Den nåværende protokollen gir en praktisk løsning som muliggjør måling av apoptose, mitokondriemembranpotensial og DNA-skade i menneskelig sæd med et enkelt cytometer.
Den konvensjonelle sædparameteranalysen er mye brukt til å vurdere mannlig fruktbarhet. Imidlertid har studier funnet at ~ 15% av infertile pasienter ikke viser noen abnormiteter i konvensjonelle sædparametere. Ytterligere teknologier er nødvendig for å forklare idiopatisk infertilitet og oppdage subtile sæddefekter. For tiden avslører biomarkører for sædfunksjon, inkludert spermapoptose, mitokondriemembranpotensial (MMP) og DNA-skade, sædfysiologi på molekylært nivå og er i stand til å forutsi mannlig fruktbarhet.
Med flowcytometri (FCM) teknikker kan hver av disse markørene måles raskt, nøyaktig og nøyaktig i menneskelige sædprøver, men tidskostnadene øker betydelig, og resultatene kan blokkeres hvis alle biomarkørene må testes med et enkelt cytometer. I denne protokollen, etter innsamling og umiddelbar inkubasjon ved 37 °C for kondensering, ble sædprøver videre analysert for spermapoptose ved bruk av Annexin V-fluoresceinisotiocyanat (FITC) / propidiumjodid (PI) farging. MMP ble merket med 5,5′,6,6′-tetraklor-1,1′,3,3′-tetraetyl-benzimidazolylkarbocyaninjodid (JC-1) sonde, og DNA-skade ble vurdert ved bruk av sædkromatinstrukturanalysen (SCSA) med akridinoransje (AO) farging. Dermed kan flowcytometrisk analyse av sædfunksjonsmarkører være en praktisk og pålitelig verktøykasse for diagnostisering av infertilitet og evaluering av sædfunksjon både på benk og seng.
Infertilitet har blitt et folkehelseproblem, med mannlig infertilitet som bidrar til 40% -50% av alle tilfeller 1,2. Selv om konvensjonell sædkvalitetsanalyse spiller en viktig rolle i å bestemme mannlig fertilitetspotensial, har omtrent 15% av pasientene med infertilitet normale sædparametere som sædkvalitet, motilitet og morfologi3. Videre har rutinemessige sædundersøkelser dårlig repeterbarhet, gir begrenset informasjon om sædfunksjon, og kan ikke gi en nøyaktig evaluering av mannlig fruktbarhet eller reflektere de subtile defektene i sædceller. Flere teknikker er utviklet for å teste sædfunksjonen, for eksempel hemizona-analysen (HZA), sædpenetrasjonsanalysen, den hypo-osmotiske hevelsestesten, antispermantistofftestingen, men disse metodene er tidkrevende og sårbare for subjektive påvirkninger fra operatørene. Derfor er det nødvendig å utvikle raske og nøyaktige metoder for sædfunksjonsanalyse.
FCM er en rask, enkeltcelleanalyseteknologi utviklet på 1970-tallet, som har vært mye brukt innen ulike felt innen cellebiologi og medisin. FCM er et robust verktøy for evaluering av sædfunksjon som analyserer spermatozoer merket med en spesifikk fluorescenssonde4. Spermatozoa passerer gjennom enkelt- eller flerkanals lasere, og spredt lys og utsendt fluorescens produseres av en laserstråle. Det spredte lyset inkluderer fremoverspredt lys (FSC) og sidespredt lys (SSC), som reflekterer størrelsen på den testede cellen og cellegranulariteten eller den indre strukturen. Disse signalene samles inn, vises og analyseres av datasystemet, og følgelig måles en rekke egenskaper fra spermatozoa raskt og nøyaktig. Derfor er FCM en rask, objektiv, flerdimensjonal og høy gjennomstrømningsteknikk som har fått økende oppmerksomhet innen sædanalyse. Anvendelsen av FCM kan gjøre opp for mangler i tradisjonelle metoder og gir en ny tilnærming for påvisning av sædens indre struktur og funksjon.
Spermapoptose er nært knyttet til mannlig fertilitet5. Påvisning av spermapoptose er en viktig indeks for å evaluere sædfunksjonen på molekylært nivå. FCM er allment anerkjent som en pålitelig og sensitiv metode for å oppdage spermapoptose ved bruk av Annexin V-FITC / PI-farging. Det grunnleggende prinsippet er at fosfatidylserin (PS) overføres fra det indre laget av cellemembranen til dets ytre lag i tidlig stadium av apoptose. Annexin V er et Ca2+-avhengig fosfolipidprotein (vanligvis merket av FITC) som har høy affinitet for PS, og oppdager dermed PS utsatt for den ytre overflaten av cellemembranen6. Nekrose og apoptose kan skilles i kombinasjon med Pl-farging. Derfor er metoden for Annexin V-FITC / PI dobbeltfarging mye brukt, da det er raskt, enkelt og enkelt å oppdage forskjellige apoptotiske sædceller.
En moden pattedyrsperm inneholder ca. 72-80 mitokondrier7, noe som tyder på en biologisk årsak til oppbevaring av sædmitokondrier8. Sperm mitokondrier har vist seg å spille viktige roller i å opprettholde sædmotilitet og fruktbarhet9. JC-1-flekken, som kan brukes som en indikator på MMP i en rekke celletyper, er en av de mest populære fluorokromene for sædmitokondriell aktivitetsvurdering10. JC-1 er et kationisk fargestoff som potensielt akkumuleres i mitokondriene. JC-1 har et maksimalt fluorescensutslipp ved 525 nm (grønn) og danner J-aggregater 11 når de bindes til membraner med høyt potensial (ΔΨm, 80-100 mV), noe som resulterer i et skifte i fluorescensutslipp til ~ 590 nm (oransje-rød). Følgelig er sperm mitokondriell depolarisering indikert ved en reduksjon i det røde / grønne fluorescensintensitetsforholdet, og FCM kan brukes til å oppdage MMP-nivåer i humane sædprøver.
SCSA-metodikken ble oppfunnet av Evenson et al.12, og regnes som en presis og repeterbar test med unike dobbeltparameterdata (rød vs grønn fluorescens) på en 1,024 × 1,024 kanalskala 13. I skadet sæd er DNA og endrede proteiner i sædkjerner merket av AO, og brudd på DNA-strengen måles ved rød fluorescens, mens intakte dobbelttråder avgir grønn fluorescens i FCM14. I dag er det utviklet mange metoder for å estimere sæd-DNA-integritet. Imidlertid, i motsetning til SCSA, er disse analysene ofte arbeidsintensive og mangler evnen til en diagnose av mannlig infertilitet. SCSA-testresultatene er signifikant kjerneformet med humant DNA, graviditet og abort, gir overbevisende bevis på at SCSA kan være nyttig i human sædanalyse, og kan tjene som et verdifullt verktøy for infertilitetsklinikere15.
Kromatinintegritet, MMP og apoptose reflekterer ulike aspekter av sædfunksjon, og dermed kan kombinasjonen av disse biomarkørene gi en mer omfattende innsikt i sædstatus. FCM kan brukes til separate målinger av enten kromatinintegritet, MMP eller apoptose i humane sædprøver. Selv om bekostning av FCM og kostnaden for fargestoffer har begrenset den brede anvendelsen av disse teknikkene i kliniske laboratorier for reproduktiv helse, blir deres verdi for fecundity estimering akseptert.
Men siden hvert av forsøkene krever forbehandling av sædprøver, og alle forbehandlede prøver må testes så snart som mulig, kan samtidig måling av alle de tre biomarkørene for en prøve med en enkelt FCM føre til lang ventetid for noen av forsøkene og hindre påliteligheten av resultatene. Dette skyldes at sædcellene får ytterligere skade under venteprosessen, hvis protokollen ikke er ordentlig arrangert med tanke på alle de tre eksperimentene. Denne artikkelen presenterer en protokoll som realiserer flytende måling av alle de tre biomarkørene i en enkelt cytometri uten vesentlig kompromiss av eksperimentkvalitet indusert av langvarige ventetider.
Kromatinintegritet, MMP og apoptose av humane spermatozoer har vist seg å være verdifulle prediktorer for reproduktive utfall. Den siste utgitte WHO-laboratoriehåndboken for undersøkelse og behandling av human sæd (sjette utgave) fremhevet også noen av disse indikatorene (kromatinintegritet og apoptose) som utvidede undersøkelser utover grunnleggende undersøkelse av rutinemessige parametere som sædkvalitet18. Nyere publikasjoner tyder også på at disse indikatorene kan være mer følsomme markører for respons på eksterne farlige eksponeringer, noe som indikerer deres potensial for identifisering av reproduktive skader på et tidligere stadium19,20. Å kombinere disse indikatorene med rutinemessige undersøkelser kan også gi en mer omfattende forståelse av profilen til sæddysfunksjon og kompleksiteten av mannlig reproduktiv skade i befolkningen.
Det er flere viktige problemer som vesentlig bestemmer suksessen til sædanalyse med FCM. For det første krever måling av sæd MMP og apoptose umiddelbar undersøkelse etter at sæden er flytende. For å minimere tidskostnaden kan to teknikere hver for seg ta ansvar for forbehandling av MMP og apoptoseanalyse av en prøve. Siden forbehandlingen av apoptose er enklere, vil den overføres til det flowcytometriske trinnet raskere enn MMP-analysen. For SCSA-analysen bør ferske sædprøver kryopreserveres umiddelbart etter tilgjengelighet etter flytendegjøring. Sædprøvene kan deretter lagres i flytende nitrogen i en relativt lang periode og trenger ikke umiddelbar undersøkelse.
Følgelig kan tidskostnaden for eksperimentet på stedet komprimeres til 40 minutter, som er varigheten av MMP-analysen pluss det flow-cytometriske trinnet med sædanalyse. For det andre må oppsettet av gatingen i den flowcytometriske plattformen avgjøres for hver batch av prøver separat. Sædprøvene med klare celleundergrupper i spredningsplottet kan velges som referanse for å tegne gatingområdet. For det tredje, siden det ikke finnes allment aksepterte kliniske referanseverdier for indikatorene for dette eksperimentet, kan historiske resultater brukes som et viktig verktøy for kvalitetskontroll. Positive og negative kontroller oppfordres også til å bli satt i hver batch av målinger, spesielt for SCSA og MMP.
De representative resultatene av sædanalyse gitt her er avledet ved hjelp av en Accuri C6. Teknikken kan imidlertid brukes på andre kommersielle plattformer med mindre modifikasjoner. Vanligvis vil det være nødvendig med totalt 5 × 106 sædceller for å oppfylle kravet til måling av alle indikatorene. Hvis sædkonsentrasjonen i en prøve er mye lavere enn gjennomsnittsnivået, vil behovet for sædvolumet øke.
I likhet med rutinemessige sædparametere er det også merkbar intraindividuell variasjon i kromatinintegriteten, MMP og apoptose av humane spermatozoer21. Følgelig kan flere tester av prøver samlet på forskjellige tidspunkter gi en mer nøyaktig estimering av sædfunksjonsskadenivået. Selv om det ikke er noen anbefalt periode med avholdenhet før sædprøvetaking for flowcytometrisk analyse, kan 2-7 dager med ejakulatorisk avholdenhet, foreslått for rutinemessig sædanalyse av WHO, vedtas. Det kan bidra til å bedre sammenlignbarheten av resultatene mellom laboratorier og mellom ulike prøver samlet inn fra de samme mennene.
En stor begrensning ved denne metoden er at to av de tre testede biomarkørene – apoptosen og mitokondriemembranpotensialet – krever ferske sædprøver. Dette kan begrense deres søknad til menn som kan gi sædprøver til laboratoriet. For test av DNA-skade (SCSA) bør referanseprøver utarbeides før eksperimentet for å kalibrere strømningscytometeret. Merk at anvendelsen av denne protokollen krever et FCM-instrument i laboratoriet, noe som fortsatt er en betydelig utfordring for mange kliniske laboratorier, selv om samarbeid med en tredjepartstjeneste kan være et alternativt valg i enkelte regioner.
I tillegg er bekostning av fargestoffer og andre reagenser også en økonomisk faktor for menn som kan trenge undersøkelsen. Til slutt kan protokollen trenge modifikasjon hvis forskjellige merker eller versjoner av FCM brukes til å undersøke biomarkørene. Oppsummert presenterer denne artikkelen en praktisk tilnærming for å estimere tre biomarkører for skade på humane spermatozoer av en enkelt flowcytometrimaskin. Dette kan gi verdifull informasjon om mannlig reproduktiv helse og utfylle den rutinemessige sperm undersøkelsen.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle feltarbeiderne for hjelpen og intervjuobjektene for samarbeidet.
0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
Biological safety hood | Airtech, USA | ||
Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
Equipments | |||
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
Materials | |||
PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |