Summary
Den nåværende protokollen gir en praktisk løsning som muliggjør måling av apoptose, mitokondriemembranpotensial og DNA-skade i menneskelig sæd med et enkelt cytometer.
Abstract
Den konvensjonelle sædparameteranalysen er mye brukt til å vurdere mannlig fruktbarhet. Imidlertid har studier funnet at ~ 15% av infertile pasienter ikke viser noen abnormiteter i konvensjonelle sædparametere. Ytterligere teknologier er nødvendig for å forklare idiopatisk infertilitet og oppdage subtile sæddefekter. For tiden avslører biomarkører for sædfunksjon, inkludert spermapoptose, mitokondriemembranpotensial (MMP) og DNA-skade, sædfysiologi på molekylært nivå og er i stand til å forutsi mannlig fruktbarhet.
Med flowcytometri (FCM) teknikker kan hver av disse markørene måles raskt, nøyaktig og nøyaktig i menneskelige sædprøver, men tidskostnadene øker betydelig, og resultatene kan blokkeres hvis alle biomarkørene må testes med et enkelt cytometer. I denne protokollen, etter innsamling og umiddelbar inkubasjon ved 37 °C for kondensering, ble sædprøver videre analysert for spermapoptose ved bruk av Annexin V-fluoresceinisotiocyanat (FITC) / propidiumjodid (PI) farging. MMP ble merket med 5,5′,6,6'-tetraklor-1,1′,3,3'-tetraetyl-benzimidazolylkarbocyaninjodid (JC-1) sonde, og DNA-skade ble vurdert ved bruk av sædkromatinstrukturanalysen (SCSA) med akridinoransje (AO) farging. Dermed kan flowcytometrisk analyse av sædfunksjonsmarkører være en praktisk og pålitelig verktøykasse for diagnostisering av infertilitet og evaluering av sædfunksjon både på benk og seng.
Introduction
Infertilitet har blitt et folkehelseproblem, med mannlig infertilitet som bidrar til 40% -50% av alle tilfeller 1,2. Selv om konvensjonell sædkvalitetsanalyse spiller en viktig rolle i å bestemme mannlig fertilitetspotensial, har omtrent 15% av pasientene med infertilitet normale sædparametere som sædkvalitet, motilitet og morfologi3. Videre har rutinemessige sædundersøkelser dårlig repeterbarhet, gir begrenset informasjon om sædfunksjon, og kan ikke gi en nøyaktig evaluering av mannlig fruktbarhet eller reflektere de subtile defektene i sædceller. Flere teknikker er utviklet for å teste sædfunksjonen, for eksempel hemizona-analysen (HZA), sædpenetrasjonsanalysen, den hypo-osmotiske hevelsestesten, antispermantistofftestingen, men disse metodene er tidkrevende og sårbare for subjektive påvirkninger fra operatørene. Derfor er det nødvendig å utvikle raske og nøyaktige metoder for sædfunksjonsanalyse.
FCM er en rask, enkeltcelleanalyseteknologi utviklet på 1970-tallet, som har vært mye brukt innen ulike felt innen cellebiologi og medisin. FCM er et robust verktøy for evaluering av sædfunksjon som analyserer spermatozoer merket med en spesifikk fluorescenssonde4. Spermatozoa passerer gjennom enkelt- eller flerkanals lasere, og spredt lys og utsendt fluorescens produseres av en laserstråle. Det spredte lyset inkluderer fremoverspredt lys (FSC) og sidespredt lys (SSC), som reflekterer størrelsen på den testede cellen og cellegranulariteten eller den indre strukturen. Disse signalene samles inn, vises og analyseres av datasystemet, og følgelig måles en rekke egenskaper fra spermatozoa raskt og nøyaktig. Derfor er FCM en rask, objektiv, flerdimensjonal og høy gjennomstrømningsteknikk som har fått økende oppmerksomhet innen sædanalyse. Anvendelsen av FCM kan gjøre opp for mangler i tradisjonelle metoder og gir en ny tilnærming for påvisning av sædens indre struktur og funksjon.
Spermapoptose er nært knyttet til mannlig fertilitet5. Påvisning av spermapoptose er en viktig indeks for å evaluere sædfunksjonen på molekylært nivå. FCM er allment anerkjent som en pålitelig og sensitiv metode for å oppdage spermapoptose ved bruk av Annexin V-FITC / PI-farging. Det grunnleggende prinsippet er at fosfatidylserin (PS) overføres fra det indre laget av cellemembranen til dets ytre lag i tidlig stadium av apoptose. Annexin V er et Ca2+-avhengig fosfolipidprotein (vanligvis merket av FITC) som har høy affinitet for PS, og oppdager dermed PS utsatt for den ytre overflaten av cellemembranen6. Nekrose og apoptose kan skilles i kombinasjon med Pl-farging. Derfor er metoden for Annexin V-FITC / PI dobbeltfarging mye brukt, da det er raskt, enkelt og enkelt å oppdage forskjellige apoptotiske sædceller.
En moden pattedyrsperm inneholder ca. 72-80 mitokondrier7, noe som tyder på en biologisk årsak til oppbevaring av sædmitokondrier8. Sperm mitokondrier har vist seg å spille viktige roller i å opprettholde sædmotilitet og fruktbarhet9. JC-1-flekken, som kan brukes som en indikator på MMP i en rekke celletyper, er en av de mest populære fluorokromene for sædmitokondriell aktivitetsvurdering10. JC-1 er et kationisk fargestoff som potensielt akkumuleres i mitokondriene. JC-1 har et maksimalt fluorescensutslipp ved 525 nm (grønn) og danner J-aggregater 11 når de bindes til membraner med høyt potensial (ΔΨm, 80-100 mV), noe som resulterer i et skifte i fluorescensutslipp til ~ 590 nm (oransje-rød). Følgelig er sperm mitokondriell depolarisering indikert ved en reduksjon i det røde / grønne fluorescensintensitetsforholdet, og FCM kan brukes til å oppdage MMP-nivåer i humane sædprøver.
SCSA-metodikken ble oppfunnet av Evenson et al.12, og regnes som en presis og repeterbar test med unike dobbeltparameterdata (rød vs grønn fluorescens) på en 1,024 × 1,024 kanalskala 13. I skadet sæd er DNA og endrede proteiner i sædkjerner merket av AO, og brudd på DNA-strengen måles ved rød fluorescens, mens intakte dobbelttråder avgir grønn fluorescens i FCM14. I dag er det utviklet mange metoder for å estimere sæd-DNA-integritet. Imidlertid, i motsetning til SCSA, er disse analysene ofte arbeidsintensive og mangler evnen til en diagnose av mannlig infertilitet. SCSA-testresultatene er signifikant kjerneformet med humant DNA, graviditet og abort, gir overbevisende bevis på at SCSA kan være nyttig i human sædanalyse, og kan tjene som et verdifullt verktøy for infertilitetsklinikere15.
Kromatinintegritet, MMP og apoptose reflekterer ulike aspekter av sædfunksjon, og dermed kan kombinasjonen av disse biomarkørene gi en mer omfattende innsikt i sædstatus. FCM kan brukes til separate målinger av enten kromatinintegritet, MMP eller apoptose i humane sædprøver. Selv om bekostning av FCM og kostnaden for fargestoffer har begrenset den brede anvendelsen av disse teknikkene i kliniske laboratorier for reproduktiv helse, blir deres verdi for fecundity estimering akseptert.
Men siden hvert av forsøkene krever forbehandling av sædprøver, og alle forbehandlede prøver må testes så snart som mulig, kan samtidig måling av alle de tre biomarkørene for en prøve med en enkelt FCM føre til lang ventetid for noen av forsøkene og hindre påliteligheten av resultatene. Dette skyldes at sædcellene får ytterligere skade under venteprosessen, hvis protokollen ikke er ordentlig arrangert med tanke på alle de tre eksperimentene. Denne artikkelen presenterer en protokoll som realiserer flytende måling av alle de tre biomarkørene i en enkelt cytometri uten vesentlig kompromiss av eksperimentkvalitet indusert av langvarige ventetider.
Protocol
MERK: Arbeidsflyt for påvisning av biomarkører for sædfunksjonsskade ved flowcytometri inkluderer (1) cellepreparering, (2) farging med fluorescerende reagenser og (3) flowcytometrisk analyse og datatolkning (figur 1). Protokollen følger retningslinjene til etikkomiteene ved Hærens medisinske universitet (1.0/2013.4-12).
1. Cell forberedelse
- Få menneskelige sædprøver ved onani i plastiske prøveglass, helst etter 3-5 dagers avholdenhet.
- Inkuber umiddelbart sædprøvene i en 37 °C inkubator og gjør prøvene helt flytende (opptil 1 time).
2. Sædceller telles ved hjelp av dataassistert sædanalyse (CASA)
- Bland de flytende sædprøvene grundig.
- Tilsett 10 μL sæd i et sædtellekammer (se materialtabellen).
- Skann lysbildene i Sperm Class Analyzer (se materialfortegnelsen), og tell minst seks områder og 400 spermatozoer for estimering av sædkonsentrasjon.
MERK: Sædprøver må være ferske, ikke frosne, for sædapoptose og MMP-analyse.
3. Farging av sædceller
- Påvisning av spermapoptose ved bruk av vedlegg V-FITC / PI-farging
- Tilsett 1 × 106 sædceller til et 1,5 ml sentrifugerør.
- Vask cellene med 500 μL kald fosfatbufret saltvann (PBS).
- Sentrifuger sædcellesuspensjonen ved 300 × g i 7 minutter og kast supernatanten.
- Resuspender sædcellene i 200 μL 1x bindingsbuffer.
- Tilsett 2 μL FITC vedlegg V og 2 μL PI (se materialtabellen).
- Virv cellene forsiktig, inkuber i 15 minutter ved romtemperatur (25 °C) i mørket, og legg dem i flowcytometeret umiddelbart for analyse.
- Analyse av mitokondriemembranpotensial ved bruk av JC-1 sonde
- Tilsett 2 × 106 sædceller til et 1,5 ml sentrifugerør og sentrifuge ved 600 × g i 5 minutter.
- Resuspender sædcellesuspensjonen i 1 ml JC-1 arbeidsløsning (se materialfortegnelsen).
- Virv cellene forsiktig og rug i 20 minutter ved 37 °C i mørket.
- Sentrifuger suspensjonen ved 600 × g i 5 minutter og kast supernatanten.
- Vask pelleten to ganger med 1 ml PBS med en hastighet på 600 × g i 5 minutter hver.
- Resuspender de fargede sædcellene i 1 ml PBS i flowcytometerrør, og plasser rørene i flowcytometeret umiddelbart for analyse.
- Bruk karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP) som en positiv kontroll. Resuspender sædcellene (som tidligere beskrevet i trinn 3.2.1) i 1 ml CCCP-arbeidsløsning (se materialfortegnelsen), og virvle cellene forsiktig og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur. Sentrifuger suspensjonen ved 600 × g i 5 minutter og kast supernatanten. Gjenta trinn 3.2.2-3.2.6.
- Analyse av sædkromatinstruktur
- Legg en alikot av flytende rå sæd (0,25 ml) i et kryorør, og frys umiddelbart sædprøvene i flytende nitrogen (-196 °C) til de er klare for SCSA.
- Tine sædprøvene i et vannbad på 37 °C og fortynn dem med TNE-buffer (se materialtabellen) til en konsentrasjon på 1-2 × 106 celler/ml.
- Tilsett 200 μL av den fortynnede prøven til et strømningscytometerreagensrør og bland det med 400 μL syreoppløsning (se materialfortegnelsen) i 30 s.
- Beis prøvene med 1,2 ml AO-fargeløsning (se materialfortegnelsen) og legg i flowcytometeret umiddelbart for analyse.
- Bruk en referanseprøve som en intern standard for oppsett og kalibrering av flowcytometer. Fortynn referanseprøven med 4 °C TNE-buffer til en konsentrasjon på 1-2 × 106 celler/ml. Gjenta trinn 3.3.1-3.3.4.
MERKNADER: Alle oppløsninger og buffere lagres ved 4 °C. (1) Sæden skal ikke fortynnes før blitzfrysing. Rå sædprøver skal tines og fortynnes med TNE-buffer ved flowcytometrimålinger. (2) For infertilitetsklinikker bør ~ 0,25 ml rå sæd være flash-frosset i en ultrakald fryser eller en LN2-tank. Disse frosne alikotene kan deretter sendes til et SCSA-diagnostisk laboratorium på tørris eller i en LN2 tørrskiper. (3) En human ejakulasjonsprøve som demonstrerer heterogenitet av DNA-integritet (f.eks. 15% DNA-fragmenteringsindeks [DFI]) ble brukt som en intern standardreferanse.
4. Oppsett av flowcytometer
MERK: Før flowcytometeret startes, bør instrumentets systemkontroll utføres for å verifisere analyseytelsen. Kjør prøvene etter at alle kontrollene er fullført og bestått.
- Åpne flowcytometer-programvaren og start cytometeret.
- Samle inn eksempeldata.
- Først laster du inn en kontrollprøve på flowcytometeret, og klikker på KJØR for å starte datainnsamlingen (juster innstillingene om nødvendig). Vent til instrumentet begynner å aspirere prøven og gi en forhåndsvisning i sanntid av oppdagede hendelser.
MERK: Kontrollprøven: en negativ kontroll (ufargede sædceller) for spermapoptose; en positiv kontroll (CCCP-behandlede celler) for MMP; et referanseeksempel for SCSA. - Opprett punktdiagrammer for visning av data, og velg x/y-akseparametrene (for eksempel FSC, SSC) og lineær for å spesifisere data vises. Velg og bruk en mangekantet port for å avgrense sædpopulasjonen for analyse, og slik at instrumentet plotter oppdagede hendelser i sanntid.
- Analyser sædhendelsene i regionen.
- For spermapoptose, sett FL1 som x-aksen og FL2 som x-aksen. For å isolere de levende, apoptotiske eller nekrotiske cellene, trykk og dra kvadrantporten for å sette sædpopulasjonene ned til fire spesifikke populasjoner.
- For MMP angir du FL1 som x-aksen og FL2 som y-aksen. Lag en polygonal port for å underordne sædpopulasjonene ned til to spesifikke populasjoner.
- For SCSA angir du FL4 som x-akse (røde fluorescens, 125/1 024 flowcytometrikanaler) og FL1 som y-aksen (grønn fluorescens, 475/1 024 flowcytometrikanaler). Tegn portene i en 45° vinkel for å utelukke signaler fra cellulært rusk.
- Angi en kjøregrense for å angi når du skal slutte å samle inn data. Beregn totalt 10.000 sædceller for hver prøve for spermapoptose, MMP og SCSA-analyser.
- Angi fluidikkhastigheten (langsom, middels og rask, eller en tilpasset fluidikkhastighet), avhengig av cellenumrene.
NOTATER: For SCSA-analyse, for å bestemme sædkonsentrasjoner, tine den frosne råprøven og kjør den på FCM. Hvis strømningshastigheten er >250/s, fortynn prøven til riktig strømningshastighet. Mål alle prøver uavhengig av hverandre to ganger, og beregn middelverdiene. En referanseprøve ble testet når hver 10-15 prøve ble målt for å sikre standardisering og stabilitet av instrumentet fra dag til dag. - Angi terskelen for å eliminere rusk og støy fra celleprøver. Bruk disse innstillingene for alle eksemplene i eksperimentet.
- Hvis nødvendig, still inn fargekompensasjonen for å korrigere fluorescensspillover.
- Rør prøvene forsiktig tilbake før du legger dem på flowcytometeret, navngi prøven og kjør prøvene.
- Når alle prøvene er kjørt, lagrer du eksempeldataene som FCS-filer ved å gi dem et filnavn for videre programvareanalyse. Lagre arbeidsmalen for gjeldende eksperiment for henting i fremtidige kjøringer (valgfritt).
- Først laster du inn en kontrollprøve på flowcytometeret, og klikker på KJØR for å starte datainnsamlingen (juster innstillingene om nødvendig). Vent til instrumentet begynner å aspirere prøven og gi en forhåndsvisning i sanntid av oppdagede hendelser.
5. Dataanalyse
- Importer dataene til dataanalyseprogrammet for flowcytometeret (se materiallisten).
- Dobbeltklikk det første eksemplet i arbeidsområdet. Vent til et Graph-vindu åpnes, som viser et plott av hendelser langs FSC versus SSC-parametere. Opprett en port som isolerer sædpopulasjonen som er inkludert i porten, og produserer en "underordnet" populasjon fra det overordnede settet av hendelser.
- Dobbeltklikk i det inngjerdede området, og åpne et nytt grafvindu som bare inneholder sædhendelsene. Still inn x- og y-akseparametrene for å velge fluorescerende kanal.
- Velg portverktøyet . Klikk i plottet for å få portene til å vises, slik at de opprettede portene isolerer de forskjellige cellepopulasjonene.
- Høyreklikk (eller kontrollklikk) en av de uthevede radene, og velg Kopier analyse til gruppe. Bruk gatingtreet på alle prøvene i gruppen.
- Lagre og eksporter datatabellen.
Representative Results
Figur 2 viser måling av spermapoptose ved bruk av Annexin V-FITC/PI-farging. FITC-signalet (grønn fluorescens) ble målt i FL1-kanalen, og PI-signalet (rød fluorescens) ble målt i FL2-kanalen. I bivariatanalysen av vedlegg V/PI identifiserte kvadrantprodusentene fire distinkte sædpopulasjoner. Resultatene ble uttrykt som prosentandelen av Annexin V-/PI-spermier (levedyktige eller levende celler), Annexin V+/PI-sæd (tidlige apoptotiske celler eller apoptotiske celler), Annexin V+/PI+ sædceller (sene apoptotiske celler) og Annexin V−/PI+ sædceller (nekrotiske celler)16,17 (figur 2B). En negativ kontroll (ufargede sædceller) ble også brukt til å sette opp kompensasjon og kvadranter (figur 2A).
Figur 3 viser måling av MMP ved bruk av JC-1 sonde i human sperm. MMP% presenteres som oransje-rød/(grønn + oransje-rød) fluorescensratio ved å analysere cytogrammet. En sædprøve av god kvalitet viser vanligvis høy oransje-rød fluorescens og lav grønn fluorescens (aktiv mitokondrier, øvre venstre kvadrant) (figur 3A). Omvendt viser en sædprøve av dårlig kvalitet vanligvis lav oransje-rød fluorescens og høy grønn fluorescens (inaktive mitokondrier, nedre høyre kvadrant), muligens på grunn av mitokondrieforstyrrelser (figur 3B).
Figur 4 viser dataene for SCSA13,14. Disse typiske SCSA-cytogrammene ble oppnådd fra to individuelle prøver. Prøve A kom fra en fruktbar mann og prøve B fra en ufruktbar mann. Analyse av flowcytometriske data ble utført ved hjelp av programvaren FlowJo. Cytogrammer viser kilden til hver komponent i SCSA-data. X-aksen (rød fluorescens med 1024 graderinger av rød fluorescens) indikerer fragmentert DNA; y-aksen (grønn fluorescens med 1024 graderinger) indikerer naturlig DNA-farbarhet. Den stiplede linjen ved y = 750 representerer grensen for normal sæd. Over denne linjen på y = 750 er sædceller med delvis ukondensert kromatin, som ble bestemt som umodne sædceller.
Figur 1 Arbeidsflyt for påvisning av biomarkører for sædfunksjonsskade ved flowcytometri. Sædprøver ble tatt og forbehandlet som beskrevet i protokoll trinn 1. (1) Cellepreparering, (2) farging med fluorescerende reagenser, og (3) flowcytometrisk analyse og datatolkning. Forkortelser: MMP = mitokondriemembranpotensial; SCSA = analyse av sædkromatinstruktur; PBS = fosfatbufret saltvann; AO = akridin oransje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative resultater av spermapoptose ved bruk av vedlegg V-FITC/PI-farging. Den nedre venstre kvadranten inneholder Annexin V-/PI-sperm (levedyktige eller levende celler), den nedre høyre kvadranten viser Annexin V + / PI-sæd (tidlige apoptotiske celler eller apoptotiske celler), øvre høyre kvadrant representerer Annexin V + / PI + sæd (sene apoptotiske celler), og øvre venstre kvadrant inneholder vedlegg V - / PI + sæd (nekrotiske celler). (A) Negativ kontroll (ufargede sædceller); (B) en prøve med spermapoptose. Forkortelser: FITC = fluoresceinisotiocyanat; PI = propidiumjodid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Måling av mitokondriemembranpotensial ved bruk av JC-1-sonde . (A) Sperm subpopulasjon med høy MMP. (B) Sperm subpopulasjon med lav MMP. Sett FL1-A og FL2-A som henholdsvis x-aksen (grønn fluorescens) og y-aksen (oransje-rød fluorescens). Forkortelser: MMP = mitokondriemembranpotensial. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Påvisning av DNA-skade i menneskelig sæd ved hjelp av sædkromatinstrukturanalyse . (A) En sædprøve med normal kromatinstruktur. (B) En sædprøve med høy andel spermatozoer med unormal kromatinstruktur. FlowJo-programvaren ble brukt til å lage dataporter rundt cellepopulasjonene identifisert som: 1) normal sæd, 2) HDS-sæd, 3) DFI-sæd og 4) celleavfall og prosentandeler av HDS- og DFI-sædceller ble beregnet. Forkortelse: SCSA = sædkromatinstrukturanalyse; HDS = høy DNA-farging; DFI = DNA-fragmenteringsindeks. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Kromatinintegritet, MMP og apoptose av humane spermatozoer har vist seg å være verdifulle prediktorer for reproduktive utfall. Den siste utgitte WHO-laboratoriehåndboken for undersøkelse og behandling av human sæd (sjette utgave) fremhevet også noen av disse indikatorene (kromatinintegritet og apoptose) som utvidede undersøkelser utover grunnleggende undersøkelse av rutinemessige parametere som sædkvalitet18. Nyere publikasjoner tyder også på at disse indikatorene kan være mer følsomme markører for respons på eksterne farlige eksponeringer, noe som indikerer deres potensial for identifisering av reproduktive skader på et tidligere stadium19,20. Å kombinere disse indikatorene med rutinemessige undersøkelser kan også gi en mer omfattende forståelse av profilen til sæddysfunksjon og kompleksiteten av mannlig reproduktiv skade i befolkningen.
Det er flere viktige problemer som vesentlig bestemmer suksessen til sædanalyse med FCM. For det første krever måling av sæd MMP og apoptose umiddelbar undersøkelse etter at sæden er flytende. For å minimere tidskostnaden kan to teknikere hver for seg ta ansvar for forbehandling av MMP og apoptoseanalyse av en prøve. Siden forbehandlingen av apoptose er enklere, vil den overføres til det flowcytometriske trinnet raskere enn MMP-analysen. For SCSA-analysen bør ferske sædprøver kryopreserveres umiddelbart etter tilgjengelighet etter flytendegjøring. Sædprøvene kan deretter lagres i flytende nitrogen i en relativt lang periode og trenger ikke umiddelbar undersøkelse.
Følgelig kan tidskostnaden for eksperimentet på stedet komprimeres til 40 minutter, som er varigheten av MMP-analysen pluss det flow-cytometriske trinnet med sædanalyse. For det andre må oppsettet av gatingen i den flowcytometriske plattformen avgjøres for hver batch av prøver separat. Sædprøvene med klare celleundergrupper i spredningsplottet kan velges som referanse for å tegne gatingområdet. For det tredje, siden det ikke finnes allment aksepterte kliniske referanseverdier for indikatorene for dette eksperimentet, kan historiske resultater brukes som et viktig verktøy for kvalitetskontroll. Positive og negative kontroller oppfordres også til å bli satt i hver batch av målinger, spesielt for SCSA og MMP.
De representative resultatene av sædanalyse gitt her er avledet ved hjelp av en Accuri C6. Teknikken kan imidlertid brukes på andre kommersielle plattformer med mindre modifikasjoner. Vanligvis vil det være nødvendig med totalt 5 × 106 sædceller for å oppfylle kravet til måling av alle indikatorene. Hvis sædkonsentrasjonen i en prøve er mye lavere enn gjennomsnittsnivået, vil behovet for sædvolumet øke.
I likhet med rutinemessige sædparametere er det også merkbar intraindividuell variasjon i kromatinintegriteten, MMP og apoptose av humane spermatozoer21. Følgelig kan flere tester av prøver samlet på forskjellige tidspunkter gi en mer nøyaktig estimering av sædfunksjonsskadenivået. Selv om det ikke er noen anbefalt periode med avholdenhet før sædprøvetaking for flowcytometrisk analyse, kan 2-7 dager med ejakulatorisk avholdenhet, foreslått for rutinemessig sædanalyse av WHO, vedtas. Det kan bidra til å bedre sammenlignbarheten av resultatene mellom laboratorier og mellom ulike prøver samlet inn fra de samme mennene.
En stor begrensning ved denne metoden er at to av de tre testede biomarkørene - apoptosen og mitokondriemembranpotensialet - krever ferske sædprøver. Dette kan begrense deres søknad til menn som kan gi sædprøver til laboratoriet. For test av DNA-skade (SCSA) bør referanseprøver utarbeides før eksperimentet for å kalibrere strømningscytometeret. Merk at anvendelsen av denne protokollen krever et FCM-instrument i laboratoriet, noe som fortsatt er en betydelig utfordring for mange kliniske laboratorier, selv om samarbeid med en tredjepartstjeneste kan være et alternativt valg i enkelte regioner.
I tillegg er bekostning av fargestoffer og andre reagenser også en økonomisk faktor for menn som kan trenge undersøkelsen. Til slutt kan protokollen trenge modifikasjon hvis forskjellige merker eller versjoner av FCM brukes til å undersøke biomarkørene. Oppsummert presenterer denne artikkelen en praktisk tilnærming for å estimere tre biomarkører for skade på humane spermatozoer av en enkelt flowcytometrimaskin. Dette kan gi verdifull informasjon om mannlig reproduktiv helse og utfylle den rutinemessige sperm undersøkelsen.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker alle feltarbeiderne for hjelpen og intervjuobjektene for samarbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).
- Nachtigall, R. D. International disparities in access to infertility services. Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).
- Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come. Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).
- Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. New flow cytometry approaches in equine andrology. Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).
- Oosterhuis, G. J., et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality. Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).
- Koopman, G., et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).
- Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility. Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).
- Lehti, M. S., Sironen, A. Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects. Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), 13666 (2021).
- Agnihotri, S. K., et al. Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).
- Smiley, S. T., et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).
- Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).
- Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).
- Evenson, D. P.
- Agarwal, A., Said, T. M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).
- Ricci, G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).
- Zhang, H. -B., et al. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).
- WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2022).
- Evenson, D. P., Wixon, R. Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).
- Wang, Y. X., et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China. Environmental Research. 150, 557-565 (2016).
- Ni, W., et al. Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments. Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).
