figur 2A).
Figur 3 visar mätningen av MMP med JC-1-sond i mänskliga spermier. MMP % presenteras som det orangeröda/(gröna + orangeröda) fluorescensförhållandet genom att analysera cytogrammet. Ett spermaprov av god kvalitet visar vanligtvis hög orangeröd fluorescens och låg grön fluorescens (aktiva mitokondrier, övre vänstra kvadranten) (figur 3A). Omvänt visar ett spermaprov av dålig kvalitet vanligtvis låg orangeröd fluorescens och hög grön fluorescens (inaktiva mitokondrier, nedre högra kvadranten), möjligen på grund av mitokondriell störning (figur 3B).
Figur 4 visar data från SCSA13,14. Dessa typiska SCSA-cytogram erhölls från två individuella prover. Prov A kom från en fertil man och prov B från en infertil man. Analys av flödescytometriska data utfördes med hjälp av programvaran FlowJo. Cytogram visar källan till varje komponent i SCSA-data. X-axeln (röd fluorescens med 1 024 graderingar av röd fluorescens) indikerar fragmenterat DNA; Y-axeln (grön fluorescens med 1 024 graderingar) indikerar ursprunglig DNA-färgbarhet. Den streckade linjen vid y = 750 representerar gränsen för normala spermier. Ovanför denna linje av y = 750 finns spermier med delvis okondenserat kromatin, som bestämdes som omogna spermier.
Figur 1: Arbetsflöde för detektion av biomarkörer för spermiefunktionsskada genom flödescytometri. Spermaprover togs och förbehandlades enligt beskrivningen i protokollsteg 1. (1) Cellberedning, (2) färgning med fluorescerande reagenser och (3) flödescytometrisk analys och datatolkning. Förkortningar: MMP = mitokondriell membranpotential; SCSA = bestämning av spermiekromatinstruktur, PBS = fosfatbuffrad koksaltlösning, AO = akridin orange. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa resultat av spermieapoptos med användning av Annexin V-FITC/PI-färgning. Den nedre vänstra kvadranten innehåller Annexin V-/PI− spermier (livsdugliga eller levande celler), den nedre högra kvadranten visar Annexin V+/PI− spermier (tidiga apoptotiska celler eller apoptotiska celler), den övre högra kvadranten representerar Annexin V+/PI+ spermier (sena apoptotiska celler) och den övre vänstra kvadranten innehåller Annexin V−/PI+ spermier (nekrotiska celler). A) Negativ kontroll (ofärgade spermier). B) Ett prov med spermieapoptos. Förkortningar: FITC = fluoresceinisotiocyanat; PI = propidiumjodid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mätning av mitokondriell membranpotential med JC-1-sond . (A) Spermiesubpopulationen med hög MMP. (B) Spermiesubpopulationen med lågt MMP. Ställ in FL1-A och FL2-A som x-axeln (grön fluorescens) respektive y-axeln (orange-röd fluorescens). Förkortningar: MMP = mitokondriell membranpotential. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Detektering av DNA-skador i mänskliga spermier med hjälp av spermiekromatinstrukturanalys . A) Ett spermaprov med normal kromatinstruktur. B) Ett spermaprov med hög andel spermier med onormal kromatinstruktur. FlowJo-programvaran användes för att göra datorgrindar runt cellpopulationerna som identifierades som: 1) normala spermier, 2) HDS-spermier, 3) DFI-spermier och 4) cellrester, och procentandelar av HDS- och DFI-spermier beräknades. Förkortning: SCSA = spermiekromatinstrukturanalys; HDS = hög DNA-färgbarhet; DFI = DNA-fragmenteringsindex. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Kromatinintegritet, MMP och apoptos hos humana spermier har visat sig vara värdefulla prediktorer för reproduktiva resultat. I WHO:s senaste laboratoriehandbok för undersökning och bearbetning av mänsklig sperma (sjätte upplagan) lyftes också några av dessa indikatorer (kromatinintegritet och apoptos) fram som utvidgade undersökningar utöver den grundläggande undersökningen av rutinparametrar som spermieantal18. Nyare publikationer tyder också på att dessa indikatorer kan vara känsligare markörer för reaktion på extern farlig exponering, vilket indikerar deras potential för identifiering av reproduktionsskador i ett tidigare skede19,20. Att kombinera dessa indikatorer med rutinundersökningar kan också ge en mer omfattande förståelse för profilen för spermiedysfunktion och komplexiteten hos manliga reproduktionsskador i befolkningen.
Det finns flera nyckelfrågor som väsentligt avgör framgången för spermieanalys med FCM. För det första kräver mätningen av spermier MMP och apoptos omedelbar undersökning efter att sperman har blivit flytande. För att minimera tidskostnaden kan två tekniker separat ta hand om förbehandlingen av MMP och apoptosanalys av ett prov. Eftersom förbehandlingen av apoptos är enklare, skulle den överföras till det flödescytometriska steget snabbare än MMP-analysen. För SCSA-analysen bör färska spermaprover kryokonserveras omedelbart efter tillgänglighet efter förvätskning. Spermaproverna kan sedan förvaras i flytande kväve under en relativt lång period och behöver inte undersökas omedelbart.
Följaktligen kan tidskostnaden för experimentet på plats komprimeras till 40 minuter, vilket är varaktigheten av MMP-analys plus det flödescytometriska steget för spermieanalys. För det andra måste inställningen av grinden i den flödescytometriska plattformen bestämmas separat för varje sats av prover. Spermaproverna med tydliga cellundergrupper i spridningsdiagrammet kan väljas som referens för att rita grindområdet. För det tredje, eftersom det inte finns några allmänt accepterade kliniska referensvärden för indikatorerna i detta experiment, kan historiska resultat användas som ett viktigt verktyg för kvalitetskontroll. Positiva och negativa kontroller uppmuntras också att ställas in i varje omgång mätningar, särskilt för SCSA och MMP.
De representativa resultaten av spermaanalysen som tillhandahålls här härleds med hjälp av en Accuri C6. Tekniken kan dock tillämpas på andra kommersiella plattformar med mindre modifieringar. Vanligtvis skulle totalt 5 × 106 spermier behövas för att uppfylla kravet på mätning av alla indikatorer. Om spermiekoncentrationen i ett prov är mycket lägre än medelnivån, skulle behovet av spermavolymen öka.
I likhet med rutinmässiga spermieparametrar finns det också en märkbar intraindividuell variation i kromatinintegritet, MMP och apoptos hos humana spermier21. Följaktligen kan flera tester av prover som samlats in vid olika tidpunkter ge en mer exakt uppskattning av skadenivån för spermiernas funktion. Även om det inte finns någon rekommenderad period av avhållsamhet före spermieprovtagning för flödescytometrisk analys, kan 2-7 dagars ejakulationsavhållsamhet, som föreslås för rutinmässig spermieanalys av WHO, antas. Det kan bidra till att förbättra jämförbarheten av resultaten mellan laboratorier och mellan olika prover som samlats in från samma män.
En stor begränsning med denna metod är att två av de tre testade biomarkörerna - apoptos och mitokondriell membranpotential - kräver färska spermaprover. Detta kan begränsa deras tillämpning till män som kan lämna spermaprover till laboratoriet. För test av DNA-skada (SCSA) bör referensprover förberedas före försöket för att kalibrera flödescytometern. Det bör noteras att tillämpningen av det nuvarande protokollet kräver ett FCM-instrument i laboratoriet, vilket fortfarande är en stor utmaning för många kliniska laboratorier, även om samarbete med en tredjepartstjänst kan vara ett alternativt val i vissa regioner.
Dessutom är kostnaden för färgämnen och andra reagenser också en ekonomisk faktor för män som kan behöva undersökningen. Slutligen kan protokollet behöva modifieras om olika märken eller versioner av FCM används för att undersöka biomarkörerna. Sammanfattningsvis presenterar denna artikel ett praktiskt tillvägagångssätt för att uppskatta tre biomarkörer för skador på mänskliga spermier med en enda flödescytometrimaskin. Detta kan ge värdefull information om manlig reproduktiv hälsa och komplettera den rutinmässiga spermieundersökningen.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte föreligger några intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar alla fältarbetare för deras hjälp och de intervjuade för deras samarbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).
- Nachtigall, R. D. International disparities in access to infertility services. Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).
- Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come. Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).
- Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. New flow cytometry approaches in equine andrology. Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).
- Oosterhuis, G. J., et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality. Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).
- Koopman, G., et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).
- Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility. Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).
- Lehti, M. S., Sironen, A. Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects. Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), 13666 (2021).
- Agnihotri, S. K., et al. Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).
- Smiley, S. T., et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).
- Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).
- Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).
- Evenson, D. P.
- Agarwal, A., Said, T. M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).
- Ricci, G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).
- Zhang, H. -B., et al. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).
- WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2022).
- Evenson, D. P., Wixon, R. Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).
- Wang, Y. X., et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China. Environmental Research. 150, 557-565 (2016).
- Ni, W., et al. Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments. Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).
