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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Un enfoque basado en la espectrometría de masas para identificar fosfoproteínas fosfatasas y sus interactores

Published: April 29, 2022 doi: 10.3791/63805
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Geisel School of Medicine at Dartmouth, 2Norris Cotton Cancer Center

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para el enriquecimiento de fosfoproteínas fosfatasas endógenas y sus proteínas que interactúan a partir de células y tejidos y su identificación y cuantificación mediante proteómica basada en espectrometría de masas.

Abstract

La mayoría de los procesos celulares están regulados por la fosforilación dinámica de proteínas. Más de tres cuartas partes de las proteínas están fosforiladas, y las fosfoproteínas fosfatasas (APP) coordinan más del 90% de toda la desfosforilación celular de serina/treonina. La desregulación de la fosforilación de proteínas se ha implicado en la fisiopatología de diversas enfermedades, incluyendo el cáncer y la neurodegeneración. A pesar de su actividad generalizada, los mecanismos moleculares que controlan las APP y los controlados por las APP están mal caracterizados. Aquí, se describe un enfoque proteómico denominado perlas inhibidoras de la fosfatasa y espectrometría de masas (PIB-MS) para identificar y cuantificar las APP, sus modificaciones posttraduccionales y sus interactores en tan solo 12 h utilizando cualquier línea celular o tejido. PIB-MS utiliza un inhibidor de PPP no selectivo, microcistina-LR (MCLR), inmovilizado en perlas de sefarosa para capturar y enriquecer ppp endógenos y sus proteínas asociadas (denominado PPPome). Este método no requiere la expresión exógena de versiones etiquetadas de PPP ni el uso de anticuerpos específicos. PIB-MS ofrece una forma innovadora de estudiar las APP conservadas evolutivamente y ampliar nuestra comprensión actual de la señalización de desfosforilación.

Introduction

La fosforilación de proteínas controla la mayoría de los procesos celulares, incluyendo pero no limitado a la respuesta al daño del ADN, la señalización del factor de crecimiento y el paso a través de la mitosis 1,2,3. En las células de mamíferos, la mayoría de las proteínas se fosforilan en uno o más residuos de serina, treonina o tirosina en algún momento, con fosfoserinas y fosfotreoninas que comprenden aproximadamente el 98% de todos los sitios de fosforilación 2,3. Si bien las quinasas se han estudiado ampliamente en la señalización celular, el papel de las APP en la regulación de los procesos celulares dinámicos aún está emergiendo.

La dinámica de fosforilación está controlada por la interacción dinámica entre las quinasas y las fosfatasas. En las células de mamíferos, hay más de 400 proteínas quinasas que catalizan la fosforilación de serina/treonina. Más del 90% de estos sitios están desfosforilados por fosfoproteínas fosfatasas (APP), una pequeña familia de enzimas que consiste en PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT y PPZ 2,3. PP1 y PP2A son responsables de la mayoría de la desfosforilación de fosfoserina y fosfotreonina dentro de una célula 2,3,4. La notable diferencia de número entre quinasas y fosfatasas y la falta de especificidad de las subunidades catalíticas de PPP in vitro llevaron a la creencia de que las quinasas son el principal determinante de la fosforilación 2,3. Sin embargo, múltiples estudios han demostrado que las fosfatasas establecen la especificidad del sustrato a través de la formación de holoenzimas multiméricas 5,6,7,8,9. Por ejemplo, PP1 es un heterodímero que consiste en una subunidad catalítica y, en un momento dado, una de las más de 150 subunidades reguladoras 6,7,8. Por el contrario, PP2A es un heterotrímero que está formado por un andamio (A), un regulador (B) y una subunidad catalítica (C) 2,3,9. Hay cuatro familias distintas de subunidades reguladoras de PP2A (B55, B56, PR72 y estriatina), cada una con múltiples genes, variantes de empalme y patrones de localización 2,3,9. La naturaleza multimérica de las APP llena el vacío en el número de quinasas y subunidades catalíticas de PPP. Sin embargo, crea desafíos analíticos para estudiar la señalización de PPP. Para analizar exhaustivamente la señalización de PPP, es fundamental investigar las diversas holoenzimas dentro de una célula o tejido. Se han logrado grandes avances en el estudio del quinasmo humano mediante el uso de perlas inhibidoras de la quinasa, denominadas perlas inhibidoras multiplex o quinabiadas, una estrategia proteómica química donde los inhibidores de la quinasa se inmovilizan en perlas y se utiliza la espectrometría de masas para identificar quinasas enriquecidas y sus interactores 10,11,12,13.

Hemos establecido un enfoque similar para estudiar la biología de la PPP. Esta técnica consiste en la captura por afinidad de subunidades catalíticas de PPP utilizando perlas con un inhibidor de PPP inmovilizado y no selectivo llamado microcistina-LR (MCLR) denominado perlas inhibidoras de la fosfatasa (PIBs)14,15. A diferencia de otros métodos que requieren el etiquetado endógeno o la expresión de subunidades exógenas de PPP que podrían alterar la actividad o localización de proteínas, PIB-MS permite el enriquecimiento de subunidades catalíticas endógenas de PPP, sus subunidades reguladoras y de andamiaje asociadas, y proteínas que interactúan (denominadas PPPome) de células y tejidos en un punto de tiempo dado o bajo condiciones de tratamiento específicas. MCLR inhibe PP1, PP2A, PP4-6, PPT y PPZ a concentraciones nanomolares, lo que hace que los PIB sean altamente efectivos para enriquecer el PPPome16. Este método se puede escalar para su uso en cualquier material de partida, desde células hasta muestras clínicas. Aquí, describimos en detalle el uso de PIBs y espectrometría de masas (PIB-MS) para capturar, identificar y cuantificar eficientemente el PPPome endógeno y sus estados de modificación.

Figure 1
Figura 1: Resumen visual del protocolo PIB-MS. En un experimento PIB-MS, se pueden obtener muestras en varias formas, desde células hasta tumores. La muestra se recoge, se lisa y homogeneiza antes del enriquecimiento con PPP. Para enriquecer para las APP, el lisado se incuba con PIBs con o sin un inhibidor de PPP, como MCLR. Los PIB se lavan y las APP se eluyen en condiciones de desnaturalización. Las muestras se preparan para el análisis de espectrometría de masas mediante la eliminación de detergentes a través del enriquecimiento de proteínas SP3, la digestión tríptica y la desalinización. Las muestras pueden ser opcionalmente marcadas con TMT antes del análisis de espectrometría de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

PIB-MS implica lisis y clarificación de células o tejidos, incubación del lisado con PIBs, elución y análisis del eluido a través de western blotting o enfoques basados en espectrometría de masas (Figura 1). La adición de MCLR libre se puede utilizar como un control para distinguir aglutinantes ESPECÍFICOS de PIB de interactores no específicos. Para la mayoría de las aplicaciones, se puede utilizar un enfoque sin etiquetas para identificar directamente las proteínas en los eluidos. En los casos en que se necesita una mayor precisión en la cuantificación o la identificación de especies de baja abundancia, se puede utilizar un procesamiento adicional con etiquetado de etiqueta de masa en tándem (TMT) para aumentar la cobertura y disminuir la entrada.

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Protocol

NOTA: La generación de PIBs se realiza según lo descrito por Moorhead et al., donde se acoplan 1 mg de microcistina y aproximadamente 6 mL de sefarosa para generar PIBs con una capacidad de unión de hasta 5 mg / mL17.

1. Preparación de la muestra

NOTA: Una cantidad inicial típica para PIB-MS es 1 mg de proteína total por condición. Para este experimento, se utilizaron aproximadamente 2,5 x 106 células HeLa para extraer 1 mg de proteína. Este cálculo debe realizarse para cada línea celular o tejido que se utilice en un experimento18. Si la muestra es limitada y no se puede obtener 1 mg, la cantidad de entrada se puede reducir con una pérdida menor de detección de subunidades PPP. Alternativamente, se puede emplear el etiquetado TMT para permitir la mezcla de todas las condiciones en una muestra, aumentando la sensibilidad de detección como se muestra en el Paso 9.

  1. Recolectar muestras de tejido o gránulos celulares. Para los gránulos celulares, recolecte las células por centrifugación a 277 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente (RT), retire los medios y lave las células con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los pellets celulares pueden almacenarse a -80 °C durante varios meses.
  2. Preparar tampón de lisis (500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5% Triton X-100 (vol/vol), 5 mM de sal disódica de ácido disódico 5 mM, cóctel inhibidor de proteasa 1:500 (vol/vol) III) y mantener en hielo. Hacer lo suficiente para lisar y lavar todas las muestras. Si comienza con 1 mg de proteína por condición, haga aproximadamente 3 ml de tampón por muestra para lisis y lavados.
    NOTA: El tampón de lisis indicado en este paso es una solución detergente suave, que puede no ser suficiente para solubilizar la membrana insoluble o las proteínas asociadas a citoesqueléticos. Se podrían explorar otros detergentes para mejorar la solubilización. Se probó un rango de concentraciones de NaCl y Triton-X-100, y se encontró que las concentraciones anteriores eran óptimas para la unión de subunidades de bajo fondo y alta fosfatasa.
  3. Agregue tampón de lisis refrigerado a las muestras. Para la lisis de 1 mg de proteína, use 1 ml de tampón. Si la muestra está congelada, agregue el tampón de lisis y deje que la muestra se descongele en el hielo en el tampón.
    1. Para las células, homogeneice las muestras a través de la sonificación, manteniendo las células en hielo entre pulsos. Sonicar las muestras a una amplitud del 15% con tres pulsos de 15 s. Esto puede variar según el sonicador utilizado (consulte la Tabla de materiales).
    2. Para los tejidos, homogeneice las muestras primero usando una amoladora de tejido Dounce para moler el tejido hasta que se licucie antes de sonicar como se describe en el Paso 1.3.1.
  4. Clarificar la muestra homogeneizada de residuos insolubles por centrifugación a 21.130 x g durante 15 min a 4 °C. Luego, sin alterar los gránulos formados o los lípidos que se han acumulado en el costado de los tubos, transfiera los lisados a nuevos tubos. Retire 100 μL de la muestra de preenriquecimiento del lisado clarificado si lo desea y guárdela a -20 °C. Asegúrese de mantener los lisados en hielo.
  5. Determine el contenido total de proteínas en cada muestra realizando un ensayo de cuantificación de proteínas, como un ensayo de ácido bicinconinico (BCA), en una pequeña alícuota de cada muestra, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que los lisados se mantengan en hielo durante el ensayo de BCA.
  6. Después de realizar el ensayo de BCA, transfiera una cantidad equivalente de proteína a nuevos tubos y diluya con tampón de lisis para asegurarse de que cada tubo tenga la misma concentración de proteína (por ejemplo, 1 mg / ml). Si el experimento requiere un control de inhibidores de PPP, prepare dos alícuotas de cada muestra que tengan el mismo contenido de proteína y proceda al Paso 1.7. Si no se necesitan controles de inhibidores de PPP, vaya al Paso 2. Asegúrese de que las muestras se mantengan en hielo.
    NOTA: Es fundamental que se utilicen concentraciones iguales de proteínas por condición en un análisis PIB-MS. Los controles de inhibidores de PPP se utilizan para distinguir aglutinantes específicos de los PIB del fondo no específico.
  7. Para el control del inhibidor de PPP, tratar una muestra con MCLR libre (1 μM) y la otra con un volumen igual de DMSO como control. Vórtice las muestras suavemente e incube en hielo durante 15 minutos.
    NOTA: El tratamiento MCLR de los lisados bloquea la unión de las subunidades catalíticas de PPP, pero no las proteínas que se unen no específicamente a los PIB en las muestras. Tenga cuidado al manipular MCLR, ya que es tóxico. Consulte las precauciones de manipulación en la Tabla de materiales.

2. Preparación de los PIB

  1. Determine la cantidad de PIB necesarios para el experimento. Para 1 mg de proteína, se pueden obtener 1-3 μg de PPP y proteínas que interactúan; utilizar al menos 10 μL de resina sólida de PIBs por muestra para minimizar la pérdida de perlas. La capacidad de unión de los PIBs es de 3-5 mg/mL14,17.
  2. Transfiera la cantidad adecuada de PIBs a un tubo de 1.5 mL y lávelos 3x con 0.5 mL de tampón de lisis mediante vórtice suavemente y luego centrifugando a 376 x g durante 30 s a RT entre lavados. Evite pipetear las perlas al quitar el tampón de lisis entre lavados.
  3. Haga una solución de PIB/tampón al 50% (vol/vol) agregando una cantidad adecuada de tampón de lisis a los SIP lavados. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y gire la punta de la pipeta en la suspensión para volver a suspender los PIB.
  4. Transfiera 20 μL de la suspensión a un nuevo tubo de 1,5 ml que ya contenga 0,5 ml de tampón de lisis. El tampón de lisis en el tubo ayuda a expulsar las cuentas de la punta de la pipeta. Haga esto hasta que haya suficientes tubos que contengan una cantidad igual de PIB para cada muestra.
  5. Gire los tubos a 376 x g durante 30 s en RT. Asegúrese de que todos los tubos contengan una cantidad igual de resina de perlas. Deseche cualquier sobrenadante, dejando solo resina sólida y un máximo de 50 μL de tampón de lisis en cada tubo.

3. Incubación de PIBs con lisados

  1. Transfiera los lisados del paso 1.6. o Paso 1.7. al tubo debidamente etiquetado que contiene los SIP del Paso 2. Gire el lisado a 8 rpm con los PIBs durante 1 h a 4 °C.

4. Lavado de PIBs

  1. Centrifugar los PIBs a 376 x g durante 30 s a 4 °C para recoger las perlas. Retire y deseche el sobrenadante, guardando una alícuota de 100 μL para el análisis posterior al enriquecimiento, si lo desea.
  2. Lave los PIBs 3x agregando 0.5 mL de tampón de lisis a las perlas, invirtiendo los tubos (no se recomienda el vórtice), recolectando las perlas por centrifugación a 376 x g durante 30 s a 4 ° C y retirando el tampón de lisis de las perlas asentadas, teniendo cuidado de no interrumpir el pellet de perlas.

5. Elución de las APP de los PIB

  1. Después del lavado final, retire la mayor cantidad posible del tampón de lisis sin pipetear ninguno de los PIB. Haga un búfer de elución que contenga 2% de SDS (vol/vol) y eluya las PPP de los PIB agregando suficiente volumen de búfer de elución para que sea 4x-5x el volumen de PIBs. Por ejemplo, si se utilizan 10 μL de PIBs, use 50 μL de tampón de elución. Incubar los PIB con el tampón de elución a 65 °C durante 1 h para eludir los PPP de los SIP.
  2. Después de la elución, recoja el eluido centrifugando los tubos a 376 x g durante 30 s en RT y pipeteando el eluido en un tubo separado, teniendo cuidado de no transferir ningún PIB. Utilice el eluido para el análisis de western blot o para los análisis de espectrometría de masas. Los eluados se pueden almacenar a -20 °C durante un máximo de varios meses.
  3. Para regenerar los PIBs para su uso posterior, incube las perlas en SDS al 2% (vol/vol), girando a 8 rpm a RT durante 1 h. Lavarlos 3x-5x en 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) con rotación durante 30 min por lavado. Después de todos los lavados, guarde los SIP en tampón de almacenamiento Tris-HCl (pH 7.5) de 25 mM con azida de sodio (0.05% en peso / vol).
  4. Analizar los eluidos mediante western blotting o espectrometría de masas. El análisis de espectrometría de masas de los eluados del PIB se describe a continuación.

6. Eliminación de detergentes

NOTA: Se pueden utilizar varios enfoques para eliminar el detergente de las muestras eluidas para el análisis de EM. Encontramos que la preparación de muestras mejoradas en fase sólida (SP3) de una sola olla, descrita por Hughes et al., funciona bien19.

  1. Agregue 0.5 μL de perlas SP3 a 50 μL de eluido del Paso 5.2 anterior. Utilice perlas SP3 en una proporción de 10:1 (μg:μg) o al menos 0,5 μg/μL (la solución madre es de 50 μg/μL). Vórtice suavemente las cuentas y eluite.
  2. Agregue un volumen de elución de etanol al 100% a la mezcla de perlas y eluidos (por ejemplo, si se usaron 50 μL del eluido, use 50 μL de etanol al 100%). Incubar las muestras durante 5 min en un termomezclador configurado para agitar a 1000 rpm a 24 °C.
  3. Para recoger todas las perlas, colóquelas en un estante de tubos magnéticos. Una vez que las perlas se acumulen, deseche el sobrenadante y lave las perlas con 0,5 ml de etanol al 80% (vol/vol) 3x. Para el lavado, resuspender las perlas por vórtice, recoger las perlas colocándolas en el estante de tubos magnéticos y desechar el sobrenadante entre lavados.
  4. Lave las perlas una vez más con 0,5 ml de acetonitrilo 100% (ACN) para eliminar todos los rastros de etanol, eliminando la mayor cantidad de ACN posible.

7. Digestión de proteínas

  1. Hacer una dilución 1:100 de tripsina (concentración final de 0.004 μg/μL) en 166 mM HEPES (pH 8.5) y agregar 30 μL de esta solución de tripsina a cada tubo con las perlas, resuspensándose por vórtice.
  2. Incubar la mezcla de perlas de SP3-tripsina en el termomezclador a 1000 rpm a 37 °C durante 5 h o durante la noche a 30 °C. Coloque los tubos en la rejilla magnética para recoger las perlas y retire los resúmenes a los tubos nuevos.
  3. Para el análisis sin etiqueta, apague la reacción agregando ácido trifluoroacético (TFA) al 20% (vol/vol) a una concentración final de TFA al 0,2% (vol/vol). Compruebe que el pH de cada muestra esté entre 2-3 con un papel de pH. De lo contrario, agregue pequeñas alícuotas adicionales del 20% de TFA hasta que esto se logre. Las muestras deberán estar adecuadamente acidificadas antes de su desalinización. Continúe con el paso 8.
  4. Para el etiquetado TMT de las muestras, no acidifique y continúe con el Paso 9.

8. Desalinizar el digesto

  1. Preparar una punta de etapa para cada muestra empacando una punta compatible con disolvente MS de 200 μL con resina C18 como lo describen Rappsilber et al.20. Use una aguja roma para presionar dos discos de material C18, asegurándose de que los discos permanezcan en la aguja. Transfiera los discos a la punta compatible con disolvente MS utilizando un émbolo de alambre delgado para expulsar los discos de la aguja.
    NOTA: Es fundamental utilizar puntas compatibles con disolventes MS a partir de este punto del protocolo, ya que otras puntas de pipeta pueden lixiviar productos químicos en las muestras que se pueden detectar a través de espectrometría de masas.
  2. Equilibre cada punta de etapa con 30 μL de 100% MeOH, luego con 30 μL de 60% De MeOH (vol/vol), seguido de 30 μL de 0.1% de TFA (vol/vol). Empuje cada solución a través de la punta del escenario con una jeringa. Coloque una punta de pipeta en el extremo de una jeringa con una película transparente para aumentar el contacto entre la jeringa y la punta del escenario si es necesario. Asegúrese de nunca dejar que el material C18 dentro de la punta del escenario se seque.
  3. Agregue la digestión del péptido acidificado del paso 7.3 a la punta de la etapa etiquetada y empuje a través de la punta de la etapa con una jeringa, nuevamente teniendo cuidado de no dejar que la punta de la etapa se seque por completo.
  4. Lavar cada muestra 2x con 30 μL de AGT al 0,1% (vol/vol). Eluya los péptidos de cada punta de etapa agregando 30 μL de 60% de MeOH (vol / vol) a cada punta de etapa y expulsándolo todo de la punta con presión de jeringa en un nuevo tubo etiquetado. Este es el único paso donde el material C18 se seca por completo.
  5. Secar cada muestra por centrifugación al vacío. Los péptidos secos se pueden almacenar a -20 ° C durante varios meses. Las muestras ya están listas para el análisis de espectrometría de masas sin etiquetas. Utilice solo la mitad de la muestra para el análisis en el espectrómetro de masas y la otra mitad para la reinyección si es necesario. Asegurar el uso de un método de espectrómetro de masas apropiado para el análisis.

9. Etiquetado TMT

NOTA: El etiquetado de etiquetas de masa en tándem se utiliza para multiplexar muestras para análisis cuantitativos. Un vial de 0,8 mg de reactivo TMT es suficiente para etiquetar hasta 0,8 mg de proteína21. En un experimento de reducción de PIB que comienza con 1 mg de proteína, se obtienen 1-3 μg de subunidades de fosfoproteína. El siguiente protocolo es óptimo para hasta 10 μg de proteína.

  1. Reconstituir un vial de 0,8 mg de reactivo TMT en 80 μL de ACN anhidro.
  2. Etiquete cada muestra del paso 7.4 con una etiqueta TMT diferente para un máximo de 18 canales. Asegúrese de anotar qué etiqueta TMT se agrega a cada muestra. Añadir 2 μL del reactivo TMT y 2 μL de ACN a la digestión peptídica, mezclar suavemente el vórtice, centrifugar a 376 x g durante 30 s en RT para recoger la muestra, e incubar en RT durante 1 h para etiquetar la muestra.
  3. Para probar la eficiencia del etiquetado TMT, haga una muestra de verificación de etiquetas combinando 1 μL de cada reacción de etiquetado en un tubo de 0,5 ml que contenga 9 μL de agua de grado LC-MS y 1 μL de hidroxilamina al 10% (vol / vol) para apagar la reacción. Coloque las muestras etiquetadas restantes sin excar en un congelador de -80 °C. Las muestras se pueden almacenar durante varios días mientras se evalúa la eficiencia del etiquetado.
  4. Acidifique la muestra de verificación de la etiqueta TMT agregando 30 μL de TFA al 0.1% (vol / vol). Compruebe que el pH está entre 2-3. De lo contrario, agregue un 20% de TFA (vol/vol) hasta que se logre este pH. Desalar la muestra de verificación de etiquetas mediante la inclinación de etapas, como se describe en los pasos 8.1.-8.5.
  5. Analice la muestra de verificación de etiquetas TMT en el espectrómetro de masas para evaluar la eficiencia del etiquetado. Filtre los resultados de la búsqueda a una tasa de descubrimiento falso (FDR) del 1% a nivel de péptido y determine la eficiencia de etiquetado21,22.
  6. Los péptidos totalmente marcados con TMT tienen reactivo TMT en el extremo N y en todas las lisinas. Cuantifique las intensidades de iones del informador TMT y compare su suma total en todos los canales. La muestra está suficientemente etiquetada cuando >95% de todos los péptidos están etiquetados y las intensidades de suma de iones del informador TMT son comparables
    NOTA: Además del etiquetado incompleto, las diferencias en las intensidades de iones del informador TMT sumado podrían ser el resultado de un pipeteo inexacto de la muestra de prueba de 1 μL. También podría reflejar una verdadera observación biológica, en cuyo caso todas las réplicas deberían mostrar el mismo comportamiento.
  7. Retire las muestras sin exprimir del almacenamiento a -80 °C y descongelarlas. Si no están completamente etiquetados, agregue 1 μL del reactivo TMT apropiado a la muestra como se indicó anteriormente, incube durante 1 h y repita la verificación de la etiqueta TMT. Si las muestras están completamente etiquetadas, continúe con el paso 9.8.
  8. Cuando esté completamente etiquetado, agregue 2 μL de hidroxilamina al 10% (vol/vol) a las reacciones TMT para apagar el etiquetado. Incubar las muestras en RT durante 15 min. Una vez apagadas, las muestras pueden almacenarse a -80 °C durante varios meses.
  9. Combine todos los canales TMT apagados y agregue 2 μL de TFA al 20% (vol/ vol) para acidificar la reacción. Compruebe el pH de la reacción combinada, asegurándose de que esté entre pH 2-3. De lo contrario, agregue pequeñas alícuotas de 20% de TFA hasta que se alcance el pH deseado. Esto es fundamental para una desalación adecuada.
  10. Retire el ACN por centrifugación al vacío durante 30 minutos y desalar la muestra como se describe a continuación.

10. Desalinización de la muestra combinada etiquetada con TMT

  1. Utilice una placa desalinizante SPE C18 con la capacidad proteica adecuada (2 mg de sorbente suele ser suficiente para esta aplicación) para desalinizar el reactivo TMT combinado. Equilibrar el pozo con 200 μL de 60% MeOH (vol/vol) y 200 μL de 10% MeOH/0,1% TFA (vol/vol).
  2. Cargue los péptidos acidificados marcados con TMT del paso 9.10. en la placa de desalinización. Lavar los pocillos de muestra 2x con 200 μL de 10% MeOH/0.1% TFA (vol/vol).
  3. Eluir los péptidos con 100 μL de 60% MeOH (vol/vol). Secar las muestras por centrifugación al vacío. La muestra seca, marcada con TMT, se puede almacenar a -80 °C durante varios meses.
  4. Para el análisis de espectrometría de masas de la muestra etiquetada con TMT, inyecte la mitad de la muestra y guarde la otra mitad si se requiere reinyección.
    NOTA: Las cantidades de inyección en la espectrometría de masas variarán según la columna específica, la configuración del instrumento y el tipo de muestra.

11. Análisis de datos

NOTA: Los métodos de filtrado y análisis de datos varían y están más allá del alcance de este protocolo, pero se incluyen las siguientes notas sobre el análisis para proporcionar orientación específica para el tipo de datos resultantes de este protocolo.

  1. Busque datos de espectrometría de masas en bruto en una base de datos de proteomas específica de la especie en función del origen de las células de muestra o el tejido utilizado. Aquí, Comet fue utilizado como un algoritmo de búsqueda23.
  2. Filtre los resultados de búsqueda con un FDR del 1% ajustando los parámetros específicos del algoritmo de búsqueda22. Para la cuantificación sin etiquetas, utilice las mediciones del área pico MS1 para cuantificar los datos. Para las muestras marcadas con TMT, utilice intensidades de iones reporteros derivadas de MSn para la cuantificación. Para la significación estadística, analice las muestras en triplicados biológicos.
  3. Para identificar de novo las subunidades de PPP y sus interactores, asegúrese de triplicar muestras biológicas de muestras inhibidas por MCLR y tratadas con DMSO. Para comparar el PPPome en diferentes condiciones o en tratamiento farmacológico, asegúrese de que se generaron triplicados biológicos de cada afección o tratamiento farmacológico.
  4. Filtre los datos para que solo estén presentes proteínas con un recuento total de péptidos >1 en al menos dos de las tres muestras tratadas con control DMSO. La competencia MCLR no siempre compite con toda la unión catalítica de subunidades. Además, algunas subunidades catalíticas de PPP podrían adherirse específicamente a la resina de sefalrosa. Para tener en cuenta cualquiera de las posibilidades mientras filtra las proteínas que no se unen específicamente a la resina, elimine las proteínas con un recuento total de péptidos en la condición tratada con MCLR más alto que el de cualquier subunidad catalítica de PPP.
  5. Excluir del análisis14 los contaminantes comunes, como la queratina, el colágeno, las proteínas ribosómicas 40S y 60S, y las ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas que no son subunidades PPP.
  6. Importe datos filtrados en Perseo haciendo clic en Carga de matriz genérica en la sección Cargar24,25. Log2 transforma los datos yendo a Basic > Transform, seleccionando los datos y especificando la función de transformación, en este caso log2(x).
  7. Impute los valores que faltan de una distribución normal yendo a Imputación > Reemplazar valores faltantes de la distribución normal, seleccionando los datos y especificando el ancho (predeterminado 0.3) y el desplazamiento hacia abajo (predeterminado 1.8) para el cálculo. Realice la normalización cuantil yendo a Normalizar > Normalización cuantil.
  8. Calcule las proporciones log2 y los valores p de la prueba T de Student para las condiciones respectivas. Primero, anote los datos yendo a Annot. Filas > Filas de anotación categórica. Realice la prueba T yendo a Pruebas > pruebas de dos muestras y seleccionando los grupos a comparar, la prueba a realizar y el método para la corrección de pruebas de hipótesis múltiples como se usa para el truncamiento.
    NOTA: Para la identificación de novo , una proteína se considera una proteína que interactúa con PPP si su abundancia es estadísticamente significativa en la condición tratada con MCLR versus DMSO, con un cambio log2 veces mayor que el cambio mínimo de pliegue de cualquier subunidad PPP conocida específicamente unida.

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Representative Results

Figure 2
Figura 2: Identificación de aglutinantes piBs específicos. (A) Se puede analizar una variedad de tipos de tejidos o células a través de PIB-MS. Las células HeLa en triplicado biológico fueron tratadas con DMSO o el inhibidor de PPP MCLR, incubadas con PIBs, y analizadas a través de LC-MS / MS. (B) Diagrama del volcán del análisis PIB-MS en lisados de células HeLa tratados con DMSO y MCLR, con aglutinantes específicos de PIB mostrados en rojo. Las subunidades catalíticas ppp están etiquetadas y se muestran en azul. Las nuevas subunidades candidatas de PPP o proteínas que interactúan se muestran en negro. Los aglutinantes no específicos se muestran en gris. (C) Diagrama de dispersión del área de log2 de dos réplicas biológicas de lisados de células HeLa tratados con DMSO para demostrar la reproducibilidad del enriquecimiento. Los aglutinantes específicos de los PIB se muestran en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis en red de todas las subunidades PPP y proteínas que interactúan con PPP identificadas en células HeLa. Se encontró que estas proteínas son interactores específicos de PIB en el desplegable HeLa PIB con y sin MCLR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para demostrar el rendimiento de los PIBs, realizamos un experimento de pulldown de PIB en células HeLa para identificar PPP y sus interactores (Figura 2A). Las células HeLa se cultivaron en triplicado biológico y se lisaron. Cada lisado triplicado se dividió por la mitad, donde la mitad se trató con MCLR durante 15 min para evitar la unión de subunidades catalíticas de PPP o DMSO antes de que se realizara el enriquecimiento de PIB. Después del enriquecimiento de PIB, se realizó una comparación sin etiqueta de la abundancia de proteínas cuantificadas en las muestras tratadas con DMSO y tratadas con MCLR para distinguir los interactores específicos de los no específicos (Figura 2B). En el análisis, se detectaron todas las subunidades catalíticas de PPP sensibles a MCLR PP1ca, PP1cb, PP1cc, PP2Aca, PP2Acb, PP4c, PP5c y PP6c. En las muestras tratadas con DMSO, las abundancias (log2 áreas de cuantificación de proteínas) estuvieron altamente correlacionadas, lo que indica reproducibilidad (Figura 2C), sin embargo, tras el tratamiento con MCLR, la subunidad catalítica PPP o la abundancia de proteínas que interactúan con PPP en los pulldowns de PIB se redujeron considerablemente (Figura 2B). En este análisis, identificamos 92 subunidades de PPP e interactores específicos de PPP (ver Tabla suplementaria 1), que es comparable a un análisis anterior de PIB-MS en celdas HeLa14 (Figura 3).

Tabla suplementaria 1: Datos de EM del análisis representativo PIB-EM. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

PIB-MS es un enfoque de proteómica química utilizado para perfilar cuantitativamente el PPPome de varias fuentes de muestra en un solo análisis. Se ha realizado mucho trabajo utilizando perlas inhibidoras de la quinasa para estudiar el quinasa y cómo cambia en el cáncer y otros estados de enfermedad 10,11,12,13. Sin embargo, el estudio del PPPome va a la zaga. Anticipamos que este enfoque es capaz de llenar este vacío y arrojar luz sobre la regulación de la desfosforilación celular. Aquí, mostramos que, utilizando PIBs, podemos enriquecer componentes catalíticos y no catalíticos de PP1, PP2A, PP4, PP5 y PP6. También podemos identificar nuevos interactores candidatos de PPP en una variedad de líneas celulares, tipos de tejidos y organismos.

Hay varios pasos críticos en el protocolo PIB-MS que no deben pasarse por alto. Estos incluyen la incorporación de controles y réplicas apropiados, la entrada de cantidades iguales de proteína en todas las muestras, el mantenimiento de condiciones no desnaturalizantes durante la preparación de la muestra, la incubación de la muestra con PIBs y el lavado de los PIBs. Con respecto a los controles y réplicas, es importante que la mitad de cada muestra se trate con un inhibidor de PPP si el objetivo es identificar nuevas subunidades e interactores de PPP. Esto es necesario para diferenciar entre interactores PIB específicos y no específicos. Si se trata de identificar cómo cambia la subunidad ppp conocida o la expresión del interactor PPP a través de los tipos de células o tejidos y las fases del ciclo celular, o en varios tratamientos farmacológicos, es fundamental seleccionar una lista de subunidades e interactores PPP conocidos para la comparación. Además, estos experimentos se realizan típicamente por triplicado biológico para garantizar la confianza estadística. La igualdad de entrada de proteínas por muestra es esencial para la reproducibilidad de los datos entre las muestras; también asegura que las diferencias en la subunidad PPP o la abundancia de interactores no se deban simplemente a diferencias en la entrada de proteínas. Se debe utilizar un ensayo de proteínas como un BCA para determinar la concentración de proteínas en cada muestra. Por último, las condiciones no desnaturalizantes en la preparación de muestras, el enriquecimiento del PIB y el lavado del PIB son fundamentales para garantizar que las proteínas permanezcan en su estado nativo. Esto preserva las interacciones de la subunidad PPP.

PIB-MS es una herramienta poderosa para interrogar al PPPome, sin embargo, viene con varias limitaciones. Los PIB pueden enriquecer para los componentes catalíticos y no catalíticos de PP1, PP2A, PP4, PP5 y PP6, pero no PP2B o PP7, ya que MCLR no inhibe estas fosfatasas a concentraciones nanomolares. Es importante tener en cuenta que esta herramienta es adecuada para facilitar la identificación y cuantificación de holoenzimas PPP endógenas y sensibles a MCLR, como las señaladas. PIB-MS no puede detectar holoenzimas PPP que son inhibidas por inhibidores endógenos de PPP que bloquean el sitio activo de PPP, como α4 y SET14. Esta técnica no requiere la expresión exógena de subunidades PPP marcadas ni el uso de anticuerpos específicos de PPP. Al igual que otras estrategias de enriquecimiento por afinidad que utilizan matrices basadas en sefalrosa, PIB-MS es propenso a la unión de proteínas no específicas. Sin embargo, la adición de MCLR libre como control negativo permite distinguir interactores específicos de no específicos, lo que permite la identificación de nuevas subunidades PPP y proteínas que interactúan. Además, los interactores no específicos se pueden reducir mediante lavados adicionales y el uso cuidadoso de la cantidad adecuada de PIBs.

Hemos empleado PIB-MS para comparar los patrones de expresión de PPP de varias líneas celulares de cáncer, incluyendo cáncer de mama y glioblastoma14. Encontramos que estos tipos de cáncer tienen patrones de expresión de PPP únicos indicativos de su origen14. Las APP se encuentran entre las enzimas másconservadas 2,3. Pudimos demostrar que EL PIB-MS es efectivo en el análisis del PPPome en tejidos de levadura y ratón14. PIB-MS también se puede utilizar para identificar diferencias en los patrones de expresión de PPP en diversas condiciones, como muestras interfase versus mitóticas15. Por lo tanto, PIB-MS proporciona información sobre las redes de fosfoproteína fosfatasa y amplía nuestra comprensión de la regulación de PPP a través de múltiples líneas celulares y estados de enfermedad, así como en tratamientos farmacológicos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar ni conflictos de intereses.

Acknowledgments

A.N.K. reconoce el apoyo de NIH R33 CA225458 y R35 GM119455. Agradecemos a los laboratorios Kettenbach y Gerber por su útil discusión.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN) Honeywell AH015-4 CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Anhydrous Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-100ML CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Benchtop centrifuge Eppendorf model no. 5424
Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate Acros Organics 410991000
Centrifuge Eppendorf model no. 5810 R 15 amp version
Distilled water
DMSO Fisher Scientific BP231-100
Dounce tissue grinder Fisherbrand Pellet Pestles 12-141-363
Empore solid phase extraction disk, C18 CDS Analytical 76333-132
Eppendorf tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363204 CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.
Eppendorf tubes, 2 mL Eppendorf 22363352 CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis.
Extraction plate manifold Waters WAT097944
Falcon tubes, 50 mL VWR 21008
Generic blunt end needle and plunger
Generic magnetic separation rack
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen chloride (HCl) VWR Chemicals BDH BDH3028 CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood.
Hydroxylamine solution 50% (wt/vol) Sigma-Aldrich 467804
Incubator, 65 °C VWR model no. 1380FM
Koptec Pure Ethanol, 200 Proof Decon Labs V1001
Methanol for HPLC (MeOH) Sigma-Aldrich 34860-4L-R CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood.
Microcystin LR (MCLR) Cayman Chemical 10007188 CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact.
PBS, 1× without calcium and magnesium, pH 7.4 ± 0.1 Corning  21-040-CV
pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers Fisher Scientific M1095310001
PIBs For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pipette tips, 10 μL Eppendorf 22491504 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
Pipette tips, 1000 μL Eppendorf 22491555 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
Pipette tips, 200 μL Eppendorf 22491539 CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis.
plastic syringe, 10 mL BD 309604
Protease inhibitor cocktail III Research Products International P50700-1
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer  Thermo Scientific
Refrigerated benchtop centrifuge Eppendorf model no. 5424 R
Rotator (Labquake Shaker Rotisserie) Thermo Scientific 13-687-12Q 8 rpm rotation
Sample collection plate, 96- well, 1 mL Waters WAT058957
SDS Fisher Scientific BP1311-1
Sequencing grade modified trypsin Promega V511C
Sodium azide EMD Chemicals SX0299-1 CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals.
Sodium chloride (NaCl) Fisher Chemical S27110
Sonicator (Branson digital sonifier) model no. SFX 250
SPE C18 desalting plate Waters 186001828BA
SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads) Cytiva 6.51521E+13
Thermomixer Eppendorf model no. 5350
TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 × 0.8 mg per tag ThermoFisher A37725
Trifluoroacetic acid (TFA) Honeywell T6508-25ML CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood.
Tris Base Research Products International T60040
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
Vacuum centrifuge and vapor trap Thermo Scientific model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105
Vortexer (Vortex-Genie 2) Scientific Industries
Water LC-MS Honeywell LC365-4

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References

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Bioquímica Número 182
Un enfoque basado en la espectrometría de masas para identificar fosfoproteínas fosfatasas y sus interactores
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Smolen, K. A., Kettenbach, A. N. A… More

Smolen, K. A., Kettenbach, A. N. A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors. J. Vis. Exp. (182), e63805, doi:10.3791/63805 (2022).

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