Summary
Här presenterar vi ett protokoll för anrikning av endogena fosfoproteinfosfataser och deras interagerande proteiner från celler och vävnader och deras identifiering och kvantifiering genom masspektrometribaserad proteomik.
Abstract
De flesta cellulära processer regleras av dynamisk proteinfosforylering. Mer än tre fjärdedelar av proteinerna fosforyleras och fosfoproteinfosfataser (PPP) samordnar över 90% av all cellulär serin/ treonin defosforylering. Avreglering av proteinfosforylering har varit inblandad i patofysiologin för olika sjukdomar, inklusive cancer och neurodegeneration. Trots sin utbredda aktivitet är de molekylära mekanismer som styr växtskyddsmedel och de som kontrolleras av växtskyddsmedel dåligt karakteriserade. Här beskrivs ett proteomiskt tillvägagångssätt som kallas fosfatasinhibitorpärlor och masspektrometri (PIB-MS) för att identifiera och kvantifiera PPP, deras posttranslationella modifieringar och deras interagerare på så lite som 12 timmar med hjälp av någon cellinje eller vävnad. PIB-MS använder en icke-selektiv PPP-hämmare, mikrocystin-LR (MCLR), immobiliserad på sepharospärlor för att fånga och berika endogena PPP och deras associerade proteiner (kallad PPPome). Denna metod kräver inte exogent uttryck av märkta versioner av växtskyddsmedel eller användning av specifika antikroppar. PIB-MS erbjuder ett innovativt sätt att studera de evolutionärt bevarade PPP:erna och utöka vår nuvarande förståelse av defosforyleringssignalering.
Introduction
Proteinfosforylering styr de flesta cellulära processer, inklusive men inte begränsat till svaret på DNA-skador, tillväxtfaktorsignalering och passagen genom mitos 1,2,3. I däggdjursceller fosforyleras majoriteten av proteinerna vid en eller flera serin-, treonin- eller tyrosinrester vid någon tidpunkt, med fosfoseriner och fosfotreoniner som utgör cirka 98% av alla fosforyleringsställen 2,3. Medan kinaser har studerats omfattande inom cellulär signalering, är PPP: s roll i regleringen av dynamiska cellulära processer fortfarande framväxande.
Fosforyleringsdynamiken styrs av det dynamiska samspelet mellan kinaser och fosfataser. I däggdjursceller finns det mer än 400 proteinkinaser som katalyserar serin / treoninfosforylering. Över 90% av dessa platser defosforyleras av fosfoproteinfosfataser (PPP), en liten familj av enzymer som består av PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT och PPZ 2,3. PP1 och PP2A är ansvariga för majoriteten av fosfoserin och fosfotreonin defosforylering inom en cell 2,3,4. Den anmärkningsvärda skillnaden i antal mellan kinaser och fosfataser och bristen på specificitet hos PPP-katalytiska subenheter in vitro ledde till tron att kinaser är den viktigaste determinanten för fosforylering 2,3. Emellertid, flera studier har visat fosfataser för att fastställa substratspecificitet genom bildandet av multimera holoenzymer 5,6,7,8,9. Till exempel är PP1 en heterodimer som består av en katalytisk underenhet och vid en given tidpunkt en av de mer än 150 reglerande underenheterna 6,7,8. Omvänt är PP2A en heterotrimer som bildas av en byggnadsställning (A), en reglerande (B) och en katalytisk (C) underenhet 2,3,9. Det finns fyra distinkta familjer av PP2A-regulatoriska underenheter (B55, B56, PR72 och striatin), var och en med flera gener, skarvvarianter och lokaliseringsmönster 2,3,9. Offentlig-privata partnerskapens multimeriska karaktär fyller gapet i antalet kinaser och PPP-katalytiska underenheter. Det skapar dock analytiska utmaningar för att studera PPP-signalering. För att omfattande analysera PPP-signalering är det viktigt att undersöka de olika holoenzymerna i en cell eller vävnad. Stora framsteg har gjorts för att studera det mänskliga släktomet genom användning av kinashämmare pärlor, kallade multiplexhämmare pärlor eller kinobeads, en kemisk proteomisk strategi där kinashämmare immobiliseras på pärlor och masspektrometri används för att identifiera berikade kinaser och deras interagerare 10,11,12,13.
Vi har etablerat ett liknande tillvägagångssätt för att studera PPP-biologi. Denna teknik involverar affinitetsfångst av PPP-katalytiska underenheter med användning av pärlor med en immobiliserad, icke-selektiv PPP-hämmare som kallas mikrocystin-LR (MCLR) som kallas fosfatashämmarepärlor (PIBs)14,15. Till skillnad från andra metoder som kräver endogen märkning eller uttryck av exogena PPP-underenheter som kan förändra proteinaktivitet eller lokalisering, möjliggör PIB-MS anrikning av endogena PPP-katalytiska underenheter, deras associerade reglerande och byggnadsställningar och interagerande proteiner (kallat PPPome) från celler och vävnader vid en given tidpunkt eller under specifika behandlingsförhållanden. MCLR hämmar PP1, PP2A, PP4-6, PPT och PPZ vid nanomolära koncentrationer, vilket gör PIBs mycket effektiva vid anrikning för PPPome16. Denna metod kan skalas för användning på vilket utgångsmaterial som helst från celler till kliniska prover. Här beskriver vi i detalj användningen av PIB och masspektrometri (PIB-MS) för att effektivt fånga, identifiera och kvantifiera det endogena PPPome och dess modifieringstillstånd.
Bild 1: Visuell sammanfattning av PIB-MS-protokollet. I ett PIB-MS-experiment kan prover erhållas i olika former, från celler till tumörer. Provet samlas in, lyseras och homogeniseras före PPP-anrikning. För att berika för PPP inkuberas lysaten med PIBs med eller utan en PPP-hämmare, såsom MCLR. PDB tvättas sedan och växtskyddsmedel elueras under denatureringsförhållanden. Proverna bereds för masspektrometrianalys genom avlägsnande av tvättmedel genom SP3-proteinanrikning, tryptisk matsmältning och avsaltning. Prover kan sedan valfritt TMT-märkas före masspektrometrianalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
PIB-MS involverar lys och förtydligande av celler eller vävnader, inkubation av lysaten med PIBs, eluering och analys av eluatet via western blotting eller masspektrometribaserade metoder (Figur 1). Tillägget av fri MCLR kan användas som en kontroll för att skilja specifika PIB-bindemedel från icke-specifika interagerare. För de flesta applikationer kan ett etikettfritt tillvägagångssätt användas för att direkt identifiera proteiner i eluater. I de fall där större precision i kvantifieringen eller identifieringen av arter med låg förekomst behövs, kan ytterligare bearbetning med tandem-masstagg (TMT) -märkning användas för att öka täckningen och minska inmatningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Genereringen av PIBs görs enligt beskrivningen av Moorhead et al., där 1 mg mikrocystin och cirka 6 ml sepharos är kopplade för att generera PIBs med en bindningskapacitet på upp till 5 mg / ml17.
1. Beredning av prover
OBS: En typisk utgångsmängd för PIB-MS är 1 mg totalt protein per tillstånd. För detta experiment användes cirka 2,5 x 106 HeLa-celler för att extrahera 1 mg protein. Denna beräkning bör utföras för varje cellinje eller vävnad som används i ett experiment18. Om provet är begränsat och 1 mg inte kan erhållas kan mängden insats minskas med en mindre förlust av PPP-underenhetsdetektering. Alternativt kan TMT-märkning användas för att tillåta blandning av alla förhållanden i ett prov, vilket ökar detektionskänsligheten som visas i steg 9.
- Samla vävnadsprover eller cellpellets. För cellpellets, samla upp celler genom centrifugering vid 277 x g i 2 minuter vid rumstemperatur (RT), ta bort media och tvätta cellerna med 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Cellpellets kan förvaras vid -80 °C i flera månader.
- Förbered lysbuffert (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5% Triton X-100 (vol / vol), 5 mM beta-glycerofosforsyra dinatriumsalt pentahydrat, 1:500 (vol / vol) proteashämmare cocktail III) och håll på is. Gör tillräckligt för att lysera och tvätta alla prover. Om du börjar med 1 mg protein per tillstånd, gör cirka 3 ml buffert per prov för lys och tvättar.
OBS: Lysbufferten som noteras i detta steg är en mild tvättmedelslösning, som kanske inte är tillräcklig för att solubilisera olösliga membran eller cytoskelettassocierade proteiner. Andra tvättmedel kan undersökas för att förbättra lösligheten. Ett intervall av NaCl- och Triton-X-100-koncentrationer testades, och ovanstående koncentrationer visade sig vara optimala för låg bakgrund och hög fosfatasunderenhetsbindning. - Tillsätt kyld lysbuffert till proverna. För lys av 1 mg protein, använd 1 ml buffert. Om provet är fryst, tillsätt lysbuffert och låt provet tina på is i bufferten.
- För celler, homogenisera proverna via sonifiering och håll cellerna på is mellan pulser. Ultraljudsbehandling proverna vid 15% amplitud med tre 15 s pulser. Detta kan variera beroende på den soniker som används (se materialtabell).
- För vävnader, homogenisera proverna först med hjälp av en Dounce vävnadskvarn för att mala vävnaden tills den är flytande innan ultraljudsbehandling enligt beskrivningen i steg 1.3.1.
- Klarlägg det homogeniserade provet av olösligt skräp genom centrifugering vid 21,130 x g i 15 minuter vid 4 °C. Sedan, utan att störa de bildade pellets eller lipider som har samlats på sidan av rören, överför lysaterna till nya rör. Avlägsna 100 μl av föranrikningsprovet av den klarade lysaten om så önskas och förvara vid -20 °C. Var noga med att hålla lysaterna på is.
- Bestäm det totala proteininnehållet i varje prov genom att utföra en proteinkvantifieringsanalys, såsom en bicinchonininsyraanalys (BCA), på en liten alikvot av varje prov, enligt tillverkarens instruktioner. Se till att lysaterna hålls på is under BCA-analysen.
- Efter att ha utfört BCA-analysen, överför en motsvarande mängd protein till nya rör och späd med lysbuffert för att säkerställa att varje rör har samma koncentration av protein (t.ex. 1 mg / ml). Om experimentet kräver en PPP-hämmare, förbered två alikvoter av varje prov som har samma proteininnehåll och fortsätt till steg 1.7. Om PPP-hämmare inte behövs går du vidare till steg 2. Se till att proverna förvaras på is.
OBS: Det är viktigt att lika proteinkoncentrationer används per tillstånd i en PIB-MS-analys. PPP-hämmare kontroller används för att skilja specifika bindemedel till PIBs från den icke-specifika bakgrunden. - För PPP-hämmarkontrollen, behandla ett prov med fri MCLR (1 μM) och det andra med en lika stor volym DMSO som en kontroll. Virvla proverna försiktigt och inkubera dem på is i 15 min.
OBS: MCLR-behandling av lysaterna blockerar bindningen av PPP-katalytiska underenheter men inte proteiner som binder icke-specifikt till PIBs i proverna. Var försiktig när du hanterar MCLR eftersom det är giftigt. Se försiktighetsåtgärder vid hantering i materialförteckningen.
2. Beredning av PIBs
- Fastställ mängden PIBs som behövs för experimentet. För 1 mg protein kan 1-3 μg växtskyddsmedel och interagerande proteiner erhållas; Använd minst 10 μl fast PIBs-harts per prov för att minimera förlusten av pärlor. Bindningskapaciteten för PIB är 3-5 mg / ml14,17.
- Överför lämplig mängd PIB till ett 1,5 ml rör och tvätta dem 3x med 0,5 ml lysbuffert genom att försiktigt virvla och sedan centrifugera vid 376 x g i 30 s vid RT mellan tvättarna. Undvik att pipettera upp pärlorna när du tar bort lysbufferten mellan tvättarna.
- Gör en 50% PIB / buffertlösning (vol / vol) genom att tillsätta en lämplig mängd lysbuffert till de tvättade PIB: erna. Pipettera försiktigt upp och ner och virvla pipettspetsen i uppslamningen för att återsuspendera PIBs.
- Överför 20 μl av flytgödseln till ett nytt 1,5 ml rör som redan innehåller 0,5 ml lysbuffert. Lysbufferten i röret hjälper till att driva ut pärlorna från pipetspetsen. Gör detta tills det finns tillräckligt med rör som innehåller lika många PIBs för varje prov.
- Snurra rören på 376 x g i 30 s vid RT. Se till att alla rör innehåller lika mycket pärlharts. Kassera eventuell supernatant och lämna endast fast harts och högst 50 μl lysbuffert i varje rör.
3. Inkubation av PIBs med lysater
- Överför lysaterna från steg 1.6. eller steg 1.7. till det lämpligt märkta röret som innehåller PIB från steg 2. Vrid lysaten vid 8 rpm med PIBs i 1 timme vid 4 °C.
4. Tvätt av PIBs
- Centrifugera PGB vid 376 x g i 30 s vid 4 °C för att samla upp pärlorna. Ta bort och kassera supernatanten och spara en alikvot på 100 μL för analys efter anrikning, om så önskas.
- Tvätta PIBs 3x genom att tillsätta 0,5 ml lysbuffert till pärlorna, invertera rören (virvel rekommenderas inte), samla pärlorna genom centrifugering vid 376 x g i 30 s vid 4 ° C och ta bort lysbufferten från de sedimenterade pärlorna, var försiktig så att du inte stör pärlpelleten.
5. Utlöjtande av offentlig-privata partnerskap från de utbetalande organen
- Efter den sista tvätten, ta bort så mycket av lysbufferten som möjligt utan att pipettera upp någon av PIB: erna. Gör elueringsbuffert som innehåller 2% SDS (vol/vol) och eluera PPP från PIBs genom att lägga till tillräckligt med volym elueringsbuffert för att vara 4x-5x volymen PIBs. Om till exempel 10 μl PIB används, använd 50 μL elueringsbuffert. Inkubera PGB med elueringsbufferten vid 65 °C i 1 timme för att eluera PPP från PIB.
- Efter eluering, samla eluatet genom att centrifugera rören vid 376 x g i 30 s vid RT och pipettera eluatet i ett separat rör, var försiktig så att du inte överför några PIBs. Använd eluatet för western blot-analys eller för masspektrometrianalyser. Eluates kan förvaras vid -20 °C i upp till flera månader.
- För att regenerera PIB: erna för vidare användning, inkubera pärlorna i 2% SDS (vol / vol) och rotera vid 8 rpm vid RT i 1 timme. Tvätta dem 3x-5x i 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) med rotation i 30 min per tvätt. Efter alla tvättar, förvara PIBs i 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) lagringsbuffert med natriumazid (0,05% vikt / vol).
- Analysera eluaterna med western blotting eller masspektrometri. Masspektrometrianalysen av PIB-eluater beskrivs nedan.
6. Avlägsnande av tvättmedel
OBS: Olika metoder kan användas för att ta bort tvättmedel från eluatprover för MS-analys. Vi fann att enpott, fastfasförstärkt provberedning (SP3), beskriven av Hughes et al., fungerar bra19.
- Tillsätt 0,5 μl SP3-pärlor till 50 μl eluat från steg 5.2 ovan. Använd SP3-pärlor i förhållandet 10:1 (μg:μg) eller minst 0,5 μg/μl (stamlösningen är 50 μg/μl). Virvla försiktigt pärlorna och eluera.
- Tillsätt en elueringsvolym på 100 % etanol till pärl-eluatblandningen (t.ex. om 50 μl av eluatet användes, använd 50 μl 100 % etanol). Inkubera proverna i 5 minuter i en termomixer inställd på att skaka vid 1000 rpm vid 24 °C.
- För att samla alla pärlor, placera dem i ett magnetiskt rörställ. När pärlorna har samlats, kassera supernatanten och tvätta pärlorna med 0,5 ml 80% etanol (vol / vol) 3x. För tvätt, återsuspendera pärlorna genom virvel, samla pärlorna genom att placera dem i magnetrörstället och kassera supernatanten mellan tvättarna.
- Tvätta pärlorna en gång till med 0,5 ml 100 % acetonitril (ACN) för att ta bort alla spår av etanol och ta bort så mycket ACN som möjligt.
7. Digestion av proteiner
- Gör en 1:100 utspädning av trypsin (slutlig koncentration av 0,004 μg / μL) i 166 mM HEPES (pH 8,5) och tillsätt 30 μL av denna trypsinlösning till varje rör med pärlorna, återsuspering genom virvel.
- Inkubera SP3-trypsinpärlblandningen i termomixern vid 1000 rpm vid 37 °C i 5 timmar eller över natten vid 30 °C. Placera rören i magnetstället för att samla pärlorna och ta bort smältningen till nya rör.
- För etikettfri analys, släck reaktionen genom att tillsätta 20% trifluorättiksyra (TFA) (vol / vol) till en slutlig koncentration av 0,2% TFA (vol / vol). Kontrollera att pH-värdet för varje prov är mellan 2-3 med ett pH-papper. Om inte, lägg till små ytterligare alikvoter på 20% TFA tills detta uppnås. Proverna skall surgöras på lämpligt sätt före avsaltning. Fortsätt till steg 8.
- För TMT-märkning av proverna, surgör inte och fortsätt till steg 9.
8. Avsalta matsmältningen
- Förbered en stegspets för varje prov genom att packa en 200 μl MS-lösningsmedelskompatibel spets med C18-harts enligt beskrivningen i Rappsilber et al.20. Använd en trubbig nål för att trycka på två C18-materialskivor, så att skivorna sitter kvar i nålen. Överför skivorna till den MS-lösningsmedelskompatibla spetsen med en tunn trådkolv för att driva ut skivorna från nålen.
OBS: Det är viktigt att använda MS-lösningsmedelskompatibla tips från denna punkt i protokollet eftersom andra pipetspetsar kan läcka ut kemikalier i proverna som kan detekteras via masspektrometri. - Balansera varje stegspets med 30 μL 100% MeOH, sedan med 30 μL 60% MeOH (vol / vol), följt av 30 μL 0,1% TFA (vol / vol). Tryck varje lösning genom scenspetsen med en spruta. Fäst en pipettspets i slutet av en spruta med en transparent film för att öka kontakten mellan sprutan och scenspetsen om det behövs. Var noga med att aldrig låta C18-materialet inuti scenspetsen bli torrt.
- Tillsätt surgjord peptidsmältning från steg 7.3 till den märkta stegspetsen och tryck igenom scenspetsen med en spruta, var återigen försiktig så att du inte låter scenspetsen bli helt torr.
- Tvätta varje prov 2x med 30 μL 0,1% TFA (vol/vol). Elue peptiderna från varje stegspets genom att tillsätta 30 μL 60% MeOH (vol / vol) till varje stegspets och utvisa allt från spetsen med spruttryck i ett nytt, märkt rör. Detta är det enda steget där C18-materialet är helt torkat.
- Torka varje prov genom vakuumcentrifugering. Torkade peptider kan förvaras vid -20 °C i flera månader. Proverna är nu klara för etikettfri masspektrometrianalys. Använd endast hälften av provet för analys på masspektrometern och den andra hälften för återinjektion om det behövs. Se till att en lämplig masspektrometermetod används för analys.
9. TMT-märkning
OBS: Tandem-masstaggmärkning används för att multiplexa prover för kvantitativ analys. En 0,8 mg injektionsflaska med TMT-reagens är tillräcklig för märkning av upp till 0,8 mg protein21. I ett PIB-pulldown-experiment som börjar med 1 mg protein erhålls 1-3 μg fosfoproteinunderenheter. Protokollet nedan är optimalt för upp till 10 μg protein.
- Rekonstituera en 0,8 mg injektionsflaska med TMT-reagens i 80 μL vattenfritt ACN.
- Märk varje prov från steg 7.4 med en annan TMT-etikett för upp till 18 kanaler. Var noga med att notera vilken TMT-etikett som läggs till i varje prov. Tillsätt 2 μl av TMT-reagenset och 2 μl ACN till peptidrötningen, virveln försiktigt för att blanda, centrifugera vid 376 x g i 30 s vid RT för att samla upp provet och inkubera vid RT i 1 timme för att märka provet.
- För att testa TMT-märkningseffektiviteten, gör ett etikettkontrollprov genom att kombinera 1 μL av varje märkningsreaktion i ett 0,5 ml rör innehållande 9 μl LC-MS-vatten och 1 μl 10% hydroxilamin (vol / vol) för att släcka reaktionen. Placera de återstående outsläckta märkta proverna i en frys på -80 °C. Prover kan lagras i flera dagar medan märkningseffektiviteten utvärderas.
- Surgör TMT-etikettkontrollprovet genom att tillsätta 30 μl 0,1% TFA (vol / vol). Kontrollera att pH är mellan 2-3. Om inte, tillsätt 20% TFA (vol / vol) tills detta pH uppnås. Avsalta etikettkontrollprovet via stegtippning, enligt beskrivningen i steg 8.1.-8.5.
- Analysera TMT-etikettkontrollprovet på masspektrometern för att utvärdera märkningseffektiviteten. Filtrera sökresultaten till en 1% falsk upptäcktsfrekvens (FDR) på peptidnivå och bestäm märkningseffektiviteten21,22.
- Helt TMT-märkta peptider har TMT-reagens vid N-terminalen och vid alla lysiner. Kvantifiera TMT-reporterns jonintensiteter och jämför deras totala summa över alla kanaler. Provet är tillräckligt märkt när >95% av alla peptider är märkta och TMT-reporterjonsummassesiteterna är jämförbara
OBS: Förutom ofullständig märkning kan skillnader i summerade TMT-reporterjonintensiteter vara resultatet av felaktig pipettering av 1 μL-testprovet. Det kan också återspegla en sann biologisk observation, i vilket fall alla replikat bör visa samma beteende. - Ta bort de osläckta proverna från -80 °C förvaring och tina dem. Om de inte är helt märkta, tillsätt 1 μl av lämpligt TMT-reagens till provet enligt ovan, inkubera i 1 timme och upprepa TMT-etikettkontrollen. Om proverna är helt märkta fortsätter du till steg 9.8.
- När den är helt märkt, tillsätt 2 μL 10% hydroxylamin (vol / vol) till TMT-reaktionerna för att släcka märkningen. Inkubera proverna vid RUMSTEMPERATUR i 15 minuter. När proverna har släckts kan de förvaras vid -80 °C i flera månader.
- Kombinera alla släckta TMT-kanaler och tillsätt 2 μL 20% TFA (vol/vol) för att surgöra reaktionen. Kontrollera pH för den kombinerade reaktionen och se till att den ligger mellan pH 2-3. Om inte, tillsätt små alikvoter på 20% TFA tills önskat pH uppnås. Detta är avgörande för korrekt avsaltning.
- Avlägsna ACN genom vakuumcentrifugering i 30 min och avsalta provet enligt beskrivningen nedan.
10. Avsaltning av det TMT-märkta kombinerade provet
- Använd en SPE C18-avsaltningsplatta med lämplig proteinkapacitet (2 mg sorbent är vanligtvis tillräckligt för denna applikation) för att avsalta det kombinerade TMT-reagenset. Balansera brunnen med 200 μl 60% MeOH (vol/vol) och 200 μL 10% MeOH/0,1% TFA (vol/vol).
- Ladda de surgjorda TMT-märkta peptiderna från steg 9.10. på avsaltningsplattan. Tvätta provbrunnarna 2x med 200 μL 10% MeOH/0,1% TFA (vol/vol).
- Elue peptiderna med 100 μL 60% MeOH (vol/vol). Torka proverna genom vakuumcentrifugering. Det torkade, TMT-märkta provet kan förvaras vid -80 °C i flera månader.
- För masspektrometrianalys av det TMT-märkta provet, injicera hälften av provet och spara den andra halvan om återinjektion krävs.
OBS: Injektionsmängderna på masspektrometrin varierar beroende på den specifika kolonnen, instrumentinställningen och provtypen.
11. Analys av data
METODER för datafiltrering och analys varierar och ligger utanför tillämpningsområdet för detta protokoll, men följande anmärkningar om analys ingår för att ge vägledning som är specifik för den typ av data som härrör från detta protokoll.
- Sök råa masspektrometridata mot en artspecifik proteomdatabas baserat på ursprunget för de provceller eller vävnader som används. Här användes Comet som sökalgoritm23.
- Filtrera sökresultaten med 1 % FDR genom att justera de sökalgoritmspecifika parametrarna22. För etikettfri kvantifiering, använd MS1-toppareamätningar för att kvantifiera data. För TMT-märkta prover, använd MSn-härledda reporterjonintensiteter för kvantifiering. För statistisk signifikans, analysera proverna i biologiska tredubblar.
- För att de novo identifiera PPP-underenheter och deras interagerare, se till att tredubbla biologiska prover av MCLR-inhiberade och DMSO-behandlade prover jämförs. För att jämföra PPPome under olika förhållanden eller vid läkemedelsbehandling, se till att biologiska tredubblingar av varje tillstånd eller läkemedelsbehandling genererades.
- Filtrera data så att endast proteiner med ett totalt peptidantal >1 i minst två av tre DMSO-kontrollbehandlade prover finns. MCLR-konkurrens konkurrerar inte alltid med all katalytisk underenhetsbindning. Vissa PPP-katalytiska underenheter kan också icke-specifikt hålla fast vid sepharoshartset. För att ta hänsyn till endera möjligheten när du filtrerar bort proteiner som icke-specifikt binder till hartset, ta bort proteiner med ett totalt peptidantal i det MCLR-behandlade tillståndet högre än för någon PPP-katalytisk underenhet.
- Uteslut vanliga föroreningar, såsom keratin, kollagen, 40S och 60S ribosomala proteiner och heterogena nukleära ribonukleoproteiner som inte är PPP-underenheter, från analysen14.
- Importera filtrerade data till Perseus genom att klicka på Generic Matrix Upload i avsnittet Load24,25. Log2 transformerar data genom att gå till Basic > Transform, välja data och ange transformeringsfunktionen, i det här fallet log2(x).
- Impute saknade värden från en normalfördelning genom att gå till Imputation > Ersätt saknade värden från normalfördelning, välja data och ange bredden (standard 0.3) och nedförskjutningen (standard 1.8) för beräkningen. Utför kvantil normalisering genom att gå till Normalisera > Kvantil normalisering.
- Beräkna log2-förhållanden och Students T-test p-värden för respektive villkor. Kommentera först data genom att gå till Anteckningar rader > Kategoriska anteckningsrader. Utför T-testet genom att gå till Tester > Tvåprovstester och välja de grupper som ska jämföras, testet som ska utföras och metoden för korrigering av flera hypotestester som används för trunkering.
OBS: För de novo-identifiering anses ett protein vara ett PPP-interagerande protein om dess överflöd är statistiskt signifikant i det MCLR-behandlade kontra DMSO-tillståndet, med en log2-faldig förändring som är större än den minsta vikförändringen för någon specifikt bunden känd PPP-underenhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2: Identifiering av specifika PIBs-bindemedel. HeLa-celler i biologiskt tre exemplar behandlades antingen med DMSO eller PPP-hämmaren MCLR, inkuberades med PIB och analyserades via LC-MS/MS. (B) Vulkandiagram för PIB-MS-analys i DMSO och MCLR-behandlade HeLa-celllysater, med specifika PIB-bindemedel visade i rött. PPP-katalytiska underenheter är märkta och visas i blått. Nya kandidat-PPP-underenheter eller interagerande proteiner visas i svart. Ospecifika bindemedel visas i grått. (C) Spridningsdiagram över log2-arean av två biologiska replikat från HeLa-celllysater behandlade med DMSO för att visa anrikningens reproducerbarhet. Specifika bindemedel till PIBs visas i rött. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Nätverksanalys av alla PPP-underenheter och PPP-interagerande proteiner identifierade i HeLa-celler. Dessa proteiner visade sig vara specifika PIB-interagerare i HeLa PIB-dragning med och utan MCLR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att demonstrera pibs prestanda utförde vi ett PIB-pulldown-experiment i HeLa-celler för att identifiera PPP och deras interagerare (figur 2A). HeLa-celler odlades i biologiskt tre exemplar och lyserades. Varje tredubbel lysat delades i hälften, där hälften behandlades med MCLR i 15 minuter för att förhindra bindning av PPP-katalytiska subenheter eller DMSO innan PIB-anrikning utfördes. Efter PIB-anrikning utfördes en etikettfri jämförelse av mängden proteiner som kvantifierats i de DMSO-behandlade och MCLR-behandlade proverna för att skilja specifika från icke-specifika interagerare (figur 2B). I analysen upptäckte vi alla MCLR-känsliga PPP-katalytiska underenheter PP1ca, PP1cb, PP1cc, PP2Aca, PP2Acb, PP4c, PP5c och PP6c. I de DMSO-behandlade proverna var förekomsterna (log2-områden med proteinkvantifiering) starkt korrelerade, vilket indikerar reproducerbarhet (figur 2C), men vid behandling med MCLR reducerades den PPP-katalytiska underenheten eller PPP-interagerande proteinöverflödet i PIB-pulldowns kraftigt (figur 2B). I denna analys identifierade vi 92 PPP-underenheter och specifika PPP-interagerare (se tilläggstabell 1), vilket är jämförbart med en tidigare PIB-MS-analys i HeLa-celler14 (figur 3).
Kompletterande tabell 1: MS-data från representativ PIB-MS-analys. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PIB-MS är en kemisk proteomikmetod som används för att kvantitativt profilera PPPome från olika provkällor i en enda analys. Mycket arbete har gjorts med hjälp av kinashämmare pärlor för att studera kinomet och hur det förändras i cancer och andra sjukdomstillstånd 10,11,12,13. Ändå ligger studien av PPPome bakom. Vi förväntar oss att detta tillvägagångssätt kan fylla detta gap och belysa regleringen av cellulär defosforylering. Här visar vi att vi med hjälp av PIBs kan berika katalytiska och icke-katalytiska komponenter i PP1, PP2A, PP4, PP5 och PP6. Vi kan också identifiera nya kandidat-PPP-interagerare i en mängd olika cellinjer, vävnadstyper och organismer.
Det finns flera kritiska steg i PIB-MS-protokollet som inte bör förbises. Dessa inkluderar införlivande av lämpliga kontroller och replikat, tillförsel av lika stora mängder protein i alla prover, upprätthållande av icke-denatureringsförhållanden under provberedningen, inkubation av provet med PIBs och tvättning av PIBs. När det gäller kontroller och replikat är det viktigt att hälften av varje prov behandlas med en PPP-hämmare om målet är att identifiera nya PPP-underenheter och interagerare. Detta krävs för att skilja mellan specifika och icke-specifika PIB-interagerare. Om man försöker identifiera hur känt PPP-underenhets- eller PPP-interaktionsuttryck förändras över cell- eller vävnadstyper och cellcykelfaser, eller vid olika läkemedelsbehandlingar, är det viktigt att kurera en lista över kända PPP-underenheter och interagerare för jämförelse. Dessutom görs dessa experiment vanligtvis i biologiskt tre exemplar för att säkerställa statistisk konfidens. Lika proteininmatning per prov är avgörande för datareproduktion mellan prover; Det säkerställer också att skillnader i PPP-underenhet eller interaktionsförekomst inte bara beror på skillnader i proteintillförsel. En proteinanalys såsom en BCA måste användas för att bestämma proteinkoncentrationen i varje prov. Slutligen är icke-denaturerande förhållanden vid provberedning, PIB-anrikning och PIB-tvättning avgörande för att säkerställa att proteinerna förblir i sitt ursprungliga tillstånd. Detta bevarar PPP-underenhetsinteraktioner.
PIB-MS är ett kraftfullt verktyg för att förhöra PPPome, men det kommer med flera begränsningar. PIBs kan berika för de katalytiska och icke-katalytiska komponenterna i PP1, PP2A, PP4, PP5 och PP6, men inte PP2B eller PP7, eftersom MCLR inte hämmar dessa fosfataser vid nanomolära koncentrationer. Det är viktigt att notera att detta verktyg är lämpligt för enkel identifiering och kvantifiering av endogena, MCLR-känsliga PPP-holoenzymer, såsom de noterade. PIB-MS kan inte detektera PPP-holoenzymer som hämmas av endogena PPP-hämmare som blockerar det PPP-aktiva stället, såsom α4 och SET14. Denna teknik kräver inte exogent uttryck av märkta PPP-underenheter eller användning av PPP-specifika antikroppar. Liksom andra affinitetsanrikningsstrategier med hjälp av sepharosbaserade matriser är PIB-MS benägen att binda icke-specifika proteiner. Tillägget av fri MCLR som en negativ kontroll gör det dock möjligt att skilja specifika från icke-specifika interagerare, vilket möjliggör identifiering av nya PPP-underenheter och interagerande proteiner. Dessutom kan icke-specifika interagerare minskas via ytterligare tvättar och noggrann användning av lämplig mängd PIBs.
Vi har använt PIB-MS för att jämföra PPP-uttrycksmönstren för olika cancercellinjer, inklusive bröstcancer och glioblastom14. Vi fann att dessa cancertyper har unika PPP-uttrycksmönster som indikerar deras ursprung14. Växtskyddsmedel är bland de mest bevarade enzymerna 2,3. Vi kunde visa att PIB-MS är effektivt för att analysera PPPome i jäst- och musvävnader14. PIB-MS kan också användas för att identifiera skillnader i PPP-uttrycksmönster under olika förhållanden, såsom interfas kontra mitotiska prover15. Således ger PIB-MS insikter i fosfoproteinfosfatasnätverk och utökar vår förståelse för PPP-reglering över flera cellinjer och sjukdomstillstånd, liksom vid läkemedelsbehandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja och inga intressekonflikter.
Acknowledgments
A.N.K. erkänner stöd från NIH R33 CA225458 och R35 GM119455. Vi tackar Kettenbach- och Gerber-laboratorierna för deras hjälpsamma diskussion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Honeywell | AH015-4 | CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Anhydrous Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | model no. 5424 | |
| Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate | Acros Organics | 410991000 | |
| Centrifuge | Eppendorf | model no. 5810 R 15 amp version | |
| Distilled water | |||
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Dounce tissue grinder | Fisherbrand Pellet Pestles | 12-141-363 | |
| Empore solid phase extraction disk, C18 | CDS Analytical | 76333-132 | |
| Eppendorf tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis. |
| Eppendorf tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363352 | CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis. |
| Extraction plate manifold | Waters | WAT097944 | |
| Falcon tubes, 50 mL | VWR | 21008 | |
| Generic blunt end needle and plunger | |||
| Generic magnetic separation rack | |||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen chloride (HCl) | VWR Chemicals BDH | BDH3028 | CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood. |
| Hydroxylamine solution 50% (wt/vol) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Incubator, 65 °C | VWR | model no. 1380FM | |
| Koptec Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | V1001 | |
| Methanol for HPLC (MeOH) | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Microcystin LR (MCLR) | Cayman Chemical | 10007188 | CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact. |
| PBS, 1× without calcium and magnesium, pH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | |
| pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers | Fisher Scientific | M1095310001 | |
| PIBs | For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007. | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pipette tips, 10 μL | Eppendorf | 22491504 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| Pipette tips, 1000 μL | Eppendorf | 22491555 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| Pipette tips, 200 μL | Eppendorf | 22491539 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| plastic syringe, 10 mL | BD | 309604 | |
| Protease inhibitor cocktail III | Research Products International | P50700-1 | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Refrigerated benchtop centrifuge | Eppendorf | model no. 5424 R | |
| Rotator (Labquake Shaker Rotisserie) | Thermo Scientific | 13-687-12Q | 8 rpm rotation |
| Sample collection plate, 96- well, 1 mL | Waters | WAT058957 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP1311-1 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511C | |
| Sodium azide | EMD Chemicals | SX0299-1 | CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals. |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S27110 | |
| Sonicator (Branson digital sonifier) | model no. SFX 250 | ||
| SPE C18 desalting plate | Waters | 186001828BA | |
| SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads) | Cytiva | 6.51521E+13 | |
| Thermomixer | Eppendorf | model no. 5350 | |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 × 0.8 mg per tag | ThermoFisher | A37725 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Honeywell | T6508-25ML | CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood. |
| Tris Base | Research Products International | T60040 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Vacuum centrifuge and vapor trap | Thermo Scientific | model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105 | |
| Vortexer (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries | ||
| Water LC-MS | Honeywell | LC365-4 |
References
- Nilsson, J.
- Brautigan, D. L. Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling. The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).
- Brautigan, D. L., Shenolikar, S. Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates. Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).
- Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).
- Virshup, D. M., Shenolikar, S. From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover. Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).
- Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. The extended PP1 toolkit: designed to create specificity. Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).
- Qian, J., Winkler, C., Bollen, M.
- Heroes, E., et al. The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity. The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).
- Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer. Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).
- Bantscheff, M., et al. Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors. Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).
- Klaeger, S., et al. Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors. ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).
- Duncan, J. S., et al. Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer. Cell. 149 (2), 307-321 (2012).
- Cooper, M. J., et al. Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia. PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).
- Lyons, S. P., et al. A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).
- Nasa, I., et al. Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry. Science Signaling. 13 (648), (2020).
- Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse. Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).
- Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose. Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).
- Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).
- Hughes, C. S., Moggridge, S., Müller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Zecha, J., et al. TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach. Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool. Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins. Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).
