Summary
Questo protocollo descrive l'analisi morfologica degli organoidi rettali (ROMA), un nuovo test diagnostico per la fibrosi cistica (FC). Le caratteristiche morfologiche, vale a dire la rotondità (indice di circolarità, CI) e la presenza di un lume (rapporto di intensità, IR), sono una misura della funzione CFTR. L'analisi di 189 soggetti ha mostrato una perfetta discriminazione tra FC e non CF.
Abstract
La diagnosi di fibrosi cistica (FC) non è sempre semplice, specialmente quando la concentrazione di cloruro nel sudore è intermedia e/o possono essere identificate meno di due mutazioni CFTR che causano la malattia. I saggi fisiologici CFTR (differenza di potenziale nasale, misurazione della corrente intestinale) sono stati inclusi nell'algoritmo diagnostico, ma non sono sempre prontamente disponibili o fattibili (ad esempio, nei neonati). Gli organoidi rettali sono strutture 3D che crescono da cellule staminali isolate da cripte di una biopsia rettale quando coltivate in condizioni specifiche. Gli organoidi di soggetti non CF hanno una forma rotonda e un lume pieno di liquido, poiché il trasporto di cloruro mediato da CFTR guida l'acqua nel lume. Gli organoidi con funzione CFTR difettosa non si gonfiano, mantenendo una forma irregolare e non avendo lume visibile. Le differenze nella morfologia tra organoidi CF e non CF sono quantificate nell'"Analisi della morfologia degli organoidi rettali" (ROMA) come nuovo test fisiologico CFTR. Per il test ROMA, gli organoidi sono placcati in lastre a 96 pozzetti, colorati con calceina e ripresi in un microscopio confocale. Le differenze morfologiche sono quantificate utilizzando due indici: l'indice di circolarità (CI) quantifica la rotondità degli organoidi e il rapporto di intensità (IR) è una misura della presenza di un lume centrale. Gli organoidi non CF hanno un alto CI e un basso IR rispetto agli organoidi CF. Gli indici ROMA hanno perfettamente discriminato 167 soggetti con FC da 22 soggetti senza FC, rendendo ROMA un interessante test fisiologico CFTR per aiutare nella diagnosi di FC. Le biopsie rettali possono essere eseguite di routine a tutte le età nella maggior parte degli ospedali e il tessuto può essere inviato a un laboratorio centrale per la coltura di organoidi e ROMA. In futuro, ROMA potrebbe anche essere applicato per testare l'efficacia dei modulatori CFTR in vitro. Lo scopo del presente rapporto è quello di spiegare pienamente i metodi utilizzati per ROMA, per consentire la replica in altri laboratori.
Introduction
La fibrosi cistica (FC) è una malattia autosomica recessiva causata da mutazioni nel gene CFTR (Transmembrane Conductance Regulator (CFTR). La proteina CFTR è un canale del cloruro e del bicarbonato, garantendo l'idratazione di diversi epiteli1. La FC è una malattia multisistemica ad alto carico, che accorcia la vita, che si manifesta principalmente come una malattia respiratoria, ma colpisce anche il tratto gastrointestinale, il pancreas, il fegato e il tratto riproduttivo2.
Le mutazioni di CFTR che causano malattie portano a una diminuzione della quantità o della funzione di CFTR, causando a loro volta disidratazione del muco. Sono state descritte più di 2.000 varianti del gene CFTR 3, di cui solo 466 sono state accuratamente caratterizzate4.
Una diagnosi di FC può essere fatta quando la concentrazione di cloruro di sudore (SCC) è superiore alla soglia di 60 mmol / L o quando vengono identificate due mutazioni CFTR che causano la malattia (secondo il database CFTR2) 4,5. Nei soggetti con SCC solo intermediamente elevata (30-60 mmol/L), che si verifica in circa il 4%-5% dei test del sudore6, e mutazioni CFTR di conseguenze cliniche variabili o sconosciute, la diagnosi non può essere confermata né esclusa, anche quando hanno sintomi compatibili con FC o un test di screening neonatale positivo. Per questi casi, nell'algoritmo diagnostico sono stati inclusi saggi fisiologici CFTR di seconda linea (differenza di potenziale nasale (NPD) e misurazioni della corrente intestinale (ICM). Questi test non sono prontamente disponibili nella maggior parte dei centri né fattibili a tutte le età, specialmente nei neonati5.
Gli organoidi rettali sono strutture 3D cresciute da cellule staminali intestinali adulte Lgr5(+) provenienti da cripte intestinali ottenute attraverso la biopsia rettale7. Gli organoidi vengono sempre più utilizzati nella ricerca biomedica, come il trattamento con modulatore di test in CF8. Una biopsia praticabile può essere ottenuta mediante aspirazione o pinza, una procedura che causa solo un disagio minimo ed è sicura anche nei neonati, con bassi tassi di complicanze9. Le cripte isolate dalle biopsie rettali sono arricchite in cellule staminali e, in specifiche condizioni di coltura, queste si auto-organizzano in organoidi rettali. La morfologia di questi organoidi è determinata dall'espressione e dalla funzione del CFTR, situato sulla membrana apicale delle cellule epiteliali. Il CFTR funzionale consente al cloruro e all'acqua di entrare nel lume degli organoidi, inducendo così il gonfiore degli organoidi non CF. Gli organoidi CF non si gonfiano e non hanno lume visibile10,11.
L'analisi della morfologia degli organoidi rettali (ROMA) consente la discriminazione tra organoidi CF e non CF sulla base di queste differenze nella morfologia degli organoidi. Gli organoidi non CF sono più rotondi e hanno un lume visibile, mentre il contrario è vero per gli organoidi CF. Per questo test, gli organoidi specifici del paziente sono placcati in 32 pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Dopo 1 giorno di crescita, gli organoidi sono colorati con verde calceina e ripresi in un microscopio confocale. Gli organoidi non-CF mostrano una forma più circolare e una parte centrale meno fluorescente, poiché il lume contiene fluido e le macchie di calceina solo le cellule. Queste differenze morfologiche sono quantificate utilizzando due indici ROMA: l'indice di circolarità (CI) quantifica la rotondità degli organoidi, mentre il rapporto di intensità (IR) è una misura della presenza o assenza di un lume centrale. In questo report, descriviamo in dettaglio il protocollo per ottenere questi indici discriminanti, per consentire la replica della tecnica.
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Protocol
Per tutte le procedure che coinvolgono tessuti umani, è stata ottenuta l'approvazione da parte del Comitato etico di ricerca UZ/KU Leuven (ricerca CE). Tutte le ricerche sono state eseguite con il consenso informato e / o l'assenso di genitori, rappresentanti e / o pazienti.
NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono biopsie rettali e organoidi devono essere eseguite in un flusso laminare per proteggere il ricercatore da qualsiasi pericolo biologico e per ridurre al minimo il rischio di contaminazione delle colture. Come per qualsiasi procedura di laboratorio, i ricercatori dovrebbero sempre indossare camici da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza per manipolare i campioni.
1. Biopsia rettale, isolamento di cellule staminali adulte da cripte e coltura organoide
- Per questa parte iniziale del protocollo, compresa la produzione e l'utilizzo dei media, la coltura di organoidi, la scissione, l'espansione e il congelamento per il biobanking, seguire idue protocolli 8,12 precedentemente pubblicati.
- In breve, devono essere prese le seguenti misure:
- Effettuare da tre a quattro biopsie rettali con una pinza o un dispositivo di aspirazione e raccogliere in un contenitore sterile (ad esempio, una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml) con il mezzo Ad-DF+++ come descritto nel protocollo sopra menzionato.
- Trasporto di biopsie in un laboratorio centrale su ghiaccio o a 4 °C. Il trasporto verso altri centri è possibile e la qualità non è influenzata in modo significativo anche quando il trasporto richiede fino a 48 ore. Se si prevede che il trasporto duri più di 6 ore, utilizzare un tubo conico da 15 mL con 6 mL di mezzo Ad-DF+++ invece di un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
- Lavare le biopsie in PBS freddo fino a quando il surnatante è chiaro per rimuovere i detriti e i tessuti non epiteliali come il tessuto adiposo.
- Incubare le biopsie con EDTA (concentrazione finale 10 mM) per staccare le cripte. Placcare le cripte in una matrice di membrana basacolare. Aggiungere antibiotici ad ampio spettro (gentamicina 50 μg/mL e vancomicina 50 μg/mL) al terreno nella prima settimana di coltura per prevenire la contaminazione batterica.
- Quando le cripte sono germogliate e sono chiuse e proliferate, eseguire la scissione meccanica, di solito dopo 7 giorni.
- Dividere gli organoidi risultanti circa ogni 7 giorni. In questo modo, espandere la coltura, congelare campioni di backup in una biobanca o utilizzare gli organoidi per i test.
2. Placcatura organoide per ROMA (giorno 1)
- Dividere meccanicamente gli organoidi per la placcatura
- Raccogliere organoidi da tre pozzetti ben cresciuti da una piastra a 24 pozzetti lavandoli due volte con mezzo freddo Ad-DF+++, raccoglierli in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e valutarli al microscopio12.
- Assicurarsi che gli organoidi siano vitali e di alta qualità, che di solito possono essere raggiunti dopo 5-7 giorni di crescita dopo essere stati precedentemente divisi (Figura 1).
- Dividere meccanicamente gli organoidi secondo il suddetto protocollo 8,12. Ripetere fino a quando la maggior parte degli organoidi, valutati utilizzando il microscopio a campo chiaro, sono abbastanza piccoli rispetto all'osservazione iniziale.
- Raccogliere gli organoidi più piccoli, di solito corrispondenti alla raccolta di circa i 4/5 superiori della soluzione organoide-mezzo in una nuova provetta da microcentrifuga, poiché i grandi organoidi affondano sul fondo del tubo a causa della gravità e i piccoli organoidi rimangono sospesi nella parte superiore della colonna media.
- Centrifugare il campione di organoidi più piccoli a 0,3 x 1000 g per 2 minuti ed eliminare il terreno.
- Diluire il pellet di organoidi più piccoli in 130 μL di matrice di membrana basale 40%-50% (diluita con mezzo Ad-DF+++12).
- Risospendere bene utilizzando una micropipetta da 200 μL.
- Impiattare gli organoidi in un piatto da 96 pozzetti
- Utilizzando una pipetta da 20 μL, gli organoidi della piastra in 32 pozzetti di una piastra preriscaldata a 96 pozzetti. Assicurarsi che ogni pozzetto contenga una goccia da 4 μL della soluzione di matrice organoide prodotta nella fase precedente.
- Gli organoidi nella soluzione tendono a formare un pellet sul fondo del tubo a causa dello spostamento verso il basso dipendente dalla gravità. Per evitare che ciò accada e garantire una placcatura uniforme, risospendere regolarmente la soluzione di matrice organoide utilizzando una micropipetta da 200 μL (ad esempio, ogni volta dopo aver placcato da quattro a otto pozzetti).
- Placca ogni goccia al centro del pozzo per evitare che la goccia scorra verso i bordi del pozzo, il che ridurrebbe la qualità dell'immagine in seguito.
- Puntare a circa 30 organoidi per pozzetto (minimo 15, massimo 90) senza organoidi sovrapposti.
- Tieni presente che questi organoidi dovranno essere incubati durante la notte e cresceranno leggermente durante questo periodo e potrebbero iniziare a sovrapporsi se la densità di placcatura è troppo alta.
- Controllare la densità di placcatura utilizzando un microscopio a campo chiaro con un obiettivo di ingrandimento 5x dopo aver placcato i primi uno o due pozzetti.
- Se la densità di placcatura è troppo elevata, diluire gradualmente la soluzione di matrice organoide con l'aggiunta della matrice della membrana basale fino a raggiungere la densità di placcatura desiderata (Figura 2).
- Dopo la placcatura, picchiettare delicatamente la piastra su una superficie piana per assicurarsi che la maggior parte degli organoidi si trovi sullo stesso piano focale.
- Incubare il piatto
- Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 °C e al 5% di CO2 per 8-10 minuti per consentire la gelificazione della matrice della membrana basale.
- Aggiungere 50 μL di terreno organoide del colon umano +/+12 in ciascun pozzetto e incubare durante la notte per 16-24 ore.
- Non aggiungere modulatori di forskolina né CFTR, quindi gli organoidi crescono in condizioni basali.
3. Imaging organoide mediante microscopia confocale (giorno 2)
- Colorare gli organoidi con calcein verde
- Preparare una soluzione madre da 1 mM di calcein verde aggiungendo 50 μL di dimetilsolfossido (DMSO) ad un flaconcino contenente 50 μg di calcein verde.
- Preparare una soluzione di lavoro di calcein verde aggiungendo 1,2 μL della soluzione madre a 200 μL di Ad-DF+++ (concentrazione 6 μM).
- Aggiungere 5 μL di questa miscela di calceina a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti in cui sono stati placcati gli organoidi (concentrazione finale di calceina 0,6 μM). Non toccare e dislocare la goccia della matrice all'interno del pozzetto quando si esegue questo passaggio.
- Ruotare e inclinare leggermente la piastra con il coperchio acceso alcune volte per garantire una distribuzione omogenea del verde calcein in tutto il pozzetto.
- Incubare nuovamente la piastra per 15-30 minuti a 37 °C e al 5% di CO2 per garantire la colorazione di tutti gli organoidi nei pozzetti.
- Trasferire la piastra al microscopio confocale
- Trasferire la piastra al microscopio confocale con uno stadio automatizzato e un incubatore integrato. Assicurarsi che la piastra sia ben fissata nel supporto della piastra.
- L'incubazione a 37 °C e al 5% di CO2 è facoltativa ma non necessaria, data la breve durata (circa 10 minuti) del processo di imaging.
- Focus sugli organoidi (Figura 3)
- Utilizzando il microscopio confocale, determinare manualmente la posizione x/y ottimale e la messa a fuoco (posizione z) degli organoidi in ciascun pozzetto e salvare queste posizioni nel software di imaging.
- La migliore messa a fuoco implica la delineazione più nitida possibile degli organoidi e la visualizzazione della maggior parte possibile della goccia organoide. Se la distribuzione della macchia non è adeguata, ripetere i passaggi 3.1.4 e 3.1.5 (incubare, ad esempio, per altri 5-10 minuti).
- Utilizzare impostazioni di imaging di cellule vive con emissione a 488 nm ed eccitazione a 515 nm (specifiche per la visualizzazione della fluorescenza della calceina) e un obiettivo di ingrandimento LD 5x.
- Acquisire immagini organoidi dei 32 pozzetti con il microscopio confocale (Figura 3 e Figura 4).
- Scatta immagini in modo unidirezionale con una risoluzione di 1024 pixel x 1024 pixel (dimensione pixel 2,5 μm x 2,5 μm) e profondità di 16 bit.
- Scegli l'intensità laser e il guadagno master per una visualizzazione ottimale delle differenze morfologiche tra organoidi CF e non CF (ad esempio, discriminazione tra un lume centrale pieno d'acqua non colorato (se presente) e un bordo cellulare colorato).
NOTA: Gli organoidi non saranno delineati correttamente quando il guadagno master e quindi il segnale di fluorescenza sono troppo bassi; impostando il guadagno master troppo alto si otterranno immagini con organoidi con intensità di segnale omogenea molto elevata, impedendo l'imaging di differenze morfologiche più sottili (Figura 2). - Salva un'immagine per pozzetto per tutti i 32 pozzetti nel formato microscopio ed esportali come file TIFF.
4. Analisi delle immagini (Figura 5)
- Caricare i file TIFF nel software di analisi delle immagini.
- Eseguire il primo controllo di qualità in base a criteri di esclusione determinati dall'operatore (Figura 2): molte strutture o detriti differenziati o morti, densità di placcatura inadeguata, troppi (ad esempio, sovrapposti) o troppo pochi organoidi e distribuzione della fluorescenza inadeguata (organoidi non chiaramente delineati, segnale di fondo troppo alto).
NOTA: questo passaggio può essere eseguito anche prima di esportare le immagini come file TIFF nel passaggio 3.4. - Preparare le immagini per l'analisi
- Ricalibrare le immagini, in modo che 1 pixel corrisponda a 2,5 μm x 2,5 μm.
- Creare e aprire un Dati di rete (. ND) di tutte le 32 immagini per ogni coltura organoide, consentendo l'analisi simultanea di tutte le 32 immagini per soggetto.
- Delinea gli organoidi
- Delinea le strutture utilizzando una soglia di intensità inferiore di 4.500 e una soglia superiore di 65.535 (funzioni Smooth e Clean disattivate; Funzione Fill Holes attivata; Funzione separata in x3).
NOTA: Questo delinea le strutture fluorescenti, con fori di riempimento che includono il lume nella struttura delineata, se presente.
- Delinea le strutture utilizzando una soglia di intensità inferiore di 4.500 e una soglia superiore di 65.535 (funzioni Smooth e Clean disattivate; Funzione Fill Holes attivata; Funzione separata in x3).
- Contare gli organoidi
- Selezionare tutte le strutture ≥40 μm.
- Fare clic sul pulsante Aggiorna misurazione ND (ogni volta che è necessaria una misurazione); Gli organoidi contati saranno numerati.
NOTA: Questo equivale al numero totale di organoidi nei 32 pozzi, mentre i piccoli detriti, come le cellule morte, sono esclusi.
- Misurare l'intensità e la circolarità per il calcolo degli indici
- Selezionare tutte le strutture ≥60 μm e contare.
NOTA: Questo conta gli organoidi abbastanza grandi da mostrare la morfologia tipica di CF o non CF. Gli organoidi >40 μm e <60 μm sono piccoli e densi, sia in non-CF che in CF. - Rimuovere tutte le strutture che toccano i bordi dell'immagine. Fai questo per rimuovere gli organoidi che non sono completamente visibili, poiché la loro morfologia non può essere quantificata con precisione.
- Erodere 1 pixel (= 2,5 μm) dal bordo di ciascuna struttura di ≥60 μm. Questo rimuove l'alone di fluorescenza di calceina diffusa che circonda gli organoidi.
- Misurare l'intensità media di ogni struttura. In questo modo, viene misurata la fluorescenza media degli organoidi.
- Selezionare nuovamente tutte le strutture ≥60 μm e rimuovere tutte le strutture che toccano i bordi.
- Erodere 10 pixel (= 25 μm) dal bordo di ogni struttura di ≥60 μm.
NOTA: Negli organoidi non-CF, questo erode il bordo cellulare e lascia solo il lume. Negli organoidi CF, questo erode la parte esterna dell'organoide, che ha all'incirca la stessa fluorescenza della parte interna che rimane. - Misurare l'intensità media di ogni struttura erosa. In questo modo, viene misurata la fluorescenza media della parte centrale degli organoidi.
- Misurare la circolarità di ogni struttura. Ciò corrisponde alla circolarità media degli organoidi.
- Selezionare tutte le strutture ≥60 μm e contare.
- Eseguire il secondo controllo di qualità: criteri di esclusione determinati dal software. Escludere l'insieme delle immagini quando meno del 50% degli organoidi (definiti come strutture ≥40 μm) sono ≥60 μm, poiché un numero sufficiente di organoidi dovrebbe essere abbastanza grande da mostrare la morfologia tipica della CF o della non CF. Escludere anche quando <500 o >3.000 organoidi (definiti come strutture ≥40 μm) sono presenti nei 32 pozzi.
5. Misurare gli indici nel software di imaging (Figura 6)
- Misurare l'indice di circolarità (CI).
NOTA: Corrisponde alla circolarità media misurata al punto 4.6, che è la circolarità media di tutti gli organoidi in tutti i 32 pozzetti. L'IC quantifica la rotondità degli organoidi, definita come
, che è inferiore nella FC rispetto agli organoidi non CF - Misurare il rapporto di intensità (IR)
- Calcolare l'IR dividendo la media della misurazione dell'intensità dopo aver eroso 25 μm dal bordo di ciascuna struttura di ≥60 μm per la media della misurazione dell'intensità dopo aver eroso 2,5 μm dal bordo di ciascuna struttura di ≥60 μm.
NOTA: IR misura la presenza o l'assenza di un lume centrale. IR è uguale a
, ed è più alto in CF che in organoidi non CF.
- Calcolare l'IR dividendo la media della misurazione dell'intensità dopo aver eroso 25 μm dal bordo di ciascuna struttura di ≥60 μm per la media della misurazione dell'intensità dopo aver eroso 2,5 μm dal bordo di ciascuna struttura di ≥60 μm.
- Semplifica il processo di analisi
- Preparare un foglio di lavoro standard utilizzando un software per fogli di calcolo per calcolare automaticamente questi indici dopo aver copiato i dati (Figura 7).
- Per calcolare l'IR:
- Prendi la misura dell'intensità dopo aver eroso 2,5 μm dal bordo di ciascuna struttura di ≥60 μm. Utilizzare la media per il calcolo (denominatore).
- Prendi la misura dell'intensità dopo aver eroso 25 μm dal bordo di ciascuna struttura di ≥60 μm. Utilizzare la media per il calcolo (numeratore).
- Per calcolare l'IC, prendi la circolarità di tutti gli organoidi in tutti i pozzi. La media corrisponde all'IC.
NOTA: quando è richiesta l'analisi di grandi lotti di immagini, il processo di analisi delle immagini descritto nella sezione 4 può essere semi-automatico, partendo dai file ND calibrati ed eseguendo una macro con tutti i passaggi combinati.
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Representative Results
Gli organoidi di 212 soggetti sono stati raccolti durante le visite cliniche di routine. Non si sono verificati eventi avversi durante o dopo la procedura di biopsia rettale. Gli organoidi sono stati fotografati da un ricercatore in cieco alle caratteristiche del soggetto come il genotipo e le informazioni cliniche. A causa delle immagini di bassa qualità, sono stati esclusi 23 soggetti. Esempi di colture organoidi riuscite e fallite e acquisizione di immagini possono essere visti nella Figura 2.
Sono stati analizzati organoidi di 167 soggetti con FC e due mutazioni CFTR patogenetiche (come definito dal database CFTR24) e 22 soggetti non CF. La quantità media di organoidi per coltura era di 1.519 (circa 40-50 organoidi per pozzetto). La quantità media di organoidi per coltura inclusa per l'analisi è stata del 77% (il numero di strutture ≥60 μm diviso per il numero di strutture ≥40 μm, corrispondente alla frazione di organoidi abbastanza grande da riflettere la morfologia tipica CF o non CF).
L'IR e l'IC hanno discriminato (p < 0,001) tra organoidi di soggetti con e senza FC (Tabella 1). Con l'analisi discriminante lineare, è stata ottenuta una discriminazione perfetta (AUC = 1) tra CF e non CF, non solo quando si utilizzano i dati di tutti i 32 pozzi (Figura 8), ma anche quando otto pozzi sono stati scelti casualmente per ogni coltura (Figura 9).
La figura 10 mostra gli istogrammi che mostrano la distribuzione dei valori per la circolarità, l'intensità della parte centrale dell'organoide e l'intensità dell'intero organoide per quattro colture illustrative (due CF, due non CF).
Figura 1: Immagini di organoidi ben cresciuti e vitali. (A) Organoidi di una persona senza FC e (B) organoidi di una persona con FC. Entrambe le colture sono state coltivate per 7 giorni dopo la precedente divisione. Le immagini sono state realizzate utilizzando un microscopio a campo chiaro con un obiettivo 5x. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Illustrazione dell'imaging organoide nel microscopio confocale. (A) organoidi CF di buona qualità; B) organoidi non CF di buona qualità; (C) densità della placcatura troppo bassa: organoidi insufficienti per l'imaging rappresentativo; D) densità di placcatura troppo elevata: la sovrapposizione degli organoidi impedisce un'adeguata colorazione della calceina e la valutazione della morfologia; (E) intensità troppo bassa a causa di un problema con la colorazione della calceina o dell'impostazione del guadagno principale troppo bassa; (F) intensità troppo elevata a causa dell'impostazione del guadagno master troppo elevata: piccoli lumen possono essere mascherati dal segnale di fluorescenza sovraesposto; (G) organoidi morti e scoppiati, in cui è possibile vedere cellule separate e non è più possibile valutare la morfologia; H) organoidi differenziati in cui lo status di cellule staminali è perso, che si presentano come strutture spesse spesso con segnali ad alta fluorescenza nel mezzo delle strutture organoidi, che non riflettono la morfologia tipica della CF o non CF; (I) segnale di fondo troppo alto, a causa della colorazione della calceina che è stata eseguita troppo tempo fa con diffusione sullo sfondo o perché l'impostazione del guadagno principale è troppo elevata; J) insufficiente scissione meccanica degli organoidi, che li lascia troppo grandi per il test, che non si colora bene e che non riflette adeguatamente la morfologia CF o non CF. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Concentrarsi sugli organoidi e acquisire immagini . (A) Scegliere la scheda Acquisizione . Fare clic sul pulsante Live qui sotto per l'imaging in tempo reale. (B) Utilizzare le impostazioni di imaging delle cellule vive con emissione a 488 nm. (C) Immagine con una risoluzione di 1024 pixel x 1024 pixel e una profondità di 16 bit per pixel. Scegliere il parametro di imaging unidirezionale. (D) Regolare il guadagno master per l'intensità ottimale della fluorescenza per ottimizzare l'imaging delle caratteristiche organoidi come la forma e la presenza o l'assenza di un lume. (E) Salvare singole posizioni (x, y e z) per ciascuno dei 32 pozzetti per coltura organoide. (F) Fare clic sul pulsante Avvia esperimento per eseguire il protocollo predefinito e acquisire le immagini in base ai parametri scelti. (G) Le immagini possono essere salvate al termine o è possibile impostare un salvataggio automatico con il pulsante Salvataggio automatico . Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Esportazione di immagini per l'analisi. (A) Scegliere la scheda Elaborazione e fare clic sul pulsante Batch per esportare immagini di più colture organoidi in un'unica procedura. (B) Fare clic sul pulsante Aggiungi e selezionare le immagini salvate necessarie per l'analisi. (C) Selezionare l'esportazione delle immagini come metodo. (D) Esportare le immagini come file TIFF, non convertire in 8 bit e non comprimere o ridimensionare. Esporta i dati originali senza grafica burn-in. Selezionate i 32 pozzetti della piastra a 96 pozzetti con il parametro scena. Non ri-affiancare. (E) Fare clic sul pulsante Applica per estrarre utilizzando i parametri scelti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Analisi delle immagini organoidi nel software di imaging . (A) Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla barra grigia sopra la sezione dei risultati (asterisco rosso) per impostare i parametri per la misurazione dell'oggetto. Aggiungi circolarità e intensità media. (B) Fare clic su File > Import/Export > Create ND file from file sequence to combine the TIFF files for one culture into one ND file . (C) Selezionare il file desiderato e confermare; Saranno combinate 32 immagini (asterisco rosso). (d) Fare clic su Ricalibrazione > Ricalibrare documento. (E) Fare clic su Dimensione pixel nella finestra pop-up. (F) Immettere 2,5 μm come dimensione di 1 pixel. (G) L'immagine verrà ora ricalibrata in micrometri anziché in pixel (asterisco rosso). (h) Fare clic su Binario > Definisci soglia. (I) La selezione delle dimensioni può essere eseguita nella finestra pop-up. La dimensione minima è di 40 μm per il conteggio degli organoidi e 60 μm per l'analisi morfologica degli organoidi. Disattiva sempre la funzione Smooth and Clean , attiva la funzione Fill Holes e inserisci Separate x3. Applicare a tutti i fotogrammi. (J) Il software mostrerà la delineazione delle strutture definite. Fare clic sul pulsante Aggiorna misurazione ND per analizzare e ottenere i parametri scelti dal passaggio A come output. (K) Fare clic sulla freccia rivolta verso il basso accanto al pulsante di esportazione e selezionare i dati negli appunti. (L) Fare clic sul pulsante Esporta per copiare l'output dei dati negli appunti. I dati possono ora essere incollati in un foglio di calcolo. (M) Fare clic sul pulsante Ripristina dati per svuotare la sezione dei risultati prima che venga eseguita una nuova misurazione. (N) Quando è necessario eseguire l'erosione per la misurazione dell'intensità per il calcolo del rapporto di intensità, fare clic su Binario > Erode. La funzione Rimuovi bordi tocco oggetti si trova nello stesso menu a discesa. (O) Selezionare la matrice mostrata nella figura per l'erosione e scegliere il conteggio desiderato (1 pixel o 2,5 μm per la rimozione degli organoidi circostanti l'alone, 10 pixel o 25 μm per la rimozione del bordo cellulare che circonda un lume se presente). Si prega di consultare il file supplementare per i pannelli a schermo intero di questa figura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Immagini di organoidi rettali di persone senza (pannelli superiori) e con CF (pannelli inferiori). Illustrazione dei metodi per calcolare i due indici, IR (rapporto di intensità; pannello centrale) e CI (indice di circolarità; pannello di destra), utilizzati per quantificare le differenze morfologiche tra organoidi rettali di soggetti con e senza FC. IR misura la presenza o l'assenza di un lume centrale, calcolato in tre fasi: (I) calcolare l'intensità di fluorescenza globale degli organoidi: erodere 1 pixel (2,5 μm) per rimuovere l'alone circostante attorno a ciascuna struttura e misurare l'intensità media di fluorescenza dell'organoide intero rimanente; (II) calcolare l'intensità centrale di fluorescenza degli organoidi: erodere 10 pixel (25 μm) attorno a ciascuna struttura per rimuovere il bordo cellulare dagli organoidi e misurare l'intensità media di fluorescenza della struttura rimanente; (III) IR è uguale a 
, ed è più alto nella FC che negli organoidi non CF. L'IC quantifica la rotondità degli organoidi, definita come 
, che è inferiore nella FC rispetto agli organoidi non CF. FC: fibrosi cistica; IR: rapporto di intensità; CI: indice di circolarità. Questa figura è stata ristampata con il permesso di Cuyx et al.13. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Esempio di foglio di calcolo per il calcolo di CI e IR. L'output (circolarità e intensità media, come definito nella Figura 5) viene copiato nel foglio di calcolo per entrambe le fasi di erosione. Il software di imaging aggiunge automaticamente i valori medi per ciascun parametro. Questi mezzi possono essere copiati in una cella a scelta nel foglio di calcolo e quindi utilizzati per il calcolo di CI e IR. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Rapporto di intensità (IR) e valori dell'indice di circolarità (CI) di ciascun soggetto in base allo stato di malattia, allo stato pancreatico e alla concentrazione di cloruro di sudore. La linea rappresenta la linea di discriminazione ottimale ottenuta dall'analisi discriminante lineare. FC: fibrosi cistica; PS: pancreatico sufficiente; PI: pancreatico insufficiente; SCC: concentrazione di cloruro nel sudore. Questa figura è stata ristampata con il permesso di Cuyx et al.13. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Calcolo degli indici ROMA. Il calcolo degli indici ROMA utilizzando otto pozzi a caso per soggetto e utilizzando la stessa metodologia statistica è stato paragonabile ai risultati utilizzando 32 pozzi. Ancora una volta, è stata ottenuta una discriminazione perfetta. CI: indice di circolarità; IR: rapporto di intensità. Questa figura è stata ristampata con il permesso di Cuyx et al.13. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 10: Istogrammi che illustrano la distribuzione dei valori misurati in ogni singolo organoide in una data coltura. Vengono rappresentati il parametro di circolarità, il parametro di intensità per la parte centrale dell'organoide e il parametro di intensità per l'intero organoide (colonne). Vengono mostrati i risultati in due colture CF e due non CF (righe). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
File supplementare: presentazione ad alta risoluzione della Figura 5. Clicca qui per scaricare.
| CFR | Non-CF | p-valore | |
| n | 167 | 22* | |
| IR | 1.11 (0.93–1.34) | 0.76 (0.61–0.88) | <0,001 |
| IC | 0.59 (0.49–0.70) | 0.79 (0.73–0.84) | <0,001 |
| Età (anni) | 18 (0–60) | 44 (0–77) | <0,001 |
| Genere | 85 maschi (51%) 82 donne (49%) |
11 maschi (50%) 11 donne (50%) |
>0,999 |
| SCC (mmol/l) (n = 164) | 97.61 (36–160) | ||
| SCC basso (<87 mmol / L) o alto (≥87 mmol / L) | 41 basso (25%) 123 alto (75%) |
||
| Stato pancreatico (n = 165) | 28 PS (17%) 137 PI (83%) |
Tabella 1: Caratteristiche basali dei soggetti e indici calcolati utilizzando l'analisi della morfologia organoide rettale (ROMA). n o media e intervallo. FC: fibrosi cistica; IR: rapporto di intensità; CI: indice di circolarità; SCC: concentrazione di cloruro di sudore; PI: pancreatico insufficiente; PS: pancreatico sufficiente. * sette portatori, tre non portatori, due malattia renale policistica autosomica dominante, sei colite ulcerosa, uno screening dei polipi, tre controlli sani inclusi in uno studio sulla malattia infiammatoria intestinale. Questa tabella è stata ristampata con il permesso di Cuyx et al.13.
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Discussion
Forniamo un protocollo dettagliato per l'analisi della morfologia organoide rettale (ROMA). I due indici calcolati con ROMA, IR e CI, distinguevano gli organoidi dai soggetti con FC da quelli senza FC con perfetta precisione. ROMA potrebbe quindi funzionare come un nuovo test fisiologico CFTR complementare a SCC e ad altri test attualmente disponibili13,14,15.
Il protocollo dipende dall'uso di organoidi intestinali, che hanno una forma rotonda e un lume centrale quando CFTR è funzionale, come descritto primadi 10,11. Gli organoidi sono sempre più utilizzati nella valutazione di nuovi trattamenti per la fibrosi cistica (ad esempio, nel saggio FIS8). Il protocollo ROMA può essere integrato con il protocollo di analisi FIS, poiché per il test FIS 32 pozzetti vengono incubati durante la notte senza correttori. Questi pozzetti possono essere visualizzati dopo l'aggiunta di calcein verde ma prima dell'aggiunta di forskolina e / o potenziatori. In questo modo, una piastra da 96 pozzetti può essere utilizzata sia per la ricerca diagnostica che terapeutica personalizzata per ogni paziente specifico. Oltre alla diagnosi, ROMA potrebbe anche fornire informazioni nella caratterizzazione di varianti di significato sconosciuto.
Il più grande ostacolo pratico di questo protocollo sarebbe probabilmente l'avvio di colture organoidi intestinali. Tuttavia, nella maggior parte degli ospedali generali, le biopsie di aspirazione rettale possono essere ottenute secondo un protocollo standardizzato e con bassi tassi di complicanze, anche nei neonati9. La generazione di organoidi da biopsie richiede solo la presenza di cripte intestinali, mentre per ICM sono necessarie biopsie a tutto spessore di qualità superiore12,15. Le biopsie possono essere trasportate in un laboratorio centrale per generare una coltura organoide e successivamente ROMA utilizzando il protocollo standardizzato e semi-automatico descritto qui 9,12. Poiché la riduzione da 32 pozzi a otto pozzi per ROMA non ha mostrato alcuna differenza nella classificazione dei casi come CF o non CF, sarebbe sufficiente placcare otto pozzi per l'analisi, riducendo così il costo.
Per un'ulteriore validazione, la ROMA dovrà essere eseguita su soggetti con diagnosi equivoche. Gli organoidi possono essere conservati in una biobanca per una successiva ricerca sulla medicina personalizzata per quelli con diagnosi di FC16. ROMA potrebbe svolgere un ruolo anche in un approccio di medicina personalizzata. Ad esempio, l'IR potrebbe rilevare l'aspetto di un lume centrale dopo l'incubazione di organoidi di soggetti con funzione CFTR residua ma prima della stimolazione con un potenziatore e forskolina.
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Disclosures
Questo studio è stato finanziato dall'associazione belga di pazienti FC "Mucovereniging/Association Muco", dalla borsa di ricerca della Società belga di pediatria BVK-SBP 2019 e da una sovvenzione del Fondo UZ Leuven per la ricerca biomedica traslazionale. Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo i pazienti e i genitori che hanno partecipato a questo studio. Ringraziamo Abida Bibi per tutto il lavoro di coltura con gli organoidi. Ringraziamo Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz e Bernard Wenderickx per il supporto logistico. Ringraziamo anche la Mucovereniging/Association Muco, e in particolare Stefan Joris e Dr. Jan Vanleeuwe, per il loro sostegno e finanziamento. Ringraziamo tutti i collaboratori del Belgian Organoid Project: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liegi, Belgio), Linda Boulanger (University Hospitals Leuven, Belgio), Georges Casimir (HUDERF, Bruxelles, Belgio), Benedicte De Meyere (University Hospital Ghent, Belgio), Elke De Wachter (University Hospital Brussels, Belgio), Danny De Looze (University Hospital Ghent, Belgio), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Bruxelles, Belgio), Laurence Hanssens (HUDERF, Bruxelles), Christiane Knoop (CHU Erasme, Bruxelles, Belgio), Monique Lequesne (Ospedale universitario di Anversa, Belgio), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hospital Anversa), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hospital Anversa), Stephanie Van Biervliet (University Hospital Ghent, Belgio), Eva Van Braeckel (University Hospital Ghent, Belgio), Kim Van Hoorenbeeck (University Hospital Antwerp, Belgio), Eef Vanderhelst (University Hospital Brussels, Belgio), Stijn Verhulst (University Hospital Antwerp, Belgio), Stefanie Vincken (Ospedale universitario di Bruxelles, Belgio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
References
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