Summary
El presente protocolo proporciona una solución práctica que permite medir la apoptosis, el potencial de membrana mitocondrial y el daño al ADN en espermatozoides humanos con un solo citómetro.
Abstract
El análisis convencional de los parámetros seminales se utiliza ampliamente para evaluar la fertilidad masculina. Sin embargo, los estudios han encontrado que ~ 15% de los pacientes infértiles no muestran anomalías en los parámetros convencionales del semen. Se necesitan tecnologías adicionales para explicar la infertilidad idiopática y detectar defectos sutiles en los espermatozoides. Actualmente, los biomarcadores de la función de los espermatozoides, incluida la apoptosis de los espermatozoides, el potencial de membrana mitocondrial (MMP) y el daño en el ADN, revelan la fisiología de los espermatozoides a nivel molecular y son capaces de predecir la fertilidad masculina.
Con las técnicas de citometría de flujo (FCM), cada uno de estos marcadores se puede medir de forma rápida, exacta y precisa en muestras de semen humano, pero los costos de tiempo aumentan sustancialmente y los resultados podrían obstruirse si todos los biomarcadores deben analizarse con un solo citómetro. En este protocolo, después de la recolección e incubación inmediata a 37 °C para licuación, las muestras de semen se analizaron más a fondo para detectar la apoptosis de los espermatozoides mediante tinción con isotiocianato de anexina V-fluoresceína (FITC)/yoduro de propidio (PI). La MMP se marcó con una sonda de yoduro de 5,5′,6,6′-tetracloro-1,1′,3,3′-tetraetil-benzimidazolilcarbocianina (JC-1), y el daño en el ADN se evaluó mediante el ensayo de estructura de cromatina espermática (SCSA) con tinción de naranja de acridina (AO). Por lo tanto, el análisis citométrico de flujo de los marcadores de función espermática puede ser una herramienta práctica y fiable para el diagnóstico de la infertilidad y la evaluación de la función de los espermatozoides tanto en el laboratorio como en la cama.
Introduction
La infertilidad se ha convertido en un problema de salud pública, ya que la infertilidad masculina contribuye al 40-50% de todos los casos 1,2. Aunque el análisis convencional de la calidad del semen juega un papel importante en la determinación del potencial de fertilidad masculina, aproximadamente el 15% de los pacientes con infertilidad tienen parámetros normales de espermatozoides, como el recuento de espermatozoides, la motilidad y la morfología3. Además, los exámenes de esperma de rutina tienen poca repetibilidad, proporcionan información limitada sobre la función de los espermatozoides y no pueden dar una evaluación precisa de la fertilidad masculina ni reflejar los defectos sutiles de los espermatozoides. Se han desarrollado múltiples técnicas para evaluar la función de los espermatozoides, como el ensayo de hemizona (HZA), el ensayo de penetración de espermatozoides, la prueba de hinchazón hipoosmótica, la prueba de anticuerpos antiespermatozoides, pero estos métodos consumen mucho tiempo y son vulnerables a las influencias subjetivas de los operadores. Por lo tanto, es necesario desarrollar métodos rápidos y precisos para el análisis de la función de los espermatozoides.
FCM es una tecnología de análisis rápido de una sola célula desarrollada en la década de 1970, que se ha utilizado ampliamente en varios campos de la biología celular y la medicina. La FCM es una herramienta robusta para la evaluación de la función espermática que analiza los espermatozoides marcados con una sonda de fluorescencia específica4. Los espermatozoides pasan a través de láseres monocanal o multicanal, y la luz dispersa y la fluorescencia emitida son producidas por un rayo láser. La luz dispersa incluye la luz dispersa hacia adelante (FSC) y la luz dispersa lateral (SSC), que refleja el tamaño de la celda probada y la granularidad de la celda o la estructura interna. Estas señales son recogidas, visualizadas y analizadas por el sistema informático y, en consecuencia, se miden de forma rápida y precisa una serie de características de los espermatozoides. Por lo tanto, la FCM es una técnica rápida, objetiva, multidimensional y de alto rendimiento que ha ganado cada vez más atención en el campo del análisis de espermatozoides. La aplicación de FCM puede compensar las deficiencias de los métodos tradicionales y proporciona un nuevo enfoque para la detección de la estructura y función interna de los espermatozoides.
La apoptosis espermática está estrechamente relacionada con la fertilidad masculina5. La detección de la apoptosis espermática es un índice importante para evaluar la función de los espermatozoides a nivel molecular. La FCM es ampliamente reconocida como un método fiable y sensible para detectar la apoptosis de los espermatozoides mediante la tinción con anexina V-FITC/PI. El principio básico es que la fosfatidilserina (PS) se transfiere de la capa interna de la membrana celular a su capa externa en la etapa temprana de la apoptosis. La anexina V es una proteína fosfolípida dependiente de Ca2+ (generalmente marcada por FITC) que tiene una alta afinidad por la PS, por lo tanto, detecta la PS expuesta a la superficie externa de la membrana celular6. La necrosis y la apoptosis se pueden distinguir en combinación con la tinción de Pl. Por lo tanto, el método de doble tinción de anexina V-FITC/PI es ampliamente utilizado, ya que es rápido, sencillo y fácil de detectar diferentes espermatozoides apoptóticos.
Un espermatozoide maduro de mamífero contiene aproximadamente 72-80 mitocondrias7, lo que sugiere una razón biológica para la retención de las mitocondrias de los espermatozoides8. Se ha descubierto que las mitocondrias de los espermatozoides desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la motilidad y la fertilidad de los espermatozoides. La tinción JC-1, que se puede utilizar como indicador de MMP en una variedad de tipos celulares, es uno de los fluorocromos más populares para la evaluación de la actividad mitocondrial de los espermatozoides10. JC-1 es un colorante catiónico que se acumula potencialmente dependiente en las mitocondrias. JC-1 tiene una emisión de fluorescencia máxima a 525 nm (verde) y forma agregados J 11 cuando se une a membranas con un alto potencial (ΔΨm, 80-100 mV), lo que resulta en un cambio en la emisión de fluorescencia a ~590 nm (naranja-rojo). En consecuencia, la despolarización mitocondrial de los espermatozoides está indicada por una disminución en la relación de intensidad de fluorescencia rojo/verde, y la FCM se puede utilizar para detectar los niveles de MMP en muestras de semen humano.
La metodología SCSA fue inventada por Evenson et al.12, y se considera una prueba precisa y repetible con datos únicos de doble parámetro (fluorescencia roja vs verde) en una escala de 1.024 × 1.024 canales 13. En los espermatozoides dañados, el ADN y las proteínas alteradas en los núcleos de los espermatozoides se marcan mediante AO, y las roturas de la hebra de ADN se miden mediante fluorescencia roja, mientras que las hebras dobles intactas emiten fluorescencia verde en FCM14. Hoy en día, se han desarrollado muchos métodos para estimar la integridad del ADN de los espermatozoides. Sin embargo, a diferencia de la SCSA, estos ensayos suelen requerir mucha mano de obra y carecen de la capacidad de diagnosticar la infertilidad masculina. Los resultados de la prueba SCSA se correlacionan significativamente con el embarazo y el aborto espontáneo del ADN humano, proporcionan evidencia convincente de que el SCSA puede ser útil en el análisis del semen humano y puede servir como una herramienta valiosa para los médicos de infertilidad15.
La integridad de la cromatina, la MMP y la apoptosis reflejan diferentes aspectos de la función de los espermatozoides y, por lo tanto, la combinación de estos biomarcadores puede proporcionar una visión más completa del estado de los espermatozoides. La FCM se puede utilizar para mediciones separadas de la integridad de la cromatina, MMP o apoptosis en muestras de semen humano. Aunque el costo de la FCM y el costo de los colorantes han limitado la amplia aplicación de estas técnicas en los laboratorios clínicos de salud reproductiva, se está aceptando su valor para la estimación de la fecundidad.
Sin embargo, dado que cada uno de los experimentos requiere un tratamiento previo de las muestras de espermatozoides, y todas las muestras pretratadas deben analizarse lo antes posible, la medición simultánea de los tres biomarcadores para una muestra con un solo FCM puede dar lugar a un largo tiempo de espera para algunos de los experimentos y obstruir la fiabilidad de los resultados. Esto se debe a que los espermatozoides reciben un daño adicional durante el proceso de espera, si el protocolo no se organiza correctamente teniendo en cuenta los tres experimentos. En este artículo se presenta un protocolo que permite la medición fluida de los tres biomarcadores en una sola citometría sin comprometer sustancialmente la calidad del experimento inducida por tiempos de espera prolongados.
Protocol
NOTA: El flujo de trabajo para la detección de biomarcadores de daño en la función de los espermatozoides mediante citometría de flujo incluye (1) preparación celular, (2) tinción con reactivos fluorescentes y (3) análisis de citometría de flujo e interpretación de datos (Figura 1). El protocolo sigue las directrices de los Comités de Ética de la Universidad Médica del Ejército (1.0/2013.4-12).
1. Preparación celular
- Obtener muestras de semen humano mediante masturbación en frascos de plástico para muestras clínicas, preferiblemente después de 3-5 días de abstinencia.
- Incubar inmediatamente las muestras de semen en una incubadora a 37 °C y licuar completamente las muestras (hasta 1 h).
2. Recuento de espermatozoides mediante análisis de espermatozoides asistido por ordenador (CASA)
- Mezclar bien las muestras de semen licuado.
- Añadir 10 μL de semen en una cámara de recuento de espermatozoides (ver Tabla de Materiales).
- Escanee los portaobjetos en el analizador de clases de espermatozoides (consulte la tabla de materiales) y cuente al menos seis áreas y 400 espermatozoides para estimar la concentración de espermatozoides.
NOTA: Las muestras de semen deben ser frescas, no congeladas, para la apoptosis de los espermatozoides y el análisis de MMP.
3. Tinción de espermatozoides
- Detección de la apoptosis espermática mediante tinción con anexina V-FITC/PI
- Agregue 1 × 106 espermatozoides a un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
- Lavar las células con 500 μL de solución salina fría tamponada con fosfato (PBS).
- Centrifugar la suspensión de espermatozoides a 300 × g durante 7 min y desechar el sobrenadante.
- Resuspender los espermatozoides en 200 μL de tampón de unión 1x.
- Añadir 2 μL de Anexina V de FITC y 2 μL de PI (ver Tabla de Materiales).
- Agitar suavemente las células, incubarlas durante 15 minutos a temperatura ambiente (25 °C) en la oscuridad y colocarlas inmediatamente en el citómetro de flujo para su análisis.
- Análisis del potencial de membrana mitocondrial mediante sonda JC-1
- Añadir 2 × 106 espermatozoides a un tubo de centrífuga de 1,5 ml y centrifugar a 600 × g durante 5 min.
- Vuelva a suspender la suspensión de espermatozoides en 1 ml de solución de trabajo JC-1 (consulte la Tabla de materiales).
- Agitar suavemente las células e incubar durante 20 minutos a 37 °C en la oscuridad.
- Centrifugar la suspensión a 600 × g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
- Lavar el pellet dos veces con 1 mL de PBS a una velocidad de 600 × g durante 5 min cada uno.
- Vuelva a suspender los espermatozoides teñidos en 1 ml de PBS en tubos de citómetro de flujo y coloque los tubos en el citómetro de flujo inmediatamente para su análisis.
- Use cianuro de carbonilo m-clorofenilhidrazona (CCCP) como control positivo. Vuelva a suspender los espermatozoides (como se ha descrito anteriormente en el paso 3.2.1) en 1 ml de solución de trabajo para CCCP (véase la tabla de materiales), y vórtice suavemente las células e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar la suspensión a 600 × g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Repita los pasos 3.2.2-3.2.6.
- Ensayo de la estructura de la cromatina espermática
- Colocar una alícuota de semen crudo licuado (0,25 mL) en un criotubo y congelar inmediatamente las muestras de semen en nitrógeno líquido (-196 °C) hasta que estén listas para el SCSA.
- Descongelar las muestras de semen en un baño de agua a 37 °C y diluirlas con tampón TNE (ver la Tabla de Materiales) a una concentración de 1-2 × 106 células/mL.
- Añadir 200 μL de la muestra diluida a un tubo de ensayo con citómetro de flujo y mezclarla con 400 μL de solución ácida (ver la Tabla de Materiales) durante 30 s.
- Tiñir las muestras con 1,2 ml de solución de tinción AO (consulte la Tabla de materiales) y colocarlas inmediatamente en el citómetro de flujo para su análisis.
- Utilice una muestra de referencia como patrón interno para la configuración y calibración del citómetro de flujo. Diluir la muestra de referencia con tampón TNE a 4 °C hasta una concentración de 1-2 × 106 células/ml. Repita los pasos 3.3.1-3.3.4.
NOTAS: Todas las soluciones y tampones se almacenan a 4 °C. (1) El semen no debe diluirse antes de la congelación instantánea. Las muestras de semen crudo deben descongelarse y diluirse con tampón TNE en el momento de las mediciones de citometría de flujo. (2) Para las clínicas de infertilidad, ~ 0.25 mL de semen crudo debe congelarse rápidamente en un congelador ultrafrío o un tanque de LN2. Estas alícuotas congeladas se pueden enviar a un laboratorio de diagnóstico de SCSA en hielo seco o en un contenedor seco de LN2. (3) Se utilizó una muestra de eyaculación humana que demuestra heterogeneidad de la integridad del ADN (p. ej., índice de fragmentación del ADN [DFI] del 15%) como referencia estándar interna.
4. Configuración del citómetro de flujo
NOTA: Antes de poner en marcha el citómetro de flujo, se debe realizar la comprobación del sistema del instrumento para verificar el rendimiento analítico. Ejecute los ejemplos después de que se hayan completado y superado todas las comprobaciones.
- Abra el software del citómetro de flujo e inicie el citómetro.
- Recopile datos de muestra.
- Primero, cargue una muestra de control en el citómetro de flujo y haga clic en RUN para iniciar la recopilación de datos (ajuste la configuración si es necesario). Espere a que el instrumento comience a aspirar la muestra y proporcione una vista previa en tiempo real de los eventos detectados.
NOTA: La muestra de control: un testigo negativo (espermatozoides sin teñir) para la apoptosis de los espermatozoides; un control positivo (células tratadas con CCCP) para MMP; una muestra de referencia para SCSA. - Cree diagramas de puntos para ver los datos y seleccione los parámetros de los ejes x/y (como FSC, SSC) y lineales para especificar que se muestran los datos. Seleccione y aplique una puerta poligonal para delinear la población de espermatozoides para el análisis, y para que el instrumento trace los eventos detectados en tiempo real.
- Analice los eventos de espermatozoides dentro de la región.
- Para la apoptosis de los espermatozoides, establezca el FL1 como el eje x y el FL2 como el eje x. Para aislar las células vivas, apoptóticas o necróticas, toque y arrastre la puerta del cuadrante para reducir las poblaciones de espermatozoides a cuatro poblaciones específicas.
- Para MMP, establezca FL1 como el eje x y FL2 como el eje y. Cree una puerta poligonal para crear un subconjunto de las poblaciones de espermatozoides en dos poblaciones específicas.
- Para SCSA, establezca el FL4 como el eje x (fluorescencia roja, 125/1.024 canales de citometría de flujo) y el FL1 como el eje y (fluorescencia verde, 475/1.024 canales de citometría de flujo). Dibuje las puertas en un ángulo de 45° para excluir las señales de desechos celulares.
- Establezca un límite de ejecución para indicar cuándo dejar de recopilar datos. Calcule un total de 10.000 espermatozoides por cada muestra para análisis de apoptosis de espermatozoides, MMP y SCSA.
- Establezca la velocidad de fluídica (lenta, media y rápida, o una velocidad de fluídica personalizada), según el número de celdas.
NOTAS: Para el análisis SCSA, para determinar las concentraciones de espermatozoides, descongele la muestra cruda congelada y ejecútela en el FCM. Si el caudal es de >250/s, diluya la muestra hasta el caudal correcto. Mida todas las muestras de forma independiente dos veces y calcule los valores medios. Se analizó una muestra de referencia cada 10-15 muestras para garantizar la estandarización y estabilidad del instrumento día a día. - Establezca el umbral para eliminar la suciedad y el ruido de las muestras de celdas. Aplique esta configuración a todas las muestras del experimento.
- Si es necesario, ajuste la compensación de color para corregir el desbordamiento de la fluorescencia.
- Pipetee suavemente las muestras antes de cargarlas en el citómetro de flujo, asigne un nombre a la muestra y ejecute las muestras.
- Una vez que se hayan ejecutado todas las muestras, guarde los datos de muestra como archivos FCS asignándoles un nombre de archivo para su posterior análisis de software. Guarde la plantilla de trabajo del experimento actual para recuperarla en futuras ejecuciones (opcional).
- Primero, cargue una muestra de control en el citómetro de flujo y haga clic en RUN para iniciar la recopilación de datos (ajuste la configuración si es necesario). Espere a que el instrumento comience a aspirar la muestra y proporcione una vista previa en tiempo real de los eventos detectados.
5. Análisis de datos
- Importe los datos en el software de análisis de datos para el citómetro de flujo (consulte la Tabla de materiales).
- Haga doble clic en la primera muestra del área de trabajo. Espere hasta que se abra una ventana de gráfico que muestre un gráfico de eventos a lo largo de los parámetros FSC frente a SSC. Cree una puerta que aísle la población de espermatozoides incluida dentro de la puerta, produciendo una población "secundaria" a partir del conjunto de eventos primarios.
- Haga doble clic dentro del área cerrada y abra una nueva ventana de gráfico que contenga solo los eventos de espermatozoides. Establezca los parámetros de los ejes x e y para seleccionar el canal fluorescente.
- Seleccione la herramienta Puerta . Haga clic dentro de la gráfica para que aparezcan las puertas, de modo que las puertas creadas aíslen las diferentes poblaciones de celdas.
- Haga clic con el botón derecho del ratón (o mantenga pulsada la tecla Control y haga clic) en cualquiera de las filas resaltadas y seleccione Copiar análisis en grupo. Aplique el árbol de compuertas a todas las muestras del grupo.
- Guarde y exporte la tabla de datos.
Representative Results
La figura 2 muestra la medición de la apoptosis espermática mediante tinción con anexina V-FITC/PI. La señal FITC (fluorescencia verde) se midió en el canal FL1 y la señal PI (fluorescencia roja) se midió en el canal FL2. En el análisis bivariado de la anexina V/PI, los creadores de los cuadrantes identificaron cuatro poblaciones de espermatozoides distintivas. Los resultados se expresaron como los porcentajes de espermatozoides de anexina V-/PI− (células viables o vivas), espermatozoides de anexina V+/PI− (células apoptóticas tempranas o células apoptóticas), espermatozoides de anexina V+/PI+ (células apoptóticas tardías) y espermatozoides de anexina V−/PI+ (células necróticas)16,17 (Figura 2B). También se utilizó un control negativo (espermatozoides sin teñir) para establecer la compensación y los cuadrantes (Figura 2A).
La Figura 3 muestra la medición de MMP utilizando la sonda JC-1 en espermatozoides humanos. El % de MMP se presenta como la relación de fluorescencia naranja-rojo/(verde + naranja-rojo) mediante el análisis del citograma. Una muestra de semen de buena calidad suele mostrar una fluorescencia naranja-roja alta y una fluorescencia verde baja (mitocondrias activas, cuadrante superior izquierdo) (Figura 3A). Por el contrario, una muestra de semen de mala calidad suele mostrar una fluorescencia naranja-roja baja y una fluorescencia verde alta (mitocondrias inactivas, cuadrante inferior derecho), posiblemente debido a la alteración mitocondrial (Figura 3B).
La Figura 4 muestra los datos de SCSA13,14. Estos citogramas típicos de SCSA se obtuvieron a partir de dos muestras individuales. La muestra A provino de un hombre fértil y la muestra B de un hombre infértil. El análisis de los datos de citometría de flujo se llevó a cabo con el software FlowJo. Los citogramas muestran la fuente de cada componente de los datos SCSA. El eje x (fluorescencia roja con 1.024 gradaciones de fluorescencia roja) indica ADN fragmentado; el eje Y (fluorescencia verde con 1.024 gradaciones) indica la tinción del ADN nativo. La línea punteada en y = 750 representa el límite de los espermatozoides normales. Por encima de esa línea de y = 750 hay espermatozoides con cromatina parcialmente no condensada, que se determinó como espermatozoides inmaduros.
Figura 1: Flujo de trabajo para la detección de biomarcadores de daño en la función espermática mediante citometría de flujo. Se obtuvieron muestras de semen y se trataron previamente como se describe en el paso 1 del protocolo. (1) Preparación celular, (2) tinción con reactivos fluorescentes y (3) análisis citométrico de flujo e interpretación de datos. Abreviaturas: MMP = potencial de membrana mitocondrial; SCSA = ensayo de estructura de la cromatina espermática; PBS = solución salina tamponada con fosfato; AO = naranja acridina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos de la apoptosis espermática mediante tinción con anexina V-FITC/PI. El cuadrante inferior izquierdo contiene espermatozoides de anexina V-/PI− (células viables o vivas), el cuadrante inferior derecho muestra espermatozoides de anexina V+/PI− (células apoptóticas tempranas o células apoptóticas), el cuadrante superior derecho representa espermatozoides de anexina V+/PI+ (células apoptóticas tardías) y el cuadrante superior izquierdo contiene espermatozoides de anexina V−/PI+ (células necróticas). (A) Control negativo (espermatozoides no teñidos); (B) una muestra con apoptosis espermática. Abreviaturas: FITC = isotiocianato de fluoresceína; PI = yoduro de propidio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Medición del potencial de membrana mitocondrial mediante la sonda JC-1 . (A) La subpoblación de espermatozoides con MMP alta. (B) La subpoblación de espermatozoides con MMP baja. Establezca FL1-A y FL2-A como el eje x (fluorescencia verde) y el eje y (fluorescencia naranja-rojo), respectivamente. Abreviaturas: MMP = potencial de membrana mitocondrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Detección de daños en el ADN de los espermatozoides humanos mediante el ensayo de la estructura de la cromatina de los espermatozoides . (A) Una muestra de semen con estructura normal de cromatina. (B) Una muestra de semen con alta proporción de espermatozoides con estructura anormal de cromatina. Se utilizó el software FlowJo para hacer puertas de computadora alrededor de las poblaciones celulares identificadas como: 1) espermatozoides normales, 2) espermatozoides HDS, 3) espermatozoides DFI y 4) restos celulares, y se calcularon los porcentajes de espermatozoides HDS y DFI. Abreviatura: SCSA = ensayo de estructura de cromatina espermática; HDS = alta tinción del ADN; DFI = índice de fragmentación del ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Se ha encontrado que la integridad de la cromatina, la MMP y la apoptosis de los espermatozoides humanos son valiosos predictores de los resultados reproductivos. El último manual de laboratorio de la OMS para el examen y procesamiento del semen humano (sexta edición) también destacó algunos de estos indicadores (integridad de la cromatina y apoptosis) como exámenes más amplios que van más allá del examen básico de parámetros rutinarios como el recuento de espermatozoides18. Publicaciones recientes también sugieren que estos indicadores pueden ser marcadores más sensibles de respuesta a exposiciones externas peligrosas, lo que indica su potencial para la identificación de daños reproductivos en una etapa más temprana19,20. La combinación de estos indicadores con exámenes rutinarios también puede proporcionar una comprensión más completa sobre el perfil de la disfunción espermática y la complejidad del daño reproductivo masculino en la población.
Hay varias cuestiones clave que determinan sustancialmente el éxito del análisis de espermatozoides con FCM. En primer lugar, la medición de la MMP y la apoptosis de los espermatozoides requiere un examen inmediato después de que se licúa el semen. Para minimizar el coste de tiempo, dos técnicos pueden encargarse por separado del pretratamiento de MMP y del análisis de apoptosis de una muestra. Como el pretratamiento de la apoptosis es más simple, se transferiría a la etapa de citometría de flujo más rápido que el análisis MMP. Para el análisis SCSA, las muestras de semen fresco deben criopreservarse inmediatamente después de la licuefacción. Las muestras de esperma pueden almacenarse en nitrógeno líquido durante un período relativamente largo y no necesitan un examen inmediato.
En consecuencia, el costo de tiempo in situ del experimento se puede comprimir a 40 minutos, que es la duración del análisis de MMP más el paso citométrico de flujo del análisis de espermatozoides. En segundo lugar, la configuración de la compuerta en la plataforma de citometría de flujo debe decidirse para cada lote de muestras por separado. Las muestras de espermatozoides con subgrupos de células claras en el diagrama de dispersión se pueden seleccionar como referencia para dibujar el área de compuerta. En tercer lugar, dado que no existen valores de referencia clínica ampliamente aceptados para los indicadores de este experimento, los resultados históricos pueden utilizarse como una herramienta importante para el control de calidad. También se recomienda establecer controles positivos y negativos en cada lote de mediciones, especialmente para SCSA y MMP.
Los resultados representativos del análisis de espermatozoides proporcionados aquí se derivan utilizando un Accuri C6. Sin embargo, la técnica podría aplicarse a otras plataformas comerciales con pequeñas modificaciones. Por lo general, se necesitaría un total de 5 × 106 espermatozoides para cumplir con el requisito de medición de todos los indicadores. Si la concentración de espermatozoides de una muestra es mucho más baja que el nivel medio, la necesidad del volumen de semen aumentaría.
Al igual que los parámetros rutinarios de los espermatozoides, también hay una variación intraindividual notable en la integridad de la cromatina, MMP y apoptosis de los espermatozoides humanos21. En consecuencia, múltiples pruebas de muestras recogidas en diferentes momentos pueden proporcionar una estimación más precisa del nivel de daño de la función espermática. Aunque no existe un período recomendado de abstinencia antes de la toma de muestras de espermatozoides para el análisis citométrico de flujo, se pueden adoptar de 2 a 7 días de abstinencia eyaculatoria, sugerido por la OMS para el análisis rutinario de espermatozoides. Puede ayudar a mejorar la comparabilidad de los resultados entre laboratorios y entre diferentes muestras recogidas de los mismos hombres.
Una limitación importante de este método es que dos de los tres biomarcadores probados, la apoptosis y el potencial de membrana mitocondrial, requieren muestras de semen fresco. Esto puede limitar su aplicación a los hombres que pueden proporcionar muestras de semen al laboratorio. Para la prueba de daño en el ADN (SCSA), se deben preparar muestras de referencia antes del experimento para calibrar el citómetro de flujo. Cabe destacar que la aplicación del protocolo actual requiere un instrumento de MCA en el laboratorio, lo que sigue siendo un desafío considerable para muchos laboratorios clínicos, aunque la cooperación con un servicio de terceros puede ser una opción alternativa en algunas regiones.
Además, el gasto de los tintes y otros reactivos también es un factor financiero para los hombres que pueden necesitar el examen. Por último, es posible que sea necesario modificar el protocolo si se utilizan diferentes marcas o versiones de FCM para examinar los biomarcadores. En resumen, este trabajo presenta un enfoque práctico para estimar tres biomarcadores de daño en espermatozoides humanos mediante una sola máquina de citometría de flujo. Esto puede proporcionar información valiosa sobre la salud reproductiva masculina y complementar el examen de esperma de rutina.
Disclosures
Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a todos los trabajadores de campo por su ayuda y a los entrevistados por su cooperación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
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