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Biochemistry

फॉस्फोप्रोटीन फॉस्फेटेस और उनके इंटरैक्टर्स की पहचान करने के लिए एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित दृष्टिकोण

Published: April 29, 2022 doi: 10.3791/63805
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 2Norris Cotton Cancer Center

Summary

यहां, हम अंतर्जात फॉस्फोप्रोटीन फॉस्फेटेस के संवर्धन और कोशिकाओं और ऊतकों से उनके इंटरैक्टिंग प्रोटीन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक्स द्वारा उनकी पहचान और मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

अधिकांश सेलुलर प्रक्रियाओं को गतिशील प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन द्वारा विनियमित किया जाता है। तीन-चौथाई से अधिक प्रोटीन फॉस्फोराइलेटेड होते हैं, और फॉस्फोप्रोटीन फॉस्फेट (पीपीपी) सभी सेलुलर सेरीन / थ्रेओनीन डिफॉस्फोराइलेशन के 90% से अधिक समन्वय करते हैं। प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन के विनियमन को कैंसर और न्यूरोडीजेनेरेशन सहित विभिन्न बीमारियों के पैथोफिजियोलॉजी में फंसाया गया है। उनकी व्यापक गतिविधि के बावजूद, पीपीपी को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्र और पीपीपी द्वारा नियंत्रित लोगों की खराब विशेषता है। यहां, फॉस्फेट इनहिबिटर मोती और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (पीआईबी-एमएस) नामक एक प्रोटिओमिक दृष्टिकोण को पीपीपी, उनके पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों और उनके इंटरैक्टर्स को किसी भी सेल लाइन या ऊतक का उपयोग करके 12 घंटे तक कम से कम पहचानने और मापने के लिए वर्णित किया गया है। पीआईबी-एमएस एक गैर-चयनात्मक पीपीपी अवरोधक, माइक्रोसिस्टिन-एलआर (एमसीएलआर) का उपयोग करता है, जो अंतर्जात पीपीपी और उनके संबंधित प्रोटीन (जिसे पीपीपीओम कहा जाता है) को पकड़ने और समृद्ध करने के लिए सेफरोज मोतियों पर स्थिर किया जाता है। इस विधि को पीपीपी के टैग किए गए संस्करणों की बहिर्जात अभिव्यक्ति या विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग की आवश्यकता नहीं है। पीआईबी-एमएस विकासवादी रूप से संरक्षित पीपीपी का अध्ययन करने और डिफॉस्फोराइलेशन सिग्नलिंग की हमारी वर्तमान समझ का विस्तार करने का एक अभिनव तरीका प्रदान करता है।

Introduction

प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन अधिकांश सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है, जिसमें डीएनए क्षति, विकास कारक सिग्नलिंग और माइटोसिस 1,2,3 के माध्यम से पारित होने की प्रतिक्रिया तक सीमित नहीं है। स्तनधारी कोशिकाओं में, अधिकांश प्रोटीन किसी समय एक या एक से अधिक सेरीन, थ्रेओनिन या टायरोसिन अवशेषों पर फॉस्फोराइलेटेड होते हैं, फॉस्फोसेरिन और फॉस्फोथ्रोनिन में सभी फॉस्फोराइलेशन साइटों का लगभग 98%शामिल होता है 2,3। जबकि सेलुलर सिग्नलिंग में किनेसेस का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं के विनियमन में पीपीपी की भूमिका अभी भी उभर रही है।

फॉस्फोराइलेशन गतिशीलता को किनेसेस और फॉस्फेटेस के बीच गतिशील परस्पर क्रिया द्वारा नियंत्रित किया जाता है। स्तनधारी कोशिकाओं में, 400 से अधिक प्रोटीन किनेसेस होते हैं जो सेरीन / थ्रेओनिन फॉस्फोराइलेशन को उत्प्रेरित करते हैं। इनमें से 90% से अधिक साइटें फॉस्फोप्रोटीन फॉस्फेटेस (पीपीपी) द्वारा डिफॉस्फोराइलेटेड हैं, एंजाइमों का एक छोटा सा परिवार जिसमें पीपी 1, पीपी 2 ए, पीपी 2 बी, पीपी 4-7, पीपीटी और पीपीजेड 2,3 शामिल हैं। पीपी 1 और पीपी 2 ए सेल 2,3,4 के भीतर फॉस्फोसेरिन और फॉस्फोथ्रोनिन डिफॉस्फोराइलेशन के बहुमत के लिए जिम्मेदार हैं। किनेसेस और फॉस्फेटेस के बीच संख्या में उल्लेखनीय अंतर और इन विट्रो में पीपीपी उत्प्रेरक सबयूनिट्स की विशिष्टता की कमी ने इस विश्वास को जन्म दिया कि किनेसेस फॉस्फोराइलेशन 2,3 के मुख्य निर्धारक हैं। हालांकि, कई अध्ययनों ने मल्टीमेरिक होलोनजाइम्स 5,6,7,8,9 के गठन के माध्यम से सब्सट्रेट विशिष्टता स्थापित करने के लिए फॉस्फेटेस दिखाए हैं। उदाहरण के लिए, पीपी 1 एक हेटेरोडिमर है जिसमें एक उत्प्रेरक सबयूनिट होता है और, एक निश्चित समय पर, 150 से अधिक नियामक सबयूनिट्स में से एक 6,7,8 होता है। इसके विपरीत, पीपी 2 ए एक हेटरोट्रिमर है जो एक मचान (ए), एक नियामक (बी), और एक उत्प्रेरक (सी) सबयूनिट 2,3,9 से बना है। पीपी 2 ए नियामक सबयूनिट्स (बी 55, बी 56, पीआर 72, और स्ट्रेटिन) के चार अलग-अलग परिवार हैं, जिनमें से प्रत्येक में कई जीन, स्प्लिस वेरिएंट और स्थानीयकरण पैटर्न 2,3,9 हैं। पीपीपी की बहुआयामी प्रकृति किनेसेस और पीपीपी उत्प्रेरक सबयूनिट्स की संख्या में अंतर को भरती है। हालांकि, यह पीपीपी सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए विश्लेषणात्मक चुनौतियां पैदा करता है। पीपीपी सिग्नलिंग का व्यापक रूप से विश्लेषण करने के लिए, एक सेल या ऊतक के भीतर विभिन्न होलोएंजाइम की जांच करना महत्वपूर्ण है। किनेज अवरोधक मोतियों के उपयोग के माध्यम से मानव किनोम का अध्ययन करने में महान प्रगति हुई है, जिसे मल्टीप्लेक्स अवरोधक मोती या किनोबीड्स कहा जाता है, एक रासायनिक प्रोटिओमिक रणनीति जहां किनेज अवरोधकों को मोतियों पर स्थिर किया जाता है और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग समृद्ध किनेसेस और उनके इंटरैक्टर्स 10,11,12,13 की पहचान करने के लिए किया जाता है।

हमने पीपीपी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक समान दृष्टिकोण स्थापित किया है। इस तकनीक में माइक्रोसिस्टिन-एलआर (एमसीएलआर) नामक एक स्थिर, गैर-चयनात्मक पीपीपी अवरोधक के साथ मोतियों का उपयोग करके पीपीपी उत्प्रेरक सबयूनिट्स का आत्मीयता कैप्चर शामिल है जिसे फॉस्फेट इनहिबिटर मोती (पीआईबी) 14,15 कहा जाता है। अन्य तरीकों के विपरीत जिनके लिए अंतर्जात टैगिंग या बहिर्जात पीपीपी सबयूनिट्स की अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है जो प्रोटीन गतिविधि या स्थानीयकरण को बदल सकते हैं, पीआईबी-एमएस अंतर्जात पीपीपी उत्प्रेरक सबयूनिट्स, उनके संबंधित नियामक और मचान सबयूनिट्स, और किसी दिए गए समय बिंदु पर या विशिष्ट उपचार स्थितियों के तहत कोशिकाओं और ऊतकों से इंटरैक्टिंग प्रोटीन (जिसे पीपीपीओम कहा जाता है) के संवर्धन की अनुमति देता है। एमसीएलआर नैनोमोलर सांद्रता में पीपी 1, पीपी 2 ए, पीपी 4-6, पीपीटी और पीपीजेड को रोकता है, जिससे पीपीपीओएम16 के लिए समृद्ध करने में पीआईबी अत्यधिक प्रभावी हो जाता है। इस विधि को कोशिकाओं से नैदानिक नमूनों तक किसी भी प्रारंभिक सामग्री पर उपयोग के लिए स्केल किया जा सकता है। यहां, हम अंतर्जात पीपीपीओम और इसके संशोधन राज्यों को कुशलतापूर्वक पकड़ने, पहचानने और मात्रा निर्धारित करने के लिए पीआईबी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (पीआईबी-एमएस) के उपयोग का विस्तार से वर्णन करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: पीआईबी-एमएस प्रोटोकॉल का दृश्य सारांश। पीआईबी-एमएस प्रयोग में, नमूने कोशिकाओं से ट्यूमर तक विभिन्न रूपों में प्राप्त किए जा सकते हैं। नमूना पीपीपी संवर्धन से पहले एकत्र, लाइज्ड और होमोजेनाइज्ड है। पीपीपी के लिए समृद्ध करने के लिए, लाइसेट को पीपीपी-अवरोधक के साथ या बिना पीआईबी के साथ ऊष्मायन किया जाता है, जैसे कि एमसीएलआर। पीआईबी को तब धोया जाता है, और पीपीपी को विकृत करने की स्थिति में एल्यूट किया जाता है। नमूने एसपी 3 प्रोटीन संवर्धन, ट्रिप्टिक पाचन और डीसाल्टिंग के माध्यम से डिटर्जेंट को हटाकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए तैयार किए जाते हैं। नमूने तब मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पहले वैकल्पिक रूप से टीएमटी-लेबल किए जा सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पीआईबी-एमएस में पश्चिमी सोख्ता या मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित दृष्टिकोण (चित्रा 1) के माध्यम से पीआईबी, क्षालन और एल्यूएट के विश्लेषण के साथ लाइसेट के इनक्यूबेशन कोशिकाओं या ऊतकों का लिसिस और स्पष्टीकरण शामिल है। मुफ्त एमसीएलआर के अलावा गैर-विशिष्ट इंटरएक्टर्स से विशिष्ट पीआईबी बाइंडर्स को अलग करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। अधिकांश अनुप्रयोगों के लिए, एक लेबल मुक्त दृष्टिकोण का उपयोग सीधे एलुएट्स में प्रोटीन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। ऐसे मामलों में जहां परिमाणीकरण में अधिक परिशुद्धता या कम बहुतायत वाली प्रजातियों की पहचान की आवश्यकता होती है, अग्रानुक्रम द्रव्यमान-टैग (टीएमटी) लेबलिंग के साथ आगे की प्रक्रिया का उपयोग कवरेज बढ़ाने और इनपुट को कम करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: पीआईबी की पीढ़ी मूरहेड एट अल द्वारा वर्णित के रूप में की जाती है, जहां 1 मिलीग्राम माइक्रोसिस्टिन और लगभग 6 मिलीलीटर सेफरोज को 5 मिलीग्राम / एमएल17 तक की बाध्यकारी क्षमता के साथ पीआईबी उत्पन्न करने के लिए युग्मित किया जाता है।

1. नमूना तैयारी

नोट: पीआईबी-एमएस के लिए एक विशिष्ट प्रारंभिक राशि प्रति स्थिति कुल प्रोटीन का 1 मिलीग्राम है। इस प्रयोग के लिए, 1 मिलीग्राम प्रोटीन निकालने के लिए लगभग 2.5 x 106 हेला कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। यह गणना एक प्रयोग18 में उपयोग की जा रही प्रत्येक सेल लाइन या ऊतक के लिए की जानी चाहिए। यदि नमूना सीमित है और 1 मिलीग्राम प्राप्त नहीं किया जा सकता है, तो पीपीपी सबयूनिट डिटेक्शन के मामूली नुकसान के साथ इनपुट की मात्रा को कम किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, टीएमटी लेबलिंग को एक नमूने में सभी स्थितियों के मिश्रण की अनुमति देने के लिए नियोजित किया जा सकता है, जिससे चरण 9 में दिखाए गए अनुसार पता लगाने की संवेदनशीलता बढ़ जाती है।

  1. ऊतक के नमूने या सेल छर्रों ले लीजिए। सेल छर्रों के लिए, कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 मिनट के लिए 277 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें, मीडिया को हटा दें, और फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें। सेल छर्रों को कई महीनों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. लसीका बफर (500 एमएम एनएसीएल, 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.5, 0.5% ट्राइटन एक्स -100 (वॉल्यूम / वॉल्यूम), 5 एमएम बीटा-ग्लिसरोफॉस्फोरिक एसिड डिसोडियम नमक पेंटाहाइड्रेट, 1: 500 (वॉल्यूम / लाइज़ और सभी नमूनों को धोने के लिए पर्याप्त बनाएं। यदि प्रति स्थिति 1 मिलीग्राम प्रोटीन से शुरू होता है, तो लाइसिस और वॉश के लिए प्रति नमूना लगभग 3 मिलीलीटर बफर बनाएं।
    नोट: इस चरण में नोट किया गया लाइसिस बफर एक हल्का डिटर्जेंट समाधान है, जो अघुलनशील झिल्ली या साइटोस्केलेटल से जुड़े प्रोटीन को घुलनशील बनाने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है। घुलनशीलता में सुधार के लिए अन्य डिटर्जेंट का पता लगाया जा सकता है। एनएसीएल और ट्राइटन-एक्स -100 सांद्रता की एक श्रृंखला का परीक्षण किया गया था, और उपरोक्त सांद्रता कम पृष्ठभूमि और उच्च फॉस्फेट सबयूनिट बाइंडिंग के लिए इष्टतम पाई गई थी।
  3. नमूनों के लिए ठंडा लिसिस बफर जोड़ें। 1 मिलीग्राम प्रोटीन के लाइसिस के लिए, बफर के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें। यदि नमूना जमे हुए है, तो लाइसिस बफर जोड़ें और नमूना बफर में बर्फ पर पिघलने दें।
    1. कोशिकाओं के लिए, दालों के बीच बर्फ पर कोशिकाओं को रखते हुए, सोनिफिकेशन के माध्यम से नमूनों को समरूप करें। तीन 15 एस दालों के साथ 15% आयाम पर नमूनों को सोनीकेट करें। यह उपयोग किए गए सोनिकेटर के आधार पर भिन्न हो सकता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. ऊतकों के लिए, चरण 1.3.1 में वर्णित सोनिकेटिंग से पहले तरलीकृत होने तक ऊतक को पीसने के लिए एक डौंस ऊतक की चक्की का उपयोग करके पहले नमूनों को समरूप करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 21,130 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अघुलनशील मलबे के समरूप नमूने को स्पष्ट करें। फिर, गठित छर्रों या लिपिड को परेशान किए बिना जो ट्यूबों के किनारे एकत्र हुए हैं, लाइसेट्स को नई ट्यूबों में स्थानांतरित करें। यदि वांछित हो तो स्पष्ट लाइसेट के पूर्व-संवर्धन नमूने के 100 μL निकालें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लाइसेट्स को बर्फ पर रखना सुनिश्चित करें।
  5. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, प्रत्येक नमूने के एक छोटे विभाज्य पर एक प्रोटीन परिमाणीकरण परख, जैसे कि एक बिसिनकोनिनिक एसिड परख (बीसीए) करके प्रत्येक नमूने में कुल प्रोटीन सामग्री का निर्धारण करें। सुनिश्चित करें कि बीसीए परख के दौरान लाइसेट्स को बर्फ पर रखा जाता है।
  6. बीसीए परख करने के बाद, नई ट्यूबों में प्रोटीन की बराबर मात्रा में स्थानांतरित करें और लाइसिस बफर के साथ पतला करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि प्रत्येक ट्यूब में प्रोटीन की समान एकाग्रता (जैसे, 1 मिलीग्राम / यदि प्रयोग के लिए पीपीपी अवरोधक नियंत्रण की आवश्यकता होती है, तो प्रत्येक नमूने के दो विभाज्य तैयार करें जिनमें एक ही प्रोटीन सामग्री होती है और चरण 1.7 पर आगे बढ़ें। यदि पीपीपी अवरोधक नियंत्रण की आवश्यकता नहीं है, तो चरण 2 पर जाएं। सुनिश्चित करें कि नमूने बर्फ पर रखे गए हैं।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि पीआईबी-एमएस विश्लेषण में प्रति स्थिति समान प्रोटीन सांद्रता का उपयोग किया जाता है। पीपीपी अवरोधक नियंत्रण का उपयोग गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि से पीआईबी के लिए विशिष्ट बाइंडर्स को अलग करने के लिए किया जाता है।
  7. पीपीपी अवरोधक नियंत्रण के लिए, एक नमूने को नि: शुल्क एमसीएलआर (1 μM) के साथ और दूसरे को नियंत्रण के रूप में डीएमएसओ की समान मात्रा के साथ इलाज करें। धीरे नमूने भंवर और 15 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें सेते हैं।
    नोट: लाइसेट्स का एमसीएलआर उपचार पीपीपी उत्प्रेरक सबयूनिट्स के बंधन को अवरुद्ध करता है लेकिन प्रोटीन नहीं जो नमूनों में पीआईबी के लिए गैर-विशेष रूप से बांधते हैं। एमसीएलआर को संभालते समय सतर्क रहें क्योंकि यह विषाक्त है। सामग्री की तालिका में सावधानियों को संभालने का संदर्भ लें।

2. पीआईबी की तैयारी

  1. प्रयोग के लिए आवश्यक पीआईबी की मात्रा निर्धारित करें। 1 मिलीग्राम प्रोटीन के लिए, पीपीपी के 1-3 μg और इंटरैक्टिंग प्रोटीन प्राप्त किए जा सकते हैं; मनका हानि को कम करने के लिए नमूना प्रति ठोस पीआईबी राल के कम से कम 10 μL का उपयोग करें। पीआईबी की बाध्यकारी क्षमता 3-5 मिलीग्राम / एमएल14,17 है।
  2. पीआईबी की उचित मात्रा को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और उन्हें धीरे-धीरे भंवर द्वारा 0.5 एमएल लिसिस बफर के साथ 3 एक्स धो लें और फिर वॉश के बीच आरटी पर 30 एस के लिए 376 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजिंग करें। धोने के बीच लाइसिस बफर को हटाते समय मोतियों को पाइप करने से बचें।
  3. धोए गए पीआईबी में उचित मात्रा में लाइसिस बफर जोड़कर 50% पीआईबी /बफर समाधान (वॉल्यूम/वॉल्यूम) बनाएं। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करें और पीआईबी को फिर से निलंबित करने के लिए घोल में पिपेट टिप घुमाएं।
  4. घोल के 20 μL को एक नए 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें पहले से ही 0.5 एमएल लाइसिस बफर होता है। ट्यूब में लाइसिस बफर पिपेट टिप से मोतियों को निष्कासित करने में मदद करता है। ऐसा तब तक करें जब तक कि प्रत्येक नमूने के लिए समान मात्रा में पीआईबी युक्त पर्याप्त ट्यूब न हों।
  5. आरटी पर 30 एस के लिए 376 एक्स जी पर ट्यूबों को स्पिन करें सुनिश्चित करें कि सभी ट्यूबों में मनका राल की समान मात्रा होती है। किसी भी सतह पर तैरनेवाला त्यागें, केवल ठोस राल और प्रत्येक ट्यूब में लाइसिस बफर के 50 μL की एक अधिकतम छोड़ दें।

3. लाइसेट्स के साथ पीआईबी का इनक्यूबेशन

  1. चरण 1.6 से लाइसेट्स स्थानांतरित करें। या चरण 1.7। चरण 2 से पीआईबी युक्त उचित रूप से लेबल ट्यूब के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए पीआईबी के साथ 8 आरपीएम पर लाइसेट घुमाएं।

4. पीआईबी की धुलाई

  1. मोती इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 376 एक्स जी पर पीआईबी अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें और त्यागें, यदि वांछित हो तो पोस्ट-संवर्धन विश्लेषण के लिए 100 μL विभाज्य की बचत करें।
  2. मोती के लिए लाइसिस बफर के 0.5 मिलीलीटर जोड़कर पीआईबी 3 एक्स धो लें, ट्यूबों को उलटकर (भंवर अनुशंसित नहीं), 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 376 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा मोतियों को इकट्ठा करें, और बसे हुए मोतियों से लाइसिस बफर को हटा दें, मनका गोली को बाधित न करें।

5. पीआईबी से पीपीपी का क्षालन

  1. अंतिम धोने के बाद, किसी भी पीआईबी को पाइप किए बिना जितना संभव हो उतना लाइसिस बफर को हटा दें। वॉल्यूम) युक्त क्षालन बफर बनाएं और पीआईबी की मात्रा के 4x-5x होने के लिए क्षालन बफर की पर्याप्त मात्रा जोड़कर पीआईबी से पीपीपी को हटा दें। उदाहरण के लिए, यदि पीआईबी के 10 μL का उपयोग किया जाता है, तो क्षालन बफर के 50 μL का उपयोग करें। पीआईबी से पीपीपी को हटाने के लिए 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर क्षालन बफर के साथ पीआईबी सेते हैं।
  2. क्षालन के बाद, आरटी पर 30 एस के लिए 376 एक्स जी पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करके एल्यूएट इकट्ठा करें और एल्यूएट को एक अलग ट्यूब में पाइपिंग करें, सावधान रहें कि किसी भी पीआईबी को स्थानांतरित न करें। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए या मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए एलुएट का उपयोग करें। एलुएट्स को कई महीनों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. आगे के उपयोग के लिए पीआईबी को पुनर्जीवित करने के लिए, 2% एसडीएस (वॉल्यूम / वॉल्यूम) में मोतियों को सेते हैं, 1 घंटे के लिए आरटी पर 8 आरपीएम पर घूर्णन करते हैं। उन्हें 3x-5x 25 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.5) में 30 मिनट प्रति धोने के लिए रोटेशन के साथ धो लें। सभी धोने के बाद, पीआईबी को 25 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.5) स्टोरेज बफर में सोडियम एजाइड (0.05% डब्ल्यूटी /
  4. पश्चिमी सोख्ता या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा एलुएट्स का विश्लेषण करें। पीआईबी एलुएट्स के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का वर्णन नीचे किया गया है।

6. डिटर्जेंट को हटाना

नोट: एमएस विश्लेषण के लिए एल्यूएट नमूनों से डिटर्जेंट को हटाने के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है। हमने पाया कि ह्यूजेस एट अल द्वारा वर्णित सिंगल-पॉट, सॉलिड-फेज-एन्हांस्ड सैंपल-तैयारी (एसपी 3), अच्छी तरह से काम करताहै।

  1. ऊपर चरण 5.2 से एल्यूएट के 50 μL करने के लिए SP3 मोती के 0.5 μL जोड़ें। 10: 1 (μg: μg) या कम से कम 0.5 μg/μL (स्टॉक समाधान 50 μg/μL है) के अनुपात में SP3 मोतियों का उपयोग करें। धीरे से मोती भंवर और एल्यूएट।
  2. मनका-एल्यूएट मिश्रण में 100% इथेनॉल की एक क्षालन मात्रा जोड़ें (उदाहरण के लिए, यदि एलुएट के 50 μL का उपयोग किया गया था, तो 100% इथेनॉल के 50 μL का उपयोग करें)। 24 डिग्री सेल्सियस पर 1000 आरपीएम पर हिला करने के लिए सेट एक थर्मोमिक्सर में 5 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
  3. सभी मोतियों को इकट्ठा करने के लिए, उन्हें चुंबकीय ट्यूब रैक में रखें। एक बार मोती इकट्ठा होने के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और मोतियों को 80% इथेनॉल (वॉल्यूम / वॉल्यूम) 3 एक्स के 0.5 एमएल के साथ धो लें। धोने के लिए, भंवर द्वारा मोतियों को फिर से निलंबित करें, उन्हें चुंबकीय ट्यूब रैक में रखकर मोतियों को इकट्ठा करें, और वॉश के बीच सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  4. इथेनॉल के सभी निशान को हटाने के लिए 100% एसिटोनिट्राइल (एसीएन) के 0.5 एमएल के साथ मोतियों को एक बार और धोएं, जितना संभव हो उतना एसीएन हटा दें।

7. प्रोटीन का पाचन

  1. μL की अंतिम एकाग्रता) 166 एमएम एचईपीईएस (पीएच 8.5) में ट्रिप्सिन (0.004 μg / μL की अंतिम एकाग्रता) का 1: 100 कमजोर पड़ना और मोतियों के साथ प्रत्येक ट्यूब में इस ट्रिप्सिन समाधान के 30 μL जोड़ें, भंवर द्वारा पुन: निलंबित।
  2. 5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1000 आरपीएम पर थर्मोमिक्सर में एसपी 3-ट्रिप्सिन मनका मिश्रण सेते हैं या 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर। मोतियों को इकट्ठा करने और नई ट्यूबों को पचाने के लिए चुंबकीय रैक में ट्यूबों को रखें।
  3. लेबल मुक्त विश्लेषण के लिए, 0.2% टीएफए (वॉल्यूम / वॉल्यूम) की अंतिम एकाग्रता में 20% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) (वॉल्यूम / जांचें कि प्रत्येक नमूने का पीएच पीएच पेपर के साथ 2-3 के बीच है। यदि नहीं, तो इसे प्राप्त करने तक 20% टीएफए के छोटे अतिरिक्त विभाज्य जोड़ें। नमूनों को डीसाल्टिंग से पहले उचित रूप से अम्लीकृत किया जाना चाहिए। चरण 8 पर जारी रखें।
  4. नमूनों के टीएमटी लेबलिंग के लिए, अम्लीय न करें और चरण 9 पर जारी रखें।

8. डाइजेस्ट को डीसाल्ट करना

  1. रैपसिल्बर एट अल द्वारा वर्णित सी 18 राल के साथ एमएस विलायक संगत टिप के 200 μL पैकिंग द्वारा प्रत्येक नमूने के लिए एक चरण टिप तैयार करें। दो सी 18 सामग्री डिस्क दबाने के लिए एक कुंद-अंत सुई का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि डिस्क सुई में रहें। सुई से डिस्क को निष्कासित करने के लिए एक पतली तार सवार का उपयोग करके एमएस विलायक संगत टिप में डिस्क को स्थानांतरित करें।
    नोट: प्रोटोकॉल में इस बिंदु से एमएस विलायक संगत युक्तियों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है क्योंकि अन्य पिपेट युक्तियां उन नमूनों में रसायनों को लीच कर सकती हैं जिन्हें मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से पता लगाया जा सकता है।
  2. प्रत्येक चरण टिप को 100% मेओएच के 30 μL के साथ संतुलित करें, फिर 60% MeOH (vol /vol) के 30 μL के साथ, इसके बाद 0.1% टीएफए (वॉल्यूम / एक सिरिंज के साथ मंच टिप के माध्यम से प्रत्येक समाधान पुश। यदि आवश्यक हो तो सिरिंज और स्टेज टिप के बीच संपर्क बढ़ाने के लिए एक पारदर्शी फिल्म के साथ एक सिरिंज के अंत में एक पिपेट टिप संलग्न करें। सुनिश्चित करें कि चरण टिप के अंदर सी 18 सामग्री को कभी सूखने न दें।
  3. चरण 7.3 से लेबल किए गए चरण टिप में अम्लीय पेप्टाइड डाइजेस्ट जोड़ें और सिरिंज के साथ स्टेज टिप के माध्यम से धक्का दें, फिर से सावधान रहें कि स्टेज टिप को पूरी तरह से सूखने न दें।
  4. 0.1% टीएफए (वॉल्यूम / वॉल्यूम) के 30 μL के साथ प्रत्येक नमूना 2x धो लें। वॉल्यूम) के 30 μL को प्रत्येक चरण टिप में जोड़कर और सिरिंज दबाव के साथ टिप से एक नए, लेबल ट्यूब में सभी को निष्कासित करके प्रत्येक चरण टिप से पेप्टाइड्स को एल्यूट करें। यह एकमात्र कदम है जहां सी 18 सामग्री पूरी तरह से सूख जाती है।
  5. वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्रत्येक नमूने को सूखा। सूखे पेप्टाइड्स को कई महीनों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। नमूने अब लेबल मुक्त मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए तैयार हैं। द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर पर विश्लेषण के लिए नमूने का केवल आधा और यदि आवश्यक हो तो पुन: इंजेक्शन के लिए दूसरा आधा उपयोग करें। विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर विधि का उपयोग सुनिश्चित करें।

9. टीएमटी लेबलिंग

नोट: अग्रानुक्रम-द्रव्यमान टैग लेबलिंग मात्रात्मक विश्लेषण के लिए मल्टीप्लेक्स नमूने के लिए प्रयोग किया जाता है। टीएमटी अभिकर्मक की 0.8 मिलीग्राम शीशी प्रोटीन21 के 0.8 मिलीग्राम तक लेबलिंग के लिए पर्याप्त है। 1 मिलीग्राम प्रोटीन से शुरू होने वाले पीआईबी पुलडाउन प्रयोग में, फॉस्फोप्रोटीन सबयूनिट्स के 1-3 μg प्राप्त होते हैं। नीचे दिया गया प्रोटोकॉल प्रोटीन के 10 μg तक के लिए इष्टतम है।

  1. निर्जल एसीएन के 80 μL में टीएमटी अभिकर्मक की एक 0.8 मिलीग्राम शीशी का पुनर्गठन करें।
  2. 18 चैनलों के लिए एक अलग टीएमटी लेबल के साथ चरण 7.4 से प्रत्येक नमूने को लेबल करें। ध्यान दें कि प्रत्येक नमूने में कौन सा टीएमटी लेबल जोड़ा जाता है। पेप्टाइड डाइजेस्ट के लिए टीएमटी अभिकर्मक के 2 μL और एसीएन के 2 μL जोड़ें, भंवर धीरे मिश्रण करने के लिए, नमूना इकट्ठा करने के लिए आरटी पर 30 एस के लिए 376 x g पर अपकेंद्रित्र, और नमूना लेबल करने के लिए 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
  3. टीएमटी लेबलिंग दक्षता का परीक्षण करने के लिए, प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए 9 μL एलसी-एमएस ग्रेड पानी और 10% हाइड्रॉक्सिलमाइन (वॉल्यूम / वॉल्यूम) के 1 μL युक्त 0.5 एमएल ट्यूब में प्रत्येक लेबलिंग प्रतिक्रिया के 1 μL के संयोजन से एक लेबल चेक नमूना बनाएं। शेष बिना बुने लेबल वाले नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें। लेबलिंग दक्षता का मूल्यांकन करते समय नमूनों को कई दिनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. 0.1% टीएफए (वॉल्यूम / वॉल्यूम) के 30 μL जोड़कर टीएमटी लेबल चेक नमूने को अम्लीय करें। जांचें कि पीएच 2-3 के बीच है। यदि नहीं, तो इस पीएच को प्राप्त करने तक 20% टीएफए (वॉल्यूम / चरण 8.1.-8.5 में वर्णित के रूप में चरण टिपिंग के माध्यम से लेबल चेक नमूना डीसाल्ट करें।
  5. लेबलिंग दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर पर टीएमटी लेबल चेक नमूने का विश्लेषण करें। पेप्टाइड स्तर पर 1% झूठी खोज दर (एफडीआर) के लिए खोज परिणामों को फ़िल्टर करें और लेबलिंग दक्षता21,22 निर्धारित करें।
  6. पूरी तरह से टीएमटी-लेबल वाले पेप्टाइड्स में एन-टर्मिनस और सभी लाइसिन पर टीएमटी अभिकर्मक होता है। टीएमटी रिपोर्टर आयन तीव्रता की मात्रा निर्धारित करें और सभी चैनलों में उनके कुल योग की तुलना करें। नमूना पर्याप्त रूप से लेबल किया जाता है जब सभी पेप्टाइड्स के >95% लेबल किए जाते हैं और टीएमटी रिपोर्टर आयन योग तीव्रता तुलनीय होती है
    नोट: अधूरे लेबलिंग के अलावा, अभिव्यक्त टीएमटी रिपोर्टर आयन तीव्रता में अंतर 1 μL परीक्षण नमूने के गलत पाइपिंग का परिणाम हो सकता है। यह एक सच्चे जैविक अवलोकन को भी प्रतिबिंबित कर सकता है, इस मामले में सभी प्रतिकृतियों को एक ही व्यवहार प्रदर्शित करना चाहिए।
  7. -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से बिना बुने हुए नमूनों को निकालें और उन्हें पिघलाएं। यदि वे पूरी तरह से लेबल नहीं हैं, तो ऊपर बताए गए नमूने में उपयुक्त टीएमटी अभिकर्मक के 1 μL जोड़ें, 1 घंटे के लिए सेते हैं, और टीएमटी लेबल चेक को दोहराते हैं। नमूने पूरी तरह से लेबल कर रहे हैं, तो चरण 9.8 करने के लिए जारी रखें।
  8. जब पूरी तरह से लेबल किया जाता है, तो लेबलिंग को बुझाने के लिए टीएमटी प्रतिक्रियाओं में 10% हाइड्रॉक्सिलमाइन (वॉल्यूम / 15 मिनट के लिए आरटी पर नमूने सेते हैं। एक बार बुझाने के बाद, नमूनों को कई महीनों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  9. सभी बुझे हुए टीएमटी चैनलों को मिलाएं और प्रतिक्रिया को अम्लीकृत करने के लिए 20% टीएफए (वॉल्यूम / संयुक्त प्रतिक्रिया के पीएच की जांच करें, यह सुनिश्चित करें कि यह पीएच 2-3 के बीच है। यदि नहीं, तो वांछित पीएच तक पहुंचने तक 20% टीएफए के छोटे विभाज्य जोड़ें। यह उचित डीसाल्टिंग के लिए महत्वपूर्ण है।
  10. 30 मिनट के लिए वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एसीएन निकालें और नीचे वर्णित के रूप में नमूना डीसाल्ट करें।

10. टीएमटी-लेबल संयुक्त नमूने को डीसाल्ट करना

  1. संयुक्त टीएमटी अभिकर्मक को डीसाल्ट करने के लिए उपयुक्त प्रोटीन क्षमता (2 मिलीग्राम शर्बत आमतौर पर इस आवेदन के लिए पर्याप्त है) के साथ एसपीई सी 18 डीसाल्टिंग प्लेट का उपयोग करें। 60% एमईओएच (वॉल्यूम / वॉल्यूम) के 200 μL और 10% एमईओएच / 0.1% टीएफए (वॉल्यूम / वॉल्यूम) के 200 μL के साथ कुएं को संतुलित करें।
  2. चरण 9.10 से अम्लीय टीएमटी-लेबल वाले पेप्टाइड्स लोड करें। डीसाल्टिंग प्लेट पर। 10% मेओएच/0.1% टीएफए (वॉल्यूम/वॉल्यूम) के 200 μL के साथ नमूना कुओं 2x धो लें।
  3. 60% एमईओएच (वॉल्यूम / वॉल्यूम) के 100 μL के साथ पेप्टाइड्स को एल्यूट करें। वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा नमूनों को सूखा। सूखे, टीएमटी-लेबल वाले नमूने को कई महीनों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. टीएमटी लेबल वाले नमूने के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए, नमूने का आधा हिस्सा इंजेक्ट करें और यदि पुन: इंजेक्शन की आवश्यकता हो तो दूसरे आधे को बचाएं।
    नोट: मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर इंजेक्शन की मात्रा विशिष्ट कॉलम, साधन सेटअप और नमूना प्रकार के आधार पर अलग-अलग होगी।

11. डेटा विश्लेषण

नोट: डेटा फ़िल्टरिंग और विश्लेषण के तरीके अलग-अलग होते हैं और इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे होते हैं, लेकिन विश्लेषण पर निम्नलिखित नोट्स इस प्रोटोकॉल से उत्पन्न डेटा के प्रकार के लिए विशिष्ट मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए शामिल हैं।

  1. उपयोग किए गए नमूना कोशिकाओं या ऊतक की उत्पत्ति के आधार पर एक प्रजाति-विशिष्ट प्रोटिओम डेटाबेस के खिलाफ कच्चे द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा खोजें। यहां, धूमकेतु को खोज एल्गोरिथ्म23 के रूप में इस्तेमाल किया गया था।
  2. खोज एल्गोरिथ्म-विशिष्ट पैरामीटर22 को समायोजित करके 1% एफडीआर के साथ खोज परिणामों को फ़िल्टर करें। लेबल मुक्त मात्रा का ठहराव के लिए, डेटा की मात्रा निर्धारित करने के लिए MS1 शिखर क्षेत्र माप का उपयोग करें। टीएमटी-लेबल वाले नमूनों के लिए, मात्रा का ठहराव के लिए एमएसएन-व्युत्पन्न रिपोर्टर आयन तीव्रता का उपयोग करें। सांख्यिकीय महत्व के लिए, जैविक ट्रिप्लिकेट्स में नमूनों का विश्लेषण करें।
  3. पीपीपी सबयूनिट्स और उनके इंटरएक्टर्स की पहचान करने के लिए, सुनिश्चित करें कि एमसीएलआर-बाधित और डीएमएसओ-उपचारित नमूनों के तीन गुना जैविक नमूनों की तुलना की जाती है। विभिन्न परिस्थितियों में या दवा उपचार पर पीपीपीओम की तुलना करने के लिए, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक स्थिति या दवा उपचार के जैविक ट्रिप्लिकेट उत्पन्न हुए थे।
  4. डेटा को फ़िल्टर करें ताकि तीन डीएमएसओ नियंत्रण-उपचारित नमूनों में से कम से कम दो में कुल पेप्टाइड गिनती >1 वाले प्रोटीन मौजूद हों। एमसीएलआर प्रतियोगिता हमेशा सभी उत्प्रेरक सबयूनिट बाइंडिंग से प्रतिस्पर्धा नहीं करती है। इसके अलावा, कुछ पीपीपी उत्प्रेरक सबयूनिट्स गैर-विशेष रूप से सेफरोज राल से चिपक सकते हैं। प्रोटीन को फ़िल्टर करते समय या तो संभावना के लिए खाते में जो गैर-विशेष रूप से राल से बंधते हैं, एमसीएलआर-उपचारित स्थिति में कुल पेप्टाइड गिनती वाले प्रोटीन को किसी भी पीपीपी उत्प्रेरक सबयूनिट की तुलना में अधिक हटा दें।
  5. विश्लेषण14 से केराटिन, कोलेजन, 40 एस और 60 एस राइबोसोमल प्रोटीन, और विषम परमाणु राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन जैसे सामान्य दूषित पदार्थों को बाहर करें जो पीपीपी सबयूनिट नहीं हैं।
  6. लोड अनुभाग24,25 में जेनेरिक मैट्रिक्स अपलोड क्लिक करके फ़िल्टर किए गए डेटा को पर्सियस में आयात करें। लॉग2 बेसिक > ट्रांसफ़ॉर्म पर जाकर, डेटा का चयन करके और ट्रांसफ़ॉर्मेशन फ़ंक्शन निर्दिष्ट करके डेटा को बदल देता है, इस मामले में लॉग 2 (एक्स)।
  7. सामान्य वितरण से अनुपलब्ध मानों को सामान्य वितरण से प्रतिस्थापित >, डेटा का चयन करके, और गणना के लिए चौड़ाई (डिफ़ॉल्ट 0.3) और डाउन शिफ्ट (डिफ़ॉल्ट 1.8) निर्दिष्ट करके सामान्य वितरण से अनुपलब्ध मानों को आरोपित करें। क्वांटाइल सामान्यीकरण के > सामान्य करने के लिए जाकर क्वांटाइल सामान्यीकरण करें।
  8. संबंधित स्थितियों के लिए लॉग2 अनुपात और छात्र के टी-टेस्ट पी-मानों की गणना करें। सबसे पहले, एनोट पर जाकर डेटा को एनोटेट करें । पंक्तियाँ श्रेणीबद्ध एनोटेशन पंक्तियों >। टेस्ट > टू-सैंपल टेस्ट में जाकर टी-टेस्ट करें, और तुलना करने के लिए समूहों का चयन करें, प्रदर्शन करने के लिए परीक्षण, और ट्रंकेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले कई परिकल्पना परीक्षण सुधार की विधि।
    नोट: डे नोवो पहचान के लिए, एक प्रोटीन को पीपीपी-इंटरैक्टिंग प्रोटीन माना जाता है यदि इसकी बहुतायत एमसीएलआर-उपचारित बनाम डीएमएसओ स्थिति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण है, जिसमें किसी भी विशेष रूप से बाध्य ज्ञात पीपीपी सबयूनिट के न्यूनतम गुना परिवर्तन से अधिक लॉग2 गुना परिवर्तन होता है।

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Representative Results

Figure 2
चित्रा 2: विशिष्ट पीआईबी बाइंडर्स की पहचान (ए) पीआईबी-एमएस के माध्यम से विभिन्न प्रकार के ऊतक प्रकार या कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा सकता है। जैविक ट्रिप्लिकेट में हेला कोशिकाओं को या तो डीएमएसओ या पीपीपी-अवरोधक एमसीएलआर के साथ इलाज किया गया था, पीआईबी के साथ ऊष्मायन किया गया था, और एलसी-एमएस / एमएस के माध्यम से विश्लेषण किया गया था( बी) डीएमएसओ और एमसीएलआर-उपचारित हेला सेल लाइसेट्स में पीआईबी-एमएस विश्लेषण के ज्वालामुखी भूखंड, लाल रंग में दिखाए गए विशिष्ट पीआईबी बाइंडर्स के साथ। पीपीपी उत्प्रेरक सबयूनिट्स को लेबल किया जाता है और नीले रंग में दिखाया जाता है। नए उम्मीदवार पीपीपी सबयूनिट्स या इंटरैक्टिंग प्रोटीन को काले रंग में दिखाया गया है। गैर-विशिष्ट बाइंडर्स ग्रे में दिखाए गए हैं। (सी) संवर्धन की प्रजनन क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए डीएमएसओ के साथ इलाज किए गए हेला सेल लाइसेट्स से दो जैविक प्रतिकृतियों के लॉग2 क्षेत्र का स्कैटर प्लॉट। पीआईबी के लिए विशिष्ट बाइंडर लाल रंग में दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: हेला कोशिकाओं में पहचाने जाने वाले सभी पीपीपी सबयूनिट्स और पीपीपी-इंटरैक्टिंग प्रोटीन का नेटवर्क विश्लेषण। इन प्रोटीनों को एमसीएलआर के साथ और बिना हेला पीआईबी पुलडाउन में विशिष्ट पीआईबी इंटरैक्टर्स पाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पीआईबी के प्रदर्शन को प्रदर्शित करने के लिए, हमने पीपीपी और उनके इंटरएक्टर्स (चित्रा 2 ए) की पहचान करने के लिए हेला कोशिकाओं में पीआईबी पुलडाउन प्रयोग किया। हेला कोशिकाओं को जैविक ट्रिप्लिकेट में उगाया गया था और लाइज़ किया गया था। प्रत्येक ट्रिप्लिकेट लाइसेट को आधे में विभाजित किया गया था, जहां पीआईबी संवर्धन किए जाने से पहले पीपीपी उत्प्रेरक सबयूनिट्स या डीएमएसओ के बंधन को रोकने के लिए 15 मिनट के लिए एमसीएलआर के साथ आधा इलाज किया गया था। पीआईबी संवर्धन के बाद, डीएमएसओ-इलाज और एमसीएलआर-उपचारित नमूनों में मात्रा निर्धारित प्रोटीन की प्रचुरता की एक लेबल-मुक्त तुलना गैर-विशिष्ट इंटरएक्टर्स (चित्रा 2 बी) से विशिष्ट अंतर करने के लिए की गई थी। विश्लेषण में, हमने सभी एमसीएलआर-संवेदनशील पीपीपी उत्प्रेरक सबयूनिट्स पीपी 1 सीए, पीपी 1 सीबी, पीपी 1 सीसी, पीपी 2 एएसीए, पीपी 2 एबी, पीपी 4 सी, पीपी 5 सी और पीपी 6 सी का पता लगाया। डीएमएसओ-इलाज नमूनों में, बहुतायत (प्रोटीन परिमाणीकरण के लॉग2 क्षेत्रों) अत्यधिक सहसंबद्ध थे, जो प्रजनन क्षमता (चित्रा 2 सी) का संकेत देते हैं, फिर भी एमसीएलआर के साथ उपचार पर, पीआईबी पुलडाउन में पीपीपी उत्प्रेरक सबयूनिट या पीपीपी इंटरैक्टिंग प्रोटीन बहुतायत बहुत कम हो गई थी (चित्रा 2 बी)। इस विश्लेषण में, हमने 92 पीपीपी सबयूनिट्स और विशिष्ट पीपीपी इंटरएक्टर्स ( पूरक तालिका 1 देखें) की पहचान की, जो हेला कोशिकाओं14 (चित्रा 3) में पिछले पीआईबी-एमएस विश्लेषण के बराबर है।

अनुपूरक तालिका 1: प्रतिनिधि पीआईबी-एमएस विश्लेषण का एमएस डेटा। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पीआईबी-एमएस एक रासायनिक प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण है जिसका उपयोग एक ही विश्लेषण में विभिन्न नमूना स्रोतों से पीपीपीओम को मात्रात्मक रूप से प्रोफाइल करने के लिए किया जाता है। किनोम का अध्ययन करने के लिए किनेज इनहिबिटर मोतियों का उपयोग करके बहुत काम किया गया है और यह कैंसर और अन्य बीमारियों में कैसे बदलता है 10,11,12,13। फिर भी, पीपीपीओम का अध्ययन पीछे है। हम अनुमान लगाते हैं कि यह दृष्टिकोण इस अंतर को भरने और सेलुलर डिफॉस्फोराइलेशन के विनियमन पर प्रकाश डालने में सक्षम है। यहां, हम दिखाते हैं कि, पीआईबी का उपयोग करके, हम पीपी 1, पीपी 2 ए, पीपी 4, पीपी 5 और पीपी 6 के उत्प्रेरक और गैर-उत्प्रेरक घटकों को समृद्ध कर सकते हैं। हम विभिन्न प्रकार की सेल लाइनों, ऊतक प्रकारों और जीवों में नए उम्मीदवार पीपीपी इंटरएक्टर्स की पहचान करने में भी सक्षम हैं।

पीआईबी-एमएस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें अनदेखा नहीं किया जाना चाहिए। इनमें उचित नियंत्रण और प्रतिकृतियों का समावेश, सभी नमूनों में प्रोटीन की समान मात्रा का इनपुट, नमूना तैयार करने के दौरान गैर-विकृतीकरण स्थितियों का रखरखाव, पीआईबी के साथ नमूने की इनक्यूबेशन और पीआईबी की धुलाई शामिल है। नियंत्रण और प्रतिकृतियों के संबंध में, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक नमूने का आधा हिस्सा पीपीपी अवरोधक के साथ इलाज किया जाता है यदि लक्ष्य उपन्यास पीपीपी सबयूनिट्स और इंटरएक्टर्स की पहचान करना है। यह विशिष्ट और गैर-विशिष्ट पीआईबी इंटरैक्टर्स के बीच अंतर करने के लिए आवश्यक है। यदि यह पहचानने की कोशिश है कि ज्ञात पीपीपी सबयूनिट या पीपीपी इंटरैक्टर अभिव्यक्ति सेल या ऊतक प्रकारों और सेल चक्र चरणों में या विभिन्न दवा उपचारों पर कैसे बदलती है, तो तुलना के लिए ज्ञात पीपीपी सबयूनिट्स और इंटरएक्टर्स की एक सूची तैयार करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, ये प्रयोग आमतौर पर सांख्यिकीय आत्मविश्वास सुनिश्चित करने के लिए जैविक ट्रिप्लिकेट में किए जाते हैं। नमूनों में डेटा प्रजनन क्षमता के लिए प्रति नमूना समान प्रोटीन इनपुट आवश्यक है; यह भी सुनिश्चित करता है कि पीपीपी सबयूनिट या इंटरैक्टर बहुतायत में अंतर केवल प्रोटीन इनपुट में अंतर के कारण नहीं है। प्रत्येक नमूने में प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए बीसीए जैसे प्रोटीन परख का उपयोग किया जाना चाहिए। अंत में, नमूना तैयारी, पीआईबी संवर्धन और पीआईबी धोने में गैर-विकृतीकरण की स्थिति यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन अपने मूल राज्य में रहें। यह पीपीपी सबयूनिट इंटरैक्शन को संरक्षित करता है।

पीआईबी-एमएस पीपीपीओम से पूछताछ करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, फिर भी यह कई सीमाओं के साथ आता है। पीआईबी पीपी 1, पीपी 2 ए, पीपी 4, पीपी 5 और पीपी 6 के उत्प्रेरक और गैर-उत्प्रेरक घटकों के लिए समृद्ध हो सकते हैं, लेकिन पीपी 2 बी या पीपी 7 नहीं, क्योंकि एमसीएलआर नैनोमोलर सांद्रता में इन फॉस्फेटेस को बाधित नहीं करता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह उपकरण अंतर्जात, एमसीएलआर-संवेदनशील पीपीपी होलोनजाइम्स की पहचान और मात्रा का ठहराव करने में आसानी के लिए अनुकूल है, जैसे कि नोट किए गए। पीआईबी-एमएस पीपीपी होलोएंजाइम्स का पता लगाने में असमर्थ है जो अंतर्जात पीपीपी अवरोधकों द्वारा बाधित होते हैं जो पीपीपी सक्रिय साइट को अवरुद्ध करते हैं, जैसे कि α4 और एसईटी14। इस तकनीक को टैग किए गए पीपीपी सबयूनिट्स की बहिर्जात अभिव्यक्ति या पीपीपी-विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग की आवश्यकता नहीं है। सेफरोज-आधारित मैट्रिक्स का उपयोग करके अन्य आत्मीयता संवर्धन रणनीतियों की तरह, पीआईबी-एमएस गैर-विशिष्ट प्रोटीन के बंधन के लिए प्रवण है। हालांकि, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में मुक्त एमसीएलआर के अलावा गैर-विशिष्ट इंटरएक्टर्स से विशिष्ट को अलग करने की अनुमति देता है, जिससे नए पीपीपी सबयूनिट्स की पहचान और इंटरैक्टिंग प्रोटीन की पहचान हो सकती है। इसके अलावा, गैर-विशिष्ट इंटरएक्टर्स को अतिरिक्त वॉश और पीआईबी की उचित मात्रा के सावधानीपूर्वक उपयोग के माध्यम से कम किया जा सकता है।

हमने स्तन कैंसर और ग्लियोब्लास्टोमा 14 सहित विभिन्न कैंसर सेल लाइनों के पीपीपी अभिव्यक्ति पैटर्न की तुलना करने के लिए पीआईबी-एमएस को नियोजितकिया है। हमने पाया कि इन कैंसर प्रकारों में अद्वितीय पीपीपी अभिव्यक्ति पैटर्न हैं जो उनकी उत्पत्ति का संकेतदेते हैं 14. पीपीपी सबसे संरक्षित एंजाइमों में से हैं 2,3. हम यह प्रदर्शित करने में सक्षम थे कि पीआईबी-एमएस खमीर और माउस ऊतकों में पीपीपीओम का विश्लेषण करने में प्रभावी है14. पीआईबी-एमएस का उपयोग विभिन्न स्थितियों के तहत पीपीपी अभिव्यक्ति पैटर्न में अंतर की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि इंटरफेज़ बनाम माइटोटिक नमूने15. इस प्रकार, पीआईबी-एमएस फॉस्फोप्रोटीन फॉस्फेट नेटवर्क में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और कई सेल लाइनों और रोग राज्यों के साथ-साथ दवा उपचार पर पीपीपी विनियमन की हमारी समझ का विस्तार करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास प्रकट करने के लिए कुछ भी नहीं है और हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एएनके एनआईएच आर 33 सीए 225458 और आर 35 जीएम 11 9 455 से समर्थन स्वीकार करता है। हम उनकी उपयोगी चर्चा के लिए केटेनबैक और गेरबर प्रयोगशालाओं को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN) Honeywell AH015-4 CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Anhydrous Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-100ML CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Benchtop centrifuge Eppendorf model no. 5424
Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate Acros Organics 410991000
Centrifuge Eppendorf model no. 5810 R 15 amp version
Distilled water
DMSO Fisher Scientific BP231-100
Dounce tissue grinder Fisherbrand Pellet Pestles 12-141-363
Empore solid phase extraction disk, C18 CDS Analytical 76333-132
Eppendorf tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363204 CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.
Eppendorf tubes, 2 mL Eppendorf 22363352 CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.
Extraction plate manifold Waters WAT097944
Falcon tubes, 50 mL VWR 21008
Generic blunt end needle and plunger
Generic magnetic separation rack
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen chloride (HCl) VWR Chemicals BDH BDH3028 CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.
Hydroxylamine solution 50% (wt/vol) Sigma-Aldrich 467804
Incubator, 65 °C VWR model no. 1380FM
Koptec Pure Ethanol, 200 Proof Decon Labs V1001
Methanol for HPLC (MeOH) Sigma-Aldrich 34860-4L-R CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Microcystin LR (MCLR) Cayman Chemical 10007188 CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.
PBS, 1× without calcium and magnesium, pH 7.4 ± 0.1 Corning  21-040-CV
pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers Fisher Scientific M1095310001
PIBs For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pipette tips, 10 μL Eppendorf 22491504 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
Pipette tips, 1000 μL Eppendorf 22491555 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
Pipette tips, 200 μL Eppendorf 22491539 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
plastic syringe, 10 mL BD 309604
Protease inhibitor cocktail III Research Products International P50700-1
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer  Thermo Scientific
Refrigerated benchtop centrifuge Eppendorf model no. 5424 R
Rotator (Labquake Shaker Rotisserie) Thermo Scientific 13-687-12Q 8 rpm rotation
Sample collection plate, 96- well, 1 mL Waters WAT058957
SDS Fisher Scientific BP1311-1
Sequencing grade modified trypsin Promega V511C
Sodium azide EMD Chemicals SX0299-1 CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.
Sodium chloride (NaCl) Fisher Chemical S27110
Sonicator (Branson digital sonifier) model no. SFX 250
SPE C18 desalting plate Waters 186001828BA
SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads) Cytiva 6.51521E+13
Thermomixer Eppendorf model no. 5350
TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 × 0.8 mg per tag ThermoFisher A37725
Trifluoroacetic acid (TFA) Honeywell T6508-25ML CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.
Tris Base Research Products International T60040
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Vacuum centrifuge and vapor trap Thermo Scientific model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105
Vortexer (Vortex-Genie 2) Scientific Industries
Water LC-MS Honeywell LC365-4

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References

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फॉस्फोप्रोटीन फॉस्फेटेस और उनके इंटरैक्टर्स की पहचान करने के लिए एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित दृष्टिकोण
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Smolen, K. A., Kettenbach, A. N. A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors. J. Vis. Exp. (182), e63805, doi:10.3791/63805 (2022).

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