Summary
본 프로토콜은 단일 세포분석기로 인간 정자의 세포사멸, 미토콘드리아 막 전위 및 DNA 손상을 측정할 수 있는 실용적인 솔루션을 제공합니다.
Abstract
기존의 정액 파라미터 분석은 남성의 생식력을 평가하는 데 널리 사용됩니다. 그러나 연구에 따르면 불임 환자의 ~15%는 기존 정액 매개변수에서 이상을 보이지 않습니다. 특발성 불임을 설명하고 미묘한 정자 결함을 감지하기 위해서는 추가 기술이 필요합니다. 현재 정자 세포사멸, 미토콘드리아 막 전위(MMP), DNA 손상을 포함한 정자 기능의 바이오마커는 분자 수준에서 정자 생리를 밝히고 남성의 생식력을 예측할 수 있습니다.
유세포 분석(FCM) 기술을 사용하면 인간 정액 샘플에서 이러한 각 마커를 빠르고 정확하며 정밀하게 측정할 수 있지만, 단일 세포분석기로 모든 바이오마커를 테스트해야 하는 경우 시간 비용이 크게 증가하고 결과가 방해받을 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 액화를 위해 37°C에서 수집 및 즉시 배양 한 후 Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)/propidium iodide(PI) 염색을 사용하여 정자 세포 사멸에 대해 정액 샘플을 추가로 분석했습니다. MMP는 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) probe로 표지되었으며, acridine orange (AO) 염색과 함께 정자 염색질 구조 분석 (SCSA)을 사용하여 DNA 손상을 평가했습니다. 따라서 정자 기능 마커의 유세포 분석은 불임 진단과 벤치와 침대 모두에서 정자 기능 평가를 위한 실용적이고 신뢰할 수 있는 툴킷이 될 수 있습니다.
Introduction
불임은 공중 보건 문제가 되었으며, 남성 불임은 모든 사례의 40%-50%를 차지합니다 1,2. 기존의 정액질 분석이 남성의 가임력 가능성을 결정하는 데 중요한 역할을 하지만, 불임 환자의 약 15%는 정자 수, 운동성, 형태 등 정자 매개변수가 정상이다3. 더욱이 정기 정자 검사는 반복성이 낮고, 정자 기능에 대한 정보가 제한적이며, 남성의 생식력에 대한 정확한 평가를 내리지 못하거나 정자의 미묘한 결함을 반영할 수 없습니다. 정자 기능을 검사하기 위해 HZA(hemizona assay), 정자 침투 분석, 저삼투압 팽창 검사, 항정자 항체 검사와 같은 여러 기술이 개발되었지만 이러한 방법은 시간이 많이 걸리고 작업자의 주관적인 영향에 취약합니다. 따라서 정자 기능 분석을 위한 신속하고 정확한 방법을 개발할 필요가 있습니다.
FCM은 1970년대에 개발된 신속한 단세포 분석 기술로 세포 생물학 및 의학의 다양한 분야에서 널리 사용되고 있습니다. FCM은 특정 형광 프로브로 표지된 정자를 분석하는 정자 기능 평가를 위한 강력한 도구이다4. 정자는 단일 또는 다중 채널 레이저를 통과하고 레이저 빔에 의해 산란광과 방출된 형광이 생성됩니다. 산란광에는 전방 산란광(FSC)과 측면 산란광(SSC)이 포함되며, 이는 테스트된 셀의 크기와 셀 입도나 또는 내부 구조를 반영합니다. 이러한 신호는 컴퓨터 시스템에 의해 수집, 표시 및 분석되며, 결과적으로 정자의 일련의 특성이 빠르고 정확하게 측정됩니다. 따라서 FCM은 정자 분석 분야에서 점점 더 주목을 받고 있는 빠르고 객관적이며 다차원적이고 처리량이 많은 기술입니다. FCM의 적용은 기존 방법의 단점을 보완할 수 있으며 정자 내부 구조 및 기능 검출을 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다.
정자 세포사멸은 남성의 생식력과 밀접한 관련이 있다5. 정자 세포 사멸의 검출은 분자 수준에서 정자 기능을 평가하는 중요한 지표입니다. FCM은 Annexin V-FITC/PI 염색을 사용하여 정자 세포 사멸을 검출하는 신뢰할 수 있고 민감한 방법으로 널리 알려져 있습니다. 기본 원리는 포스파티딜세린(PS)이 세포사멸 초기 단계에서 세포막의 내층에서 외층으로 전달된다는 것입니다. Annexin V는 PS에 대한 친화력이 높은 Ca2+ 의존성 인지질 단백질(일반적으로 FITC에 의해 표시됨)이므로 세포막의 외부 표면에 노출된 PS를 검출합니다6. 괴사와 세포사멸은 Pl 염색과 함께 구별할 수 있습니다. 따라서 Annexin V-FITC/PI 이중 염색 방법은 빠르고 간단하며 다양한 자가사멸 정자 세포를 검출하기 쉽기 때문에 널리 사용됩니다.
성숙한 포유류의 정자는 대략 72-80개의 미토콘드리아7를 포함하고 있으며, 이는 정자 미토콘드리아8의 보유에 대한 생물학적 이유를 시사한다. 정자 미토콘드리아는 정자의 운동성과 생식력을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다9. 다양한 세포 유형에서 MMP의 지표로 사용할 수 있는 JC-1 염색은 정자 미토콘드리아 활성 평가에 가장 많이 사용되는 형광 색소 중 하나입니다10. JC-1은 미토콘드리아에 전위 의존적으로 축적되는 양이온성 염료입니다. JC-1은 525nm(녹색)에서 최대 형광 방출을 가지며 높은 전위(ΔΨm, 80-100mV)의 멤브레인에 결합할 때 J-응집체11을 형성하여 형광 방출이 ~590nm(주황색-빨간색)로 이동합니다. 결과적으로, 정자 미토콘드리아 탈분극은 적색/녹색 형광 강도 비율의 감소로 표시되며, FCM은 인간 정액 샘플에서 MMP 수준을 검출하는 데 사용할 수 있습니다.
SCSA 방법론은 Evenson et al.12에 의해 발명되었으며, 1,024 × 1,024 채널 스케일 13에서 고유한 이중 파라미터 데이터(적색 대 녹색 형광)를 사용하는 정확하고 반복 가능한 테스트로 간주됩니다. 손상된 정자에서 정자 핵의 DNA와 변형된 단백질은 AO에 의해 표지되고 DNA 가닥의 파손은 적색 형광으로 측정되는 반면 온전한 이중 가닥은 FCM14에서 녹색 형광을 방출합니다. 오늘날에는 정자 DNA 무결성을 추정하기 위한 많은 방법이 개발되었습니다. 그러나 SCSA와 달리 이러한 분석은 종종 노동 집약적이며 남성 불임을 진단할 수 있는 능력이 부족합니다. SCSA 검사 결과는 인간 DNA 임신 및 유산과 유의한 상관관계가 있으며, SCSA가 인간 정액 분석에 유용할 수 있다는 강력한 증거를 제공하며, 불임 임상의에게 유용한 도구가 될 수 있다15.
염색질 무결성, MMP 및 세포 사멸은 정자 기능의 다양한 측면을 반영하므로 이러한 바이오마커의 조합은 정자 상태에 대한 보다 포괄적인 통찰력을 제공할 수 있습니다. FCM은 인간 정액 표본에서 염색질 무결성, MMP 또는 세포사멸을 별도로 측정하는 데 사용할 수 있습니다. FCM의 비용과 염료의 비용으로 인해 생식 건강을 위한 임상 실험실에서 이러한 기술의 광범위한 적용이 제한되었지만 생식력 추정에 대한 가치는 인정되고 있습니다.
그러나 각 실험은 정자 샘플의 전처리가 필요하고 모든 전처리된 샘플은 가능한 한 빨리 테스트해야 하기 때문에 단일 FCM을 가진 샘플에 대해 3개의 바이오마커를 모두 동시에 측정하면 일부 실험에 대한 대기 시간이 길어지고 결과의 신뢰성이 저하될 수 있습니다. 이는 세 가지 실험을 모두 고려하여 프로토콜이 제대로 배열되지 않은 경우 대기 과정에서 정자가 추가 손상을 받기 때문입니다. 이 논문은 긴 대기 시간으로 인한 실험 품질의 실질적인 저하 없이 단일 세포 분석에서 세 가지 바이오마커 모두의 유창한 측정을 실현하는 프로토콜을 제시합니다.
Protocol
참고: 유세포 분석에 의한 정자 기능 손상에 대한 바이오마커 검출을 위한 워크플로우에는 (1) 세포 준비, (2) 형광 시약을 사용한 염색, (3) 유세포 분석 및 데이터 해석이 포함됩니다(그림 1). 이 의정서는 육군의과대학 윤리위원회의 가이드라인(1.0/2013.4-12)을 따른다.
1. 세포 준비
- 플라스틱 임상 표본 항아리에서 자위행위를 통해 인간 정액 샘플을 얻고, 가급적이면 3-5일 동안 금욕한 후에 채취하십시오.
- 37°C 인큐베이터에서 정액 샘플을 즉시 배양하고 샘플을 완전히 액화시킵니다(최대 1시간).
2. CASA(Computer-Aided Sperm Analysis)를 사용하여 계수된 정자 세포
- 액화 정액 샘플을 잘 섞는다.
- 정자 계수 챔버에 정액 10μL를 추가합니다( 재료 표 참조).
- 정자 등급 분석기( 재료 표 참조)의 슬라이드를 스캔하고 정자 농도 추정을 위해 최소 6개 영역과 400개의 정자를 계산합니다.
참고: 정액 샘플은 정자 세포 사멸 및 MMP 분석을 위해 냉동되지 않은 신선한 것이어야 합니다.
3. 정자 세포 염색
- Annexin V-FITC/PI 염색을 사용한 정자 세포 사멸 검출
- 1.5mL 원심분리 튜브에 1 × 10개의 정자 세포를 1.5mL 추가합니다.
- 500μL의 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다.
- 정자 세포 현탁액을 300× g 에서 7분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 200 μL의 1x Binding Buffer에 정자 세포를 재현탁시킵니다.
- 2μL의 FITC Annexin V와 2μL의 PI를 추가합니다( 재료 표 참조).
- 세포를 부드럽게 소용돌이치게 하고 어두운 곳에서 실온(25°C)에서 15분 동안 배양한 후 분석을 위해 즉시 유세포 분석기에 넣습니다.
- JC-1 프로브를 사용한 미토콘드리아 막 전위 분석
- 1.5mL 원심분리 튜브에 2× 10개의6 개 정자 세포를 넣고 600× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 정자 세포 현탁액을 1mL의 JC-1 작업 용액에 재현탁시킵니다( 재료 표 참조).
- 세포를 부드럽게 소용돌이치고 어두운 곳에서 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
- 현탁액을 600× g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 펠릿을 1mL의 PBS로 600× g 의 속도로 각각 5분 동안 두 번 세척합니다.
- 염색된 정자 세포를 유세포 분석기 튜브의 PBS 1mL에 재현탁시키고 분석을 위해 튜브를 즉시 유세포 분석기에 넣습니다.
- 카르보닐 시안화물 m-클로로페닐 히드라존(CCCP)을 양성 대조군으로 사용하십시오. CCCP 작업 용액 1mL( 재료 표 참조)에 정자 세포(이전에 3.2.1단계에서 설명한 바와 같이)를 재현탁시키고 세포를 부드럽게 소용돌이치고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 현탁액을 600× g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 3.2.2-3.2.6단계를 반복합니다.
- 정자 염색질 구조 분석
- 액화 생정액 분취액(0.25mL)을 cryotube에 넣고 SCSA가 준비될 때까지 액체 질소(-196°C)에서 정액 샘플을 즉시 동결합니다.
- 정액 샘플을 37°C 수조에서 해동하고 TNE 완충액( 재료 표 참조)으로 1-2 × 106 cells/mL의 농도로 희석합니다.
- 희석된 샘플 200μL를 유세포 분석기 시험관에 넣고 400μL의 산성 용액( 재료 표 참조)과 30초 동안 혼합합니다.
- 1.2mL의 AO 염색 용액( 재료 표 참조)으로 샘플을 염색하고 분석을 위해 즉시 유세포 분석기에 넣습니다.
- 참조 샘플을 내부 표준물질로 사용하여 유세포분석기 설정 및 보정을 수행할 수 있습니다. 기준 샘플을 4°C TNE 완충액으로 1-2 × 106 cells/mL의 농도로 희석합니다. 3.3.1-3.3.4단계를 반복합니다.
참고: 모든 용액과 완충액은 4°C에서 보관합니다. (1) 급속 냉동 전에 정액을 희석해서는 안 됩니다. 원시 정액 샘플은 유세포 분석 측정 시 해동하고 TNE 완충액으로 희석해야 합니다. (2) 불임 클리닉의 경우 ~0.25mL의 생 정액을 초저온 냉동고 또는 LN2 탱크에서 급속 냉동해야 합니다. 그런 다음 이러한 냉동 부분 표본을 드라이아이스 또는 LN2 드라이 배송업체에 담아 SCSA 진단 실험실로 보낼 수 있습니다. (3) DNA 무결성의 이질성(예: 15% DNA 단편화 지수[DFI])을 보여주는 인간 사정 샘플을 내부 표준 참조로 사용했습니다.
4. 유세포 분석기 설정
참고: 유세포 분석기를 시작하기 전에 기기의 시스템 점검을 수행하여 분석 성능을 확인해야 합니다. 모든 검사가 완료되고 통과된 후 샘플을 실행합니다.
- 유세포 분석기 소프트웨어를 열고 유세포 분석기를 시작합니다.
- 샘플 데이터를 수집합니다.
- 먼저 대조군 샘플을 유세포 분석기에 로드하고 RUN을 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다(필요한 경우 설정 조정). 기기가 샘플 흡입을 시작할 때까지 기다렸다가 감지된 이벤트의 실시간 미리보기를 제공합니다.
참고: 대조군 샘플: 정자 세포사멸에 대한 음성 대조군(염색되지 않은 정자 세포); MMP에 대한 양성 대조군(CCCP 처리 세포); SCSA에 대한 참조 샘플입니다. - 데이터를 보기 위한 도트 플롯을 만들고 x/y축 파라미터(예: FSC, SSC)를 선택하고 선형을 선택하여 데이터가 표시되도록 지정합니다. 다각형 게이트를 선택하고 적용하여 분석을 위한 정자 집단을 묘사하고 기기가 감지된 이벤트를 실시간으로 플롯하도록 합니다.
- 영역 내의 정자 이벤트를 분석합니다.
- 정자 세포 사멸의 경우 FL1을 x축으로, FL2를 x축으로 설정합니다. 살아 있는 세포, 세포사멸 세포, 괴사하는 세포를 분리하려면 사분면 게이트를 탭하고 드래그하여 정자 집단을 4개의 특정 집단으로 하위 집합으로 만듭니다.
- MMP의 경우 FL1을 x축으로, FL2를 y축으로 설정합니다. 다각형 게이트를 만들어 정자 집단을 두 개의 특정 집단으로 하위 집합으로 만듭니다.
- SCSA의 경우 FL4를 x축(적색 형광, 125/1,024 유세포 분석 채널)으로 설정하고 FL1을 y축(녹색 형광, 475/1,024 유세포 분석 채널)으로 설정합니다. 게이트를 45° 각도로 그려 셀룰러 파편 신호를 제외합니다.
- 데이터 수집을 중지할 시기를 나타내기 위해 실행 제한을 설정합니다. 정자 세포 사멸, MMP 및 SCSA 분석을 위해 각 샘플에 대해 총 10,000개의 정자 세포를 계산합니다.
- 셀 번호에 따라 유체 속도(느림, 중간, 빠름 또는 사용자 지정 유체 속도)를 설정합니다.
참고 사항 : SCSA 분석의 경우 정자 농도를 측정하려면 냉동 원시 샘플을 해동하고 FCM에서 실행합니다. 유속이 >250/s인 경우 샘플을 올바른 유속으로 희석합니다. 모든 표본을 독립적으로 두 번 측정하고 평균값을 계산합니다. 10-15개의 샘플마다 표준 샘플을 테스트하여 일상적으로 기기의 표준화 및 안정성을 보장했습니다. - 임계값을 설정하여 세포 샘플에서 파편과 노이즈를 제거합니다. 실험의 모든 표본에 이 설정을 적용합니다.
- 필요한 경우 형광 번짐을 수정하도록 색상 보정을 설정합니다.
- 샘플을 유세포 분석기에 로드하기 전에 샘플을 부드럽게 백피펫팅하고, 샘플의 이름을 지정하고, 샘플을 실행합니다.
- 모든 샘플이 실행되면 추가 소프트웨어 분석을 위해 파일 이름을 지정하여 샘플 데이터를 FCS 파일로 저장합니다. 이후 실행에서 검색할 수 있도록 현재 실험의 작업 템플릿을 저장합니다(선택 사항).
- 먼저 대조군 샘플을 유세포 분석기에 로드하고 RUN을 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다(필요한 경우 설정 조정). 기기가 샘플 흡입을 시작할 때까지 기다렸다가 감지된 이벤트의 실시간 미리보기를 제공합니다.
5. 데이터 분석
- 유세포 분석기의 데이터 분석 소프트웨어로 데이터를 가져옵니다( 재료 표 참조).
- 작업 공간에서 첫 번째 샘플을 더블 클릭합니다. 그래프 창이 열릴 때까지 기다렸다가 FSC 대 SSC 매개변수에 따른 이벤트 플롯을 표시합니다. 게이트 내에 포함된 정자 집단을 분리하는 게이트를 만들어 상위 이벤트 집합에서 '자식' 집단을 생성합니다.
- 게이트 영역 내부를 두 번 클릭하고 정자 이벤트만 포함된 새 그래프 창을 엽니다. x축 및 y축 매개변수를 설정하여 형광 채널을 선택합니다.
- [게이트] 도구를 선택합니다. 플롯 내부를 클릭하여 게이트를 표시하고, 생성된 게이트가 서로 다른 세포 집단을 분리하도록 합니다.
- 강조 표시된 행 중 하나를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭(또는 Control 키를 누른 상태에서 클릭)하고 분석 결과를 그룹에 복사(Copy analysis to group)를 선택합니다. 그룹 내의 모든 샘플에 게이팅 트리를 적용합니다.
- 데이터 테이블을 저장하고 내보냅니다.
Representative Results
그림 2는 Annexin V-FITC/PI 염색을 사용한 정자 세포 사멸 측정을 보여줍니다. FITC 신호(녹색 형광)는 FL1 채널에서 측정되었고, PI 신호(적색 형광)는 FL2 채널에서 측정되었습니다. Annexin V/PI 이변량 분석에서 사분면 제작자는 4개의 독특한 정자 집단을 식별했습니다. 결과는 Annexin V-/PI− 정자(생존 가능 또는 살아있는 세포), Annexin V+/PI− 정자(초기 자가사멸 세포 또는 자가사멸 세포), Annexin V+/PI+ 정자(후기 자가사멸 세포) 및 Annexin V-/PI+ 정자(괴사 세포)의 백분율로 표현되었습니다(그림 2B). 음성 대조군(염색되지 않은 정자 세포)도 보상 및 사분면을 설정하는 데 사용되었습니다(그림 2A).
그림 3 은 인간 정자에서 JC-1 프로브를 사용한 MMP 측정을 보여줍니다. MMP %는 사이토그램을 분석하여 주황색-빨간색/(녹색 + 주황색-빨간색) 형광 비율로 표시됩니다. 양질의 정액 샘플은 일반적으로 높은 주황색-적색 형광과 낮은 녹색 형광(활성 미토콘드리아, 왼쪽 위 사분면)을 보여줍니다(그림 3A). 반대로, 품질이 좋지 않은 정액 샘플은 일반적으로 낮은 주황색-적색 형광과 높은 녹색 형광(비활성 미토콘드리아, 오른쪽 아래 사분면)을 나타내는데, 이는 미토콘드리아 파괴로 인한 것일 수 있습니다(그림 3B).
그림 4는 SCSA13,14의 데이터를 보여줍니다. 이러한 일반적인 SCSA 세포도는 두 개의 개별 샘플에서 얻었습니다. 샘플 A는 가임 남성에게서, 샘플 B는 불임 남성에게서 나왔습니다. 유세포 분석 데이터의 분석은 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 사이토그램은 SCSA 데이터의 각 구성 요소의 소스를 보여줍니다. x축(적색 형광의 1,024개 그라데이션이 있는 적색 형광)은 단편화된 DNA를 나타냅니다. y축(1,024개의 그라데이션이 있는 녹색 형광)은 네이티브 DNA 염색성을 나타냅니다. y = 750의 점선은 정상 정자의 경계를 나타냅니다. y = 750의 선 위에는 미성숙 정자로 결정된 부분적으로 응축되지 않은 염색질을 가진 정자가 있습니다.
그림 1: 유세포 분석을 통한 정자 기능 손상에 대한 바이오마커 검출을 위한 워크플로우. 정액 샘플을 수득하고, 프로토콜 단계 1에 기술된 바와 같이 전처리하였다. (1) 세포 준비, (2) 형광 시약을 사용한 염색, (3) 유세포 분석 및 데이터 해석. 약어: MMP = 미토콘드리아 막 전위; SCSA = 정자 염색질 구조 분석; PBS = 인산염 완충 식염수; AO = 아크리딘 오렌지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Annexin V-FITC/PI 염색을 사용한 정자 세포 사멸의 대표적인 결과. 왼쪽 아래 사분면에는 Annexin V-/PI− 정자(생존 가능 또는 살아있는 세포)가 있고, 오른쪽 아래 사분면에는 Annexin V+/PI− 정자(초기 자가사멸 세포 또는 자가사멸 세포)가 있고, 오른쪽 위 사분면에는 Annexin V+/PI+ 정자(후기 자가사멸 세포)가 있고, 왼쪽 위 사분면에는 Annexin V-/PI+ 정자(괴사 세포)가 있습니다. (A) 음성 대조군 (염색되지 않은 정자 세포); (B) 정자 세포사멸이 있는 샘플. 약어: FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트; PI = 프로피듐 요오드화물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: JC-1 프로브를 사용한 미토콘드리아 막 전위 측정 . (A) MMP가 높은 정자 하위 집단. (B) MMP가 낮은 정자 하위 집단. FL1-A와 FL2-A를 각각 x축(녹색 형광)과 y축(주황색-적색 형광)으로 설정합니다. 약어: MMP = 미토콘드리아 막 전위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 정자 염색질 구조 분석을 사용한 인간 정자의 DNA 손상 검출 . (A) 정상적인 염색질 구조를 가진 정액 샘플. (B) 비정상적인 염색질 구조를 가진 정자의 비율이 높은 정액 샘플. FlowJo 소프트웨어는 1) 정상 정자, 2) HDS 정자, 3) DFI 정자, 4) 세포 파편으로 식별된 세포 집단 주위에 컴퓨터 게이트를 만드는 데 사용되었으며 HDS 및 DFI 정자의 백분율을 계산했습니다. 약어: SCSA = 정자 염색질 구조 분석; HDS = 높은 DNA 염색성; DFI = DNA 단편화 지수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
인간 정자의 염색질 무결성, MMP 및 세포 사멸은 생식 결과의 귀중한 예측 인자로 밝혀졌습니다. 최근 발표된 인간 정액 검사 및 처리를 위한 WHO 실험실 매뉴얼(6판)은 또한 이러한 지표 중 일부(염색질 무결성 및 세포사멸)를 정자 수와 같은 일상적인 매개변수의 기본 검사를 넘어서는 확장된 검사로 강조했습니다18. 최근 간행물들은 또한 이러한 지표들이 외부 유해 노출에 대한 반응의 더 민감한 표지가 될 수 있음을 시사하며, 초기 단계에서 생식 손상을 식별할 수 있는 가능성을 나타낸다19,20. 이러한 지표를 정기 검사와 결합하면 정자 기능 장애의 프로필과 인구 내 남성 생식 손상의 복잡성에 대한 보다 포괄적인 이해를 제공할 수 있습니다.
FCM을 사용한 정자 분석의 성공을 실질적으로 결정하는 몇 가지 주요 문제가 있습니다. 첫째, 정자 MMP와 세포사멸의 측정은 정액이 액화된 후 즉시 검사가 필요합니다. 시간 비용을 최소화하기 위해 두 명의 기술자가 MMP의 전처리와 샘플의 세포 사멸 분석을 별도로 담당할 수 있습니다. 세포사멸의 전처리가 더 간단하기 때문에 MMP 분석보다 유세포 분석 단계로 더 빠르게 전환됩니다. SCSA 분석의 경우 신선한 정액 샘플은 액화 후 사용 가능한 즉시 냉동 보존해야 합니다. 그런 다음 정자 샘플을 액체 질소에 비교적 오랜 기간 동안 보관할 수 있으며 즉각적인 검사가 필요하지 않습니다.
따라서, 실험의 현장 소요 시간은 MMP 분석의 지속 시간과 정자 분석의 유세포 분석 단계를 더한 40분으로 압축될 수 있습니다. 둘째, 유세포 분석 플랫폼에서의 게이팅 설정은 각 샘플 배치에 대해 개별적으로 결정해야 합니다. 산점도에서 명확한 세포 부분군이 있는 정자 샘플을 참조로 선택하여 게이팅 영역을 그릴 수 있습니다. 셋째, 이 실험의 지표에 대해 널리 인정되는 임상 참조 값이 없기 때문에 과거 결과가 품질 관리를 위한 중요한 도구로 사용될 수 있습니다. 또한 포지티브 및 네거티브 대조군은 특히 SCSA 및 MMP의 경우 각 측정 배치에서 설정하는 것이 좋습니다.
여기에 제공된 정자 분석의 대표적인 결과는 Accuri C6를 사용하여 도출된 것입니다. 그러나 이 기술은 약간의 수정으로 다른 상용 플랫폼에 적용할 수 있습니다. 일반적으로 모든 지표의 측정 요구 사항을 충족하기 위해 총 5개 × 10개6 개의 정자 세포가 필요합니다. 샘플의 정자 농도가 평균 수준보다 훨씬 낮으면 정액의 양에 대한 필요성이 증가합니다.
일상적인 정자 매개변수와 유사하게, 인간 정자의 염색질 무결성, MMP 및 세포사멸에도 눈에 띄는 개체 내 변이가 있다21. 따라서, 상이한 시간에 수집된 샘플에 대한 다중 테스트는 정자 기능 손상 수준에 대한 보다 정확한 추정치를 제공할 수 있다. 유세포 분석을 위한 정자 샘플링 전 권장 금욕 기간은 없지만 WHO에서 일상적인 정자 분석을 위해 권장하는 2-7일의 사정 금욕을 채택할 수 있습니다. 실험실 간 및 동일한 사람으로부터 수집 된 다른 샘플 간의 결과 비교 가능성을 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 방법의 주요 한계는 테스트된 세 가지 바이오마커 중 두 가지(세포사멸 및 미토콘드리아 막 전위)에 신선한 정액 샘플이 필요하다는 것입니다. 이로 인해 실험실에 정액 샘플을 제공할 수 있는 남성으로 적용이 제한될 수 있습니다. DNA 손상 검사(SCSA)의 경우, 유세포 분석기를 보정하기 위해 실험 전에 참조 샘플을 준비해야 합니다. 주목할 점은, 본 프로토콜을 적용하기 위해서는 실험실에 FCM 기기가 필요하며, 이는 일부 지역에서는 제3자 서비스와의 협력이 대안이 될 수 있지만 여전히 많은 임상 실험실에서 상당한 과제입니다.
또한 염료 및 기타 시약의 비용도 검사가 필요할 수 있는 남성에게 재정적 요인입니다. 마지막으로, 바이오마커를 검사하기 위해 FCM의 다른 브랜드 또는 버전을 사용하는 경우 프로토콜에 수정이 필요할 수 있습니다. 요약하면, 이 논문은 단일 유세포 분석 기계로 인간 정자 손상의 세 가지 바이오마커를 추정하는 실용적인 접근 방식을 제시합니다. 이는 남성의 생식 건강에 대한 귀중한 정보를 제공하고 일상적인 정자 검사를 보완할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
도움을 주신 모든 현장 작업자와 협조해 주신 인터뷰 대상자에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
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