Summary
在这里，我们提出了一种方案，用于富集来自细胞和组织的内源性磷酸蛋白磷酸酶及其相互作用的蛋白质，并通过基于质谱的蛋白质组学鉴定和定量它们。
Abstract
大多数细胞过程受动态蛋白质磷酸化调节。超过四分之三的蛋白质被磷酸化，磷酸蛋白磷酸酶（PPP）协调超过90%的细胞丝氨酸/苏氨酸脱磷酸化。蛋白质磷酸化的失调与各种疾病的病理生理学有关，包括癌症和神经变性。尽管其活性广泛，但控制PPP和PPP控制的分子机制的分子机制特征不佳。在这里，描述了一种称为磷酸酶抑制剂磁珠和质谱（PIB-MS）的蛋白质组学方法，以使用任何细胞系或组织在短短12小时内鉴定和量化PPP，其翻译后修饰及其相互作用者。PIB-MS利用非选择性PPP抑制剂微囊藻毒素LR（MCLR），固定在琼脂糖珠上以捕获和丰富内源性PPP及其相关蛋白质（称为PPPome）。该方法不需要标记版本的PPP的外源性表达或使用特异性抗体。PIB-MS提供了一种创新方法来研究进化保守的PPP，并扩展了我们目前对去磷酸化信号传导的理解。
Introduction
蛋白质磷酸化控制大多数细胞过程，包括但不限于对DNA损伤的反应，生长因子信号传导以及通过有丝分裂1，2，3的传代。在哺乳动物细胞中，大多数蛋白质在某个时间点在一个或多个丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸残基处磷酸化，磷酸盐和磷酸尿嘧啶约占所有磷酸化位点的98%2，3。虽然激酶已经在细胞信号传导中得到了广泛的研究，但PPP在动态细胞过程调节中的作用仍在出现。
磷酸化动力学由激酶和磷酸酶之间的动态相互作用控制。在哺乳动物细胞中，有400多种蛋白激酶催化丝氨酸/苏氨酸磷酸化。这些位点中超过90%由磷酸蛋白磷酸酶（PPP）脱磷酸化，磷蛋白磷酸酶是一种由PP1，PP2A，PP2B，PP4-7，PPT和PPZ2，3组成的酶的小家族。PP1和PP2A负责细胞2，3，4内大部分磷酸盐水和磷酸尿嘧啶去磷酸化。激酶和磷酸酶之间的数量显着差异以及体外PPP催化亚基缺乏特异性，导致人们相信激酶是磷酸化的主要决定因素2，3。然而，多项研究表明，磷酸酶通过形成多聚体全酶5，6，7，8，9来建立底物特异性。例如，PP1是一种异源二聚体，由催化亚基组成，并且在给定时间，150多个调节亚基6，7，8中的一个。相反，PP2A是由脚手架（A），调节（B）和催化（C）亚基2，3，9形成的异源三聚体。PP2A调节亚基有四个不同的家族（B55，B56，PR72和纹状体），每个家族都有多个基因，剪接变体和定位模式2，3，9。PPP的多聚体性质填补了激酶和PPP催化亚基数量的空白。然而，它为研究PPP信令带来了分析挑战。为了全面分析PPP信号传导，研究细胞或组织内的各种全息酶至关重要。通过使用激酶抑制剂微球（称为多重抑制剂磁珠或激蛋白），在研究人类基质组方面取得了巨大进展，这是一种化学蛋白质组学策略，其中激酶抑制剂固定在磁珠上，质谱法用于鉴定富集激酶及其相互作用子10，11，12，13。
我们已经建立了类似的方法来研究PPP生物学。该技术涉及使用带有固定化非选择性PPP抑制剂（称为微囊藻毒素-LR（MCLR）的磷酸酶抑制剂珠（PIB）的磁珠14，15）对PPP催化亚基的亲和力捕获。与其他需要内源性标记或表达可能改变蛋白质活性或定位的外源性PPP亚基的方法不同，PIB-MS允许在给定时间点或特定处理条件下富集内源性PPP催化亚基，其相关的调节和支架亚基以及来自细胞和组织的相互作用蛋白质（称为PPPome）。MCLR 在纳摩尔浓度下抑制 PP1、PP2A、PP4-6、PPT 和 PPZ，使 PIB 在富集16 方面非常有效。该方法可以缩放以用于从细胞到临床样品的任何起始材料。在这里，我们详细描述了使用PIB和质谱（PIB-MS）来有效地捕获，鉴定和量化内源性PPPome及其修饰状态。
图 1：PIB-MS 协议的可视化摘要。 在PIB-MS实验中，样品可以以各种形式获得，从细胞到肿瘤。在PPP富集之前收集，裂解和均质样品。为了富集PPP，裂解物与PIB一起孵育，有或没有PPP抑制剂，例如MCLR。然后洗涤PIB，并在变性条件下洗脱PPP。通过SP3蛋白富集，胰蛋白酶消化和脱盐去除去垢剂，制备样品进行质谱分析。然后，可以在质谱分析之前选择性地对样品进行TMT标记。 请点击此处查看此图的大图。
PIB-MS涉及细胞或组织的裂解和澄清，裂解物与PIB的孵育，洗脱以及通过蛋白质印迹或基于质谱的方法分析洗脱液（图1）。添加游离 MCLR 可用作区分特定 PIB 粘合剂和非特异性相互作用子的对照。对于大多数应用，无标记方法可用于直接鉴定洗脱液中的蛋白质。在需要更精确地定量或鉴定低丰度物种的情况下，可以使用串联质量标签（TMT）标签进行进一步处理，以增加覆盖范围并减少输入。
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Protocol
注意：PIB的产生是按照Moorhead等人的描述完成的，其中1mg微囊藻毒素和约6 mL琼脂糖偶联产生具有高达5mg / mL17的结合能力的PIB。
1. 样品制备
注意：PIB-MS的典型起始量是每种情况1mg的总蛋白。对于该实验，使用大约2.5×106 个HeLa细胞来提取1mg蛋白质。该计算应针对实验18中使用的每个细胞系或组织进行。如果样品有限且无法获得1 mg，则可以通过PPP亚基检测的轻微损失来减少输入量。或者，可以采用TMT标记来允许在一个样品中混合所有条件，从而提高检测的灵敏度，如步骤9所示。
- 收集组织样本或细胞沉淀。对于细胞沉淀，通过在室温（RT）下以277× g 离心2分钟收集细胞，除去培养基，并用5mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。细胞沉淀可以在-80°C下储存数月。
- 准备裂解缓冲液（500 mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 7.5，0.5%曲里通X-100（体积/体积），5mM β-甘油磷酸二钠盐五水合物，1：500（体积/体积）蛋白酶抑制剂鸡尾酒III）并保持在冰上。制作足够的裂解和清洗所有样品。如果从每种情况的1mg蛋白质开始，则每个样品产生约3 mL缓冲液用于裂解和洗涤。
注意：此步骤中记录的裂解缓冲液是温和的洗涤剂溶液，可能不足以溶解不溶性膜或细胞骨架相关蛋白质。可以探索其他洗涤剂以改善增溶性。测试了一系列NaCl和Triton-X-100浓度，发现上述浓度是低背景和高磷酸酶亚基结合的最佳浓度。 - 向样品中加入冷冻裂解缓冲液。对于1mg蛋白质的裂解，使用1 mL缓冲液。如果样品被冷冻，加入裂解缓冲液，让样品在缓冲液中的冰上解冻。
- 对于细胞，通过超声处理使样品均质化，使细胞在脉冲之间保持在冰上。用三个15秒脉冲以15%的幅度超声处理样品。这可能因所使用的超声仪而异（参见 材料表）。
- 对于组织，首先使用Dounce组织研磨机将样品均质化，以研磨组织直至液化，然后按照步骤1.3.1中所述进行超声处理。
- 通过在4°C下以21，130× g 离心15分钟来澄清不溶性碎片的均质样品。 然后，在不干扰在管侧收集的形成的颗粒或脂质的情况下，将裂解物转移到新管中。如果需要，除去澄清裂解物的100μL预富集样品，并储存在-20°C。 一定要把裂解物放在冰上。
- 根据制造商的说明，通过对每个样品的小等分试样进行蛋白质定量测定（例如双新胆酸测定（BCA），确定每个样品中的总蛋白质含量。确保在BCA测定期间将裂解物保存在冰上。
- 进行BCA测定后，将等量的蛋白质转移到新试管中并用裂解缓冲液稀释，以确保每个试管具有相同浓度的蛋白质（例如，1mg / mL）。如果实验需要PPP抑制剂对照，请为每个样品制备两个具有相同蛋白质含量的等分试样，然后继续步骤1.7。如果不需要 PPP 抑制剂对照，请跳至步骤 2。确保将样品保存在冰上。
注意：在PIB-MS分析中，每种条件使用相等的蛋白质浓度至关重要。PPP 抑制剂对照用于区分 PIB 的特定结合剂与非特异性背景。 - 对于PPP抑制剂对照，用游离MCLR（1μM）处理一个样品，用等体积的DMSO处理另一个样品作为对照。轻轻涡旋样品并将其在冰上孵育15分钟。
注意：裂解物的MCLR处理会阻断PPP催化亚基的结合，但不会阻断与样品中PIB非特异性结合的蛋白质。处理 MCLR 时要小心，因为它是有毒的。请参阅 材料表中的处理注意事项。
2. 准备像素
- 确定实验所需的PIB量。对于1mg蛋白质，可以获得1-3μgPPp和相互作用的蛋白质;每个样品至少使用 10 μL 固体 PIB 树脂，以最大限度地减少磁珠损失。PIB的结合能力为3-5毫克/毫升14，17。
- 将适量的PIB转移到1.5 mL管中，并通过轻轻涡旋，然后在两次洗涤之间以376× g 在室温下离心30秒，用0.5mL裂解缓冲液洗涤3x。在洗涤之间去除裂解缓冲液时，避免移液掉磁珠。
- 通过在洗涤的PIB中加入适量的裂解缓冲液，制成50%PIB /缓冲液（vol/vol）。轻轻地上下移液，并在浆料中旋转移液器尖端以重悬PIB。
- 将20μL浆料转移到已经含有0.5 mL裂解缓冲液的新1.5 mL管中。管中的裂解缓冲液有助于将磁珠从移液器尖端排出。这样做，直到每个样品有足够的管子含有等量的PIB。
- 在室温下以376 x g 旋转试管30秒，确保所有试管都含有等量的珠状树脂。弃去任何上清液，只留下固体树脂，每管中最多留下50μL裂解缓冲液。
3. PIB与裂解物的孵育
- 从步骤1.6转移裂解物。或步骤 1.7.从步骤2到含有PIB的适当标记的管子。用PIB以8rpm旋转裂解物在4°C下1小时。
4. 水准器清洗
- 在4°C下以376× g 离心PIB30秒以收集磁珠。取出并丢弃上清液，如果需要，可节省100μL等分试样用于富集后分析。
- 通过向磁珠中加入0.5 mL裂解缓冲液，倒置管（不推荐涡旋），通过在4°C下以376× g 离心30秒来收集磁珠，并从沉降的磁珠中取出裂解缓冲液，小心不要破坏磁珠沉淀，从而洗涤PIB 3x。
5. 从PIB中洗脱PPP
- 最终洗涤后，尽可能多地除去裂解缓冲液，而不移液任何PIB。制作含有2%SDS（体积/体积）的洗脱缓冲液，并通过添加足够体积的洗脱缓冲液（为PIB体积的4x-5x）从PIB中洗脱PPP。例如，如果使用10μLPIB，请使用50μL洗脱缓冲液。将PIB与洗脱缓冲液在65°C下孵育1小时，以从PIB中洗脱PPP。
- 洗脱后，通过在室温下将管以376× g 离心30秒来收集洗脱液，并将洗脱液移液到单独的管中，注意不要转移任何PIB。使用洗脱液进行蛋白质印迹分析或质谱分析。洗脱液可在 -20 °C 下储存长达数月。
- 要再生PIB以供进一步使用，请将磁珠在2%SDS（体积/体积）中孵育，在室温下以8rpm旋转1小时。在25 mM三氯化碳（pH 7.5）中洗涤3x-5x，每次洗涤旋转30分钟。所有洗涤后，将PIB储存在25mM三盐酸盐（pH 7.5）储存缓冲液中，并含有叠氮化钠（0.05%重量/体积）。
- 通过蛋白质印迹或质谱分析洗脱液。PIB洗脱的质谱分析如下所述。
6. 去除洗涤剂
注意：可以使用各种方法从洗脱液样品中去除洗涤剂以进行MS分析。我们发现Hughes等人描述的单罐固相增强样品制备（SP3）在19中效果很好。
- 从上述步骤5.2中将0.5μL SP3珠加入50μL洗脱液中。以 10：1 （μg：μg） 或至少 0.5 μg/μL（储备溶液为 50 μg/μL）的比例使用 SP3 磁珠。轻轻涡旋珠子并洗脱。
- 向珠洗脱液混合物中加入一个洗脱体积的100%乙醇（例如，如果使用50μL洗脱液，则使用50μL100%乙醇）。将样品在热混合器中孵育5分钟，在24°C下以1000rpm摇动。
- 要收集所有磁珠，请将它们放在磁管架中。一旦磁珠收集，弃去上清液并用0.5 mL 80%乙醇（体积/体积）3x洗涤珠子。对于洗涤，通过涡旋重悬磁珠，通过将磁珠放入磁管架中收集珠子，并在洗涤之间丢弃上清液。
- 用0.5 mL 100%乙腈（ACN）再次洗涤磁珠，以除去所有痕量的乙醇，尽可能多地去除ACN。
7. 蛋白质的消化
- 在166mM HEPES（pH 8.5）中稀释1：100胰蛋白酶（终浓度为0.004μg/ μL），并将30μL该胰蛋白酶溶液加入每个管中，通过涡旋重新吸食。
- 将SP3-胰蛋白酶珠混合物在热混合器中以1000rpm在37°C下孵育5小时或在30°C下过夜。 将管子放在磁性架中以收集磁珠并将消化物取出到新管中。
- 对于无标记分析，通过加入20%三氟乙酸（TFA）（体积/体积）至终浓度为0.2%TFA（体积/体积）来淬灭反应。用pH纸检查每个样品的pH值是否在2-3之间。如果没有，请添加20%TFA的小等分试样，直到达到这一目标。在脱盐之前，样品必须适当酸化。继续执行步骤 8。
- 对于样品的TMT标记，请勿酸化并继续执行步骤9。
8. 脱盐消化液
- 按照 Rappsilber 等人等人的说明，通过用 C18 树脂包装 200 μL MS 溶剂相容性吸头，为每个样品制备一个载物台吸头。使用钝头针按压两个C18材料圆盘，确保圆盘保持在针中。使用细线柱塞将圆盘转移到MS溶剂兼容尖端中，以从针中排出圆盘。
注意：从实验方案的这一点开始使用MS溶剂兼容吸头至关重要，因为其他移液器吸头可能会将化学物质浸入可通过质谱检测的样品中。 - 用30μL100%MeOH平衡每个阶段的吸头，然后用30μL60%MeOH（体积/体积），然后用30μL0.1%TFA（体积/体积）平衡。用注射器将每个溶液推过载物台尖端。如果需要，用透明薄膜将移液器尖端连接到注射器的末端，以增加注射器与载物台尖端之间的接触。切勿让载物台尖端内的 C18 材料变干。
- 将步骤7.3中的酸化肽消化物加入标记的阶段尖端，并用注射器推动阶段尖端，再次注意不要让阶段尖端完全干燥。
- 用30μL 0.1%TFA（体积/体积）洗涤每个样品2倍。通过向每个阶段尖端加入30μL的60%MeOH（vol/vol），并用注射器压力将其全部从尖端排出到新的标记管中，洗脱每个阶段尖端的肽。这是C18材料完全干燥的唯一步骤。
- 通过真空离心干燥每个样品。干燥的肽可以在-20°C下储存数月。样品现在已准备好进行无标记质谱分析。如果需要，仅使用一半样品在质谱仪上进行分析，另一半用于再注射。确保使用适当的质谱仪方法进行分析。
9. 印刷电路板贴标
注意：串联质量标签用于多重检测样品以进行定量分析。一瓶0.8毫克的TMT试剂足以标记高达0.8毫克的蛋白质21。在从1mg蛋白质开始的PIB下拉实验中，获得1-3μg磷酸蛋白亚基。以下方案是多达10μg蛋白质的最佳方案。
- 在80μL无水ACN中重建一个0.8mg的TMT试剂小瓶。
- 使用不同的TMT标签标记步骤7.4中的每个样品，最多可标记18个通道。请务必注意将哪个TMT标签添加到每个样品中。向肽消化液中加入2μLTMT试剂和2μLACN，轻轻涡旋混合，在室温下以376× g 离心30秒以收集样品，并在室温下孵育1小时以标记样品。
- 为了测试TMT标记效率，通过在含有9μLLC LC-MS级水和1μL 10%羟胺（vol / vol）的0.5 mL管中混合1μL每种标记反应来制作标记检查样品以淬灭反应。将剩余的未淬灭的标记样品放入-80°C冰箱中。样品可以储存数天，同时评估标记效率。
- 通过加入30μL0.1%TFA（体积/体积）来酸化TMT标签检查样品。检查pH值是否在2-3之间。如果没有，加入20%TFA（体积/体积），直到达到该pH值。通过载物台倾倒对标签检查样品进行脱盐，如步骤8.1.-8.5中所述。
- 在质谱仪上分析TMT标记检查样品以评估标记效率。将搜索结果过滤到肽水平上1%的错误发现率（FDR），并确定标记效率21，22。
- 完全TMT标记的肽在N端和所有赖氨酸处都有TMT试剂。量化TMT报告离子强度，并比较所有通道的总和。当标记所有肽的>95%并且TMT报告离子和强度相当时，样品被充分标记
注意：除了不完整的标记外，总和的TMT报告离子强度的差异可能是1μL测试样品移液不准确的结果。它也可以反映真实的生物学观察，在这种情况下，所有重复都应表现出相同的行为。 - 从-80°C储存中取出未淬灭的样品并将其解冻。如果它们没有完全标记，如上所述，向样品中加入1μL适当的TMT试剂，孵育1小时，然后重复TMT标记检查。如果样品已完全标记，请继续执行步骤 9.8。
- 完全标记后，向TMT反应中加入2μL 10%羟胺（体积/体积）以淬灭标记。将样品在室温下孵育15分钟。淬火后，样品可以在-80°C下储存数月。
- 合并所有淬灭的TMT通道，加入2μL 20%TFA（体积/体积）以酸化反应。检查组合反应的pH值，确保其pH值在2-3之间。如果没有，加入20%TFA的小等分试样，直到达到所需的pH值。这对于适当的脱盐至关重要。
- 通过真空离心30分钟除去ACN，并按如下所述对样品进行脱盐。
10. TMT标记的组合样品脱盐
- 使用具有适当蛋白质容量的SPE C18脱盐板（2mg吸附剂通常足以用于此应用）来脱盐组合的TMT试剂。用200微升60%甲基OH（体积/体积）和200μL10%甲基OH / 0.1%TFA（体积/体积）平衡孔。
- 从步骤9.10加载酸化的TMT标记肽。到脱盐板上。用200μL10%甲基OH / 0.1%TFA（体积/体积）洗涤样品孔2x。
- 用100μL 60%MeOH（体积/体积）洗脱肽。通过真空离心干燥样品。干燥的TMT标记样品可以在-80°C下储存数月。
- 对于TMT标记样品的质谱分析，如果需要回注，则注入一半样品并保存另一半。
注意：质谱仪上的进样量将根据特定色谱柱，仪器设置和样品类型而变化。
11. 数据分析
注意：数据过滤和分析的方法各不相同，超出了本协议的范围，但包括以下有关分析的说明，以提供特定于该协议生成的数据类型的指导。
- 根据所用样品细胞或组织的来源，针对物种特异性蛋白质组数据库搜索原始质谱数据。在这里，彗星被用作搜索算法23。
- 通过调整搜索算法22的1%FDR过滤搜索结果。对于无标记定量，请使用 MS1 峰面积测量来量化数据。对于TMT标记的样品，使用MSn衍生的报告离子强度进行定量。对于统计显著性，请一式三份分析样品。
- 为了 从头 鉴定PPP亚基及其相互作用者，请确保比较MCLR抑制和DMSO处理的样品的一式三份的生物样品。为了比较不同条件下或药物治疗时的PPPome，确保产生每种条件或药物治疗的生物三份。
- 过滤数据，以便在三个DMSO对照处理的样品中的至少两个中仅存在总肽计数为>1的蛋白质。MCLR竞争并不总是竞争所有催化亚基结合。此外，一些PPP催化亚基可能不特异性地粘附在琼脂糖树脂上。为了在过滤掉与树脂非特异性结合的蛋白质时考虑任何一种可能性，在MCLR处理条件下去除总肽计数高于任何PPP催化亚基的蛋白质。
- 从分析中排除常见的污染物，如角蛋白，胶原蛋白，40S和60S核糖体蛋白，以及非PPP亚基的异质核糖核蛋白14。
- 通过单击加载部分中的 通用矩阵上传 将过滤后的数据导入英仙座24，25。Log2 通过转到 基本>转换，选择数据并指定转换函数（在本例中为 log2（x））来转换数据。
- 通过转到 “插补”>替换正态分布中的缺失值，选择数据，然后指定计算的宽度（默认 0.3）和下移位（默认 1.8），来插补正态分布中的缺失值。通过转到归一化 >分位数规范化来执行分位数规范化。
- 计算相应条件下的对数2 比率和学生的 T 检验 p 值。首先，通过转到 “注释行”>分类注释行“来批注数据。通过转到 检验>双样本检验，然后选择要比较的组、要执行的检验以及用于截断的多重假设检验校正方法，来执行 T 检验。
注意：对于 从头 鉴定，如果一种蛋白质的丰度在MCLR处理的与DMSO条件下具有统计学意义，则认为该蛋白质具有统计学意义，其对数变化比任何特异性结合的已知PPP亚基的最小折叠变化大2倍。
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Representative Results
图2：鉴定特定的PIB粘合剂（A）可以通过PIB-MS分析各种组织类型或细胞。生物一式三份的HeLa细胞用DMSO或PPP抑制剂MCLR处理，与PIB一起孵育，并通过LC-MS / MS进行分析。PPP催化亚基被标记为蓝色并显示为蓝色。新的候选PPP亚基或相互作用的蛋白质以黑色显示。非特异性粘合剂以灰色显示。（C）用DMSO处理的HeLa细胞裂解物的两个生物重复的对数2区域的散点图，以证明富集的再现性。PIB的特定粘合剂以红色显示。请点击此处查看此图的大图。
图3：在HeLa细胞中鉴定的所有PPP亚基和PPP相互作用蛋白的网络分析。 在有或没有 MCLR 的 HeLa PIB 下拉中，这些蛋白质被发现是特异性 PIB 相互作用子。 请点击此处查看此图的大图。
为了证明PIB的性能，我们在HeLa细胞中进行了PIB下拉实验，以鉴定PPP及其相互作用子（图2A）。HeLa细胞一式三份生长并裂解。将每个一式三份裂解物分成两半，其中一半用MCLR处理15分钟，以防止在进行PIB富集之前PPP催化亚基或DMSO的结合。PIB富集后，对DMSO处理的样品和MCLR处理的样品中定量的蛋白质丰度进行了无标记比较，以区分特异性和非特异性相互作用子（图2B）。在分析中，我们检测到所有对MCLR敏感的PPP催化亚基PP PP1卡，PP1cb，PP1cc，PP2Aca，PP2Acb，PP4c，PP5c和PP6c。在DMSO处理的样品中，丰度（蛋白质定量的对数2 区域）高度相关，表明重现性（图2C），但在用MCLR处理时，PPP催化亚基或PPP相互作用的蛋白质丰度在PIB下拉下大大减少（图2B）。在该分析中，我们鉴定了92个PPP亚基和特定的PPP相互作用子（参见 补充表1），这与先前在HeLa细胞14 中的PIB-MS分析相当（图3）。
补充表1：具有代表性的PIB-MS分析的MS数据。请按此下载此表格。
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Discussion
PIB-MS是一种化学蛋白质组学方法，用于在单次分析中定量分析来自各种样品来源的PPPome。使用激酶抑制剂磁珠已经做了很多工作来研究运动组以及它在癌症和其他疾病状态下如何变化10，11，12，13。然而，对PPPome的研究却落后了。我们预计这种方法能够填补这一空白，并阐明细胞脱磷酸化的调节。在这里，我们表明，使用PIB，我们可以富集PP1，PP2A，PP4，PP5和PP6的催化和非催化组分。我们还能够在各种细胞系、组织类型和生物体中鉴定新的候选PPP相互作用物。
PIB-MS协议中有几个关键步骤不容忽视。这些包括加入适当的对照和重复，在所有样品中输入等量的蛋白质，在样品制备期间保持非变性条件，用PIB孵育样品以及洗涤PIB。关于对照和重复，如果目标是鉴定新的PPP亚基和相互作用子，则每个样品的一半用PPP抑制剂处理是很重要的。这是区分特定和非特定PIB相互作用子所必需的。如果试图确定已知的PPP亚基或PPP相互作用子表达如何在细胞或组织类型和细胞周期阶段或各种药物治疗中发生变化，那么整理已知PPP亚基和相互作用子的列表以进行比较至关重要。此外，这些实验通常一式三份进行，以确保统计上的可信度。每个样品的蛋白质输入相等对于样品之间的数据再现性至关重要。它还确保PPP亚基或相互作用子丰度的差异不仅仅是由于蛋白质输入的差异。必须使用BCA等蛋白质测定来确定每个样品中的蛋白质浓度。最后，样品制备、PIB富集和PIB洗涤中的非变性条件对于确保蛋白质保持其天然状态至关重要。这保留了PPP亚基相互作用。
PIB-MS是用于询问PPPome的强大工具，但它有几个限制。PIB可以富集PP1，PP2A，PP4，PP5和PP6的催化和非催化组分，但不能富集PP2B或PP7，因为MCLR在纳摩尔浓度下不会抑制这些磷酸酶。重要的是要注意，该工具适用于易于识别和定量内源性，MCLR敏感的PPP全息酶，例如所指出的那些。PIB-MS无法检测被阻断PPP活性位点的内源性PPP抑制剂抑制的PPP全酶，例如α4和SET14。该技术不需要标记的PPP亚基的外源性表达或使用PPP特异性抗体。与使用基于琼脂糖的基质的其他亲和力富集策略一样，PIB-MS容易与非特异性蛋白质结合。然而，添加游离MCLR作为阴性对照可以区分特异性和非特异性相互作用子，从而能够鉴定新的PPP亚基和相互作用的蛋白质。此外，非特异性相互作用可以通过额外的洗涤和谨慎使用适量的PIB来减少。
我们使用PIB-MS来比较各种癌细胞系的PPP表达模式，包括乳腺癌和胶质母细胞瘤14。我们发现这些癌症类型具有独特的PPP表达模式，表明其起源14。PPP是最保守的酶之一2，3。我们能够证明PIB-MS在分析酵母和小鼠组织中的PPPome方面是有效的14。PIB-MS还可用于鉴定各种条件下PPP表达模式的差异，例如相间和有丝分裂样品15。因此，PIB-MS提供了对磷酸蛋白磷酸酶网络的见解，并扩展了我们对多种细胞系和疾病状态的PPP调节以及药物治疗的理解。
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Disclosures
作者没有什么可披露的，也没有利益冲突。
Acknowledgments
A.N.K.感谢NIH R33 CA225458和R35 GM119455的支持。我们感谢凯滕巴赫和格伯实验室的有益讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Honeywell | AH015-4 | CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Anhydrous Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | model no. 5424 | |
| Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate | Acros Organics | 410991000 | |
| Centrifuge | Eppendorf | model no. 5810 R 15 amp version | |
| Distilled water | |||
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Dounce tissue grinder | Fisherbrand Pellet Pestles | 12-141-363 | |
| Empore solid phase extraction disk, C18 | CDS Analytical | 76333-132 | |
| Eppendorf tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis. |
| Eppendorf tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363352 | CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis. |
| Extraction plate manifold | Waters | WAT097944 | |
| Falcon tubes, 50 mL | VWR | 21008 | |
| Generic blunt end needle and plunger | |||
| Generic magnetic separation rack | |||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen chloride (HCl) | VWR Chemicals BDH | BDH3028 | CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood. |
| Hydroxylamine solution 50% (wt/vol) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Incubator, 65 °C | VWR | model no. 1380FM | |
| Koptec Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | V1001 | |
| Methanol for HPLC (MeOH) | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Microcystin LR (MCLR) | Cayman Chemical | 10007188 | CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact. |
| PBS, 1× without calcium and magnesium, pH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | |
| pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers | Fisher Scientific | M1095310001 | |
| PIBs | For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007. | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pipette tips, 10 μL | Eppendorf | 22491504 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| Pipette tips, 1000 μL | Eppendorf | 22491555 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| Pipette tips, 200 μL | Eppendorf | 22491539 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| plastic syringe, 10 mL | BD | 309604 | |
| Protease inhibitor cocktail III | Research Products International | P50700-1 | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Refrigerated benchtop centrifuge | Eppendorf | model no. 5424 R | |
| Rotator (Labquake Shaker Rotisserie) | Thermo Scientific | 13-687-12Q | 8 rpm rotation |
| Sample collection plate, 96- well, 1 mL | Waters | WAT058957 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP1311-1 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511C | |
| Sodium azide | EMD Chemicals | SX0299-1 | CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals. |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S27110 | |
| Sonicator (Branson digital sonifier) | model no. SFX 250 | ||
| SPE C18 desalting plate | Waters | 186001828BA | |
| SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads) | Cytiva | 6.51521E+13 | |
| Thermomixer | Eppendorf | model no. 5350 | |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 × 0.8 mg per tag | ThermoFisher | A37725 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Honeywell | T6508-25ML | CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood. |
| Tris Base | Research Products International | T60040 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Vacuum centrifuge and vapor trap | Thermo Scientific | model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105 | |
| Vortexer (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries | ||
| Water LC-MS | Honeywell | LC365-4 |
References
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