Summary
Detta protokoll beskriver rektal organoid morfologianalys (ROMA), en ny diagnostisk analys för cystisk fibros (CF). Morfologiska egenskaper, nämligen rundheten (cirkularitetsindex, CI) och närvaron av en lumen (intensitetsförhållande, IR), är ett mått på CFTR-funktionen. Analys av 189 försökspersoner visade perfekt diskriminering mellan CF och icke-CF.
Abstract
Diagnos av cystisk fibros (CF) är inte alltid okomplicerad, särskilt när svettkloridkoncentrationen är mellanliggande och / eller mindre än två sjukdomsframkallande CFTR-mutationer kan identifieras. Fysiologiska CFTR-analyser (nasal potentialskillnad, tarmströmmätning) har inkluderats i den diagnostiska algoritmen men är inte alltid lättillgängliga eller genomförbara (t.ex. hos spädbarn). Rektala organoider är 3D-strukturer som växer från stamceller isolerade från krypter av en rektal biopsi när de odlas under specifika förhållanden. Organoider från icke-CF-ämnen har en rund form och en vätskefylld lumen, eftersom CFTR-medierad kloridtransport driver vatten in i lumen. Organoider med defekt CFTR-funktion sväller inte, behåller en oregelbunden form och har ingen synlig lumen. Skillnader i morfologi mellan CF- och icke-CF-organoider kvantifieras i 'Rectal Organoid Morphology Analysis' (ROMA) som en ny CFTR-fysiologisk analys. För ROMA-analysen är organoider pläterade i 96-brunnsplattor, färgade med calcein och avbildade i ett konfokalmikroskop. Morfologiska skillnader kvantifieras med hjälp av två index: Cirkularitetsindexet (CI) kvantifierar organoidernas rundhet och intensitetsförhållandet (IR) är ett mått på närvaron av en central lumen. Icke-CF-organoider har en hög CI och låg IR jämfört med CF-organoider. ROMA-index diskriminerade perfekt 167 personer med CF från 22 försökspersoner utan CF, vilket gör ROMA till en tilltalande fysiologisk CFTR-analys för att hjälpa till med CF-diagnos. Rektala biopsier kan rutinmässigt utföras i alla åldrar på de flesta sjukhus och vävnad kan skickas till ett centralt laboratorium för organoidodling och ROMA. I framtiden kan ROMA också komma att tillämpas för att testa effekten av CFTR-modulatorer in vitro. Syftet med denna rapport är att fullständigt förklara de metoder som används för ROMA, för att möjliggöra replikering i andra laboratorier.
Introduction
Cystisk fibros (CF) är en autosomal recessiv sjukdom som orsakas av mutationer i CF-transmembrankonduktansregulatorn (CFTR) -genen. CFTR-proteinet är en klorid- och bikarbonatkanal, vilket säkerställer hydrering av flera epitel1. CF är en sjukdom med hög börda, livsförkortande, multisystem, som främst manifesterar sig som en andningssjukdom, men också påverkar mag-tarmkanalen, bukspottkörteln, levern och reproduktionskanalen2.
Sjukdomsframkallande CFTR-mutationer leder till en minskning av mängden eller funktionen av CFTR , vilket i sin tur orsakar uttorkning av slem. Mer än 2 000 varianter i CFTR-genen har beskrivits3, varav endast 466 har karakteriserats grundligt4.
En diagnos av CF kan ställas när antingen svettkloridkoncentrationen (SCC) ligger över tröskeln på 60 mmol / L eller när två sjukdomsframkallande CFTR-mutationer (enligt CFTR2-databasen) identifieras 4,5. Hos patienter med endast mellanförhöjd (30-60 mmol / L) SCC, som förekommer i cirka 4% -5% av svetttesterna6, och CFTR-mutationer av varierande eller okänd klinisk konsekvens, kan diagnosen inte bekräftas eller uteslutas, även om de har CF-kompatibla symtom eller ett positivt neonatalt screeningtest. För dessa fall har andra linjens fysiologiska CFTR-analyser (nasal potentialskillnad (NPD) och tarmströmmätningar (ICM)) inkluderats i den diagnostiska algoritmen. Dessa tester är inte lätt tillgängliga på de flesta centra eller genomförbara i alla åldrar, särskilt hos spädbarn5.
Rektala organoider är 3D-strukturer odlade från Lgr5 (+) vuxna tarmstamceller från tarmkrypter erhållna genom rektal biopsi7. Organoider används alltmer i biomedicinsk forskning, såsom testning av modulatorbehandling i CF8. En livskraftig biopsi kan erhållas genom antingen sug- eller pincettbiopsi, ett förfarande som endast orsakar minimalt obehag och är säkert även hos spädbarn, med låga komplikationsfrekvenser9. Krypterna isolerade från rektala biopsier berikas i stamceller, och under specifika odlingsförhållanden organiserar dessa sig själv i rektala organoider. Morfologin hos dessa organoider bestäms av uttrycket och funktionen hos CFTR, som ligger vid epitelcellernas apikala membran. Funktionell CFTR tillåter klorid och vatten att komma in i organoidlumen, vilket inducerar svullnad av icke-CF-organoider. CF-organoider sväller inte och har ingen synlig lumen10,11.
Rektal organoid morfologianalys (ROMA) möjliggör diskriminering mellan CF och icke-CF-organoider baserat på dessa skillnader i organoidmorfologi. Icke-CF-organoider är mer runda och har en synlig lumen, medan motsatsen gäller för CF-organoider. För denna analys pläteras patientspecifika organoider i 32 brunnar med en 96-brunnsplatta. Efter 1 dags odling färgas organoiderna med kalceingrönt och avbildas i ett konfokalmikroskop. De icke-CF-organoiderna visar en mer cirkulär form och en mindre fluorescerande central del, eftersom lumen endast innehåller vätske- och kalceinfläckar. Dessa skillnader i morfologi kvantifieras med hjälp av två ROMA-index: cirkularitetsindexet (CI) kvantifierar organoidernas rundhet, medan intensitetsförhållandet (IR) är ett mått på närvaron eller frånvaron av en central lumen. I den här rapporten beskriver vi i detalj protokollet för att erhålla dessa diskriminerande index, för att möjliggöra replikering av tekniken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
För alla förfaranden som involverar mänsklig vävnad erhölls godkännande av etikkommittén Research UZ/KU Leuven (EG-forskning). All forskning utfördes med informerat samtycke och / eller samtycke från föräldrar, representanter och / eller patienter.
OBS: Alla procedurer som involverar rektala biopsier och organoider bör utföras i ett laminärt flöde för att skydda forskaren från biologisk fara och för att minimera risken för kontaminering av kulturerna. När det gäller alla laboratorieprocedurer bör forskare alltid bära labbrockar, handskar och skyddsglasögon för att manipulera prover.
1. Rektal biopsi, isolering av vuxna stamceller från krypter och organoidodling
- För denna inledande del av protokollet, inklusive medieproduktion och användning, organoidkultur, splittring, expansion och frysning för biobanking, följ de två tidigare publicerade protokollen 8,12.
- Kort sagt måste följande åtgärder vidtas:
- Ta tre till fyra rektala biopsier med en pincett eller suganordning och samla i en steril behållare (t.ex. 1,5 ml mikrocentrifugrör) med Ad-DF +++ -mediet som beskrivs i protokollet som nämns ovan.
- Transportera biopsier till ett centralt laboratorium på is eller vid 4 °C. Transport till andra centra är möjlig, och kvaliteten påverkas inte signifikant även när transporten tar upp till 48 timmar. Om transporten förväntas ta över 6 timmar, använd ett 15 ml koniskt rör med 6 ml Ad-DF +++ medium istället för ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tvätta biopsierna i kall PBS tills supernatanten är klar för att ta bort skräp och icke-epitelvävnader som fettvävnad.
- Inkubera biopsierna med EDTA (slutlig koncentration 10 mM) för att lossa krypterna. Platta krypterna i en källarmembranmatris. Tillsätt bredspektrumantibiotika (gentamicin 50 μg/ml och vankomycin 50 μg/ml) till mediet under den första odlingsveckan för att förhindra bakteriell kontaminering.
- När krypterna har knoppat och är stängda och spridda, utför mekanisk splittring, vanligtvis efter 7 dagar.
- Dela de resulterande organoiderna ungefär var 7: e dag. På så sätt kan du utöka kulturen, frysa reservprover i en biobank eller använda organoiderna för analyser.
2. Organoid plätering för ROMA (dag 1)
- Dela mekaniskt organoiderna för plätering
- Samla organoider från tre välvuxna brunnar från en 24-brunnsplatta genom att tvätta två gånger med kallt Ad-DF +++ -medium, samla dem i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och bedöm dem under mikroskopet12.
- Se till att organoider är livskraftiga och av hög kvalitet, vilket vanligtvis kan uppnås efter 5-7 dagars tillväxt efter att ha delats tidigare (figur 1).
- Dela upp organoiderna mekaniskt enligt ovannämnda protokoll 8,12. Upprepa tills majoriteten av organoiderna, som bedöms med hjälp av ljusfältmikroskopet, är tillräckligt små jämfört med den ursprungliga observationen.
- Samla de mindre organoiderna, som vanligtvis motsvarar samlingen av cirka de översta 4/5 av organoid-mediumlösningen i ett nytt mikrocentrifugrör, eftersom stora organoider sjunker till botten av röret på grund av tyngdkraften och små organoider förblir upphängda i den övre delen av mellankolonnen.
- Centrifugera provet av mindre organoider vid 0,3 x 1000 g i 2 minuter och kassera mediet.
- Späd pelleten av mindre organoider i 130 μL av 40% -50% källarmembranmatris (utspädd med Ad-DF +++ medium12).
- Återsuspendera brunnen med en 200 μL mikropipett.
- Plåta organoiderna i en 96-brunnsplatta
- Använd en 20 μL pipett, platta organoider i 32 brunnar av en förvärmd 96-brunnsplatta. Se till att varje brunn innehåller en droppe på 4 μl av den organoidmatrislösning som producerades i föregående steg.
- Organoiderna i lösningen tenderar att bilda en pellet i botten av röret på grund av tyngdkraftsberoende förskjutning nedåt. För att förhindra detta och säkerställa enhetlig plätering, återsuspendera regelbundet organoidmatrislösningen med en 200 μL mikropipett (t.ex. varje gång efter plätering av fyra till åtta brunnar).
- Platta varje droppe i mitten av brunnen för att förhindra att droppen löper mot brunnens kanter, vilket skulle minska bildkvaliteten senare.
- Sikta på cirka 30 organoider per brunn (minst 15, högst 90) utan överlappande organoider.
- Tänk på att dessa organoider måste inkuberas över natten och kommer att växa något under denna tid och kan börja överlappa om pläteringstätheten är för hög.
- Kontrollera pläteringstätheten med ett ljusfältmikroskop med ett 5x förstoringsmål efter plätering av de första en eller två brunnarna.
- Om pläteringstätheten är för hög, späd organoidmatrislösningen stegvis med tillsats av källarmembranmatrisen tills önskad pläteringstäthet uppnås (figur 2).
- Efter plätering, knacka försiktigt på plattan på en plan yta för att säkerställa att majoriteten av organoiderna befinner sig i samma fokalplan.
- Inkubera plattan
- Inkubera 96-brunnsplattan vid 37 °C och 5%CO2 under 8-10 min för att möjliggöra gelering av källarmembranmatrisen.
- Tillsätt 50 μl humant kolonorganoidmedium +/+12 i varje brunn och inkubera över natten i 16-24 timmar.
- Lägg till inga forskolin eller CFTR modulatorer, så organoiderna växer under basala förhållanden.
3. Organoid avbildning med konfokalmikroskopi (dag 2)
- Fläcka organoiderna med kalceingrön
- Bered en 1 mM stamlösning av kalceingrönt genom att tillsätta 50 μl dimetylsulfoxid (DMSO) till en injektionsflaska som innehåller 50 μg kalceingrönt.
- Bered en arbetslösning av kalceingrön genom att tillsätta 1,2 μL av stamlösningen till 200 μL Ad-DF+++ (koncentration 6 μM).
- Tillsätt 5 μl av denna kalceinblandning till varje brunn på 96-brunnsplattan i vilken organoider pläterades (slutlig kalceinkoncentration 0,6 μM). Rör inte vid och förskjuta matrisfallet inuti brunnen när du utför detta steg.
- Rotera och luta plattan något med locket på några gånger för att säkerställa homogen fördelning av kalceingrönt i hela brunnen.
- Inkubera plattan igen i 15-30 min vid 37 °C och 5%CO2 för att säkerställa färgning av alla organoider i brunnarna.
- Överför plattan till konfokalmikroskopet
- Överför plattan till konfokalmikroskopet med ett automatiserat steg och integrerad inkubator. Se till att plattan är väl fastsatt i platthållaren.
- Inkubation vid 37 °C och 5 %CO2 är valfritt men inte nödvändigt med tanke på avbildningsprocessens korta varaktighet (cirka 10 minuter).
- Fokusera på organoiderna (figur 3)
- Använd konfokalmikroskopet för att bestämma den optimala x / y-positionen och fokusen (z-positionen) för organoiderna i varje brunn manuellt och spara dessa positioner i bildprogramvaran.
- Det bästa fokuset innebär den skarpaste möjliga avgränsningen av organoiderna och visualisering av den största möjliga delen av organoiddroppen. Om fläckens fördelning inte är tillräcklig, upprepa steg 3.1.4 och 3.1.5 (inkubera t.ex. i ytterligare 5-10 minuter).
- Använd avbildningsinställningar för levande celler med emission vid 488 nm och excitation vid 515 nm (specifikt för visualisering av kalceinfluorescens) och ett 5x LD-förstoringsmål.
- Skaffa organoidbilder av de 32 brunnarna med konfokalmikroskopet (figur 3 och figur 4).
- Ta bilder på ett enkelriktat sätt med en upplösning på 1024 pixlar x 1024 pixlar (pixelstorlek 2,5 μm x 2,5 μm) och djup på 16 bitar.
- Välj laserintensitet och masterförstärkning för optimal visualisering av morfologiska skillnader mellan CF- och icke-CF-organoider (t.ex. diskriminering mellan en icke-färgad vattenfylld central lumen (om sådan finns) och en färgad cellulär kant).
OBS: Organoider kommer inte att avgränsas korrekt när huvudförstärkningen och därmed fluorescenssignalen är för låg; Om du ställer in masterförstärkningen för högt kommer det att resultera i bilder med organoider med homogen mycket hög signalintensitet, vilket förhindrar avbildning av mer subtila morfologiska skillnader (figur 2). - Spara en bild per brunn för alla 32 brunnar i mikroskopformatet och exportera dem som TIFF-filer.
4. Bildanalys (figur 5)
- Ladda TIFF-filerna i bildanalysprogramvaran.
- Utför den första kvalitetskontrollen baserat på uteslutningskriterier som fastställts av operatören (figur 2): många differentierade eller döda strukturer eller skräp, otillräcklig pläteringstäthet, för många (t.ex. överlappande) eller för få organoider och otillräcklig fluorescensfördelning (organoider inte tydligt avgränsade, bakgrundssignalen för hög).
OBS: Detta steg kan också utföras innan du exporterar bilder som TIFF-filer i steg 3.4. - Förbereda bilder för analys
- Kalibrera om bilder, så 1 pixel motsvarar 2,5 μm x 2,5 μm.
- Skapa och öppna en nätverksdata (. ND) -fil med alla 32 bilder för varje organoidkultur, vilket möjliggör samtidig analys av alla 32 bilder per ämne.
- Avgränsa organoiderna
- Avgränsa strukturer med en lägre intensitetströskel på 4 500 och en övre tröskel på 65 535 (Släta och rena funktioner avstängda; Fyll hål funktion på; Separat funktion vid x3).
OBS: Detta avgränsar fluorescerande strukturer, med fyllningshål inklusive lumen i den avgränsade strukturen om den finns.
- Avgränsa strukturer med en lägre intensitetströskel på 4 500 och en övre tröskel på 65 535 (Släta och rena funktioner avstängda; Fyll hål funktion på; Separat funktion vid x3).
- Räkna organoiderna
- Välj alla strukturer ≥40 μm.
- Klicka på knappen Uppdatera ND-mätning (varje gång en mätning behövs); De räknade organoiderna kommer att numreras.
OBS: Detta motsvarar det totala antalet organoider i de 32 brunnarna, medan små skräp, såsom döda celler, är uteslutet.
- Mät intensitet och cirkularitet för beräkning av index
- Välj alla strukturer ≥60 μm och räkna.
OBS: Detta räknar organoiderna tillräckligt stora för att visa morfologi som är typisk för antingen CF eller icke-CF. Organoider >40 μm och <60 μm är små och täta, både i icke-CF och i CF. - Ta bort alla strukturer som rör vid bildens gränser. Gör detta för att ta bort organoider som inte är helt synliga, eftersom deras morfologi inte kan kvantifieras exakt.
- Erodera 1 pixel (= 2,5 μm) från gränsen för varje ≥60 μm struktur. Detta tar bort halo av diffus kalceinfluorescens som omger organoiderna.
- Mät medelintensiteten för varje struktur. På så sätt mäts organoidernas genomsnittliga fluorescens.
- Välj alla strukturer ≥60 μm igen och ta bort alla strukturer som rör vid gränserna.
- Erodera 10 pixlar (= 25 μm) från gränsen för varje ≥60 μm struktur.
OBS: I icke-CF-organoider eroderar detta den cellulära gränsen och lämnar endast lumen. I CF-organoider eroderar detta den yttre delen av organoiden, som har ungefär samma fluorescens som den inre delen som återstår. - Mät medelintensiteten för varje eroderad struktur. På så sätt mäts den genomsnittliga fluorescensen hos den centrala delen av organoiderna.
- Mät cirkulariteten för varje struktur. Detta motsvarar organoidernas genomsnittliga cirkularitet.
- Välj alla strukturer ≥60 μm och räkna.
- Utför den andra kvalitetskontrollen: uteslutningskriterier som bestäms av programvaran. Uteslut uppsättningen bilder när mindre än 50% av organoiderna (definierade som strukturer ≥40 μm) är ≥60 μm, eftersom tillräckligt många organoider bör vara tillräckligt stora för att visa morfologi som är typisk för antingen CF eller icke-CF. Uteslut också när <500 eller >3 000 organoider (definierade som strukturer ≥40 μm) finns i de 32 brunnarna.
5. Mät indexen i bildbehandlingsprogrammet (figur 6)
- Mät cirkularitetsindexet (CI).
OBS: Detta motsvarar den genomsnittliga cirkulariteten mätt i steg 4.6, vilket är den genomsnittliga cirkulariteten för alla organoider i alla 32 brunnar. CI kvantifierar organoidernas rundhet, definierad som , som
är lägre i CF än i icke-CF-organoider - Mät intensitetsförhållandet (IR)
- Beräkna IR genom att dividera medelvärdet av intensitetsmätningen efter att ha eroderat 25 μm från gränsen för varje ≥60 μm-struktur med medelvärdet av intensitetsmätningen efter att ha eroderat 2,5 μm från gränsen för varje ≥60 μm-struktur.
OBS: IR mäter närvaron eller frånvaron av ett centralt lumen. IR är lika med
, och är högre i CF än i icke-CF-organoider.
- Beräkna IR genom att dividera medelvärdet av intensitetsmätningen efter att ha eroderat 25 μm från gränsen för varje ≥60 μm-struktur med medelvärdet av intensitetsmätningen efter att ha eroderat 2,5 μm från gränsen för varje ≥60 μm-struktur.
- Förenkla analysprocessen
- Förbered ett standardkalkylblad med hjälp av kalkylprogram för att automatiskt beräkna dessa index när du kopierar data (bild 7).
- Så här beräknar du IR:
- Gör intensitetsmätningen efter att ha eroderat 2,5 μm från gränsen för varje ≥60 μm-struktur. Använd medelvärdet för beräkningen (nämnaren).
- Ta intensitetsmätningen efter att ha eroderat 25 μm från gränsen för varje ≥60 μm struktur. Använd medelvärdet för beräkningen (täljaren).
- För att beräkna CI, ta cirkulariteten hos alla organoider i alla brunnar. Medelvärdet motsvarar CI.
OBS: När analys av stora partier bilder krävs kan bildanalysprocessen som beskrivs i avsnitt 4 halvautomatiseras, med början från de kalibrerade ND-filerna och kör ett makro med alla steg kombinerade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoider från 212 försökspersoner samlades in under rutinmässiga kliniska besök. Inga biverkningar inträffade under eller efter rektal biopsiprocedur. Organoider avbildades av en forskare blindad för ämnesegenskaper som genotyp och klinisk information. På grund av bilder av låg kvalitet uteslöts 23 försökspersoner. Exempel på framgångsrika och misslyckade organoidkulturer och bildförvärv kan ses i figur 2.
Organoider av 167 patienter med CF och två sjukdomsframkallande CFTR-mutationer (enligt definitionen i CFTR2-databasen4) och 22 icke-CF-patienter analyserades. Den genomsnittliga mängden organoider per kultur var 1 519 (cirka 40-50 organoider per brunn). Den genomsnittliga mängden organoider per kultur som inkluderades för analys var 77% (antalet strukturer ≥60 μm dividerat med antalet strukturer ≥40 μm, vilket motsvarar fraktionen av organoider som är tillräckligt stora för att återspegla typisk CF- eller icke-CF-morfologi).
IR och CI diskriminerade (p < 0,001) mellan organoider från försökspersoner med och utan CF (tabell 1). Med linjär diskriminantanalys erhölls perfekt diskriminering (AUC = 1) mellan CF och icke-CF, inte bara när man använde data från alla 32 brunnar (figur 8), utan också när åtta brunnar valdes slumpmässigt för varje kultur (Figur 9).
Figur 10 visar histogram som visar fördelningen av värden för cirkularitet, intensiteten hos den centrala delen av organoiden och intensiteten hos hela organoiden för fyra illustrativa kulturer (två CF, två icke-CF).
Figur 1: Bilder av välvuxna och livskraftiga organoider. (A) Organoider från en person utan CF och (B) organoider från en person med CF. Båda kulturerna odlades i 7 dagar efter den tidigare splittringen. Bilderna gjordes med hjälp av ett ljusfältmikroskop med ett 5x mål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Illustration av organoid avbildning i konfokalmikroskopet. A) CF-organoider av god kvalitet. B) Icke-CF-organoider av god kvalitet. C) För låg pläteringstäthet: inte tillräckligt med organoider för representativ avbildning. D) För hög pläteringstäthet: överlappning av organoider förhindrar tillräcklig kalceinfärgning och bedömning av morfologi. E) Intensiteten är för låg på grund av antingen ett problem med kalceinfärgning eller att huvudförstärkningsinställningen är för låg. (F) Intensiteten är för hög på grund av att huvudförstärkningsinställningen är för hög: små lumen kan maskeras av den överexponerade fluorescenssignalen. G) Döda organoider och sprängorganoider, där separata celler kan ses och morfologin inte längre kan bedömas. H) differentierade organoider där stamcellsstatus går förlorad, som uppträder som tjocka strukturer, ofta med höga fluorescenssignaler i mitten av organoidstrukturerna, som inte återspeglar typisk CF- eller icke-CF-morfologi, (I) bakgrundssignalen är för hög, antingen på grund av att kalceinfärgning har utförts för länge sedan med diffusion i bakgrunden eller på grund av att huvudförstärkningsinställningen är för hög; (J) otillräcklig mekanisk uppdelning av organoider, vilket gör dem för stora för analysen, inte färgar väl och inte återspeglar CF eller icke-CF-morfologi på ett adekvat sätt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Fokusera på organoider och skaffa bilder . (A) Välj fliken Förvärv . Klicka på Live-knappen nedan för realtidsavbildning. (B) Använd avbildningsinställningar för levande celler med emission vid 488 nm. (C) Bild med en upplösning på 1024 pixlar x 1024 pixlar och ett djup på 16 bitar per pixel. Välj den enkelriktade bildparametern. (D) Justera huvudförstärkningen för den optimala intensiteten av fluorescens för att optimera avbildning av organoida egenskaper såsom form och närvaro eller frånvaro av ett lumen. (E) Spara enstaka positioner (x, y och z) för var och en av de 32 brunnarna per organoidkultur. (F) Klicka på Start Experiment-knappen för att köra det fördefinierade protokollet och hämta bilder enligt de valda parametrarna. (G) Bilder kan sparas när de är färdiga, eller så kan en autospara ställas in med knappen Autospara . Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Exportera bilder för analys. (A) Välj fliken Bearbetning och klicka på Batch för att exportera bilder av flera organoidkulturer i en procedur. (B) Klicka på knappen Lägg till och välj de sparade bilderna som behövs för analys. (C) Välj bildexport som metod. (D) Exportera bilder som TIFF-filer, konvertera inte till 8 bitar och komprimera eller ändra inte storlek. Exportera originaldata utan inbränningsgrafik. Välj de 32 brunnarna på 96-brunnsplattan med scenparametern. Kakla inte om. (E) Klicka på knappen Använd för att extrahera med de valda parametrarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Analys av organoidbilder i bildbehandlingsprogrammet. (A) Högerklicka på det grå fältet ovanför resultatavsnittet (röd asterisk) för att ställa in parametrar för objektmätning. Lägg till cirkularitet och medelintensitet. (B) Klicka på Arkiv > Importera / exportera > Skapa ND-fil från filsekvensen för att kombinera TIFF-filerna för en kultur till en ND-fil. (C) Välj önskad fil och bekräfta; 32 bilder kommer att kombineras (röd asterisk). (d) Klicka på Omkalibrering > kalibrera om dokumentet. (E) Klicka på Pixelstorlek i popup-fönstret. (F) Mata in 2,5 μm som storleken på 1 pixel. (G) Bilden kommer nu att kalibreras om till mikrometer istället för pixlar (röd asterisk). (h) Klicka på Binär > definiera tröskelvärde. (I) Storleksval kan utföras i popup-fönstret. Minsta storlek är 40 μm för organoidräkning och 60 μm för organoidmorfologianalys. Stäng alltid av funktionen Slät och ren, slå på funktionen Fyll hål och mata in separat x3. Applicera på alla ramar. (J) Programvaran visar avgränsning av de definierade strukturerna. Klicka på knappen Uppdatera ND-mätning för att analysera och hämta de valda parametrarna från steg A som utdata. (K) Klicka på nedåtpilen bredvid exportknappen och välj data till Urklipp. (L) Klicka på Exportera för att kopiera datautmatningen till Urklipp. Data kan nu klistras in i ett kalkylblad. (M) Klicka på knappen Återställ data för att tömma resultatavsnittet innan en ny mätning utförs. (N) När erosion måste utföras för intensitetsmätning för beräkning av intensitetsförhållandet, klicka på Binär > Erode. Funktionen Ta bort objekt som rör vid gränser finns i samma rullgardinsmeny. (O) Välj matrisen som visas i figuren för erosion och välj önskat antal (1 pixel eller 2,5 μm för avlägsnande av halo omgivande organoider, 10 pixlar eller 25 μm för avlägsnande av den cellulära gränsen som omger en lumen om sådan finns). Se tilläggsfilen för helskärmspaneler av den här figuren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Bilder av rektala organoider från personer utan (övre paneler) och med CF (nedre paneler). Illustration av metoderna för att beräkna de två indexen, IR (intensitetsförhållande; central panel) och CI (cirkularitetsindex; höger panel), som används för att kvantifiera morfologiska skillnader mellan rektala organoider hos försökspersoner med och utan CF. IR mäter närvaron eller frånvaron av en central lumen, beräknad i tre steg: (I) beräkna organoidernas globala fluorescensintensitet: erodera 1 pixel (2,5 μm) för att avlägsna den omgivande "glorian" runt varje struktur och mäta den genomsnittliga fluorescensintensiteten för den återstående hela organoiden; II) beräkna organoidernas centrala fluorescensintensitet: erodera 10 pixlar (25 μm) runt varje struktur för att avlägsna den cellulära gränsen från organoiderna och mäta den genomsnittliga fluorescensintensiteten för den återstående strukturen; (III) IR är lika med 
, och är högre i CF än i icke-CF-organoider. CI kvantifierar organoidernas rundhet, definierad som 
, vilket är lägre i CF än i icke-CF-organoider. CF: cystisk fibros; IR: intensitetsförhållande; CI: cirkularitetsindex. Denna siffra har tryckts om med tillstånd från Cuyx et al.13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 7: Exempel på ett kalkylblad för beräkning av CI och IR. Utdata (cirkularitet och medelintensitet, enligt definitionen i figur 5) kopieras till kalkylbladet för båda erosionsstegen. Bildprogramvaran lägger automatiskt till medelvärdena för varje parameter. Dessa medel kan kopieras till en valfri cell i kalkylbladet och sedan användas för beräkning av CI och IR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Intensitetsförhållande (IR) och cirkularitetsindex (CI) för varje försöksperson enligt sjukdomsstatus, bukspottkörtelstatus och svettkloridkoncentration. Linjen representerar den optimala diskrimineringslinjen erhållen genom linjär diskriminantanalys. CF: cystisk fibros; PS: bukspottskörteln tillräcklig; PI: pankreas otillräcklig; SCC: svettkloridkoncentration. Denna siffra har tryckts om med tillstånd från Cuyx et al.13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Beräkning av ROMA-index. Beräkningen av ROMA-index med åtta brunnar slumpmässigt per ämne och med samma statistiska metod var jämförbar med resultaten med 32 brunnar. Återigen uppnåddes perfekt diskriminering. CI: cirkularitetsindex; IR: intensitetsförhållande. Denna siffra har tryckts om med tillstånd från Cuyx et al.13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: Histogram som illustrerar fördelningen av värden som mäts i varje enskild organoid i en given kultur. Cirkularitetsparametern, intensitetsparametern för den centrala delen av organoiden och intensitetsparametern för hela organoiden avbildas (kolumner). Resultat i två CF- och två icke-CF-kulturer visas (rader). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil: Presentation i full upplösning av figur 5. Klicka här för att ladda ner.
| JFR | Icke-CF | p-värde | |
| n | 167 | 22* | |
| IR | 1.11 (0.93–1.34) | 0.76 (0.61–0.88) | <0.001 |
| CI | 0.59 (0.49–0.70) | 0.79 (0.73–0.84) | <0.001 |
| Ålder (år) | 18 (0–60) | 44 (0–77) | <0.001 |
| Genus | 85 män (51%) 82 kvinnor (49%) |
11 män (50%) 11 kvinnor (50%) |
>0,999 |
| SCC (mmol/l) (n = 164) | 97.61 (36–160) | ||
| SCC låg (<87 mmol/L) eller hög (≥87 mmol/L) | 41 låg (25%) 123 höga (75%) |
||
| Pankreasstatus (n = 165) | 28 PS (17%) 137 PI (83%) |
Tabell 1: Försökspersonernas baslinjekarakteristika och index beräknade med hjälp av rektal organoidmorfologianalys (ROMA). n eller medelvärde och intervall. CF: cystisk fibros; IR: intensitetsförhållande; CI: cirkularitetsindex; SCC: svettkloridkoncentration; PI: pankreas otillräcklig; PS: pankreas tillräckligt. *sju bärare, tre icke-bärare, två autosomal dominant polycystisk njursjukdom, sex ulcerös kolit, en polypscreening, tre friska kontroller som ingår i en studie om inflammatorisk tarmsjukdom. Denna tabell har tryckts om med tillstånd från Cuyx et al.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för rektal organoid morfologianalys (ROMA). De två indexen beräknade med ROMA, IR och CI, skilde organoider från personer med CF från de utan CF med perfekt noggrannhet. ROMA skulle således kunna fungera som en ny fysiologisk CFTR-analys som kompletterar SCC och andra för närvarande tillgängliga tester13,14,15.
Protokollet är beroende av användningen av tarmorganoider, som har en rund form och central lumen när CFTR är funktionell, som beskrivits före10,11. Organoider används i allt större utsträckning vid bedömning av nya CF-behandlingar (t.ex. i FIS-analys8). ROMA-protokollet kan integreras med FIS-analysprotokollet, eftersom 32 brunnar inkuberas över natten utan korrigerare för FIS-analysen. Dessa brunnar kan avbildas efter tillsats av kalceingrönt men före tillsats av forskolin och / eller potentiatorer. På så sätt kan en 96-brunnsplatta användas för både diagnostisk och personlig terapeutisk forskning för varje specifik patient. Förutom diagnos kan ROMA också ge information vid karakterisering av varianter av okänd betydelse.
Det största praktiska hindret för detta protokoll skulle förmodligen vara uppstarten av tarmorganoidkulturer. Men på de flesta allmänna sjukhus kan rektala sugbiopsier erhållas enligt ett standardiserat protokoll och med låga komplikationsfrekvenser, även hos spädbarn9. Generering av organoider från biopsier kräver endast närvaron av tarmkrypter, medan för ICM är biopsier i full tjocklek av högre kvalitetnödvändiga 12,15. Biopsier kan transporteras till ett centralt laboratorium för att generera en organoidkultur och efterföljande ROMA med hjälp av det standardiserade och halvautomatiska protokollet som beskrivs häri 9,12. Eftersom minskningen från 32 brunnar till åtta brunnar för ROMA inte visade någon skillnad i klassificeringen av fall som CF eller icke-CF, skulle plätering av åtta brunnar för analys vara tillräcklig, vilket skulle minska kostnaden.
För ytterligare validering måste ROMA utföras på personer med tvetydiga diagnoser. Organoider kan förvaras i en biobank för senare forskning om individanpassad medicin för dem som diagnostiserats med CF16. ROMA kan också spela en roll i en personlig medicinmetod. Till exempel kan IR detektera utseendet på en central lumen efter inkubation av organoider hos patienter med kvarvarande CFTR-funktion men före stimulering med en potentiator och forskolin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denna studie finansierades av den belgiska CF-patientföreningen "Mucovereniging/Association Muco", forskningsbidraget från det belgiska sällskapet för pediatrik BVK-SBP 2019 och ett bidrag från UZ Leuven Fund for Translational Biomedical Research. Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar de patienter och föräldrar som deltog i denna studie. Vi tackar Abida Bibi för allt odlingsarbete med organoiderna. Vi tackar Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz och Bernard Wenderickx för logistiskt stöd. Vi tackar också Mucovereniging/Association Muco, och särskilt Stefan Joris och Dr. Jan Vanleeuwe, för deras stöd och finansiering. Vi tackar alla medarbetare från det belgiska organoidprojektet: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liège, Belgien), Linda Boulanger (Universitetssjukhuset Leuven, Belgien), Georges Casimir (HUDERF, Bryssel, Belgien), Benedicte De Meyere (Universitetssjukhuset i Gent, Belgien), Elke De Wachter (Universitetssjukhuset i Bryssel, Belgien), Danny De Looze (Universitetssjukhuset i Gent, Belgien), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Bryssel, Belgien), Laurence Hanssens (HUDERF, Bryssel), Christiane Knoop (CHU Erasme, Bryssel, Belgien), Monique Lequesne (Universitetssjukhuset Antwerpen, Belgien), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Stephanie Van Biervliet (Universitetssjukhuset Gent, Belgien), Eva Van Braeckel (Universitetssjukhuset i Gent, Belgien), Kim Van Hoorenbeeck (Universitetssjukhuset Antwerpen, Belgien), Eef Vanderhelst (Universitetssjukhuset i Bryssel, Belgien), Stijn Verhulst (Universitetssjukhuset Antwerpen, Belgien), Stefanie Vincken (Universitetssjukhuset i Bryssel, Belgien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
References
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).
- Cystic Fibrosis Mutation Database. , Available from: http://www.genet.sickkids.on.ca/ (2022).
- CFTR2. , Available from: https://www.cftr2.org/ (2022).
- Farrell, P. M., et al. Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation. The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).
- Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).
- Friedmacher, F., Puri, P. Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung's disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications. Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Cuyx, S., et al. Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis. Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).
- Wilschanski, M., et al. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
- Ramalho, A. S., et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis. European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).
