Summary
ここでは、細胞および組織からの内因性リンタンパク質ホスファターゼおよびそれらの相互作用タンパク質の濃縮、ならびに質量分析ベースのプロテオミクスによるそれらの同定および定量のためのプロトコルを提示する。
Abstract
ほとんどの細胞プロセスは、動的タンパク質リン酸化によって調節される。タンパク質の4分の3以上がリン酸化されており、リンプロテインホスファターゼ(PPP)はすべての細胞セリン/スレオニン脱リン酸化の90%以上をコーディネートしています。タンパク質リン酸化の調節解除は、癌および神経変性を含む様々な疾患の病態生理学に関与している。それらの広範な活性にもかかわらず、PPPsおよびPPPによって制御される分子機構は、ほとんど特徴付けられていない。ここでは、ホスファターゼ阻害剤ビーズおよび質量分析(PIB-MS)と呼ばれるプロテオミクスアプローチが、任意の細胞株または組織を使用してわずか12時間でPPP、それらの翻訳後修飾、およびそれらの相互作用因子を同定および定量するために記載されている。PIB-MSは、セファロースビーズに固定化された非選択的PPP阻害剤であるミクロシスチン-LR(MCLR)を利用して、内因性PPPおよびその関連タンパク質(PPPomeと呼ばれる)を捕捉および濃縮する。この方法は、PPPのタグ付きバージョンの外因性発現または特異的抗体の使用を必要としない。PIB-MSは、進化的に保存されたPPPを研究し、脱リン酸化シグナル伝達に関する現在の理解を広げる革新的な方法を提供します。
Introduction
タンパク質リン酸化は、DNA損傷に対する応答、成長因子シグナル伝達、および有糸分裂1,2,3の通過を含むがこれらに限定されない、ほとんどの細胞プロセスを制御する。哺乳動物細胞では、タンパク質の大部分は、ある時点で1つ以上のセリン、スレオニン、またはチロシン残基でリン酸化され、ホスホセリンおよびホスホスレオニンは、すべてのリン酸化部位の約98%を占める2,3。キナーゼは細胞シグナル伝達において広く研究されてきたが、動的細胞プロセスの調節におけるPPPの役割はまだ現れている。
リン酸化ダイナミクスは、キナーゼとホスファターゼの間の動的相互作用によって制御される。哺乳類細胞には、セリン/スレオニンリン酸化を触媒する400以上のプロテインキナーゼが存在する。これらの部位の90%以上は、PP1、PP2A、PP2B、PP4-7、PPT、およびPPZ 2,3からなる酵素の小さなファミリーであるリンタンパク質ホスファターゼ(PPP)によって脱リン酸化されている。PP1およびPP2Aは、細胞内のホスホセリンおよびホスホスレオニン脱リン酸化の大部分を担う2、3、4。キナーゼとホスファターゼの数の顕著な違いおよびインビトロでのPPP触媒サブユニットの特異性の欠如は、キナーゼがリン酸化の主な決定因子であるという信念につながった2,3。しかしながら、複数の研究は、ホスファターゼが多量体ホロ酵素5、6、7、8、9の形成を通じて基質特異性を確立することを示している。例えば、PP1は、触媒サブユニットおよび、所与の時点で、150を超える調節サブユニットのうちの1つからなるヘテロ二量体である6、7、8である。逆に、PP2Aは、足場(A)、調節(B)、および触媒(C)サブユニット2,3,9から形成されるヘテロ三量体である。PP2A調節サブユニット(B55、B56、PR72、および線条体)の4つの異なるファミリーがあり、それぞれに複数の遺伝子、スプライスバリアント、および局在化パターン2、3、9がある。PPPの多量体性は、キナーゼおよびPPP触媒サブユニットの数のギャップを埋める。しかし、PPPシグナリングを研究するための分析上の課題が生じます。PPPシグナル伝達を網羅的に解析するためには、細胞または組織内の様々なホロ酵素を調べることが重要です。キナーゼ阻害剤ビーズ(マルチプレックス阻害剤ビーズまたはキノビーズと呼ばれる)の使用を通じてヒトキノメの研究において大きな進歩がなされており、キナーゼ阻害剤がビーズに固定化され、質量分析法が濃縮キナーゼおよびそれらのインターアクターを同定するために使用される化学的プロテオミクス戦略10,11,12,13。
我々は、PPP生物学を研究するために同様のアプローチを確立している。この技術は、ホスファターゼ阻害剤ビーズ(PIB)と呼ばれるミクロシスチン−LR(MCLR)と呼ばれる固定化された非選択的PPP阻害剤を有するビーズを用いたPPP触媒サブユニットの親和性捕捉を含む14,15。タンパク質活性または局在化を変化させる可能性のある外因性PPPサブユニットの内因性タグ付けまたは発現を必要とする他の方法とは異なり、PIB-MSは、内因性PPP触媒サブユニット、それらに関連する調節および足場サブユニット、および所定の時点または特定の治療条件下での細胞および組織からの相互作用タンパク質(PPPomeと呼ばれる)の濃縮を可能にする。MCLRは、PP1、PP2A、PP4-6、PPT、およびPPZをナノモル濃度で阻害し、PIBをPPPome16の濃縮に非常に効果的にする。この方法は、細胞から臨床サンプルまでの任意の出発物質に使用するためにスケーリングすることができる。ここでは、内因性PPPomeとその修飾状態を効率的に捕捉、同定、定量化するためのPIBおよび質量分析(PIB-MS)の使用について詳しく説明します。
図1:PIB-MSプロトコルの視覚的な概要 PIB-MS実験では、細胞から腫瘍まで、さまざまな形態でサンプルを得ることができます。サンプルは、PPP 濃縮の前に収集、溶解、および均質化されます。PPPを富化するために、溶解液をMCLRなどのPPP阻害剤の有無にかかわらずPIBと共にインキュベートする。その後、PIBを洗浄し、PPPを変性条件下で溶出します。サンプルは、SP3タンパク質濃縮、トリプシン消化、および脱塩による洗剤の除去によって質量分析分析用に調製される。次いで、サンプルを、質量分析分析の前に任意選択でTMT標識することができる。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
PIB-MSには、細胞または組織の溶解および清澄化、溶解液とPIBとのインキュベーション、溶出、およびウェスタンブロッティングまたは質量分析ベースのアプローチによる溶出液の分析が含まれます(図1)。遊離MCLRの添加は、特異的PIB結合剤を非特異的相互作用体から区別するための対照として使用することができる。ほとんどのアプリケーションでは、溶出液中のタンパク質を直接同定するためにラベルフリーのアプローチを使用できます。定量化または低存在種の同定においてより高い精度が必要な場合は、タンデム質量タグ(TMT)標識によるさらなる処理を使用して、カバレッジを増加させ、入力を減少させることができる。
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Protocol
注:PIBの生成は、Moorheadらによって記述されているように行われ、1mgのミクロシスチンおよび約6mLのセファロースが結合されて、最大5mg/mLの結合能を有するPIBを生成する17。
1. サンプル調製
注:PIB-MSの典型的な開始量は、条件ごとに総タンパク質の1mgです。この実験では、約2.5 x106 HeLa細胞を使用して1mgのタンパク質を抽出しました。この計算は、実験18において使用されている各細胞株または組織について実施されるべきである。サンプルが制限されていて1mgが得られない場合、PPPサブユニット検出のわずかな損失で入力量を減らすことができます。あるいは、TMT標識を用いて、1つの試料中のすべての条件の混合を可能にし、ステップ9に示すように検出の感度を高めることができる。
- 組織サンプルまたは細胞ペレットを収集する。細胞ペレットの場合、室温 (RT) で 277 x g で 2 分間遠心分離して細胞を回収し、培地を除去し、5 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で細胞を洗浄します。細胞ペレットは、-80°Cで数ヶ月間保存することができる。
- 溶解バッファー(500 mM NaCl、50 mM Tris-HCl pH 7.5、0.5% Triton X-100 (vol/vol)、5 mM β-グリセロリン酸二ナトリウム塩 5 水和物、1:500 (vol/vol) プロテアーゼ阻害剤カクテル III) を調製し、氷上に保ちます。すべてのサンプルを溶解して洗うのに十分な量を作ります。条件ごとに1mgのタンパク質から始める場合は、溶解および洗浄のためにサンプルあたり約3mLの緩衝液を作ります。
注:このステップで指摘されている溶解バッファーは中性洗剤溶液であり、不溶性メンブレンまたは細胞骨格関連タンパク質を可溶化するのに十分ではない場合があります。可溶化を改善するために他の洗剤を探索することができる。NaClおよびTriton−X−100濃度の範囲を試験し、上記の濃度が、低バックグラウンドおよび高ホスファターゼサブユニット結合に最適であることが見出された。 - 冷却溶解バッファーをサンプルに加えます。1mgのタンパク質を溶解するには、1mLの緩衝液を使用する。サンプルが凍結している場合は、溶解バッファーを加え、バッファー内の氷上でサンプルを解凍させます。
- 細胞の場合は、超音波処理によってサンプルを均質化し、パルス間で細胞を氷上に保ちます。3つの15 sパルスで15%の振幅でサンプルを超音波処理します。これは、使用される超音波処理器によって異なる場合があります( 材料表を参照)。
- 組織の場合、ステップ1.3.1に記載されているように超音波処理する前に液化されるまで組織を粉砕するためにDounce組織グラインダーを使用して最初にサンプルを均質化する。
- 不溶性破片の均質化サンプルを、21,130 x g で4°Cで15分間遠心分離することによって明らかにする。 次いで、チューブの側面に集められた形成されたペレットまたは脂質を乱すことなく、溶解物を新しいチューブに移す。必要に応じて清澄化された溶解液の濃縮前サンプルを100 μL取り出し、-20°Cで保存します。 溶解液は必ず氷の上に保つようにしてください。
- 製造業者の指示に従って、各サンプルの小さなアリコート上で、ビシンコニン酸アッセイ(BCA)などのタンパク質定量アッセイを実行することによって、各サンプル中の総タンパク質含有量を決定する。BCAアッセイ中に溶解物が氷上に保持されていることを確認してください。
- BCAアッセイを実施した後、等量のタンパク質を新しいチューブに移し、溶解バッファーで希釈して、各チューブが同じ濃度のタンパク質(例えば、1mg/mL)を有することを確認します。実験でPPP阻害剤コントロールが必要な場合は、同じタンパク質含有量を持つ各サンプルのアリコートを2つ用意し、ステップ1.7に進みます。PPP 阻害剤コントロールが必要ない場合は、ステップ 2 に進んでください。サンプルが氷の上に保管されていることを確認してください。
注:PIB-MS分析では、条件ごとに等しいタンパク質濃度を使用することが重要です。PPP阻害剤対照は、PIBに対する特異的結合剤を非特異的バックグラウンドから区別するために使用される。 - PPP阻害剤コントロールの場合、1つのサンプルを遊離MCLR(1μM)で処理し、もう1つのサンプルを同じ量のDMSOでコントロールとして処理します。サンプルを穏やかにボルテックスし、氷上で15分間インキュベートします。
注:溶解物のMCLR処理は、PPP触媒サブユニットの結合を遮断するが、サンプル中のPIBに非特異的に結合するタンパク質はブロックしない。MCLRは毒性があるため、取り扱いには注意してください。 資料表の取り扱い上の注意事項を参照してください。
2. PIBの準備
- 実験に必要なPIBの量を決定します。1mgのタンパク質に対して、1〜3μgのPPPおよび相互作用タンパク質を得ることができる。ビーズ損失を最小限に抑えるために、サンプルあたり少なくとも10μLの固体PIB樹脂を使用してください。PIBの結合能は3〜5mg/mL14,17である。
- 適量のPIBを1.5mLチューブに移し、0.5mLの溶解バッファーで3倍洗浄した後、穏やかにボルテックス処理し、洗浄の合間にRTで376 x g で30秒間遠心分離します。洗浄の間に溶解バッファーを除去するときは、ビーズをピペッティングしないでください。
- 洗浄したPIBに適量の溶解バッファーを加えて、50%のPIB/バッファー溶液(vol/vol)を作ります。ピペットを静かに上下させ、ピペットチップをスラリーに巻き付けてPIBを再懸濁させます。
- スラリー 20 μL を、既に 0.5 mL の溶解バッファーを含む新しい 1.5 mL チューブに移します。チューブ内の溶解バッファーは、ピペット先端からビーズを排出するのに役立ちます。各サンプルに等量のPIBを含むチューブが十分になるまでこれを行います。
- チューブを 376 x g で回転させ、RT で 30 秒回転させます。すべてのチューブにビーズ樹脂が等量含まれていることを確認してください。上清を捨て、固形樹脂と最大50 μLの溶解バッファーのみを各チューブに残します。
3. PIBとライセートとのインキュベーション
- ステップ1.6から溶解物を移す。またはステップ 1.7.ステップ2からPIBを含む適切にラベル付けされたチューブに。溶解液をPIBで8rpmで4°Cで1時間回転させる。
4. PIBの洗浄
- PIBを376 x g で4°Cで30秒間遠心分離してビーズを回収します。上清を除去して廃棄し、必要に応じて濃縮後分析のために100 μLのアリコートを保存します。
- ビーズに0.5 mLの溶解バッファーを加え、チューブを反転させ(ボルテックスは推奨されません)、4°Cで30秒間376 x g で遠心分離してビーズを回収し、落ち着いたビーズから溶解バッファーを除去して、ビーズペレットを壊さないように注意して、PIB 3xを洗浄します。
5. PIBからのPPPの溶出
- 最終洗浄後、PIBをピペッティングせずにできるだけ多くの溶解バッファーを除去します。2% SDS(vol/vol)を含む溶出バッファーを作成し、PIBの容量の4倍から5倍になるのに十分な量の溶出バッファーを追加して、PIBからPPPを溶出します。例えば、10 μL の PIB を使用する場合は、50 μL の溶出バッファーを使用します。PIBを溶出バッファーと共に65°Cで1時間インキュベートし、PIBからPPPを溶出させます。
- 溶出後、RTで30秒間チューブを376 x g で遠心分離し、溶出液を別のチューブにピペッティングして溶出液を回収し、PIBを移さないように注意してください。溶出液は、ウェスタンブロット分析または質量分析に使用します。溶出液は、-20°Cで最大数ヶ月間保存することができます。
- さらに使用するためにPIBを再生するには、ビーズを2%SDS(vol/vol)でインキュベートし、RTで8rpmで1時間回転させます。25 mM Tris-HCl(pH 7.5)で3x-5xを、1回の洗浄につき30分間回転させて洗浄します。すべての洗浄後、PIBをアジ化ナトリウム(0.05% wt/vol)を含む25 mM Tris-HCl(pH 7.5)保存バッファーに保存します。
- 溶出液をウェスタンブロッティングまたは質量分析法で分析する。PIB溶出液の質量分析を以下に記載する。
6. 洗剤の除去
注:MS分析用の溶出液サンプルから洗剤を除去するために、さまざまなアプローチを使用できます。我々は、Hughesらによって記述されたシングルポット固相増強サンプル調製(SP3)がうまく機能することを見出した19。
- 上記のステップ 5.2 からの溶出液 50 μL に 0.5 μL の SP3 ビーズを追加します。SP3ビーズは、10:1(μg:μg)または少なくとも0.5μg/μL(原液は50μg/μL)の比率で使用してください。ビーズを静かに渦巻き、溶出します。
- ビーズ-溶出液混合物に100%エタノールの1つの溶出量を加える(例えば、50μLの溶出液を使用した場合、50μLの100%エタノールを使用する)。試料を24°Cで1000rpmで振とうするように設定したサーモミキサー中で5分間インキュベートする。
- すべてのビーズを集めるには、磁気ビュアーラックに入れます。ビーズが溜まったら、上清を捨て、0.5mLの80%エタノール(vol/vol)3xでビーズを洗浄します。洗浄のためには、ボルテックスによりビーズを再懸濁し、磁気チューブラックに入れてビーズを回収し、洗浄の間に上澄み液を捨てる。
- 0.5 mLの100%アセトニトリル(ACN)でビーズをもう一度洗浄し、微量のエタノールをすべて除去し、できるだけ多くのACNを除去します。
7. タンパク質の消化
- 166 mM HEPES(pH 8.5)でトリプシン(終濃度0.004 μg/μL)を1:100希釈し、このトリプシン溶液30 μLをビーズで各チューブに加え、ボルテックスで再懸濁します。
- SP3-トリプシンビーズ混合物をサーモミキサー中で、37°Cで1000rpmで5時間または30°Cで一晩インキュベートする。 チューブを磁気ラックに入れてビーズを収集し、消化物を新しいチューブに取り出します。
- ラベルフリー分析の場合は、20% トリフルオロ酢酸 (TFA) (vol/vol) を終濃度 0.2% TFA (vol/vol) に添加して反応をクエンチします。pHペーパーで各サンプルのpHが2〜3の間であることを確認してください。そうでない場合は、これが達成されるまで、20%TFAの小さなアリコートを追加します。サンプルは、脱塩する前に適切に酸性にする必要があります。ステップ 8 に進んでください。
- サンプルのTMT標識については、酸性化せず、ステップ9に進んでください。
8. ダイジェストの脱塩
- Rappsilberら20によって記述されているように、C18樹脂と互換性のある200μLのMS溶媒チップを充填することによって、各サンプルのステージチップを準備する。鈍い針を使用して 2 枚の C18 材料ディスクを押し、ディスクが針に残っていることを確認します。細いワイヤープランジャーを使用してディスクをMS溶媒互換チップに移し、ディスクを針から取り出します。
注:他のピペットチップは質量分析で検出できるサンプルに化学物質を浸出する可能性があるため、プロトコルのこの時点からMS溶媒適合チップを使用することが重要です。 - 各ステージチップを30 μLの100%MeOHで平衡化し、次に30 μLの60%MeOH(vol/vol)、続いて30 μLの0.1% TFA(vol/vol)で平衡化します。各溶液をシリンジでステージ先端に押し込みます。必要に応じて、ピペットチップを透明フィルムでシリンジの端に取り付け、シリンジとステージチップの接触を増加させます。ステージ先端内部のC18素材が乾かないように注意してください。
- ステップ7.3の酸性化ペプチド消化物を標識されたステージ先端に加え、ステージ先端が完全に乾燥しないように注意しながら、シリンジでステージ先端を押し込みます。
- 各サンプルを30 μL の 0.1% TFA (vol/vol) で 2x 洗浄します。各ステージ先端に30 μLの60%MeOH(vol/vol)を添加し、シリンジ圧力で先端から新しいラベル付きチューブにすべてを排出することにより、各ステージチップからペプチドを溶出します。これは、C18材料が完全に乾燥される唯一のステップです。
- 真空遠心分離により各試料を乾燥させる。乾燥ペプチドは、-20°Cで数ヶ月間保存することができます。これで、サンプルはラベルフリーの質量分析分析の準備が整いました。サンプルの半分のみを質量分析計での分析に使用し、残りの半分を必要に応じて再注入に使用します。分析には適切な質量分析計法を使用してください。
9. TMTラベリング
注:タンデム質量タグ標識は、定量分析のためにサンプルを多重化するために使用されます。TMT試薬の0.8mgバイアルは、タンパク質21の0.8mgまで標識するのに十分である。1mgのタンパク質から始まるPIBプルダウン実験では、1〜3μgのリンタンパク質サブユニットが得られる。以下のプロトコールは、最大10μgのタンパク質に最適です。
- 80 μLの無水ACN中のTMT試薬の0.8 mgバイアル1本を再構成する。
- ステップ 7.4 の各サンプルに、最大 18 チャンネルの異なる TMT ラベルを付けます。各サンプルに追加される TMT ラベルを必ずメモしておいてください。2 μLのTMT試薬と2 μLのACNをペプチド消化物に加え、ボルテックスを穏やかに混合し、RTで376 x g で30秒間遠心分離してサンプルを収集し、RTで1時間インキュベートしてサンプルを標識します。
- TMT 標識効率をテストするには、9 μL の LC-MS グレードの水と 1 μL の 10% ヒドロキシルアミン (vol/vol) を含む 0.5 mL チューブに各標識反応 1 μL を組み合わせて標識チェックサンプルを作成し、反応をクエンチします。残りの非急冷標識サンプルを-80°Cの冷凍庫に入れる。サンプルは、ラベリング効率が評価されている間、数日間保存することができます。
- TMTラベルチェックサンプルを酸性にし、30μLの0.1%TFA(vol/vol)を加えます。pHが2〜3の間であることを確認してください。そうでない場合は、このpHが達成されるまで20%TFA(vol/vol)を追加します。ステップ 8.1.-8.5 で説明されているように、ステージの転倒によってラベルチェックサンプルを脱塩します。
- 質量分析計でTMTラベルチェックサンプルを分析し、ラベリング効率を評価します。検索結果をペプチドレベルで1%の誤発見率(FDR)にフィルタリングし、標識効率21、22を決定する。
- 完全TMT標識ペプチドは、N末端にTMT試薬を有し、かつ、すべてのリジンを有する。TMTレポーターイオン強度を定量化し、すべてのチャネルにわたってそれらの合計を比較します。すべてのペプチドの>95%が標識され、TMTレポーターイオンの合計強度が同等である場合、サンプルは十分に標識されます
注:不完全な標識に加えて、合計されたTMTレポーターイオン強度の違いは、1μLの試験サンプルの不正確なピペッティングの結果である可能性があります。また、真の生物学的観察を反映している可能性もあり、その場合、すべての反復は同じ動作を示すはずです。 - -80°C保存からクエンチされていないサンプルを取り出し、解凍します。それらが完全に標識されていない場合は、上記のように適切なTMT試薬を1 μLサンプルに加え、1時間インキュベートしてから、TMTラベルチェックを繰り返します。サンプルが完全にラベル付けされている場合は、ステップ 9.8 に進みます。
- 完全に標識したら、TMT反応に2μLの10%ヒドロキシルアミン(vol/vol)を加えて標識をクエンチします。サンプルをRTで15分間インキュベートします。急冷すると、サンプルは-80°Cで数ヶ月間保存できます。
- クエンチしたすべてのTMTチャネルを結合し、20%TFA(vol/vol)を2μL加えて反応を酸性にします。併用反応のpHを確認し、pHが2〜3の間であることを確認します。そうでない場合は、所望のpHに達するまで20%TFAの小さなアリコートを加える。これは適切な脱塩に不可欠です。
- 30分間の真空遠心分離によりACNを除去し、以下のようにして試料を脱塩した。
10. TMT標識結合サンプルの脱塩
- 適切なタンパク質容量(通常、この用途には2mgの吸着剤で十分です)を備えたSPE C18脱塩プレートを使用して、組み合わせたTMT試薬を脱塩します。ウェルを 200 μL の 60% MeOH (vol/vol) および 200 μL の 10% MeOH/0.1% TFA (vol/vol) で平衡化します。
- ステップ9.10から酸性化TMT標識ペプチドをロードする。脱塩プレートの上に。サンプルウェルを200 μL の 10% MeOH/0.1% TFA (vol/vol) で 2 倍洗浄します。
- 100 μL の 60% MeOH (vol/vol) でペプチドを溶出します。真空遠心分離により試料を乾燥させる。乾燥させたTMT標識サンプルは、-80°Cで数ヶ月間保存することができます。
- TMT標識サンプルの質量分析では、サンプルの半分を注入し、再注入が必要な場合は残りの半分を保存します。
注:質量分析の注入量は、特定のカラム、機器のセットアップ、およびサンプルタイプによって異なります。
11. データ解析
注: データのフィルタリングと分析の方法はさまざまで、このプロトコルの範囲外ですが、このプロトコルから生じるデータの種類に固有のガイダンスを提供するために、分析に関する次の注意事項が含まれています。
- 使用したサンプル細胞または組織の起源に基づいて、種特異的プロテオームデータベースに対して生の質量分析データを検索します。ここでは、探索アルゴリズム23として彗星を用いた。
- 検索アルゴリズム固有のパラメータ22を調整することによって1%FDRで検索結果をフィルタリングする。ラベルのない定量化のために、MS1ピーク面積測定を使用してデータを定量化します。TMT標識サンプルの場合、定量にはMSn由来のレポーターイオン強度を使用します。統計的有意性については、サンプルを生物学的三連で分析します。
- de novoでPPPサブユニットとその相互作用因子を同定するには、MCLR阻害サンプルとDMSO処理サンプルの3連の生物学的サンプルが比較されるようにします。異なる条件下で、または薬物治療時にPPPomeを比較するには、各条件または薬物治療の生物学的三連が生成されたことを確認する。
- 3 つの DMSO 対照処理サンプルのうち少なくとも 2 つで総ペプチド数>1のタンパク質のみが存在するようにデータをフィルタリングします。MCLR競合は、必ずしもすべての触媒サブユニット結合と競合するわけではありません。また、いくつかのPPP触媒サブユニットは、セファロース樹脂に非特異的に固着する可能性がある。樹脂に非特異的に結合するタンパク質をフィルタリングしながら、いずれかの可能性を考慮するには、MCLR処理条件下でPPP触媒サブユニットの場合よりも高い総ペプチド数を持つタンパク質を除去します。
- ケラチン、コラーゲン、40Sおよび60Sリボソームタンパク質、PPPサブユニットではない不均一な核リボヌクレオタンパク質などの一般的な汚染物質を分析から除外する14。
- フィルタリングされたデータをペルセウスにインポートするには、[読み込み] セクション24,25 の [汎用マトリックスのアップロード] をクリックします。Log2 は、基本>変換に移動し、データを選択し、変換関数 (この場合は log2(x) ) を指定することによって、データを変換します。
- 正規分布から欠損値 >代入 [正規分布の欠損値を置き換える] に移動し、データを選択し、計算の幅 (デフォルト 0.3) と下方シフト (デフォルト 1.8) を指定します。分位点正規化を実行するには、「 分位点正規化」>「正規化」に移動します。
- それぞれの条件の対数2 比とスチューデントのT検定p値を計算します。まず、Annot. 行 >カテゴリ注釈行に移動して、データ に注釈を付けます。T検定を実行するには 、検定>2サンプル検定に移動し、比較するグループ、実行する検定、および切り捨てに使用する多重仮説検定補正の方法を選択します。
注: de novo 同定の場合、MCLR処理状態とDMSO状態においてその存在量が統計的に有意であり、log2倍の変化が特異的に結合した既知のPPPサブユニットの最小倍数変化よりも大きい場合、タンパク質はPPP相互作用タンパク質とみなされます。
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Representative Results
図2:特定のPIBバインダーの同定(A)PIB-MSを介して、さまざまな組織タイプまたは細胞を分析できます。生物学的三連中のHeLa細胞をDMSOまたはPPP阻害剤MCLRで処理し、PIBと共にインキュベートし、LC-MS/MS(B)DMSOおよびMCLR処理HeLa細胞溶解物におけるPIB-MS分析の火山プロット、特定のPIB結合剤を赤色で示した。PPP触媒サブユニットは標識され、青色で示されている。新規候補PPPサブユニットまたは相互作用タンパク質は黒色で示されている。非特異的結合剤は灰色で示されている。(c)濃縮の再現性を実証するためにDMSOで処理したHeLa細胞溶解物からの2つの生物学的複製物のlog2領域の散布図。PIBに対する特定のバインダーは赤で示されている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:HeLa細胞で同定されたすべてのPPPサブユニットおよびPPP相互作用タンパク質のネットワーク解析。 これらのタンパク質は、MCLRの有無にかかわらず、HeLa PIBプルダウンにおいて特異的なPIBインターアクターであることが判明した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
PIBの性能を実証するために、我々はHeLa細胞でPIBプルダウン実験を行い、PPPとその相互作用因子を同定した(図2A)。HeLa細胞を生物学的三連で増殖させ、溶解した。各三連溶解物を半分に分割し、PIB濃縮が行われる前に、PPP触媒サブユニットまたはDMSOの結合を防ぐために、半分をMCLRで15分間処理した。PIB濃縮に続いて、特異的なインタラクターと非特異的なインターアクターを区別するために、DMSO処理サンプルとMCLR処理サンプルで定量されたタンパク質の存在量のラベルフリー比較を実施しました(図2B)。分析では、MCLR感受性PPP触媒サブユニットPP1ca、PP1cb、PP1cc、PP2Aca、PP2Acb、PP4c、PP5c、およびPP6cをすべて検出しました。DMSO処理サンプルでは、存在量(タンパク質定量のlog2領域)は高度に相関し、再現性を示し(図2C)、MCLRで処理すると、PPP触媒サブユニットまたはPPP相互作用タンパク質の存在量はPIBプルダウンにおいて大幅に減少した(図2B)。この解析では、92個のPPPサブユニットおよび特異的PPPインターアクター(補足表1を参照)を同定し、これはHeLa細胞14における以前のPIB-MS解析に匹敵する(図3)。
補足表1:代表的なPIB-MS分析のMSデータ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
PIB-MSは、単一の分析でさまざまなサンプルソースからPPPomeを定量的にプロファイリングするために使用される化学プロテオミクスアプローチです。キナーゼ阻害剤ビーズを使用して、キノメとそれが癌および他の疾患状態においてどのように変化するかを研究するために多くの研究が行われてきた10、11、12、13。しかし、PPPomeの研究は遅れをとっている。このアプローチは、このギャップを埋め、細胞脱リン酸化の調節に光を当てることができると期待しています。ここでは、PIBを使用して、PP1、PP2A、PP4、PP5、およびPP6の触媒成分および非触媒成分を濃縮できることを示しています。我々はまた、様々な細胞株、組織型、および生物における新しいPPP相互作用因子候補を同定することができる。
PIB-MS プロトコルには、見落とされてはならないいくつかの重要なステップがあります。これらには、適切なコントロールと複製の組み込み、すべてのサンプルにわたる等量のタンパク質の入力、サンプル調製中の非変性条件の維持、PIBによるサンプルのインキュベーション、およびPIBの洗浄が含まれます。対照および複製に関しては、新規なPPPサブユニットおよび相互作用因子を同定することが目標である場合、各サンプルの半分をPPP阻害剤で処理することが重要である。これは、特定のPIBインタラクタと非特異的PIBインタラクタを区別するために必要です。既知のPPPサブユニットまたはPPPインタラクター発現が細胞または組織タイプおよび細胞周期段階にわたって、または様々な薬物治療においてどのように変化するかを特定しようとする場合、比較のために既知のPPPサブユニットおよびインターアクターのリストをキュレーションすることが重要です。さらに、これらの実験は、典型的には、統計的信頼性を確保するために生物学的三連で行われる。サンプルあたりのタンパク質入力量が等しいことは、サンプル間のデータ再現性に不可欠です。また、PPPサブユニットまたは相互作用体の存在量の違いが、単にタンパク質入力の違いによるものではないことも保証します。BCAなどのタンパク質アッセイを使用して、各サンプル中のタンパク質濃度を決定する必要があります。最後に、サンプル調製、PIB濃縮、およびPIB洗浄における非変性条件は、タンパク質が元の状態にとどまることを保証するために重要です。これにより、PPP サブユニットの相互作用が保持されます。
PIB-MSはPPPomeを調査するための強力なツールですが、いくつかの制限があります。MCLRはナノモル濃度でこれらのホスファターゼを阻害しないため、PIBはPP1、PP2A、PP4、PP5、およびPP6の触媒成分および非触媒成分を濃縮することができるが、PP2BまたはPP7は濃縮しない。このツールは、記載されているような内因性のMCLR感受性PPPホロ酵素の同定と定量を容易にするのに適していることに注意することが重要です。PIB−MSは、α4およびSET14などのPPP活性部位をブロックする内因性PPP阻害剤によって阻害されるPPPホロ酵素を検出することができない。この技術は、タグ付きPPPサブユニットの外因性発現またはPPP特異的抗体の使用を必要としない。セファロースベースのマトリックスを使用する他の親和性濃縮戦略と同様に、PIB-MSは非特異的タンパク質の結合を起こしやすい。しかし、ネガティブコントロールとして遊離MCLRを添加すると、特異的な相互作用因子と非特異的な相互作用因子を区別することができ、新しいPPPサブユニットおよび相互作用タンパク質の同定が可能になる。さらに、非特異的インタラクターは、追加の洗浄および適切な量のPIBの慎重な使用によって低減することができる。
我々はPIB-MSを用いて、乳癌および膠芽腫を含む様々な癌細胞株のPPP発現パターンを比較した14。我々は、これらのがんタイプが、その起源を示すユニークなPPP発現パターンを有することを見出した14。PPPsは、最も保存された酵素の1つです 2,3.我々は、PIB−MSが酵母およびマウス組織におけるPPPomeの分析に有効であることを実証することができた14。PIB−MSはまた、同相対有糸分裂サンプル15などの様々な条件下でのPPP発現パターンの違いを同定するために使用され得る。したがって、PIB-MSは、リンタンパク質ホスファターゼネットワークへの洞察を提供し、複数の細胞株および疾患状態、ならびに薬物治療時のPPP調節に関する我々の理解を広げる。
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Disclosures
著者は開示するものは何もなく、利益相反もありません。
Acknowledgments
A.N.K. は、NIH R33 CA225458 および R35 GM119455 からのサポートを認めています。ケッテンバッハ研究所とガーバー研究所の有益な議論に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Honeywell | AH015-4 | CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Anhydrous Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | model no. 5424 | |
| Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate | Acros Organics | 410991000 | |
| Centrifuge | Eppendorf | model no. 5810 R 15 amp version | |
| Distilled water | |||
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Dounce tissue grinder | Fisherbrand Pellet Pestles | 12-141-363 | |
| Empore solid phase extraction disk, C18 | CDS Analytical | 76333-132 | |
| Eppendorf tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis. |
| Eppendorf tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363352 | CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis. |
| Extraction plate manifold | Waters | WAT097944 | |
| Falcon tubes, 50 mL | VWR | 21008 | |
| Generic blunt end needle and plunger | |||
| Generic magnetic separation rack | |||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen chloride (HCl) | VWR Chemicals BDH | BDH3028 | CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood. |
| Hydroxylamine solution 50% (wt/vol) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Incubator, 65 °C | VWR | model no. 1380FM | |
| Koptec Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | V1001 | |
| Methanol for HPLC (MeOH) | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Microcystin LR (MCLR) | Cayman Chemical | 10007188 | CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact. |
| PBS, 1× without calcium and magnesium, pH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | |
| pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers | Fisher Scientific | M1095310001 | |
| PIBs | For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007. | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pipette tips, 10 μL | Eppendorf | 22491504 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| Pipette tips, 1000 μL | Eppendorf | 22491555 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| Pipette tips, 200 μL | Eppendorf | 22491539 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| plastic syringe, 10 mL | BD | 309604 | |
| Protease inhibitor cocktail III | Research Products International | P50700-1 | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Refrigerated benchtop centrifuge | Eppendorf | model no. 5424 R | |
| Rotator (Labquake Shaker Rotisserie) | Thermo Scientific | 13-687-12Q | 8 rpm rotation |
| Sample collection plate, 96- well, 1 mL | Waters | WAT058957 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP1311-1 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511C | |
| Sodium azide | EMD Chemicals | SX0299-1 | CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals. |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S27110 | |
| Sonicator (Branson digital sonifier) | model no. SFX 250 | ||
| SPE C18 desalting plate | Waters | 186001828BA | |
| SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads) | Cytiva | 6.51521E+13 | |
| Thermomixer | Eppendorf | model no. 5350 | |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 × 0.8 mg per tag | ThermoFisher | A37725 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Honeywell | T6508-25ML | CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood. |
| Tris Base | Research Products International | T60040 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Vacuum centrifuge and vapor trap | Thermo Scientific | model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105 | |
| Vortexer (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries | ||
| Water LC-MS | Honeywell | LC365-4 |
References
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