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रेक्टल ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान विश्लेषण (रोमा): सिस्टिक फाइब्रोसिस में एक नैदानिक परख

Published: June 10, 2022 doi: 10.3791/63818
Automatic Translation
1,2, 1, 3,4, 5, 6, 7,8, 7,9, 8, 3,4, 1,2, 1,2, 10,11, 1,2, 1,2
1Department of Development and Regeneration, Woman and Child Unit, CF research lab, KU Leuven, 2Department of Pediatrics, Pediatric Pulmonology, University Hospitals Leuven, 3VIB Bio Imaging Core, VIB-KU Leuven Center for Brain & Disease Research, 4Department for Neuroscience, KU Leuven, 5Interuniversity Center for Biostatistics and Statistical Bioinformatics, University of Leuven and University of Hasselt, 6Department of Pediatrics, 2nd Faculty of Medicine, Charles University and Motol University Hospital, 7Department of Chronic Diseases and Metabolism (CHROMETA), Translational Research Center for Gastrointestinal Disorders (TARGID), KU Leuven, 8Department of Development and Regeneration, Stem Cell Institute Leuven (SCIL), KU Leuven, 9Department of Gastroenterology and Hepatology, University Hospitals Leuven, KU Leuven, 10Department of Chronic Diseases, Metabolism and Ageing; Pneumology, KU Leuven, 11Department of Respiratory Diseases, University Hospitals Leuven

Summary

यह प्रोटोकॉल रेक्टल ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान विश्लेषण (रोमा) का वर्णन करता है, जो सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) के लिए एक नया नैदानिक परख है। रूपात्मक विशेषताएं, अर्थात् गोलाई (परिपत्रता सूचकांक, सीआई) और लुमेन (तीव्रता अनुपात, आईआर) की उपस्थिति, सीएफटीआर फ़ंक्शन का एक उपाय है। 189 विषयों के विश्लेषण ने सीएफ और गैर-सीएफ के बीच सही भेदभाव दिखाया।

Abstract

सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) का निदान हमेशा सीधा नहीं होता है, खासकर जब पसीने क्लोराइड एकाग्रता मध्यवर्ती होती है और / या दो से कम रोग पैदा करने वाले सीएफटीआर उत्परिवर्तन की पहचान की जा सकती है। फिजियोलॉजिकल सीएफटीआर परख (नाक संभावित अंतर, आंतों का वर्तमान माप) नैदानिक एल्गोरिथ्म में शामिल किया गया है, लेकिन हमेशा आसानी से उपलब्ध या व्यवहार्य नहीं होता है (उदाहरण के लिए, शिशुओं में)। रेक्टल ऑर्गेनोइड ्स 3 डी संरचनाएं हैं जो विशिष्ट परिस्थितियों में सुसंस्कृत होने पर रेक्टल बायोप्सी के क्रिप्ट से अलग स्टेम कोशिकाओं से बढ़ती हैं। गैर-सीएफ विषयों के ऑर्गेनोइड्स में एक गोल आकार और एक तरल पदार्थ से भरा लुमेन होता है, क्योंकि सीएफटीआर-मध्यस्थता क्लोराइड परिवहन लुमेन में पानी चलाता है। दोषपूर्ण सीएफटीआर फ़ंक्शन वाले ऑर्गेनोइड्स फूलते नहीं हैं, अनियमित आकार को बनाए रखते हैं और कोई दृश्यमान लुमेन नहीं होता है। सीएफ और गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स के बीच आकृति विज्ञान में अंतर को 'रेक्टल ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान विश्लेषण' (रोमा) में एक उपन्यास सीएफटीआर शारीरिक परख के रूप में निर्धारित किया गया है। रोमा परख के लिए, ऑर्गेनोइड्स को 96-वेल प्लेटों में चढ़ाया जाता है, कैल्सीन से दाग दिया जाता है, और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में चित्रित किया जाता है। रूपात्मक अंतर को दो सूचकांकों का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है: परिपत्रता सूचकांक (सीआई) ऑर्गेनोइड्स की गोलाई को निर्धारित करता है, और तीव्रता अनुपात (आईआर) एक केंद्रीय लुमेन की उपस्थिति का एक उपाय है। सीएफ ऑर्गेनोइड्स की तुलना में गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स में उच्च सीआई और कम आईआर होता है। रोमा इंडेक्स ने सीएफ के बिना 22 विषयों से सीएफ के साथ 167 विषयों को पूरी तरह से भेदभाव किया, जिससे रोमा सीएफ निदान में सहायता के लिए एक आकर्षक शारीरिक सीएफटीआर परख बन गया। रेक्टल बायोप्सी को अधिकांश अस्पतालों में सभी उम्र में नियमित रूप से किया जा सकता है और ऊतक को ऑर्गेनॉइड कल्चर और रोमा के लिए एक केंद्रीय प्रयोगशाला में भेजा जा सकता है। भविष्य में, ROMA को विट्रो में CFTR मॉड्यूलेटर की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए भी लागू किया जा सकता है। वर्तमान रिपोर्ट का उद्देश्य रोमा के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों को पूरी तरह से समझाना है, ताकि अन्य प्रयोगशालाओं में प्रतिकृति की अनुमति मिल सके।

Introduction

सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) एक ऑटोसोमल रिसेसिव बीमारी है जो सीएफ ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) जीन में उत्परिवर्तन के कारण होती है। सीएफटीआर प्रोटीन एक क्लोराइड और बाइकार्बोनेट चैनल है, जो कई एपिथेलिया1 के जलयोजन को सुनिश्चित करता है। सीएफ एक उच्च बोझ, जीवन-छोटा, बहु-प्रणाली रोग है, जो मुख्य रूप से श्वसन रोग के रूप में प्रकट होता है, लेकिन जठरांत्र संबंधी मार्ग, अग्न्याशय, यकृत और प्रजनन पथ को भी प्रभावित करताहै।

रोग पैदा करने वाले सीएफटीआर उत्परिवर्तन सीएफटीआर की मात्रा या कार्य में कमी का कारण बनते हैं, बदले में बलगम निर्जलीकरण का कारण बनते हैं। सीएफटीआर जीन में 2,000 से अधिक वेरिएंट को3 वर्णित किया गया है, जिनमें से केवल 466 को पूरी तरह सेचित्रित किया गया है।

सीएफ का निदान तब किया जा सकता है जब या तो पसीना क्लोराइड एकाग्रता (एससीसी) 60 mmol / L की सीमा से ऊपर हो या जब दो रोग पैदा करने वाले CFTR उत्परिवर्तन (CFTR2 डेटाबेस के अनुसार) की पहचान की जाती है। केवल मध्यवर्ती रूप से ऊंचा (30-60 mmol / L) एससीसी वाले विषयों में, जो पसीनेके परीक्षणों के लगभग 4% -5% में होता है, और अलग-अलग या अज्ञात नैदानिक परिणाम के CFTR उत्परिवर्तन, निदान की पुष्टि नहीं की जा सकती है और न ही इनकार किया जा सकता है, भले ही उनके पास सीएफ संगत लक्षण हों या सकारात्मक नवजात स्क्रीनिंग परीक्षण हो। इन मामलों के लिए, दूसरी पंक्ति के शारीरिक सीएफटीआर परख (नाक संभावित अंतर (एनपीडी) और आंतों के वर्तमान माप (आईसीएम)) को नैदानिक एल्गोरिथ्म में शामिल किया गया है। ये परीक्षण अधिकांश केंद्रों पर आसानी से उपलब्ध नहीं हैं और न ही सभी उम्र मेंसंभव हैं, खासकर शिशुओं में।

रेक्टल ऑर्गेनोइड्स 3 डी संरचनाएं हैं जो एलजीआर 5 (+) वयस्क आंतों की स्टेम कोशिकाओं से विकसित होती हैं जो रेक्टल बायोप्सी 7 के माध्यम से प्राप्त आंतों के क्रिप्ट सेहोती हैं। बायोमेडिकल अनुसंधान में ऑर्गेनोइड्स का तेजी से उपयोग किया जा रहा है, जैसे कि सीएफ8 में मॉड्यूलेटर उपचार का परीक्षण। एक व्यवहार्य बायोप्सी या तो सक्शन या फोर्सप्स बायोप्सी द्वारा प्राप्त की जा सकती है, एक ऐसी प्रक्रिया जो केवल न्यूनतम असुविधा का कारण बनती है और शिशुओं में भी सुरक्षित है, कम जटिलता दरके साथ 9. रेक्टल बायोप्सी से अलग किए गए क्रिप्ट्स स्टेम कोशिकाओं में समृद्ध होते हैं, और विशिष्ट संवर्धन स्थितियों के तहत, ये रेक्टल ऑर्गेनोइड्स में स्वयं व्यवस्थित होते हैं। इन ऑर्गेनोइड्स की आकृति विज्ञान सीएफटीआर की अभिव्यक्ति और कार्य द्वारा निर्धारित किया जाता है, जो उपकला कोशिकाओं के एपिकल झिल्ली पर स्थित है। कार्यात्मक सीएफटीआर क्लोराइड और पानी को ऑर्गेनॉइड लुमेन में प्रवेश करने की अनुमति देता है, जिससे गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स की सूजन उत्पन्न होती है। सीएफ ऑर्गेनोइड्स सूज नहीं जाते हैं और इसमें कोई दृश्यमान लुमेन10,11 नहीं होता है।

रेक्टल ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान विश्लेषण (रोमा) ऑर्गेनोइड आकृति विज्ञान में इन अंतरों के आधार पर सीएफ और गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड के बीच भेदभाव की अनुमति देता है। गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड अधिक गोल होते हैं और इसमें एक दृश्यमान लुमेन होता है, जबकि सीएफ ऑर्गेनोइड्स के लिए विपरीत सच है। इस परख के लिए, रोगी-विशिष्ट ऑर्गेनोइड्स को 96-वेल प्लेट के 32 कुओं में चढ़ाया जाता है। बढ़ने के 1 दिन के बाद, ऑर्गेनोइड्स को कैल्सीन हरे रंग से दाग दिया जाता है और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में चित्रित किया जाता है। गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड एक अधिक गोलाकार आकार और कम फ्लोरोसेंट केंद्रीय भाग दिखाते हैं, क्योंकि लुमेन में तरल पदार्थ और कैल्सीन के दाग केवल कोशिकाएं होती हैं। आकृति विज्ञान में इन अंतरों को दो रोमा इंडेक्स का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है: परिपत्रता सूचकांक (सीआई) ऑर्गेनोइड्स की गोलाई को निर्धारित करता है, जबकि तीव्रता अनुपात (आईआर) एक केंद्रीय लुमेन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का एक उपाय है। इस रिपोर्ट में, हम तकनीक की प्रतिकृति की अनुमति देने के लिए, इन भेदभावपूर्ण सूचकांकों को प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं।

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Protocol

मानव ऊतक से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं के लिए, एथिक्स कमेटी रिसर्च यूजेड / केयू ल्यूवेन (ईसी अनुसंधान) द्वारा अनुमोदन प्राप्त किया गया था। सभी शोध माता-पिता, प्रतिनिधियों और / या रोगियों से सूचित सहमति और / या सहमति के साथ किए गए थे।

नोट: रेक्टल बायोप्सी और ऑर्गेनोइड्स से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को शोधकर्ता को किसी भी जैविक खतरे से बचाने और संस्कृतियों के संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए एक लामिनार प्रवाह में किया जाना चाहिए। किसी भी प्रयोगशाला प्रक्रिया के लिए, शोधकर्ताओं को नमूनों में हेरफेर करने के लिए हर समय लैब कोट, दस्ताने और सुरक्षा चश्मे पहनने चाहिए।

1. रेक्टल बायोप्सी, क्रिप्ट्स से वयस्क स्टेम कोशिकाओं का अलगाव, और ऑर्गेनॉइड कल्चर

  1. प्रोटोकॉल के इस प्रारंभिक भाग के लिए, जिसमें मीडिया उत्पादन और उपयोग, ऑर्गेनॉइड संस्कृति, विभाजन, विस्तार और बायोबैंकिंग के लिए ठंड शामिल है, पहले प्रकाशित दो प्रोटोकॉल 8,12 का पालन करें।
  2. संक्षेप में, निम्नलिखित कदम उठाए जाने चाहिए:
    1. एक फोर्स या सक्शन डिवाइस के साथ तीन से चार रेक्टल बायोप्सी लें और ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल में वर्णित एड-डीएफ +++ माध्यम के साथ एक बाँझ कंटेनर (जैसे, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब) में इकट्ठा करें।
    2. बायोप्सी को बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर एक केंद्रीय प्रयोगशाला में ले जाएं। अन्य केंद्रों के लिए परिवहन संभव है, और परिवहन में 48 घंटे तक लगने पर भी गुणवत्ता महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं होती है। यदि परिवहन में 6 घंटे से अधिक समय लगने की उम्मीद है, तो 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के बजाय 6 एमएल एडी-डीएफ +++ माध्यम के साथ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें।
    3. बायोप्सी को ठंडे पीबीएस में धोएं जब तक कि मलबे और वसा ऊतक जैसे गैर-उपकला ऊतकों को हटाने के लिए सतह पर तैरने वाला स्पष्ट न हो।
    4. क्रिप्ट्स को अलग करने के लिए ईडीटीए (अंतिम एकाग्रता 10 एमएम) के साथ बायोप्सी को इनक्यूबेट करें। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में क्रिप्ट्स को प्लेट करें। जीवाणु संदूषण को रोकने के लिए संवर्धन के पहले सप्ताह में माध्यम में व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक्स (जेंटामाइसिन 50 μg / mL और वैनकोमाइसिन 50 μg / mL) जोड़ें।
    5. जब क्रिप्ट्स बुड होते हैं और बंद हो जाते हैं और बढ़े हुए होते हैं, तो यांत्रिक विभाजन करते हैं, आमतौर पर 7 दिनों के बाद।
    6. परिणामी ऑर्गेनोइड्स को लगभग हर 7 दिनों में विभाजित करें। इस तरह, संस्कृति का विस्तार करें, बायोबैंक में बैकअप नमूने फ्रीज करें, या परख के लिए ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करें।

2. रोमा के लिए ऑर्गेनॉइड चढ़ाना (दिन 1)

  1. प्लेटिंग के लिए ऑर्गेनोइड्स को यांत्रिक रूप से विभाजित करें
    1. ठंडे एडी-डीएफ +++ माध्यम से दो बार धोकर 24-वेल प्लेट से तीन अच्छी तरह से विकसित कुओं से ऑर्गेनोइड एकत्र करें, उन्हें 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें, और माइक्रोस्कोप12 के तहत उनका आकलन करें।
    2. सुनिश्चित करें कि ऑर्गेनोइड व्यवहार्य और उच्च गुणवत्ता वाले हैं, जो आमतौर पर पहले विभाजित होने के बाद 5-7 दिनों के विकास के बाद प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 1)।
    3. उपरोक्त प्रोटोकॉल 8,12 के अनुसार ऑर्गेनोइड्स को यांत्रिक रूप से विभाजित करें। तब तक दोहराएं जब तक कि ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मूल्यांकन किए गए अधिकांश ऑर्गेनोइड्स प्रारंभिक अवलोकन की तुलना में काफी छोटे न हों।
    4. छोटे ऑर्गेनोइड्स एकत्र करें, जो आमतौर पर एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ऑर्गेनॉइड-मध्यम समाधान के लगभग शीर्ष 4/5 के संग्रह के अनुरूप होते हैं, क्योंकि गुरुत्वाकर्षण के कारण बड़े ऑर्गेनोइड ट्यूब के नीचे तक डूब जाते हैं और छोटे ऑर्गेनोइड मध्यम स्तंभ के ऊपरी हिस्से में निलंबित रहते हैं।
    5. 2 मिनट के लिए 0.3 x 1000 ग्राम पर छोटे ऑर्गेनोइड्स के नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें और माध्यम को छोड़ दें।
    6. छोटे ऑर्गेनोइड्स की गोली को 40% -50% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (एडी-डीएफ +++ मध्यम12 के साथ पतला) के 130 μL में पतला करें।
    7. 200 μL माइक्रोपिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह से पुन: चार्ज करें।
  2. ऑर्गेनोइड्स को 96-वेल प्लेट में प्लेट करें
    1. 20 μL पिपेट का उपयोग करके, एक पूर्व-गर्म 96-वेल प्लेट के 32 कुओं में प्लेट ऑर्गेनोइड्स। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कुएं में पिछले चरण में उत्पादित ऑर्गेनॉइड-मैट्रिक्स समाधान की एक 4 μL बूंद शामिल है।
    2. घोल में ऑर्गेनोइड गुरुत्वाकर्षण-निर्भर नीचे की ओर विस्थापन के कारण ट्यूब के तल पर एक गोली बनाते हैं। इसे रोकने और समान चढ़ाना सुनिश्चित करने के लिए, नियमित रूप से 200 μL माइक्रोपिपेट (उदाहरण के लिए, हर बार चार से आठ कुओं को चढ़ाने के बाद) का उपयोग करके ऑर्गेनॉइड-मैट्रिक्स समाधान को फिर से निलंबित करें।
    3. बूंद को कुएं के किनारों की ओर चलने से रोकने के लिए कुएं के केंद्र में प्रत्येक बूंद को प्लेट करें, जो बाद में छवि की गुणवत्ता को कम कर देगा।
    4. अतिव्यापी ऑर्गेनोइड्स के बिना प्रति कुएं (न्यूनतम 15, अधिकतम 90) के लगभग 30 ऑर्गेनोइड्स का लक्ष्य रखें।
    5. ध्यान रखें कि इन ऑर्गेनोइड्स को रात भर इनक्यूबेट करना होगा और इस समय के दौरान थोड़ा बढ़ जाएगा, और यदि चढ़ाना घनत्व बहुत अधिक है तो ओवरलैपिंग शुरू हो सकती है।
    6. पहले एक या दो कुओं को चढ़ाने के बाद 5x आवर्धन उद्देश्य के साथ ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्लेटिंग घनत्व की जांच करें।
    7. यदि चढ़ाना घनत्व बहुत अधिक है, तो वांछित प्लेटिंग घनत्व तक पहुंचने तक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को जोड़ने के साथ ऑर्गेनॉइड-मैट्रिक्स समाधान को चरणबद्ध रूप से पतला करें (चित्रा 2)।
    8. चढ़ाना के बाद, प्लेट को एक सपाट सतह पर धीरे से टैप करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि अधिकांश ऑर्गेनोइड एक ही फोकल प्लेन में हैं।
  3. प्लेट को इनक्यूबेट करें
    1. बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के गेलेशन की अनुमति देने के लिए 8-10 मिनट के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 96-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    2. प्रत्येक कुएं में मानव बृहदान्त्र ऑर्गेनॉइड माध्यम +/+12 का 50 μL जोड़ें और 16-24 घंटे के लिए रात भर इनक्यूबेट करें।
    3. कोई फोरस्कोलिन और न ही सीएफटीआर मॉड्यूलेटर जोड़ें, इसलिए ऑर्गेनोइड बेसल स्थितियों के तहत बढ़ते हैं।

3. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर ऑर्गेनोइड इमेजिंग (दिन 2)

  1. ऑर्गेनोइड्स को कैल्सीन हरे रंग से दाग दें
    1. 50 μg कैल्सीन हरे रंग वाली एक शीशी में 50 μL डाइमिथाइलसल्फोक्साइड (DMSO) जोड़कर कैल्सीन ग्रीन का 1 mM स्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. एड-डीएफ +++ (एकाग्रता 6 μM) के 200 μL में स्टॉक समाधान के 1.2 μL जोड़कर कैल्सीन ग्रीन का एक कामकाजी समाधान तैयार करें।
    3. 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में इस कैल्सीन मिश्रण का 5 μL जोड़ें जिसमें ऑर्गेनोइड्स चढ़ाए गए थे (अंतिम कैल्सीन एकाग्रता 0.6 μM)। इस चरण को करते समय कुएं के अंदर मैट्रिक्स ड्रॉप को स्पर्श और अव्यवस्थित न करें।
    4. पूरे कुएं में कैल्सीन हरे रंग के समरूप वितरण को सुनिश्चित करने के लिए ढक्कन के साथ प्लेट को कुछ बार घुमाएं और थोड़ा झुकाएं।
    5. कुओं में सभी ऑर्गेनोइड्स के धुंधलापन को सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को 15-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर फिर से इनक्यूबेट करें।
  2. प्लेट को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित करें
    1. प्लेट को एक स्वचालित चरण और एकीकृत इनक्यूबेटर के साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि प्लेट धारक में प्लेट अच्छी तरह से तय है।
    2. इमेजिंग प्रक्रिया की छोटी अवधि (लगभग 10 मिनट) को देखते हुए, 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेशन वैकल्पिक है लेकिन आवश्यक नहीं है।
  3. ऑर्गेनोइड्स पर ध्यान केंद्रित करें (चित्रा 3)
    1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, मैन्युअल रूप से प्रत्येक अच्छी तरह से ऑर्गेनोइड्स की इष्टतम एक्स / वाई स्थिति और फोकस (जेड स्थिति) निर्धारित करें, और इन पदों को इमेजिंग सॉफ्टवेयर में सहेजें।
    2. सबसे अच्छा फोकस ऑर्गेनोइड्स के सबसे तेज संभव चित्रण और ऑर्गेनॉइड ड्रॉप के सबसे बड़े संभव हिस्से के विज़ुअलाइज़ेशन का तात्पर्य है। यदि दाग का वितरण पर्याप्त नहीं है, तो चरण 3.1.4 और 3.1.5 दोहराएं (उदाहरण के लिए, अतिरिक्त 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें)।
    3. 488 एनएम पर उत्सर्जन और 515 एनएम पर उत्तेजना के साथ लाइव-सेल इमेजिंग सेटिंग्स का उपयोग करें (कैल्सीन फ्लोरेसेंस के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए विशिष्ट) और 5x एलडी आवर्धन उद्देश्य।
  4. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 और चित्रा 4) के साथ 32 कुओं के ऑर्गेनोइड चित्र प्राप्त करें।
    1. 1024 पिक्सेल x 1024 पिक्सेल (पिक्सेल आकार 2.5 μm x 2.5 μm) और 16 बिट्स की गहराई के रिज़ॉल्यूशन के साथ यूनिडायरेक्शनल तरीके से छवियां लें।
    2. सीएफ और गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स के बीच रूपात्मक अंतर के इष्टतम विज़ुअलाइज़ेशन के लिए लेजर तीव्रता और मास्टर लाभ चुनें (उदाहरण के लिए, एक गैर-दाग वाले पानी से भरे केंद्रीय लुमेन (यदि मौजूद है) और एक सना हुआ सेलुलर सीमा के बीच भेदभाव)।
      नोट: मास्टर लाभ होने पर ऑर्गेनोइड्स को सही ढंग से चित्रित नहीं किया जाएगा और इस प्रकार प्रतिदीप्ति संकेत बहुत कम हैं; मास्टर लाभ को बहुत अधिक सेट करने से समरूप बहुत उच्च सिग्नल तीव्रता वाले ऑर्गेनोइड्स के साथ छवियां होंगी, जिससे अधिक सूक्ष्म रूपात्मक अंतर (चित्रा 2) की इमेजिंग को रोका जा सकेगा।
    3. माइक्रोस्कोप प्रारूप में सभी 32 कुओं के लिए प्रति अच्छी तरह से एक चित्र सहेजें और उन्हें टीआईएफएफ फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें।

4. छवि विश्लेषण (चित्रा 5)

  1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में TIFF फ़ाइलों को लोड करें।
  2. ऑपरेटर द्वारा निर्धारित बहिष्करण मानदंडों के आधार पर पहली गुणवत्ता जांच करें (चित्रा 2): कई विभेदित या मृत संरचनाएं या मलबे, अपर्याप्त चढ़ाना घनत्व, बहुत अधिक (जैसे, अतिव्यापी) या बहुत कम ऑर्गेनोइड, और अपर्याप्त प्रतिदीप्ति वितरण (ऑर्गेनोइड स्पष्ट रूप से चित्रित नहीं हैं, पृष्ठभूमि संकेत बहुत अधिक है)।
    नोट: चरण 3.4 में TIFF फ़ाइलों के रूप में छवियों को निर्यात करने से पहले यह चरण भी किया जा सकता है।
  3. विश्लेषण के लिए चित्र तैयार करें
    1. छवियों को पुन: कैलिब्रेट करें, इसलिए 1 पिक्सेल 2.5 μm x 2.5 μm से मेल खाता है।
    2. एक नेटवर्क डेटा बनाएँ और खोलें (. एनडी) प्रत्येक ऑर्गेनॉइड संस्कृति के लिए सभी 32 चित्रों की फ़ाइल, प्रति विषय सभी 32 चित्रों के एक साथ विश्लेषण को सक्षम करता है।
  4. ऑर्गेनोइड्स को चित्रित करें
    1. 4,500 की कम तीव्रता सीमा और 65,535 की ऊपरी सीमा का उपयोग करके संरचनाओं को चित्रित करें (चिकनी और स्वच्छ कार्य बंद; फिल होल्स फ़ंक्शन पर; x3 पर अलग फ़ंक्शन)।
      नोट: यह फ्लोरोसेंट संरचनाओं को चित्रित करता है, जिसमें मौजूद होने पर चित्रित संरचना में लुमेन सहित फिल होल्स शामिल हैं।
  5. ऑर्गेनोइड्स की गणना करें
    1. ≥40 μm सभी संरचनाओं का चयन करें.
    2. अद्यतन एनडी माप बटन पर क्लिक करें (हर बार जब माप की आवश्यकता होती है); गिने गए ऑर्गेनोइड्स को क्रमांकित किया जाएगा।
      नोट: यह 32 कुओं में ऑर्गेनोइड्स की कुल संख्या के बराबर है, जबकि छोटे मलबे, जैसे मृत कोशिकाओं को बाहर रखा गया है।
  6. सूचकांकों की गणना के लिए तीव्रता और परिपत्रता को मापें
    1. सभी संरचनाओं ≥60 μm का चयन करें और गिनती करें।
      नोट: यह सीएफ या गैर-सीएफ के लिए विशिष्ट आकृति विज्ञान दिखाने के लिए पर्याप्त बड़े ऑर्गेनोइड्स की गणना करता है। ऑर्गेनोइड्स >40 μm और <60 μm छोटे और घने होते हैं, दोनों गैर-सीएफ और सीएफ में।
    2. चित्र की सीमाओं को छूने वाली सभी संरचनाओं को हटा दें। ऑर्गेनोइड्स को हटाने के लिए ऐसा करें जो पूरी तरह से दिखाई नहीं देते हैं, क्योंकि उनकी आकृति विज्ञान को सटीक रूप से निर्धारित नहीं किया जा सकता है।
    3. प्रत्येक ≥60 μm संरचना की सीमा से 1 पिक्सेल (= 2.5 μm) का क्षरण करें। यह ऑर्गेनोइड्स के आसपास फैले हुए कैल्सीन फ्लोरेसेंस के प्रभामंडल को हटा देता है।
    4. प्रत्येक संरचना की औसत तीव्रता को मापें। इस तरह, ऑर्गेनोइड्स की औसत प्रतिदीप्ति को मापा जाता है।
    5. फिर से सभी संरचनाओं ≥60 μm का चयन करें और सीमाओं को छूने वाली सभी संरचनाओं को हटा दें।
    6. प्रत्येक ≥60 μm संरचना की सीमा से 10 पिक्सेल (= 25 μm) का क्षरण करें।
      नोट: गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स में, यह सेलुलर सीमा को नष्ट कर देता है और केवल लुमेन को छोड़ देता है। सीएफ ऑर्गेनोइड्स में, यह ऑर्गेनॉइड के बाहरी हिस्से को नष्ट कर देता है, जिसमें लगभग आंतरिक भाग के समान प्रतिदीप्ति होती है।
    7. प्रत्येक अपरदित संरचना की औसत तीव्रता को मापें। इस तरह, ऑर्गेनोइड्स के मध्य भाग की औसत प्रतिदीप्ति को मापा जाता है।
    8. प्रत्येक संरचना की परिपत्रता को मापें। यह ऑर्गेनोइड्स की औसत परिपत्रता से मेल खाती है।
  7. दूसरी गुणवत्ता जांच करें: सॉफ़्टवेयर द्वारा निर्धारित बहिष्करण मानदंड। चित्रों के सेट को बाहर रखें जब 50% से कम ऑर्गेनोइड्स (संरचनाओं ≥40 μm के रूप में परिभाषित) ≥60 μm होते हैं, क्योंकि पर्याप्त ऑर्गेनोइड ्स सीएफ या गैर-सीएफ के लिए विशिष्ट आकृति विज्ञान दिखाने के लिए पर्याप्त बड़े होने चाहिए। इसके अलावा जब <500 या >3,000 ऑर्गेनोइड्स (संरचनाओं ≥40 μm) के रूप में परिभाषित) 32 कुओं में मौजूद होते हैं।

5. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में सूचकांक ों को मापें (चित्रा 6)

  1. परिपत्रता सूचकांक (सीआई) को मापें।
    नोट: यह चरण 4.6 में मापी गई औसत परिपत्रता से मेल खाती है, जो सभी 32 कुओं में सभी ऑर्गेनोइड्स की औसत परिपत्रता है। सीआई ऑर्गेनोइड्स की गोलाई को निर्धारित करता है, जिसे इस प्रकार Equation 1परिभाषित किया गया है, जो गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स की तुलना में सीएफ में कम है
  2. तीव्रता अनुपात (IR) मापें
    1. प्रत्येक ≥60 μm संरचना की सीमा से 2.5 μm का क्षरण करने के बाद तीव्रता माप के माध्य से प्रत्येक ≥60 μm संरचना के क्षरण के बाद तीव्रता माप के माध्य को विभाजित करके IR की गणना करें।
      नोट: आईआर एक केंद्रीय लुमेन की उपस्थिति या अनुपस्थिति को मापता है। आईआर के बराबर Equation 2है, और गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स की तुलना में सीएफ में अधिक है।
  3. विश्लेषण प्रक्रिया को सरल बनाएं
    1. डेटा की प्रतिलिपि बनाने पर स्वचालित रूप से इन सूचकांकों की गणना करने के लिए स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक मानक कार्यपत्रक तैयार करें (चित्रा 7)।
    2. आईआर की गणना करने के लिए:
      1. प्रत्येक ≥60 μm संरचना की सीमा से 2.5 μm का क्षरण करने के बाद तीव्रता माप लें। गणना के लिए माध्य का उपयोग करें (भाजक)।
      2. प्रत्येक ≥60 μm संरचना की सीमा से 25 μm का क्षरण करने के बाद तीव्रता माप लें। गणना के लिए माध्य का उपयोग करें (प्रगणक)।
    3. सीआई की गणना करने के लिए, सभी कुओं में सभी ऑर्गेनोइड्स की परिपत्रता लें। माध्य सीआई से मेल खाता है।
      नोट: जब छवियों के बड़े बैचों के विश्लेषण की आवश्यकता होती है, तो अनुभाग 4 में वर्णित छवि विश्लेषण प्रक्रिया अर्ध-स्वचालित हो सकती है, कैलिब्रेटेड एनडी फ़ाइलों से शुरू होती है और सभी चरणों को संयुक्त करने के साथ मैक्रो चलाती है।

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Representative Results

नियमित नैदानिक यात्राओं के दौरान 212 विषयों से ऑर्गेनोइड एकत्र किए गए थे। रेक्टल बायोप्सी प्रक्रिया के दौरान या बाद में कोई प्रतिकूल घटना नहीं हुई। ऑर्गेनोइड्स को एक शोधकर्ता द्वारा जीनोटाइप और नैदानिक जानकारी जैसे विषय विशेषताओं के लिए अंधा कर दिया गया था। कम गुणवत्ता वाली छवियों के कारण, 23 विषयों को बाहर रखा गया था। सफल और असफल ऑर्गेनोइड संस्कृतियों और छवि अधिग्रहण के उदाहरण चित्रा 2 में देखे जा सकते हैं।

सीएफ के साथ 167 विषयों के ऑर्गेनोइड्स और दो रोग पैदा करने वाले सीएफटीआर उत्परिवर्तन (जैसा कि सीएफटीआर 2 डेटाबेस4 द्वारा परिभाषित किया गया है) और 22 गैर-सीएफ विषयों का विश्लेषण किया गया था। प्रति संस्कृति ऑर्गेनोइड्स की औसत मात्रा 1,519 (लगभग 40-50 ऑर्गेनोइड प्रति कुएं) थी। विश्लेषण के लिए शामिल प्रति संस्कृति ऑर्गेनोइड्स की औसत मात्रा 77% थी (संरचनाओं की संख्या ≥60 μm संरचनाओं की संख्या ≥40 μm, विशिष्ट CF या गैर-CF आकृति विज्ञान को प्रतिबिंबित करने के लिए पर्याप्त ऑर्गेनोइड्स के अंश के अनुरूप)।

आईआर और सीआई ने सीएफ के साथ और बिना विषयों के ऑर्गेनोइड्स के बीच भेदभाव (पी < 0.001) किया (तालिका 1)। रैखिक भेदभाव विश्लेषण के साथ, सीएफ और गैर-सीएफ के बीच सही भेदभाव (एयूसी = 1) प्राप्त किया गया था, न केवल सभी 32 कुओं (चित्रा 8) से डेटा का उपयोग करते समय, बल्कि जब प्रत्येक संस्कृति के लिए यादृच्छिक रूप से आठ कुओं को चुना गया था (चित्रा 9)।

चित्र 10 हिस्टोग्राम को दर्शाता है जो गोलाकारता के लिए मूल्यों के वितरण, ऑर्गेनॉइड के मध्य भाग की तीव्रता और चार उदाहरणात्मक संस्कृतियों (दो सीएफ, दो गैर-सीएफ) के लिए पूरे ऑर्गेनोइड की तीव्रता को दर्शाता है।

Figure 1
चित्र 1: अच्छी तरह से विकसित और व्यवहार्य ऑर्गेनोइड्स की छवियां। (A) CF के बिना एक व्यक्ति से ऑर्गेनोइड्स और (B) CF वाले व्यक्ति से ऑर्गेनोइड्स। दोनों संस्कृतियों को पिछले विभाजन के बाद 7 दिनों के लिए उगाया गया था। छवियों को 5x उद्देश्य के साथ एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में ऑर्गेनोइड इमेजिंग का चित्रण। (ए) अच्छी गुणवत्ता वाले सीएफ ऑर्गेनोइड; (बी) अच्छी गुणवत्ता वाले गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड; (सी) प्लेटिंग का घनत्व बहुत कम: प्रतिनिधि इमेजिंग के लिए पर्याप्त ऑर्गेनोइड नहीं; (डी) प्लेटिंग का घनत्व बहुत अधिक: ऑर्गेनोइड्स का अतिव्यापीकरण पर्याप्त कैल्सीन धुंधला होने और आकृति विज्ञान के मूल्यांकन को रोकता है; (ई) कैल्सीन धुंधला होने की समस्या के कारण तीव्रता बहुत कम है या मास्टर गेन सेटिंग बहुत कम है; (एफ) मास्टर गेन सेटिंग बहुत अधिक होने के कारण तीव्रता बहुत अधिक है: छोटे लुमेन को ओवरएक्सपोज़्ड फ्लोरेसेंस सिग्नल द्वारा मुखौटा किया जा सकता है; (जी) मृत और फटने वाले ऑर्गेनोइड्स, जहां अलग-अलग कोशिकाओं को देखा जा सकता है और आकृति विज्ञान का मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है; (एच) विभेदित ऑर्गेनोइड्स जहां स्टेम सेल की स्थिति खो जाती है, अक्सर ऑर्गेनोइड संरचनाओं के बीच में उच्च प्रतिदीप्ति संकेतों के साथ मोटी संरचनाओं के रूप में दिखाई देती है, जो विशिष्ट सीएफ या गैर-सीएफ आकृति विज्ञान को प्रतिबिंबित नहीं करती है; (I) पृष्ठभूमि संकेत बहुत अधिक है, या तो कैल्सीन धुंधला होने के कारण पृष्ठभूमि में प्रसार के साथ बहुत पहले किया गया था या मास्टर गेन सेटिंग बहुत अधिक होने के कारण; (जे) ऑर्गेनोइड्स का अपर्याप्त यांत्रिक विभाजन, उन्हें परख के लिए बहुत बड़ा छोड़ देता है, अच्छी तरह से धुंधला नहीं होता है, और सीएफ या गैर-सीएफ आकृति विज्ञान को पर्याप्त रूप से प्रतिबिंबित नहीं करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: ऑर्गेनोइड्स पर ध्यान केंद्रित करना और चित्र प्राप्त करना। (A) अधिग्रहण टैब चुनें। रीयल-टाइम इमेजिंग के लिए नीचे लाइव बटन पर क्लिक करें। (बी) 488 एनएम पर उत्सर्जन के साथ लाइव सेल इमेजिंग सेटिंग्स का उपयोग करें। (सी) 1024 पिक्सेल x 1024 पिक्सेल के रिज़ॉल्यूशन और 16 बिट्स प्रति पिक्सेल की गहराई पर छवि। यूनिडायरेक्शनल इमेजिंग पैरामीटर चुनें। (डी) प्रतिदीप्ति की इष्टतम तीव्रता के लिए मास्टर लाभ को समायोजित करें ताकि ऑर्गेनोइड विशेषताओं जैसे आकार और उपस्थिति या लुमेन की अनुपस्थिति की इमेजिंग को अनुकूलित किया जा सके। (E) प्रति ऑर्गेनॉइड संस्कृति के 32 कुओं में से प्रत्येक के लिए एकल स्थिति (x, y, और z) सहेजें। (एफ) पूर्व-परिभाषित प्रोटोकॉल चलाने के लिए स्टार्ट एक्सपेरिमेंट बटन पर क्लिक करें और चुने गए मापदंडों के अनुसार छवियां प्राप्त करें। (जी) छवियों को पूरा होने पर सहेजा जा सकता है, या ऑटोसेव बटन के साथ एक ऑटोसेव सेट किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: विश्लेषण के लिए छवियों का निर्यात करना। (A) प्रसंस्करण टैब चुनें, और एक प्रक्रिया में कई ऑर्गेनोइड संस्कृतियों की छवियों को निर्यात करने के लिए बैच बटन पर क्लिक करें। (बी) जोड़ें बटन पर क्लिक करें और विश्लेषण के लिए आवश्यक सहेजी गई छवियों का चयन करें। (सी) विधि के रूप में छवि निर्यात का चयन करें। (डी) छवियों को टीआईएफएफ फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें, 8 बिट्स में परिवर्तित न करें, और संपीड़ित या आकार न बदलें। बर्न-इन ग्राफिक्स के बिना मूल डेटा निर्यात करें। दृश्य पैरामीटर के साथ 96-वेल प्लेट के 32 कुओं का चयन करें। री-टाइल न करें। (ई) चुने हुए मापदंडों का उपयोग करके निकालने के लिए लागू करें बटन पर क्लिक करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: इमेजिंग सॉफ्टवेयर में ऑर्गेनोइड छवियों का विश्लेषण। (A) ऑब्जेक्ट माप के लिए पैरामीटर सेट करने के लिए परिणाम अनुभाग (लाल तारांकन) के ऊपर ग्रे बार पर राइट-क्लिक करें। परिपत्रता और माध्य तीव्रता जोड़ें। (बी) फ़ाइल > आयात / निर्यात पर क्लिक करें > एक संस्कृति के लिए टीआईएफएफ फ़ाइलों को एक एनडी फ़ाइल में संयोजित करने के लिए फ़ाइल अनुक्रम से एनडी फ़ाइल बनाएं। (सी) वांछित फ़ाइल का चयन करें और पुष्टि करें; 32 चित्रों को जोड़ा जाएगा (लाल तारांकन)। (डी) रीकैलिब्रेट दस्तावेज़ > रीकैलिब्रेशन पर क्लिक करें। (E) पॉप-अप विंडो में Pixel Size पर क्लिक करें। (एफ) इनपुट 2.5 μm 1 पिक्सेल के आकार के रूप में। (जी) तस्वीर को अब पिक्सेल (लाल तारांकन) के बजाय माइक्रोमीटर में फिर से कैलिब्रेट किया जाएगा। (एच) सीमा निर्धारित > बाइनरी पर क्लिक करें। (I) आकार चयन पॉप-अप विंडो में किया जा सकता है। ऑर्गेनॉइड गिनती के लिए न्यूनतम आकार 40 μm और ऑर्गेनोइड आकृति विज्ञान विश्लेषण के लिए 60 μm है। हमेशा चिकनी और स्वच्छ फ़ंक्शन को बंद करें, फिल होल्स फ़ंक्शन चालू करें, और अलग x3 इनपुट करें। सभी फ़्रेम पर लागू करें. (जे) सॉफ्टवेयर परिभाषित संरचनाओं का चित्रण दिखाएगा। आउटपुट के रूप में चरण ए से चुने गए मापदंडों का विश्लेषण और प्राप्त करने के लिए अपडेट एनडी माप बटन पर क्लिक करें। (K) निर्यात बटन के बगल में नीचे की ओर मुख वाले तीर पर क्लिक करें और क्लिपबोर्ड पर डेटा का चयन करें। (एल) क्लिपबोर्ड पर डेटा आउटपुट कॉपी करने के लिए निर्यात बटन पर क्लिक करें। डेटा अब स्प्रेडशीट पर चिपकाया जा सकता है। (M) एक नया माप किए जाने से पहले परिणाम अनुभाग को खाली करने के लिए डेटा रीसेट बटन पर क्लिक करें। (N) जब तीव्रता अनुपात की गणना के लिए तीव्रता माप के लिए क्षरण किया जाना है, तो द्विआधारी > इरोड पर क्लिक करें। रिमूव ऑब्जेक्ट्स टचिंग बॉर्डर्स फ़ंक्शन एक ही ड्रॉप-डाउन मेनू में पाया जा सकता है। (ओ) क्षरण के लिए चित्र में दिखाए गए मैट्रिक्स का चयन करें, और वांछित गणना चुनें (ऑर्गेनोइड्स के आसपास के प्रभामंडल को हटाने के लिए 1 पिक्सेल या 2.5 μm, यदि मौजूद हो तो लुमेन के आसपास सेलुलर सीमा को हटाने के लिए 10 पिक्सेल या 25 μm)। कृपया इस आंकड़े के पूर्ण स्क्रीन पैनलों के लिए पूरक फ़ाइल देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: बिना (ऊपरी पैनलों) और सीएफ (निचले पैनलों) के साथ लोगों से रेक्टल ऑर्गेनोइड्स की छवियां। दो सूचकांकों की गणना करने के तरीकों का चित्रण, आईआर (तीव्रता अनुपात; केंद्रीय पैनल) और सीआई (परिपत्रता सूचकांक; दाएं हाथ का पैनल), जिसका उपयोग सीएफ के साथ और बिना विषयों के रेक्टल ऑर्गेनोइड्स के बीच रूपात्मक अंतर को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। आईआर एक केंद्रीय लुमेन की उपस्थिति या अनुपस्थिति को मापता है, जिसकी गणना तीन चरणों में की जाती है: (I) ऑर्गेनोइड्स की वैश्विक प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना करें: प्रत्येक संरचना के चारों ओर आसपास के 'प्रभामंडल' को हटाने के लिए 1 पिक्सेल (2.5 μm) को नष्ट करें, और शेष पूरे ऑर्गेनॉइड की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापें; (II) ऑर्गेनोइड्स की केंद्रीय प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना करें: ऑर्गेनोइड्स से सेलुलर सीमा को हटाने और शेष संरचना की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए प्रत्येक संरचना के चारों ओर 10 पिक्सेल (25 μm) को नष्ट करें; (III) आईआर गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स की Equation 3तुलना में सीएफ में बराबर है, और अधिक है। सीआई ऑर्गेनोइड्स की गोलाई को निर्धारित करता है, जिसे इस रूप Equation 4में परिभाषित किया गया है, जो गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स की तुलना में सीएफ में कम है। सीएफ: सिस्टिक फाइब्रोसिस; आईआर: तीव्रता अनुपात; सीआई: परिपत्रता सूचकांक। इस आंकड़े को Cuyx et al.13 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: सीआई और आईआर की गणना के लिए एक स्प्रेडशीट का उदाहरण। आउटपुट (परिपत्रता और माध्य तीव्रता, जैसा कि चित्र 5 में परिभाषित किया गया है) को दोनों क्षरण चरणों के लिए स्प्रेडशीट में कॉपी किया जाता है। इमेजिंग सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से प्रत्येक पैरामीटर के लिए औसत मान जोड़ता है। इन साधनों को स्प्रेडशीट में पसंद के सेल में कॉपी किया जा सकता है और फिर सीआई और आईआर की गणना के लिए उपयोग किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: रोग की स्थिति, अग्नाशय की स्थिति और पसीने क्लोराइड एकाग्रता के अनुसार प्रत्येक विषय के तीव्रता अनुपात (आईआर) और परिपत्रता सूचकांक (सीआई) मान। रेखा रैखिक भेदभाव विश्लेषण द्वारा प्राप्त इष्टतम भेदभाव रेखा का प्रतिनिधित्व करती है। सीएफ: सिस्टिक फाइब्रोसिस; पुनश्च: अग्नाशय पर्याप्त है; पीआई: अग्नाशय अपर्याप्त; एससीसी: पसीना क्लोराइड एकाग्रता। इस आंकड़े को Cuyx et al.13 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: रोमा इंडेक्स की गणना। प्रति विषय यादृच्छिक रूप से आठ कुओं का उपयोग करके और एक ही सांख्यिकीय पद्धति का उपयोग करके रोमा इंडेक्स की गणना 32 कुओं का उपयोग करके परिणामों के बराबर थी। फिर, पूर्ण भेदभाव प्राप्त किया गया था। सीआई: परिपत्रता सूचकांक; आईआर: तीव्रता अनुपात। इस आंकड़े को Cuyx et al.13 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 10
चित्र 10: हिस्टोग्राम किसी दिए गए संस्कृति में प्रत्येक एकल ऑर्गेनॉइड में मापा गया मूल्यों के वितरण को दर्शाता है। परिपत्रता पैरामीटर, ऑर्गेनॉइड के मध्य भाग के लिए तीव्रता पैरामीटर, और पूरे ऑर्गेनोइड के लिए तीव्रता पैरामीटर को चित्रित किया गया है (कॉलम)। दो सीएफ और दो गैर-सीएफ संस्कृतियों में परिणाम दिखाए गए हैं (पंक्तियाँ)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल: चित्रा 5 की पूर्ण-रिज़ॉल्यूशन प्रस्तुति। डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

CF गैर-CF p-मान
n 167 22*
IR 1.11 (0.93–1.34) 0.76 (0.61–0.88) <0.001
सीआई 0.59 (0.49–0.70) 0.79 (0.73–0.84) <0.001
आयु (वर्ष) 18 (0–60) 44 (0–77) <0.001
लिंग 85 पुरुष (51%)
82 महिलाएं (49%)		 11 पुरुष (50%)
11 महिलाएं (50%)		 >0.999
SCC (mmol/l) (n = 164) 97.61 (36–160)
एससीसी कम (<87 mmol / L) या उच्च (≥87 mmol / L) 41 कम (25%)
123 उच्च (75%)
अग्नाशय की स्थिति (एन = 165) 28 पीएस (17%)
137 पीआई (83%)

तालिका 1: रेक्टल ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान विश्लेषण (रोमा) का उपयोग करके गणना किए गए विषयों और सूचकांकों की आधारभूत विशेषताएं। n या माध्य और सीमा। सीएफ: सिस्टिक फाइब्रोसिस; आईआर: तीव्रता अनुपात; सीआई: परिपत्रता सूचकांक; एससीसी: पसीना क्लोराइड एकाग्रता; पीआई: अग्नाशय अपर्याप्त; पुनश्च: अग्नाशय पर्याप्त है। * सात वाहक, तीन गैर-वाहक, दो ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिक किडनी रोग, छह अल्सरेटिव कोलाइटिस, एक पॉलीप स्क्रीनिंग, सूजन आंत्र रोग के बारे में एक अध्ययन में शामिल तीन स्वस्थ नियंत्रण। इस तालिका को Cuyx et al.13 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है।

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Discussion

हम रेक्टल ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान विश्लेषण (ROMA) के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। रोमा, आईआर और सीआई के साथ गणना किए गए दो इंडेक्स, सीएफ के साथ विषयों से ऑर्गेनोइड्स को सही सटीकता के साथ सीएफ के बिना अलग करते हैं। इस प्रकार रोमा एससीसी और अन्य वर्तमान में उपलब्धपरीक्षणों 13,14,15 के पूरक के रूप में एक नवीन शारीरिक सीएफटीआर परख के रूप में कार्य कर सकता है।

प्रोटोकॉल आंतों के ऑर्गेनोइड्स के उपयोग पर निर्भर है, जिसमें सीएफटीआर कार्यात्मक होने पर एक गोल आकार और केंद्रीय लुमेन होता है, जैसा कि10,11 से पहले वर्णित है। ऑर्गेनोइड्स का उपयोग उपन्यास सीएफ उपचार के मूल्यांकन में तेजी से किया जाता है (उदाहरण के लिए, एफआईएस परख8 में)। रोमा प्रोटोकॉल को एफआईएस परख प्रोटोकॉल के साथ एकीकृत किया जा सकता है, क्योंकि एफआईएस परख के लिए 32 कुओं को सुधारकों के बिना रात भर इनक्यूबेट किया जाता है। इन कुओं को कैल्सीन ग्रीन के अतिरिक्त के बाद लेकिन फोरस्कोलिन और / या पोटेंशिएटर्स को जोड़ने से पहले चित्रित किया जा सकता है। इस तरह, प्रत्येक विशिष्ट रोगी के लिए नैदानिक और व्यक्तिगत चिकित्सीय अनुसंधान दोनों के लिए एक 96-वेल प्लेट का उपयोग किया जा सकता है। निदान के अलावा, रोमा अज्ञात महत्व के वेरिएंट के लक्षण वर्णन में भी जानकारी प्रदान कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल की सबसे बड़ी व्यावहारिक बाधा शायद आंतों के ऑर्गेनोइड संस्कृतियों का स्टार्टअप होगा। हालांकि, अधिकांश सामान्य अस्पतालों में, रेक्टल सक्शन बायोप्सी को एक मानकीकृत प्रोटोकॉल के अनुसार और कम जटिलता दर के साथ प्राप्तकिया जा सकता है, यहां तक कि शिशुओं में भी। बायोप्सी से ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए केवल आंतों के क्रिप्ट की उपस्थिति की आवश्यकता होती है, जबकि आईसीएम के लिए, उच्च गुणवत्ता की पूर्ण मोटाई बायोप्सीआवश्यक है 12,15। बायोप्सी को ऑर्गेनॉइड संस्कृति उत्पन्न करने के लिए एक केंद्रीय प्रयोगशाला में ले जाया जा सकता है, और बाद में 9,12 में वर्णित मानकीकृत और अर्ध-स्वचालित प्रोटोकॉल का उपयोग करके रोमा। चूंकि रोमा के लिए 32 कुओं से आठ कुओं तक की कमी ने सीएफ या गैर-सीएफ के रूप में मामलों के वर्गीकरण में कोई अंतर नहीं दिखाया, विश्लेषण के लिए आठ कुओं को चढ़ाना पर्याप्त होगा, इस प्रकार लागत कम हो जाएगी।

आगे के सत्यापन के लिए, रोमा को अस्पष्ट निदान वाले विषयों पर किया जाना होगा। सीएफ16 के निदान वाले लोगों के लिए व्यक्तिगत चिकित्सा में बाद के शोध के लिए ऑर्गेनोइड्स को बायोबैंक में संग्रहीत किया जा सकता है। ROMA एक व्यक्तिगत चिकित्सा दृष्टिकोण में भी भूमिका निभा सकता है। उदाहरण के लिए, आईआर अवशिष्ट सीएफटीआर फ़ंक्शन वाले विषयों के ऑर्गेनोइड्स को इंजेक्ट करने के बाद एक केंद्रीय लुमेन की उपस्थिति का पता लगा सकता है, लेकिन एक पोटेंशिएटर और फोर्स्कोलिन के साथ उत्तेजना से पहले।

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Disclosures

एसोसिएशन म्यूको, बेल्जियम सोसाइटी ऑफ पेडियाट्रिक्स बीवीके-एसबीपी 2019 के रिसर्च ग्रांट और ट्रांसलेशनल बायोमेडिकल रिसर्च के लिए यूजेड ल्यूवेन फंड से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम इस अध्ययन में भाग लेने वाले रोगियों और माता-पिता को धन्यवाद देते हैं। हम आबिदा बीबी को ऑर्गेनोइड्स के साथ सभी संवर्धन कार्यों के लिए धन्यवाद देते हैं। हम एल्स एर्टगर्ट्स, कैरोलीन ब्रुनेल, क्लेयर कोलार्ड, लिलियन कोलिग्नन, मोनिक डेलफॉस, अंजा डेलपोर्ट, नथाली फेयर्स, सेसिले लैम्ब्रेमोंट, लुट नीयूबोर्ग, नथाली पीटर्स, एन रमन, पिम सैनसेन, हिल्डे स्टीवंस, मैरिएन शूल्टे, एल्स वान रैंसबेक, क्रिस्टेल वैन डी ब्रांडे, ग्रीट वैन डेन आइंडे, मार्लिन वेंडरकेन, इंगे वैन डिज्क, ऑड्रे वेंडरकेन, इंगे वैन डिज्क, और बर्नार्ड वेंडर, वेंडरी वेंडर, मोनिका वासिके का शुक्रिया अदा करते हैं। एसोसिएशन म्यूको, और विशेष रूप से स्टीफन जोरिस और डॉ जान वानल्यूवे को उनके समर्थन और वित्तपोषण के लिए धन्यवाद देते हैं। हम बेल्जियम ऑर्गेनॉइड प्रोजेक्ट के सभी सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं: हेडविगे बोबोली (सीएचआर सिटाडेल, लीज, बेल्जियम), लिंडा बाउलंगर (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल्स ल्यूवेन, बेल्जियम), जॉर्जेस कैसिमिर (एचयूडीईआरएफ, ब्रुसेल्स, बेल्जियम), बेनेडिक्ट डी मेयर (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल गेंट, बेल्जियम), एल्के डी वाच्टर (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल ब्रसेल्स, बेल्जियम), डैनी डी लूज़ (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल गेंट, बेल्जियम), इसाबेल एटिने (सीएचयू इरास्मे, ब्रसेल्स, बेल्जियम), लॉरेंस हैंसेन्स ब्रसेल्स, क्रिस्टियन नोप (सीयू इरास्मे, ब्रसेल्स, बेल्जियम), मोनिक लेक्वेस्ने (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल एंटवर्प, बेल्जियम), विक्की नोवे (जीजेडए सेंट विंसेंटियस हॉस्पिटल एंटवर्प), डिर्क स्टेसेन (जीजेडए सेंट विंसेंटियस हॉस्पिटल एंटवर्प), स्टेफनी वान बिएर्लेट (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल गेंट, बेल्जियम), ईवा वैन ब्रैकेल (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल गेंट, बेल्जियम), किम वान होरेनबेक (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल एंटवर्प, बेल्जियम), ईफ वेंडरहेल्स्ट (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल ब्रसेल्स, बेल्जियम), ईफ वेंडरहेल्स्ट (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल ब्रसेल्स, बेल्जियम) बेल्जियम), स्टेफनी विन्केन (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल ब्रसेल्स, बेल्जियम)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Sorenson 17040
15 mL conical tubes VWR 525-0605
24 well plates Corning 3526
96 well plates Greiner 655101
Brightfield microscope Zeiss Axiovert 40C
Centrifuge Eppendorf 5702
CO2 incubator Binder CB160
Computer Hewlett-Packard Z240
Confocal microscope  Zeiss LSM 800
Laminar flow hood Thermo Fisher 51025413
Material for organoid culture as detailed in previous protocol10
Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) Eppendorf 3123000039, 3123000055, 3123000063
Microsoft Excel Microsoft Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit Spreadsheet software
NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software  Nikon v.5.02.00 Imaging software
Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) Greiner 774288, 775353, 750288
Zeiss Zen Blue software  Zeiss v2.6 Imaging software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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चिकित्सा अंक 184
रेक्टल ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान विश्लेषण (रोमा): सिस्टिक फाइब्रोसिस में एक नैदानिक परख
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Cuyx, S., Ramalho, A. S., Corthout,… More

Cuyx, S., Ramalho, A. S., Corthout, N., Fieuws, S., Fürstová, E., Arnauts, K., Ferrante, M., Verfaillie, C., Munck, S., Boon, M., Proesmans, M., Dupont, L., De Boeck, K., Vermeulen, F. Rectal Organoid Morphology Analysis (ROMA): A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis. J. Vis. Exp. (184), e63818, doi:10.3791/63818 (2022).

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