Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Rektal organoid morfologi analyse (ROMA): En diagnostisk analyse i cystisk fibrose

Published: June 10, 2022 doi: 10.3791/63818
Automatic Translation
1,2, 1, 3,4, 5, 6, 7,8, 7,9, 8, 3,4, 1,2, 1,2, 10,11, 1,2, 1,2
1Department of Development and Regeneration, Woman and Child Unit, CF research lab, KU Leuven, 2Department of Pediatrics, Pediatric Pulmonology, University Hospitals Leuven, 3VIB Bio Imaging Core, VIB-KU Leuven Center for Brain & Disease Research, 4Department for Neuroscience, KU Leuven, 5Interuniversity Center for Biostatistics and Statistical Bioinformatics, University of Leuven and University of Hasselt, 6Department of Pediatrics, 2nd Faculty of Medicine, Charles University and Motol University Hospital, 7Department of Chronic Diseases and Metabolism (CHROMETA), Translational Research Center for Gastrointestinal Disorders (TARGID), KU Leuven, 8Department of Development and Regeneration, Stem Cell Institute Leuven (SCIL), KU Leuven, 9Department of Gastroenterology and Hepatology, University Hospitals Leuven, KU Leuven, 10Department of Chronic Diseases, Metabolism and Ageing; Pneumology, KU Leuven, 11Department of Respiratory Diseases, University Hospitals Leuven

Summary

Denne protokollen beskriver rektal organoid morfologi analyse (ROMA), en ny diagnostisk analyse for cystisk fibrose (CF). Morfologiske egenskaper, nemlig rundheten (sirkularitetsindeks, CI) og tilstedeværelsen av et lumen (intensitetsforhold, IR), er et mål på CFTR-funksjonen. Analyse av 189 forsøkspersoner viste perfekt diskriminering mellom CF og ikke-CF.

Abstract

Diagnosen cystisk fibrose (CF) er ikke alltid enkel, spesielt når konsentrasjonen av svetteklorid er middels og/eller mindre enn to sykdomsfremkallende mutasjoner av CFTR kan identifiseres. Fysiologiske CFTR-analyser (nasal potensialforskjell, måling av tarmstrøm) er inkludert i den diagnostiske algoritmen, men er ikke alltid lett tilgjengelige eller gjennomførbare (f.eks. hos spedbarn). Rektale organoider er 3D-strukturer som vokser fra stamceller isolert fra krypter av en rektal biopsi når de dyrkes under spesifikke forhold. Organoider fra ikke-CF-personer har en rund form og et væskefylt lumen, da CFTR-mediert kloridtransport driver vann inn i lumen. Organoider med defekt CFTR-funksjon svulmer ikke, beholder en uregelmessig form og har ingen synlig lumen. Forskjeller i morfologi mellom CF og ikke-CF organoider er kvantifisert i 'Rectal Organoid Morphology Analysis' (ROMA) som en ny CFTR fysiologisk analyse. For ROMA-analysen er organoider belagt i 96-brønnplater, farget med calcein og avbildet i et konfokalt mikroskop. Morfologiske forskjeller kvantifiseres ved hjelp av to indekser: Sirkularitetsindeksen (CI) kvantifiserer rundheten til organoider, og intensitetsforholdet (IR) er et mål på tilstedeværelsen av et sentralt lumen. Ikke-CF-organoider har høy KI og lav IR sammenlignet med CF-organoider. ROMA-indekser diskriminerte perfekt 167 personer med CF fra 22 personer uten CF, noe som gjorde ROMA til en tiltalende fysiologisk CFTR-analyse for å hjelpe til med CF-diagnose. Rektale biopsier kan rutinemessig utføres i alle aldre på de fleste sykehus, og vev kan sendes til et sentralt laboratorium for organoidkultur og ROMA. I fremtiden kan ROMA også brukes til å teste effekten av CFTR-modulatorer in vitro. Målet med denne rapporten er å fullt ut forklare metodene som brukes for ROMA, for å tillate replikering i andre laboratorier.

Introduction

Cystisk fibrose (CF) er en autosomal recessiv sykdom forårsaket av mutasjoner i CF transmembran konduktansregulator (CFTR) genet. CFTR-proteinet er en klorid- og bikarbonatkanal, noe som sikrer hydrering av flere epitel1. CF er en høybelastende, livsforkortende, multisystemsykdom, som først og fremst manifesterer seg som en luftveissykdom, men påvirker også mage-tarmkanalen, bukspyttkjertelen, leveren og reproduktive kanalen2.

Sykdomsfremkallende mutasjoner i CFTR fører til en reduksjon i mengden eller funksjonen av CFTR, noe som igjen forårsaker dehydrering av slim. Mer enn 2000 varianter i CFTR-genet er beskrevet3, hvorav bare 466 har blitt grundig karakterisert4.

En diagnose av CF kan gjøres når enten svettekloridkonsentrasjonen (SCC) er over terskelen på 60 mmol / L eller når to sykdomsfremkallende CFTR-mutasjoner (ifølge CFTR2-databasen) er identifisert 4,5. Hos personer med bare middels forhøyet (30-60 mmol / L) SCC, som forekommer i ca. 4% -5% av svettetester6, og CFTR-mutasjoner av varierende eller ukjent klinisk konsekvens, kan diagnosen ikke bekreftes eller utelukkes, selv når de har CF-kompatible symptomer eller en positiv neonatal screeningstest. For disse tilfellene har andrelinje fysiologiske CFTR-analyser (nasal potensialforskjell (NPD) og tarmstrømmålinger (ICM)) blitt inkludert i den diagnostiske algoritmen. Disse testene er ikke lett tilgjengelige på de fleste sentre og heller ikke gjennomførbare i alle aldre, spesielt hos spedbarn5.

Rektale organoider er 3D-strukturer dyrket fra Lgr5 (+) voksne intestinale stamceller fra tarmkrypter oppnådd gjennom rektal biopsi7. Organoider brukes i økende grad i biomedisinsk forskning, for eksempel testing av modulatorbehandling i CF8. En levedyktig biopsi kan oppnås ved enten suge- eller tangbiopsi, en prosedyre som bare forårsaker minimal ubehag og er trygg selv hos spedbarn, med lave komplikasjonsrater9. Kryptene isolert fra rektalbiopsiene er beriket i stamceller, og under spesifikke dyrkingsforhold organiserer disse seg selv i rektalorganoider. Morfologien til disse organoider bestemmes av uttrykket og funksjonen til CFTR, lokalisert ved den apikale membranen av epitelceller. Funksjonell CFTR tillater klorid og vann å komme inn i organoidlumen, og derved indusere hevelse av ikke-CF-organoider. CF-organoider svulmer ikke og har ingen synlig lumen10,11.

Rektal organoid morfologi analyse (ROMA) tillater diskriminering mellom CF og ikke-CF organoider basert på disse forskjellene i organoid morfologi. Ikke-CF-organoider er mer runde og har et synlig lumen, mens det motsatte er tilfelle for CF-organoider. For denne analysen er pasientspesifikke organoider belagt i 32 brønner i en 96-brønnplate. Etter 1 dag med dyrking, er organoider farget med calcein grønn og avbildet i et konfokalt mikroskop. De ikke-CF-organoider viser en mer sirkulær form og en mindre fluorescerende sentral del, da lumen inneholder væske og calcein flekker bare celler. Disse forskjellene i morfologi kvantifiseres ved hjelp av to ROMA-indekser: Sirkularitetsindeksen (CI) kvantifiserer rundheten til organoider, mens intensitetsforholdet (IR) er et mål på tilstedeværelsen eller fraværet av et sentralt lumen. I denne rapporten beskriver vi i detalj protokollen for å oppnå disse diskriminerende indeksene, for å tillate replikering av teknikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

For alle prosedyrer som involverer menneskelig vev, ble det innhentet godkjenning av etisk komité Research UZ/KU Leuven (EC research). All forskning ble utført med informert samtykke og / eller samtykke fra foreldre, representanter og / eller pasienter.

MERK: Alle prosedyrer som involverer rektalbiopsier og organoider bør utføres i en laminær strøm for å beskytte forskeren mot biologisk fare og for å minimere risikoen for forurensning av kulturene. Som for enhver laboratorieprosedyre, bør forskere til enhver tid bruke laboratoriefrakker, hansker og vernebriller for å manipulere prøver.

1. Rektal biopsi, isolering av voksne stamceller fra krypter og organoidkultur

  1. For denne første delen av protokollen, inkludert medieproduksjon og bruk, organoidkultur, splitting, utvidelse og frysing for biobanking, følg de to tidligere publiserte protokollene 8,12.
  2. Kort sagt, følgende trinn må tas:
    1. Ta tre til fire rektale biopsier med tang eller sugeanordning og samles i en steril beholder (f.eks. 1,5 ml mikrosentrifugerør) med Ad-DF+++-mediet som beskrevet i protokollen nevnt ovenfor.
    2. Transportbiopsier til et sentralt laboratorium på is eller ved 4 °C. Transport til andre sentre er mulig, og kvaliteten påvirkes ikke vesentlig selv når transporten tar opptil 48 timer. Hvis transporten forventes å ta over 6 timer, bruk et 15 ml konisk rør med 6 ml Ad-DF +++ medium i stedet for et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    3. Vask biopsiene i kald PBS til supernatanten er klar for å fjerne rusk og ikke-epitelvev som fettvev.
    4. Inkuber biopsiene med EDTA (endelig konsentrasjon 10 mM) for å løsne kryptene. Plate kryptene i en kjellermembranmatrise. Legg bredspektret antibiotika (gentamicin 50 μg / ml og vankomycin 50 μg / ml) til mediet i den første uken av dyrking for å forhindre bakteriell forurensning.
    5. Når kryptene har spiret og er lukket og spredt, utfør mekanisk splitting, vanligvis etter 7 dager.
    6. Del de resulterende organoider omtrent hver 7. På denne måten kan du utvide kulturen, fryse sikkerhetskopieringsprøver i en biobank, eller bruke organoidene til analyser.

2. Organoid plating for ROMA (dag 1)

  1. Del organoidene mekanisk for plating
    1. Samle organoider fra tre godt dyrkede brønner fra en 24-brønnsplate ved å vaske to ganger med kaldt Ad-DF +++ medium, samle dem i et 1,5 ml mikrosentrifugerør og vurder dem under mikroskopet12.
    2. Sørg for at organoider er levedyktige og av høy kvalitet, noe som vanligvis kan oppnås etter 5-7 dagers vekst etter å ha blitt delt tidligere (figur 1).
    3. Del organoidene mekanisk i henhold til den nevnte protokollen 8,12. Gjenta til flertallet av organoider, som vurdert ved hjelp av brightfield-mikroskopet, er små nok sammenlignet med den første observasjonen.
    4. Samle de mindre organoider, vanligvis tilsvarende samlingen av omtrent den øverste 4/5 av organoid-medium løsningen i en ny mikrocentrifuge tube, som store organoider synker til bunnen av røret på grunn av tyngdekraften og små organoider opphold suspendert i den øvre delen av medium kolonnen.
    5. Sentrifuge prøven av mindre organoider ved 0,3 x 1000 g i 2 minutter og kast mediet.
    6. Fortynn pelleten av mindre organoider i 130 μL 40% -50% kjellermembranmatrise (fortynnet med Ad-DF +++ medium12).
    7. Resuspender godt ved hjelp av en 200 μL mikropipette.
  2. Plate organoider i en 96-brønns plate
    1. Ved hjelp av en 20 μL pipette, plateorganoider i 32 brønner av en forvarmet 96-brønnplate. Forsikre deg om at hver brønn inneholder en 4 μL dråpe av organoidmatriseoppløsningen produsert i forrige trinn.
    2. Organoidene i løsningen har en tendens til å danne en pellet i bunnen av røret på grunn av tyngdekraftavhengig nedadgående forskyvning. For å forhindre dette og sikre jevn plettering, resuspender organoidmatriseløsningen regelmessig ved hjelp av en 200 μL mikropipette (f.eks. hver gang etter plating av fire til åtte brønner).
    3. Plate hver dråpe i midten av brønnen for å forhindre at dråpen løper mot kantene på brønnen, noe som vil redusere bildekvaliteten senere.
    4. Sikt på rundt 30 organoider per brønn (minimum 15, maksimum 90) uten overlappende organoider.
    5. Husk at disse organoider må inkuberes over natten og vil vokse litt i løpet av denne tiden, og kan begynne å overlappe hvis plating tettheten er for høy.
    6. Kontroller plating tetthet ved hjelp av et brightfield mikroskop med en 5x forstørrelse mål etter plating den første en eller to brønner.
    7. Hvis pletteringstettheten er for høy, fortynn organoidmatriseløsningen trinnvis med tilsetning av kjellermembranmatrisen til ønsket pletteringstetthet er nådd (figur 2).
    8. Etter plating, bank forsiktig platen på en flat overflate for å sikre at flertallet av organoider er i samme fokalplan.
  3. Inkubere platen
    1. Inkuber 96-brønnsplaten ved 37 ° C og 5% CO2 i løpet av 8-10 minutter for å tillate gelering av kjellermembranmatrisen.
    2. Tilsett 50 μL humant kolonorganoidmedium +/+12 i hver brønn og inkuber over natten i 16-24 timer.
    3. Legg ingen forskolin eller CFTR modulatorer, slik at organoider vokse under basale forhold.

3. Organoidavbildning ved bruk av konfokalmikroskopi (dag 2)

  1. Flekk organoider med calcein grønn
    1. Forbered en 1 mM stamløsning av kalseingrønn ved å tilsette 50 μL dimetylsulfoksid (DMSO) til ett hetteglass som inneholder 50 μg kalsedanrønt.
    2. Forbered en arbeidsløsning av kalseingrønn ved å tilsette 1,2 μL av stamløsningen til 200 μL Ad-DF +++ (konsentrasjon 6 μM).
    3. Tilsett 5 μL av denne kalsineblandingen til hver brønn i 96-brønnsplaten der organoider ble belagt (endelig kalseinkonsentrasjon 0,6 μM). Ikke berør og forskyv matrisedråpen inne i brønnen når du utfører dette trinnet.
    4. Roter og vipp platen litt med lokket på noen ganger for å sikre homogen fordeling av calcein grønn i hele brønnen.
    5. Inkuber platen igjen i 15-30 min ved 37 °C og 5 % CO2 for å sikre farging av alle organoider i brønnene.
  2. Overfør platen til det konfokale mikroskopet
    1. Overfør platen til det konfokale mikroskopet med et automatisert stadium og integrert inkubator. Forsikre deg om at platen er godt festet i plateholderen.
    2. Inkubasjon ved 37 °C og 5 % CO2 er valgfritt, men ikke nødvendig, gitt den korte varigheten (ca. 10 min) av bildeprosessen.
  3. Fokus på organoidene (figur 3)
    1. Bruk det konfokale mikroskopet til å bestemme den optimale x/y-posisjonen og fokuset (z-posisjonen) til organoidene i hver brønn manuelt, og lagre disse posisjonene i bildebehandlingsprogramvaren.
    2. Det beste fokuset innebærer skarpest mulig avgrensning av organoider og visualisering av størst mulig del av organoidfallet. Hvis fordelingen av flekken ikke er tilstrekkelig, gjenta trinn 3.1.4 og 3.1.5 (inkuberer for eksempel i ytterligere 5-10 minutter).
    3. Bruk levende celleavbildningsinnstillinger med utslipp ved 488 nm og eksitasjon ved 515 nm (spesifikt for visualisering av kalseinfluorescens) og et 5x LD forstørrelsesmål.
  4. Ta organoidbilder av de 32 brønnene med konfokalmikroskop (figur 3 og figur 4).
    1. Ta bilder på en ensrettet måte med en oppløsning på 1024 piksler x 1024 piksler (pikselstørrelse 2,5 μm x 2,5 μm) og dybde på 16 biter.
    2. Velg laserintensitet og masterforsterkning for optimal visualisering av morfologiske forskjeller mellom CF- og ikke-CF-organoider (f.eks. Diskriminering mellom et ikke-farget vannfylt sentralt lumen (hvis tilstede) og en farget cellulær kant).
      MERK: Organoider vil ikke bli avgrenset riktig når masterforsterkningen og dermed fluorescenssignalet er for lavt; Å sette mastergevinsten for høyt vil resultere i bilder med organoider med homogen svært høy signalintensitet, noe som forhindrer avbildning av mer subtile morfologiske forskjeller (figur 2).
    3. Lagre ett bilde per brønn for alle 32 brønner i mikroskopformat og eksporter dem som TIFF-filer.

4. Bildeanalyse (figur 5)

  1. Last inn TIFF-filene i bildeanalyseprogramvaren.
  2. Utfør den første kvalitetskontrollen basert på eksklusjonskriterier bestemt av operatøren (figur 2): mange differensierte eller døde strukturer eller rusk, utilstrekkelig pletteringstetthet, for mange (f.eks. overlappende) eller for få organoider, og utilstrekkelig fluorescensfordeling (organoider ikke tydelig avgrenset, bakgrunnssignalet for høyt).
    MERK: Dette trinnet kan også utføres før du eksporterer bilder som TIFF-filer i trinn 3.4.
  3. Klargjøre bilder for analyse
    1. Kalibrer bilder på nytt, slik at 1 piksel tilsvarer 2,5 μm x 2,5 μm.
    2. Opprett og åpne én nettverksdata (. ND) fil av alle 32 bilder for hver organoid kultur, slik at samtidig analyse av alle 32 bilder per emne.
  4. Avgrens organoidene
    1. Avgrens strukturer ved hjelp av en lavere intensitetsterskel på 4 500 og en øvre terskel på 65 535 (Glatte og rene funksjoner av; Fyllhull funksjon på; Separat funksjon ved x3).
      MERK: Dette avgrenser fluorescerende strukturer, med fyllhull inkludert lumen i den avgrensede strukturen hvis den finnes.
  5. Tell organoider
    1. Velg alle strukturer ≥40 μm.
    2. Klikk på knappen Oppdater ND-måling (hver gang en måling er nødvendig); de talte organoider vil bli nummerert.
      MERK: Dette tilsvarer det totale antallet organoider i de 32 brønnene, mens små rester, som døde celler, er utelukket.
  6. Mål intensitet og sirkularitet for beregning av indeksene
    1. Velg alle strukturer ≥60 μm og antall.
      MERK: Dette teller organoider store nok til å vise morfologi typisk for enten CF eller ikke-CF. Organoider >40 μm og <60 μm er små og tette, både i ikke-CF og i CF.
    2. Fjern alle strukturer som berører kantlinjene i bildet. Gjør dette for å fjerne organoider som ikke er helt synlige, da deres morfologi ikke kan kvantifiseres nøyaktig.
    3. Erodere 1 piksel (= 2,5 μm) fra grensen til hver ≥60 μm struktur. Dette fjerner haloen av diffust calcein fluorescens som omgir organoider.
    4. Mål gjennomsnittsintensiteten til hver struktur. På denne måten måles den gjennomsnittlige fluorescensen av organoider.
    5. Velg alle strukturer ≥60 μm igjen og fjern alle strukturer som berører kantene.
    6. Erodere 10 piksler (= 25 μm) fra grensen til hver ≥60 μm struktur.
      MERK: I ikke-CF-organoider eroderer dette den cellulære grensen og etterlater bare lumen. I CF-organoider eroderer dette den ytre delen av organoiden, som har omtrent samme fluorescens som den indre delen som er igjen.
    7. Mål gjennomsnittsintensiteten til hver erodert struktur. På denne måten måles den gjennomsnittlige fluorescensen av den sentrale delen av organoider.
    8. Mål sirkulariteten til hver struktur. Dette tilsvarer organoidenes gjennomsnittlige sirkularitet.
  7. Utfør den andre kvalitetskontrollen: eksklusjonskriterier bestemt av programvaren. Ekskluder settet med bilder når mindre enn 50% av organoider (definert som strukturer ≥40 μm) er ≥60 μm, da nok organoider skal være store nok til å vise morfologi som er typisk for enten CF eller ikke-CF. Ekskluderes også når <500 eller >3000 organoider (definert som strukturer ≥40 μm) er til stede i de 32 brønnene.

5. Mål indeksene i bildebehandlingsprogrammet (figur 6)

  1. Mål sirkularitetsindeksen (CI).
    MERK: Dette tilsvarer gjennomsnittlig sirkularitet målt i trinn 4.6, som er gjennomsnittlig sirkularitet for alle organoider i alle 32 brønner. CI kvantifiserer rundheten til organoidene, definert som , som Equation 1er lavere i CF enn i ikke-CF-organoider
  2. Måle intensitetsforholdet (IR)
    1. Beregn IR ved å dele gjennomsnittet av intensitetsmålingen etter å ha erodert 25 μm fra grensen til hver ≥60 μm struktur med gjennomsnittet av intensitetsmålingen etter å ha erodert 2,5 μm fra grensen til hver ≥60 μm struktur.
      MERK: IR måler tilstedeværelsen eller fraværet av et sentralt lumen. IR er lik Equation 2, og er høyere i CF enn i ikke-CF organoider.
  3. Forenkle analyseprosessen
    1. Forbered et standard regneark ved hjelp av regnearkprogramvare for automatisk å beregne disse indeksene ved kopiering av dataene (figur 7).
    2. Slik beregner du IR:
      1. Ta intensitetsmålingen etter å ha erodert 2,5 μm fra grensen til hver ≥60 μm struktur. Bruk gjennomsnittet for beregningen (nevneren).
      2. Ta intensitetsmålingen etter å ha erodert 25 μm fra grensen til hver ≥60 μm struktur. Bruk gjennomsnittet for beregningen (teller).
    3. For å beregne CI, ta sirkulariteten til alle organoider i alle brønner. Gjennomsnittet tilsvarer CI.
      MERK: Når analyse av store grupper med bilder er nødvendig, kan bildeanalyseprosessen som beskrevet i avsnitt 4 halvautomatiseres, fra de kalibrerte ND-filene og kjøre en makro med alle trinnene kombinert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Organoider fra 212 forsøkspersoner ble samlet inn under rutinemessige kliniske besøk. Ingen bivirkninger forekom under eller etter rektal biopsi-prosedyren. Organoider ble avbildet av en forsker blindet for fagegenskaper som genotype og klinisk informasjon. På grunn av bilder av lav kvalitet ble 23 forsøkspersoner ekskludert. Eksempler på vellykkede og mislykkede organoidkulturer og bildetilegnelse kan ses i figur 2.

Organoider med 167 pasienter med CF og to sykdomsfremkallende CFTR-mutasjoner (som definert i CFTR2-databasen4) og 22 ikke-CF-pasienter ble analysert. Gjennomsnittlig mengde organoider per kultur var 1,519 (ca. 40-50 organoider per brønn). Gjennomsnittlig mengde organoider per kultur inkludert for analyse var 77% (antall strukturer ≥60 μm delt på antall strukturer ≥40 μm, tilsvarende fraksjonen av organoider som er store nok til å reflektere typisk CF- eller ikke-CF-morfologi).

IR og KI diskriminerte (p < 0,001) mellom organoider fra forsøkspersoner med og uten CF (tab 1). Ved lineær diskriminantanalyse ble perfekt diskriminering (AUC = 1) oppnådd mellom CF og ikke-CF, ikke bare ved bruk av data fra alle 32 brønner (figur 8), men også ved valg av åtte brønner tilfeldig for hver kultur (figur 9).

Figur 10 viser histogrammer som viser fordelingen av verdier for sirkularitet, intensiteten av den sentrale delen av organoiden og intensiteten av hele organoiden for fire illustrative kulturer (to CF, to ikke-CF).

Figure 1
Figur 1: Bilder av godt voksne og levedyktige organoider. (A) Organoider fra en person uten CF og (B) organoider fra en person med CF. Begge kulturene ble dyrket i 7 dager etter forrige splittelse. Bilder ble laget ved hjelp av et brightfield-mikroskop med et 5x mål. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Illustrasjon av organoidavbildning i konfokalmikroskopet. (A) CF-organoider av god kvalitet; (B) ikke-CF-organoider av god kvalitet; (C) tetthet av plating for lav: ikke nok organoider for representativ bildebehandling; (D) tetthet av plating for høy: overlapping av organoider forhindrer tilstrekkelig kalseinfarging og vurdering av morfologi; (E) intensiteten er for lav på grunn av enten et problem med kalseinfarging eller at masterforsterkningsinnstillingen er for lav; (F) intensiteten er for høy på grunn av at masterforsterkningsinnstillingen er for høy: små lumen kan maskeres av det overeksponerte fluorescenssignalet; (G) døde og sprengte organoider, hvor separate celler kan ses og morfologi ikke lenger kan vurderes; (H) differensierte organoider der stamcellestatus går tapt, og vises som tykke strukturer ofte med høye fluorescenssignaler midt i organoidstrukturene, som ikke reflekterer typisk CF- eller ikke-CF-morfologi; (I) bakgrunnssignalet er for høyt, enten på grunn av at kalseinfarging har blitt utført for lenge siden med diffusjon i bakgrunnen eller på grunn av at masterforsterkningsinnstillingen er for høy; (J) utilstrekkelig mekanisk splitting av organoider, slik at de blir for store for analysen, ikke flekker godt, og ikke tilstrekkelig reflekterer CF eller ikke-CF morfologi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Fokus på organoider og innhenting av bilder . (A) Velg Anskaffelse-fanen . Klikk på Live-knappen nedenfor for sanntidsbilder. (B) Bruk levende celleavbildningsinnstillinger med utslipp ved 488 nm. (C) Bilde med en oppløsning på 1024 piksler x 1024 piksler og en dybde på 16 bits per piksel. Velg den ensrettede bildeparameteren. (D) Juster masterforsterkningen for optimal intensitet av fluorescens for å optimalisere avbildning av organoide egenskaper som form og tilstedeværelse eller fravær av lumen. (E) Lagre enkeltposisjoner (x, y og z) for hver av de 32 brønnene per organoidkultur. (F) Klikk på Start eksperiment-knappen for å kjøre den forhåndsdefinerte protokollen og hente bilder i henhold til de valgte parametrene. (G) Bilder kan lagres ved ferdigstillelse, eller en automatisk lagring kan settes opp med Autosave-knappen . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Eksportere bilder for analyse. (A) Velg kategorien Behandling , og klikk på Batch-knappen for å eksportere bilder av flere organoidkulturer i en prosedyre. (B) Klikk på Legg til-knappen og velg de lagrede bildene som trengs for analyse. (C) Velg bildeeksport som metode. (D) Eksporter bilder som TIFF-filer, ikke konverter til 8 bits, og ikke komprimer eller endre størrelse. Eksporter opprinnelige data uten innbrenningsgrafikk. Velg de 32 brønnene på 96-brønnsplaten med sceneparameteren. Ikke flislegg på nytt. (E) Klikk på Bruk-knappen for å trekke ut ved hjelp av de valgte parametrene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Analyse av organoidbilder i bildebehandlingsprogrammet. (A) Høyreklikk den grå linjen over resultatdelen (rød stjerne) for å definere parametere for objektmåling. Legg til sirkularitet og gjennomsnittlig intensitet. (B) Klikk på Fil > Importer / eksporter > Opprett ND-fil fra filsekvens for å kombinere TIFF-filene for en kultur til en ND-fil. (C) Velg ønsket fil og bekreft; 32 bilder vil bli kombinert (rød stjerne). (d) Klikk på Rekalibrering > kalibrer dokumentet på nytt. (E) Klikk på Pikselstørrelse i popup-vinduet. (F) Skriv inn 2,5 μm som størrelse på 1 piksel. (G) Bildet vil nå bli rekalibrert til mikrometer i stedet for piksler (rød stjerne). (h) Klikk binær > definer terskel. (I) Størrelsesvalg kan utføres i popup-vinduet. Minimumsstørrelsen er 40 μm for organoidtelling og 60 μm for organoidmorfologianalyse. Slå alltid av funksjonen Glatt og ren, slå på Fyllhull-funksjonen og skriv inn separat x3. Bruk på alle rammer. (J) Programvaren vil vise avgrensning av de definerte strukturene. Klikk på Oppdater ND-måling-knappen for å analysere og få de valgte parametrene fra trinn A som utgang. (K) Klikk på nedoverpilen ved siden av eksportknappen, og velg data til utklippstavlen. (L) Klikk på Eksport knappen for å kopiere datautgangen til utklippstavlen. Data kan nå limes inn i et regneark. (M) Klikk på Tilbakestill data-knappen for å tømme resultatdelen før en ny måling utføres. (N) Når erosjon må utføres for intensitetsmåling for beregning av intensitetsforholdet, klikker du Binær > Erodere. Funksjonen Fjern objekter som berører grenser finner du i samme rullegardinmeny. (O) Velg matrisen som vises i figuren for erosjon, og velg ønsket antall (1 piksel eller 2,5 μm for fjerning av halo-omgivende organoider, 10 piksler eller 25 μm for fjerning av den cellulære grensen som omgir et lumen hvis det finnes). Se tilleggsfilen for fullskjermpaneler av denne figuren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Bilder av rektalorganoider fra personer uten (øvre panel) og med CF (nedre paneler). Illustrasjon av metodene for å beregne de to indeksene, IR (intensitetsforhold; sentralpanel) og CI (sirkularitetsindeks; høyre panel), som brukes til å kvantifisere morfologiske forskjeller mellom rektalorganoider hos forsøkspersoner med og uten CF. IR måler tilstedeværelse eller fravær av et sentralt lumen, beregnet i tre trinn: (I) beregne organoidenes globale fluorescensintensitet: erodere 1 piksel (2,5 μm) for å fjerne den omkringliggende 'haloen' rundt hver struktur, og måle den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten til den gjenværende hele organoiden; (II) beregne organoidenes sentrale fluorescensintensitet: erodere 10 piksler (25 μm) rundt hver struktur for å fjerne den cellulære grensen fra organoidene og måle gjennomsnittlig fluorescensintensitet av den gjenværende strukturen; (III) IR er lik Equation 3, og er høyere i CF enn i ikke-CF-organoider. CI kvantifiserer rundheten til organoidene, definert som , som Equation 4er lavere i CF enn i ikke-CF-organoider. CF: cystisk fibrose; IR: intensitetsforhold; CI: sirkularitetsindeks. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Cuyx et al.13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Eksempel på regneark for beregning av CI og IR. Utgangen (sirkularitet og gjennomsnittlig intensitet, som definert i figur 5) kopieres inn i regnearket for begge erosjonstrinnene. Bildebehandlingsprogramvaren legger automatisk til middelverdiene for hver parameter. Disse midlene kan kopieres til en valgt celle i regnearket og deretter brukes til beregning av CI og IR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: Intensitetsforhold (IR) og sirkularitetsindeks (CI) verdier for hvert individ i henhold til sykdomsstatus, bukspyttkjertelstatus og svettekloridkonsentrasjon. Linjen representerer den optimale diskrimineringslinjen oppnådd ved lineær diskriminantanalyse. CF: cystisk fibrose; PS: bukspyttkjertelen tilstrekkelig; PI: bukspyttkjertelen utilstrekkelig; SCC: konsentrasjon av svetteklorid. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Cuyx et al.13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: Beregning av ROMA-indekser. Beregning av ROMA-indekser ved hjelp av åtte brønner tilfeldig per og ved bruk av samme statistiske metode var sammenlignbar med resultatene ved bruk av 32 brønner. Igjen ble perfekt diskriminering oppnådd. CI: sirkularitetsindeks; IR: intensitetsforhold. Dette tallet er gjengitt med tillatelse fra Cuyx et al.13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: Histogrammer som illustrerer fordelingen av verdier målt i hver enkelt organoid i en gitt kultur. Sirkularitetsparameteren, intensitetsparameteren for den sentrale delen av organoiden og intensitetsparameteren for hele organoiden er avbildet (kolonner). Resultater i to CF- og to ikke-CF-kulturer er vist (rader). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilleggsfil: Fulloppløsningspresentasjon av figur 5. Vennligst klikk her for å laste ned.

JF Ikke-CF p-verdi
n 167 22*
IR 1.11 (0.93–1.34) 0.76 (0.61–0.88) <0.001
CI 0.59 (0.49–0.70) 0.79 (0.73–0.84) <0.001
Alder (år) 18 (0–60) 44 (0–77) <0.001
Kjønn 85 menn (51 %)
82 kvinner (49 %)		 11 menn (50 %)
11 kvinner (50%)		 >0.999
SCC (mmol/l) (n = 164) 97.61 (36–160)
SCC lav (<87 mmol / L) eller høy (≥87 mmol / L) 41 lave (25 %)
123 høye (75 %)
Pancreasstatus (n = 165) 28 HK (17 %)
137 PI (83 %)

Tabell 1: Baseline karakteristika for forsøkspersonene og indeksene beregnet ved hjelp av rektal organoid morfologianalyse (ROMA). n eller gjennomsnitt og rekkevidde. CF: cystisk fibrose; IR: intensitetsforhold; CI: sirkularitetsindeks; SCC: konsentrasjon av svetteklorid; PI: bukspyttkjertelen utilstrekkelig; PS: bukspyttkjertelen tilstrekkelig. * Syv bærere, tre ikke-bærere, to autosomal dominant polycystisk nyresykdom, seks ulcerøs kolitt, en polyp screening, tre friske kontroller inkludert i en studie om inflammatorisk tarmsykdom. Denne tabellen er gjengitt med tillatelse fra Cuyx et al.13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi gir en detaljert protokoll for rektal organoid morfologi analyse (ROMA). De to indeksene beregnet med ROMA, IR og CI, skilte organoider fra personer med CF fra de uten CF med perfekt nøyaktighet. ROMA kan dermed fungere som en ny fysiologisk CFTR-analyse komplementær til SCC og andre tilgjengelige tester13,14,15.

Protokollen er avhengig av bruk av tarmorganoider, som har en rund form og sentral lumen når CFTR er funksjonell, som beskrevet før10,11. Organoider brukes i økende grad i vurderingen av nye CF-behandlinger (f.eks. i FIS-analysen8). ROMA-protokollen kan integreres med FIS-analyseprotokollen, som for FIS-analysen inkuberes 32 brønner over natten uten korrektorer. Disse brønnene kan avbildes etter tilsetning av calcein grønn, men før tilsetning av forskolin og / eller potensatorer. På denne måten kan en 96-brønnsplate brukes til både diagnostisk og personlig terapeutisk forskning for hver enkelt pasient. Bortsett fra diagnose, kan ROMA også gi informasjon i karakterisering av varianter av ukjent betydning.

Den største praktiske hindringen i denne protokollen vil trolig være oppstart av tarmorganoidkulturer. På de fleste somatiske sykehus kan imidlertid rektal sugebiopsi oppnås i henhold til en standardisert protokoll og med lave komplikasjonsrater, selv hos spedbarn9. Generering av organoider fra biopsier krever bare tilstedeværelse av tarmkrypter, mens for ICM er det nødvendig med biopsier av høyere kvalitet i full tykkelse12,15. Biopsier kan transporteres til et sentralt laboratorium for å generere en organoidkultur, og påfølgende ROMA ved hjelp av den standardiserte og halvautomatiske protokollen beskrevet her i 9,12. Siden reduksjon fra 32 brønner til åtte brønner for ROMA ikke viste noen forskjell i klassifiseringen av tilfeller som CF eller ikke-CF, ville det være tilstrekkelig å legge åtte brønner til analyse, og dermed redusere kostnadene.

For ytterligere validering må ROMA utføres på personer med tvetydige diagnoser. Organoider kan lagres i en biobank for senere forskning på persontilpasset medisin for de som er diagnostisert med CF16. ROMA kan også spille en rolle i en personlig medisintilnærming. For eksempel kan IR oppdage utseendet til et sentralt lumen etter inkubering av organoider av personer med gjenværende CFTR-funksjon, men før stimulering med en potensator og forskolin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Denne studien ble finansiert av den belgiske CF-pasientforeningen "Mucovereniging/Association Muco", forskningsstipendet til Belgian Society of Paediatrics BVK-SBP 2019, og et stipend fra UZ Leuven Fund for Translational Biomedical Research. Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker pasienter og foreldre som deltok i denne studien. Vi takker Abida Bibi for alt kulturarbeid med organoidene. Vi takker Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz og Bernard Wenderickx for logistikkstøtte. Vi takker også Mucovereniging / Association Muco, og spesielt Stefan Joris og Dr. Jan Vanleeuwe, for deres støtte og finansiering. Vi takker alle samarbeidspartnere fra det belgiske organoidprosjektet: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liège, Belgia), Linda Boulanger (Universitetssykehusene Leuven, Belgia), Georges Casimir (HUDERF, Brussel, Belgia), Benedicte De Meyere (Universitetssykehuset Gent, Belgia), Elke De Wachter (Universitetssykehuset Brussel, Belgia), Danny De Looze (Universitetssykehuset Gent, Belgia), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Brussel, Belgia), Laurence Hanssens (HUDERF, Brussel), Christiane Knoop (CHU Erasme, Brussel, Belgia), Monique Lequesne (Universitetssykehuset Antwerpen, Belgia), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Stephanie Van Biervliet (Universitetssykehuset Gent, Belgia), Eva Van Braeckel (Universitetssykehuset Gent, Belgia), Kim Van Hoorenbeeck (Universitetssykehuset Antwerpen, Belgia), Eef Vanderhelst (Universitetssykehuset Brussel, Belgia), Stijn Verhulst (Universitetssykehuset Antwerpen, Belgia), Stefanie Vincken (Universitetssykehuset Brussel, Belgia).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Sorenson 17040
15 mL conical tubes VWR 525-0605
24 well plates Corning 3526
96 well plates Greiner 655101
Brightfield microscope Zeiss Axiovert 40C
Centrifuge Eppendorf 5702
CO2 incubator Binder CB160
Computer Hewlett-Packard Z240
Confocal microscope  Zeiss LSM 800
Laminar flow hood Thermo Fisher 51025413
Material for organoid culture as detailed in previous protocol10
Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) Eppendorf 3123000039, 3123000055, 3123000063
Microsoft Excel Microsoft Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit Spreadsheet software
NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software  Nikon v.5.02.00 Imaging software
Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) Greiner 774288, 775353, 750288
Zeiss Zen Blue software  Zeiss v2.6 Imaging software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
  2. Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).
  3. Cystic Fibrosis Mutation Database. , Available from: http://www.genet.sickkids.on.ca/ (2022).
  4. CFTR2. , Available from: https://www.cftr2.org/ (2022).
  5. Farrell, P. M., et al. Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation. The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).
  6. Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).
  7. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  8. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).
  9. Friedmacher, F., Puri, P. Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung's disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications. Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).
  10. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  11. Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).
  12. Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
  13. Cuyx, S., et al. Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis. Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).
  14. Wilschanski, M., et al. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).
  15. Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
  16. Ramalho, A. S., et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis. European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).

Tags

Medisin utgave 184
Rektal organoid morfologi analyse (ROMA): En diagnostisk analyse i cystisk fibrose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cuyx, S., Ramalho, A. S., Corthout,… More

Cuyx, S., Ramalho, A. S., Corthout, N., Fieuws, S., Fürstová, E., Arnauts, K., Ferrante, M., Verfaillie, C., Munck, S., Boon, M., Proesmans, M., Dupont, L., De Boeck, K., Vermeulen, F. Rectal Organoid Morphology Analysis (ROMA): A Diagnostic Assay in Cystic Fibrosis. J. Vis. Exp. (184), e63818, doi:10.3791/63818 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter