Summary
Denne protokol beskriver rektal organoid morfologianalyse (ROMA), et nyt diagnostisk assay for cystisk fibrose (CF). Morfologiske egenskaber, nemlig rundheden (cirkularitetsindeks, CI) og tilstedeværelsen af et lumen (intensitetsforhold, IR), er et mål for CFTR-funktionen. Analyse af 189 emner viste perfekt diskrimination mellem CF og ikke-CF.
Abstract
Diagnose af cystisk fibrose (CF) er ikke altid ligetil, især når svedchloridkoncentrationen er mellemliggende og / eller mindre end to sygdomsfremkaldende CFTR-mutationer kan identificeres. Fysiologiske CFTR-assays (nasal potentialforskel, måling af tarmstrøm) er inkluderet i den diagnostiske algoritme, men er ikke altid let tilgængelige eller gennemførlige (f.eks. Hos spædbørn). Rektale organoider er 3D-strukturer, der vokser fra stamceller isoleret fra krypter af en rektal biopsi, når de dyrkes under specifikke forhold. Organoider fra ikke-CF-forsøgspersoner har en rund form og et væskefyldt lumen, da CFTR-medieret kloridtransport driver vand ind i lumen. Organoider med defekt CFTR-funktion svulmer ikke op, bevarer en uregelmæssig form og har ingen synlig lumen. Forskelle i morfologi mellem CF og ikke-CF organoider kvantificeres i 'Rectal Organoid Morphology Analysis' (ROMA) som et nyt CFTR fysiologisk assay. Til ROMA-analysen er organoider belagt i 96-brøndsplader, farvet med calcein og afbildet i et konfokalmikroskop. Morfologiske forskelle kvantificeres ved hjælp af to indekser: Cirkularitetsindekset (CI) kvantificerer organoidernes rundhed, og intensitetsforholdet (IR) er et mål for tilstedeværelsen af et centralt lumen. Ikke-CF-organoider har en høj CI og lav IR sammenlignet med CF-organoider. ROMA-indekser diskriminerede perfekt 167 forsøgspersoner med CF fra 22 forsøgspersoner uden CF, hvilket gør ROMA til et tiltalende fysiologisk CFTR-assay til hjælp ved CF-diagnose. Rektale biopsier kan rutinemæssigt udføres i alle aldre på de fleste hospitaler, og væv kan sendes til et centralt laboratorium for organoidkultur og ROMA. I fremtiden kan ROMA også anvendes til at teste effektiviteten af CFTR-modulatorer in vitro. Formålet med denne rapport er fuldt ud at forklare de metoder, der anvendes til ROMA, for at muliggøre replikation i andre laboratorier.
Introduction
Cystisk fibrose (CF) er en autosomal recessiv sygdom forårsaget af mutationer i CF transmembran konduktansregulator (CFTR) genet. CFTR-proteinet er en chlorid- og bicarbonatkanal, der sikrer hydrering af flere epithelia1. CF er en højbyrde, livsforkortende, multi-system sygdom, der primært manifesterer sig som en luftvejssygdom, men også påvirker mave-tarmkanalen, bugspytkirtlen, leveren og reproduktionskanalen2.
Sygdomsfremkaldende CFTR-mutationer fører til et fald i mængden eller funktionen af CFTR , hvilket igen forårsager slimdehydrering. Mere end 2.000 varianter i CFTR-genet er blevet beskrevet3, hvoraf kun 466 er blevet grundigt karakteriseret4.
En diagnose af CF kan stilles, når enten svedchloridkoncentrationen (SCC) er over tærsklen på 60 mmol / L, eller når to sygdomsfremkaldende CFTR-mutationer (ifølge CFTR2-databasen) identificeres 4,5. Hos personer med kun mellemliggende forhøjet (30-60 mmol / L) SCC, som forekommer i ca. 4% -5% af svedtest6 og CFTR-mutationer af varierende eller ukendt klinisk konsekvens, kan diagnosen ikke bekræftes eller udelukkes, selv når de har CF-kompatible symptomer eller en positiv neonatal screeningstest. I disse tilfælde er anden linje fysiologiske CFTR-assays (nasal potential difference (NPD) og intestinal current measurements (ICM)) inkluderet i den diagnostiske algoritme. Disse tests er ikke let tilgængelige på de fleste centre eller gennemførlige i alle aldre, især hos spædbørn5.
Rektale organoider er 3D-strukturer dyrket af Lgr5 (+) voksne tarmstamceller fra tarmkrypter opnået gennem rektal biopsi7. Organoider anvendes i stigende grad i biomedicinsk forskning, såsom test af modulatorbehandling i CF8. En levedygtig biopsi kan opnås ved enten sugning eller pincet biopsi, en procedure, der kun forårsager minimal ubehag og er sikker selv hos spædbørn, med lave komplikationsrater9. Krypterne isoleret fra de rektale biopsier er beriget med stamceller, og under specifikke dyrkningsbetingelser organiserer disse sig selv i rektale organoider. Morfologien af disse organoider bestemmes af ekspressionen og funktionen af CFTR, der er placeret ved den apikale membran af epitelceller. Funktionel CFTR tillader klorid og vand at komme ind i organoid lumen og derved fremkalde hævelse af ikke-CF organoider. CF-organoider svulmer ikke op og har ingen synlig lumen10,11.
Rektal organoid morfologianalyse (ROMA) tillader forskelsbehandling mellem CF og ikke-CF organoider baseret på disse forskelle i organoid morfologi. Ikke-CF organoider er mere runde og har et synligt lumen, mens det modsatte er tilfældet for CF organoider. Til dette assay er patientspecifikke organoider belagt i 32 brønde af en 96-brøndplade. Efter 1 dags vækst farves organoiderne med calceingrøn og afbildes i et konfokalmikroskop. De ikke-CF organoider viser en mere cirkulær form og en mindre fluorescerende central del, da lumen indeholder væske og calcein pletter kun celler. Disse forskelle i morfologi kvantificeres ved hjælp af to ROMA-indekser: cirkularitetsindekset (CI) kvantificerer organoidernes rundhed, mens intensitetsforholdet (IR) er et mål for tilstedeværelsen eller fraværet af et centralt lumen. I denne rapport beskriver vi detaljeret protokollen for at opnå disse diskriminerende indekser for at muliggøre replikering af teknikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For alle procedurer, der involverer humant væv, blev godkendelse fra den etiske komité Forskning UZ/KU Leuven (EF-forskning) erhvervet. Al forskning blev udført med informeret samtykke og / eller samtykke fra forældre, repræsentanter og / eller patienter.
BEMÆRK: Alle procedurer, der involverer rektale biopsier og organoider, skal udføres i en laminær strøm for at beskytte forskeren mod enhver biologisk fare og for at minimere risikoen for forurening af kulturerne. Hvad angår enhver laboratorieprocedure, bør forskere til enhver tid bære laboratoriefrakker, handsker og sikkerhedsbriller for at manipulere prøver.
1. Rektal biopsi, isolering af voksne stamceller fra krypter og organoidkultur
- For denne indledende del af protokollen, herunder medieproduktion og -brug, organoidkultur, opdeling, ekspansion og frysning til biobanking, følg de to tidligere offentliggjorte protokoller 8,12.
- Kort sagt skal følgende skridt tages:
- Tag tre til fire rektale biopsier med en tang eller sugeanordning og opsaml i en steril beholder (f.eks. 1,5 ml mikrocentrifugerør) med Ad-DF +++ mediet som beskrevet i protokollen nævnt ovenfor.
- Transport af biopsier til et centralt laboratorium på is eller ved 4 °C. Transport til andre centre er mulig, og kvaliteten påvirkes ikke væsentligt, selv når transporten tager op til 48 timer. Hvis transporten forventes at tage over 6 timer, skal du bruge et 15 ml konisk rør med 6 ml Ad-DF +++ medium i stedet for et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Vask biopsierne i kold PBS, indtil supernatanten er klar for at fjerne snavs og ikke-epitelvæv såsom fedtvæv.
- Inkuber biopsierne med EDTA (endelig koncentration 10 mM) for at løsne krypterne. Plad krypterne i en kældermembranmatrix. Tilsæt bredspektret antibiotika (gentamicin 50 μg / ml og vancomycin 50 μg / ml) til mediet i den første uge af dyrkning for at forhindre bakteriel forurening.
- Når krypterne er knoppet og er lukket og spredt, skal du udføre mekanisk opdeling, normalt efter 7 dage.
- Opdel de resulterende organoider ca. hver 7. dag. På denne måde udvides kulturen, fryser backupprøver i en biobank eller bruger organoiderne til analyser.
2. Organoid plettering til ROMA (dag 1)
- Opdel organoiderne mekanisk til plettering
- Saml organoider fra tre velvoksne brønde fra en 24-brønds plade ved at vaske to gange med koldt Ad-DF +++ medium, saml dem i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og vurder dem under mikroskopet12.
- Sørg for, at organoider er levedygtige og af høj kvalitet, hvilket normalt kan opnås efter 5-7 dages vækst efter tidligere opdeling (figur 1).
- Opdel organoiderne mekanisk i henhold til ovennævnte protokol 8,12. Gentag, indtil størstedelen af organoiderne, som vurderet ved hjælp af brightfieldmikroskopet, er små nok i forhold til den indledende observation.
- Saml de mindre organoider, der normalt svarer til samlingen af ca. de øverste 4/5 af organoid-medium-opløsningen i et nyt mikrocentrifugerør, da store organoider synker til bunden af røret på grund af tyngdekraften, og små organoider forbliver suspenderet i den øverste del af mediumkolonnen.
- Centrifugering af prøven af mindre organoider ved 0,3 x 1000 g i 2 minutter og kassér mediet.
- Fortynd pelleten af mindre organoider i 130 μL 40% -50% kældermembranmatrix (fortyndet med Ad-DF +++ medium12).
- Resuspender godt ved hjælp af en 200 μL mikropipette.
- Plade organoiderne i en 96-brønds plade
- Ved hjælp af en 20 μL pipette pladeorganoider i 32 brønde af en forvarmet 96-brøndplade. Sørg for, at hver brønd indeholder en 4 μL dråbe af organoidmatrixopløsningen produceret i det foregående trin.
- Organoiderne i opløsningen har tendens til at danne en pellet i bunden af røret på grund af tyngdekraftsafhængig nedadgående forskydning. For at forhindre dette og sikre ensartet plettering skal organoidmatrixopløsningen regelmæssigt resuspenderes ved hjælp af en 200 μL mikropipette (f.eks. hver gang efter plettering af fire til otte brønde).
- Plader hver dråbe i midten af brønden for at forhindre dråben i at løbe mod brøndens kanter, hvilket ville reducere billedkvaliteten senere.
- Sigt efter omkring 30 organoider pr. brønd (minimum 15, maksimum 90) uden overlappende organoider.
- Husk, at disse organoider skal inkuberes natten over og vil vokse lidt i løbet af denne tid og kan begynde at overlappe hinanden, hvis belægningstætheden er for høj.
- Kontroller belægningstætheden ved hjælp af et brightfield-mikroskop med et 5x forstørrelsesmål efter plettering af de første eller to brønde.
- Hvis belægningstætheden er for høj, fortyndes organoidmatrixopløsningen trinvist med tilsætning af kældermembranmatrixen, indtil den ønskede belægningstæthed er nået (figur 2).
- Efter plettering skal du forsigtigt banke pladen på en plan overflade for at sikre, at størstedelen af organoiderne er i samme brændplan.
- Inkuber pladen
- Inkuber 96-brøndspladen ved 37 °C og 5% CO2 i løbet af 8-10 minutter for at tillade gelering af kældermembranmatrixen.
- Tilsæt 50 μL humant kolonorganoidmedium +/+12 i hver brønd og inkuberes natten over i 16-24 timer.
- Tilsæt ingen forskolin eller CFTR-modulatorer, så organoiderne vokser under basale forhold.
3. Organoid billeddannelse ved hjælp af konfokal mikroskopi (dag 2)
- Plet organoiderne med calcein grøn
- Der fremstilles en 1 mM stamopløsning af calceingrøn ved tilsætning af 50 μL dimethylsulfoxid (DMSO) til et hætteglas indeholdende 50 μg calceingrønt.
- Der fremstilles en arbejdsopløsning af calceingrøn ved tilsætning af 1,2 μL stamopløsning til 200 μL Ad-DF+++ (koncentration 6 μM).
- Der tilsættes 5 μL af denne calceinblanding til hver brønd i den 96-brøndsplade, hvori organoider blev belagt (endelig calceinkoncentration 0,6 μM). Rør ikke ved og forskyd matrixfaldet inde i brønden, når du udfører dette trin.
- Drej og vip pladen let med låget på et par gange for at sikre homogen fordeling af calceingrøn i hele brønden.
- Inkuber pladen igen i 15-30 minutter ved 37 °C og 5% CO2 for at sikre farvning af alle organoider i brøndene.
- Overfør pladen til det konfokale mikroskop
- Overfør pladen til det konfokale mikroskop med et automatiseret trin og integreret inkubator. Sørg for, at pladen er godt fastgjort i pladeholderen.
- Inkubation ved 37 °C og 5 % CO2 er valgfri, men ikke nødvendig i betragtning af billeddannelsesprocessens korte varighed (ca. 10 min.).
- Fokus på organoiderne (figur 3)
- Brug det konfokale mikroskop til at bestemme den optimale x / y-position og fokus (z-position) for organoiderne i hver brønd manuelt, og gem disse positioner i billeddannelsessoftwaren.
- Det bedste fokus indebærer den skarpest mulige afgrænsning af organoiderne og visualisering af den størst mulige del af organoidfaldet. Hvis fordelingen af pletten ikke er tilstrækkelig, gentages trin 3.1.4 og 3.1.5 (inkuberes for eksempel i yderligere 5-10 minutter).
- Brug indstillinger for levende cellebilleddannelse med emission ved 488 nm og excitation ved 515 nm (specifik for visualisering af calceinfluorescens) og et 5x LD-forstørrelsesmål.
- Anskaf organoidbilleder af de 32 brønde med konfokalmikroskopet (figur 3 og figur 4).
- Tag billeder på en ensrettet måde med en opløsning på 1024 pixels x 1024 pixels (pixelstørrelse 2,5 μm x 2,5 μm) og dybde på 16 bit.
- Vælg laserintensitet og masterforstærkning for optimal visualisering af morfologiske forskelle mellem CF og ikke-CF organoider (f.eks. Diskrimination mellem et ikke-farvet vandfyldt centralt lumen (hvis det er til stede) og en farvet cellulær kant).
BEMÆRK: Organoider afgrænses ikke korrekt, når masterforstærkningen og dermed fluorescenssignalet er for lavt; indstilling af masterforstærkningen for høj vil resultere i billeder med organoider med homogen meget høj signalintensitet, hvilket forhindrer billeddannelse af mere subtile morfologiske forskelle (figur 2). - Gem et billede pr. brønd for alle 32 brønde i mikroskopformatet, og eksporter dem som TIFF-filer.
4. Billedanalyse (figur 5)
- Indlæs TIFF-filerne i billedanalysesoftwaren.
- Udfør den første kvalitetskontrol baseret på udelukkelseskriterier bestemt af operatøren (figur 2): mange differentierede eller døde strukturer eller snavs, utilstrækkelig belægningstæthed, for mange (f.eks. overlappende) eller for få organoider og utilstrækkelig fluorescensfordeling (organoider ikke klart afgrænset, baggrundssignal for højt).
BEMÆRK: Dette trin kan også udføres, før du eksporterer billeder som TIFF-filer i trin 3.4. - Forbered billeder til analyse
- Kalibrer billeder igen, så 1 pixel svarer til 2,5 μm x 2,5 μm.
- Opret og åbn én netværksdata (. ND) fil med alle 32 billeder for hver organoidkultur, hvilket muliggør samtidig analyse af alle 32 billeder pr. emne.
- Afgræns organoiderne
- Afgræns strukturer ved hjælp af en lavere intensitetstærskel på 4.500 og en øvre tærskel på 65.535 (glatte og rene funktioner slået fra; Fill Holes funktion på; Separat funktion ved x3).
BEMÆRK: Dette afgrænser fluorescerende strukturer med fyldhuller inklusive lumen i den afgrænsede struktur, hvis den er til stede.
- Afgræns strukturer ved hjælp af en lavere intensitetstærskel på 4.500 og en øvre tærskel på 65.535 (glatte og rene funktioner slået fra; Fill Holes funktion på; Separat funktion ved x3).
- Tæl organoiderne
- Vælg alle strukturer ≥40 μm.
- Klik på knappen Opdater ND-måling (hver gang der er behov for en måling); de tællede organoider vil blive nummereret.
BEMÆRK: Dette svarer til det samlede antal organoider i de 32 brønde, mens små affald, såsom døde celler, er udelukket.
- Mål intensitet og cirkularitet til beregning af indekserne
- Vælg alle strukturer ≥60 μm og tæl.
BEMÆRK: Dette tæller organoiderne, der er store nok til at vise morfologi, der er typiske for enten CF eller ikke-CF. Organoider >40 μm og <60 μm er små og tætte, både i ikke-CF og i CF. - Fjern alle strukturer, der berører billedets grænser. Gør dette for at fjerne organoider, der ikke er helt synlige, da deres morfologi ikke kan kvantificeres nøjagtigt.
- Eroderer 1 pixel (= 2,5 μm) fra grænsen for hver ≥60 μm struktur. Dette fjerner haloen af diffust calceinfluorescens omkring organoiderne.
- Mål den gennemsnitlige intensitet af hver struktur. På denne måde måles organoidernes gennemsnitlige fluorescens.
- Vælg alle strukturer ≥60 μm igen, og fjern alle strukturer, der berører grænserne.
- Eroder 10 pixels (= 25 μm) fra grænsen for hver ≥60 μm struktur.
BEMÆRK: I ikke-CF-organoider eroderer dette den cellulære grænse og efterlader kun lumen. I CF-organoider eroderer dette den ydre del af organoiden, som har omtrent samme fluorescens som den indre del, der er tilbage. - Mål den gennemsnitlige intensitet af hver eroderet struktur. På denne måde måles den gennemsnitlige fluorescens af den centrale del af organoiderne.
- Mål cirkulariteten af hver struktur. Dette svarer til organoidernes gennemsnitlige cirkularitet.
- Vælg alle strukturer ≥60 μm og tæl.
- Udfør den anden kvalitetskontrol: eksklusionskriterier bestemt af softwaren. Udelad sættet af billeder, når mindre end 50% af organoiderne (defineret som strukturer ≥40 μm) er ≥60 μm, da nok organoider skal være store nok til at vise morfologi, der er typisk for enten CF eller ikke-CF. Ekskluder også, når <500 eller >3.000 organoider (defineret som strukturer ≥40 μm) er til stede i de 32 brønde.
5. Mål indekserne i billedbehandlingssoftwaren (figur 6)
- Mål cirkularitetsindekset (CI).
BEMÆRK: Dette svarer til den gennemsnitlige cirkularitet målt i trin 4.6, som er den gennemsnitlige cirkularitet for alle organoider i alle 32 brønde. CI kvantificerer rundheden af organoiderne, defineret som , som
er lavere i CF end i ikke-CF-organoider - Mål intensitetsforholdet (IR)
- IR beregnes ved at dividere gennemsnittet af intensitetsmålingen efter erodering af 25 μm fra grænsen for hver ≥60 μm-struktur med gennemsnittet af intensitetsmålingen efter erodering af 2,5 μm fra grænsen for hver ≥60 μm-struktur.
BEMÆRK: IR måler tilstedeværelsen eller fraværet af et centralt lumen. IR er lig med
, og er højere i CF end i ikke-CF organoider.
- IR beregnes ved at dividere gennemsnittet af intensitetsmålingen efter erodering af 25 μm fra grænsen for hver ≥60 μm-struktur med gennemsnittet af intensitetsmålingen efter erodering af 2,5 μm fra grænsen for hver ≥60 μm-struktur.
- Gør analyseprocessen enklere
- Forbered et standardregneark ved hjælp af regnearkssoftware til automatisk at beregne disse indekser ved kopiering af dataene (figur 7).
- Sådan beregnes IR:
- Tag intensitetsmålingen efter erodering af 2,5 μm fra grænsen for hver ≥60 μm struktur. Brug middelværdien til beregningen (nævneren).
- Tag intensitetsmålingen efter erodering af 25 μm fra grænsen for hver ≥60 μm struktur. Brug middelværdien til beregningen (tæller).
- For at beregne CI skal du tage cirkulariteten af alle organoider i alle brønde. Gennemsnittet svarer til CI.
BEMÆRK: Når analyse af store partier af billeder er påkrævet, kan billedanalyseprocessen som beskrevet i afsnit 4 semi-automatiseres, startende fra de kalibrerede ND-filer og køre en makro med alle trin kombineret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoider fra 212 forsøgspersoner blev indsamlet under rutinemæssige kliniske besøg. Ingen bivirkninger opstod under eller efter rektal biopsiproceduren. Organoider blev afbildet af en forsker, der var blindet for emnekarakteristika som genotype og klinisk information. På grund af billeder af lav kvalitet blev 23 forsøgspersoner udelukket. Eksempler på vellykkede og mislykkede organoidkulturer og billederhvervelse kan ses i figur 2.
Organoider af 167 forsøgspersoner med CF og to sygdomsfremkaldende CFTR-mutationer (som defineret af CFTR2-databasen4) og 22 ikke-CF-forsøgspersoner blev analyseret. Den gennemsnitlige mængde organoider pr. Kultur var 1.519 (ca. 40-50 organoider pr. Brønd). Den gennemsnitlige mængde organoider pr. kultur, der blev inkluderet til analyse, var 77% (antallet af strukturer ≥60 μm divideret med antallet af strukturer ≥40 μm, svarende til fraktionen af organoider, der er store nok til at afspejle typisk CF eller ikke-CF-morfologi).
IR og CI diskriminerede (p < 0,001) mellem organoider fra forsøgspersoner med og uden CF (tabel 1). Med lineær diskriminantanalyse blev der opnået perfekt diskrimination (AUC = 1) mellem CF og ikke-CF, ikke kun ved brug af data fra alle 32 brønde (figur 8), men også når otte brønde blev valgt tilfældigt for hver kultur (figur 9).
Figur 10 viser histogrammer, der viser fordelingen af værdier for cirkularitet, intensiteten af den centrale del af organoiden og intensiteten af hele organoiden for fire illustrative kulturer (to CF, to ikke-CF).
Figur 1: Billeder af velvoksne og levedygtige organoider. (A) Organoider fra en person uden CF og (B) organoider fra en person med CF. Begge kulturer blev dyrket i 7 dage efter den foregående opdeling. Billeder blev lavet ved hjælp af et brightfield mikroskop med et 5x mål. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Illustration af organoidbilleddannelse i konfokalmikroskopet. (A) CF-organoider af god kvalitet B) ikke-CF-organoider af god kvalitet C) belægningstæthed for lav: ikke nok organoider til repræsentativ billeddannelse D) belægningstætheden for høj: overlapning af organoider forhindrer tilstrækkelig calceinfarvning og vurdering af morfologi E) intensiteten er for lav på grund af enten et problem med calceinfarvning eller masterforstærkningsindstillingen for lav F) intensiteten er for høj, fordi masterforstærkningsindstillingen er for høj: små lumen kan maskeres af det overeksponerede fluorescenssignal G) døde og sprængte organoider, hvor der kan ses separate celler, og morfologi ikke længere kan vurderes H) differentierede organoider, hvor stamcellestatus går tabt, og som viser sig som tykke strukturer, ofte med høje fluorescenssignaler midt i organoidstrukturerne, hvilket ikke afspejler typisk CF- eller ikke-CF-morfologi (I) baggrundssignalet er for højt, enten på grund af at calceinfarvning er blevet udført for længe siden med diffusion i baggrunden, eller fordi masterforstærkningsindstillingen er for høj J) utilstrækkelig mekanisk opdeling af organoider, hvilket efterlader dem for store til analysen, ikke farvning godt og ikke i tilstrækkelig grad afspejler CF- eller ikke-CF-morfologi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fokus på organoider og erhvervelse af billeder . (A) Vælg fanen Anskaffelse . Klik på Live-knappen nedenfor for at få billeder i realtid. (B) Brug indstillinger for levende cellebilleddannelse med emission ved 488 nm. (C) Billede i en opløsning på 1024 pixels x 1024 pixels og en dybde på 16 bit pr. pixel. Vælg den ensrettede billeddannelsesparameter. (D) Juster masterforstærkningen for den optimale intensitet af fluorescens for at optimere billeddannelse af organoide egenskaber såsom form og tilstedeværelse eller fravær af lumen. (E) Gem enkelte positioner (x, y og z) for hver af de 32 brønde pr. organoidkultur. (F) Klik på knappen Start eksperiment for at køre den foruddefinerede protokol og erhverve billeder i henhold til de valgte parametre. (G) Billeder kan gemmes efter færdiggørelsen, eller en autosave kan konfigureres med knappen Autosave . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Eksport af billeder til analyse . (A) Vælg fanen Behandling , og klik på Batch-knappen for at eksportere billeder af flere organoidkulturer i en procedure. (B) Klik på knappen Tilføj , og vælg de gemte billeder, der er nødvendige til analyse. (C) Vælg billedeksport som metode. (D) Eksporter billeder som TIFF-filer, konverter ikke til 8 bit, og komprimer eller tilpas ikke størrelsen. Eksporter originale data uden indbrændingsgrafik. Vælg de 32 brønde på 96-brøndpladen med sceneparameteren. Marker ikke igen. (E) Klik på knappen Anvend for at udtrække ved hjælp af de valgte parametre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Analyse af organoidbilleder i billedbehandlingssoftwaren. (A) Højreklik på den grå bjælke over resultatafsnittet (rød stjerne) for at konfigurere parametre til objektmåling. Tilføj cirkularitet og gennemsnitlig intensitet. (B) Klik på File > Import / Export > Opret ND-fil fra filsekvens for at kombinere TIFF-filerne til en kultur til en ND-fil . (C) Vælg den ønskede fil og bekræft; 32 billeder vil blive kombineret (rød stjerne). (d) Klik på Rekalibrering > kalibrer dokument igen. (E) Klik på Pixelstørrelse i pop op-vinduet. (F) Indtast 2,5 μm som størrelsen på 1 pixel. (G) Billedet vil nu blive rekalibreret til mikrometer i stedet for pixels (rød stjerne). (h) Klik på Binær > definere tærskel. (I) Størrelsesvalg kan udføres i pop op-vinduet. Minimumsstørrelsen er 40 μm for organoidtælling og 60 μm for organoidmorfologianalyse. Sluk altid funktionen Glat og Rens , tænd for funktionen Udfyld huller , og indtast Separat x3. Gælder for alle rammer. (J) Softwaren viser afgrænsning af de definerede strukturer. Klik på knappen Opdater ND-måling for at analysere og få de valgte parametre fra trin A som output. (K) Klik på pilen nedad ved siden af eksportknappen, og vælg data til udklipsholderen. (L) Klik på eksport knappen for at kopiere dataoutputtet til udklipsholderen. Data kan nu indsættes i et regneark. (M) Klik på knappen Nulstil data for at tømme resultatafsnittet, før en ny måling udføres. (N) Når erosion skal udføres til intensitetsmåling til beregning af intensitetsforholdet, skal du klikke på Binær > erodere. Funktionen Fjern objekter, der berører kanter, findes i den samme rullemenu. (O) Vælg den matrix, der er vist i figuren for erosion, og vælg det ønskede antal (1 pixel eller 2,5 μm til fjernelse af haloen omkring organoider, 10 pixels eller 25 μm til fjernelse af den cellulære grænse, der omgiver et lumen, hvis det er til stede). Se den supplerende fil for fuldskærmspaneler i denne figur. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Billeder af rektale organoider fra mennesker uden (øvre paneler) og med CF (nedre paneler). Illustration af metoderne til beregning af de to indekser, IR (intensitetsforhold; centralt panel) og CI (cirkularitetsindeks; højre panel), der bruges til at kvantificere morfologiske forskelle mellem rektale organoider hos forsøgspersoner med og uden CF. IR måler tilstedeværelsen eller fraværet af et centralt lumen, beregnet i tre trin: (I) beregne organoidernes globale fluorescensintensitet: erodere 1 pixel (2,5 μm) for at fjerne den omgivende "halo" omkring hver struktur og måle den gennemsnitlige fluorescensintensitet for den resterende hele organoid; II) beregne organoidernes centrale fluorescensintensitet: erodere 10 pixels (25 μm) omkring hver struktur for at fjerne den cellulære kant fra organoiderne og måle den gennemsnitlige fluorescensintensitet af den resterende struktur (III) IR er lig med 
og er højere i CF end i ikke-CF-organoider. CI kvantificerer rundheden af organoiderne, defineret som 
, hvilket er lavere i CF end i ikke-CF-organoider. CF: cystisk fibrose; IR: intensitetsforhold; CI: cirkularitet indeks. Dette tal er blevet genoptrykt med tilladelse fra Cuyx et al.13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Eksempel på et regneark til beregning af CI og IR. Outputtet (cirkularitet og middelintensitet som defineret i figur 5) kopieres ind i regnearket for begge erosionstrin. Billedbehandlingssoftwaren tilføjer automatisk middelværdierne for hver parameter. Disse midler kan kopieres til en valgt celle i regnearket og derefter bruges til beregning af CI og IR. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Intensitetsforhold (IR) og cirkularitetsindeks (CI) værdier for hvert emne i henhold til sygdomsstatus, bugspytkirtelstatus og svedchloridkoncentration. Linjen repræsenterer den optimale diskriminationslinje opnået ved lineær diskriminantanalyse. CF: cystisk fibrose; PS: bugspytkirtel tilstrækkelig; PI: bugspytkirtlen utilstrækkelig; SCC: koncentration af svedklorid. Dette tal er blevet genoptrykt med tilladelse fra Cuyx et al.13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Beregning af romaindekser. Beregningen af romaindekser ved hjælp af otte tilfældige brønde pr. emne og ved hjælp af den samme statistiske metode var sammenlignelig med resultaterne ved hjælp af 32 brønde. Igen blev der opnået perfekt diskrimination. CI: cirkularitet indeks; IR: intensitetsforhold. Dette tal er blevet genoptrykt med tilladelse fra Cuyx et al.13. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Histogrammer, der illustrerer fordelingen af værdier målt i hver enkelt organoid i en given kultur. Cirkularitetsparameteren, intensitetsparameteren for den centrale del af organoiden og intensitetsparameteren for hele organoiden er afbildet (kolonner). Resultater i to CF- og to ikke-CF-kulturer vises (rækker). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil: Præsentation i fuld opløsning af figur 5. Klik her for at downloade.
| CF | Ikke-CF | p-værdi | |
| n | 167 | 22* | |
| IR | 1.11 (0.93–1.34) | 0.76 (0.61–0.88) | <0.001 |
| CI | 0.59 (0.49–0.70) | 0.79 (0.73–0.84) | <0.001 |
| Alder (år) | 18 (0–60) | 44 (0–77) | <0.001 |
| Køn | 85 mænd (51 %) 82 kvinder (49 %) |
11 mænd (50%) 11 kvinder (50 %) |
>0,999 |
| SCC (mmol/l) (n = 164) | 97.61 (36–160) | ||
| SCC lav (<87 mmol/L) eller høj (≥87 mmol/L) | 41 lav (25%) 123 høj (75%) |
||
| Bugspytkirtelstatus (n = 165) | 28 hk (17%) 137 PI (83 %) |
Tabel 1: Baselinekarakteristika for forsøgspersonerne og indekser beregnet ved hjælp af rektal organoid morfologianalyse (ROMA). n eller middelværdi og rækkevidde. CF: cystisk fibrose; IR: intensitetsforhold; CI: cirkularitet indeks; SCC: koncentration af svedchlorid; PI: bugspytkirtlen utilstrækkelig; PS: bugspytkirtel tilstrækkelig. * syv bærere, tre ikke-bærere, to autosomale dominerende polycystiske nyresygdomme, seks ulcerøs colitis, en polypscreening, tre sunde kontroller inkluderet i en undersøgelse om inflammatorisk tarmsygdom. Denne tabel er blevet genoptrykt med tilladelse fra Cuyx et al.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi leverer en detaljeret protokol til rektal organoid morfologianalyse (ROMA). De to indekser beregnet med ROMA, IR og CI, skelnede organoider fra emner med CF fra dem uden CF med perfekt nøjagtighed. ROMA kan således fungere som et nyt fysiologisk CFTR-assay, der supplerer SCC og andre aktuelt tilgængelige test13,14,15.
Protokollen er afhængig af brugen af tarmorganoider, som har en rund form og central lumen, når CFTR er funktionel, som beskrevet før10,11. Organoider anvendes i stigende grad til vurdering af nye CF-behandlinger (f.eks. i FIS-assay8). ROMA-protokollen kan integreres med FIS-analyseprotokollen, da 32 brønde for FIS-analysen inkuberes natten over uden korrektorer. Disse brønde kan afbildes efter tilsætning af calceingrøn, men før tilsætning af forskolin og / eller potentiatorer. På denne måde kan en 96-brøndplade bruges til både diagnostisk og personlig terapeutisk forskning for hver specifik patient. Bortset fra diagnose kan ROMA også give oplysninger om karakterisering af varianter af ukendt betydning.
Den største praktiske hindring for denne protokol ville sandsynligvis være opstarten af tarmorganoidkulturer. På de fleste almindelige hospitaler kan rektale sugebiopsier imidlertid opnås i henhold til en standardiseret protokol og med lave komplikationsrater, selv hos spædbørn9. Generering af organoider fra biopsier kræver kun tilstedeværelse af tarmkrypter, mens for ICM er biopsi af højere kvalitet af højere kvalitet nødvendige12,15. Biopsier kan transporteres til et centralt laboratorium til generering af en organoidkultur og efterfølgende ROMA ved hjælp af den standardiserede og halvautomatiske protokol, der er beskrevet heri 9,12. Da reduktionen fra 32 brønde til otte brønde for romaer ikke viste nogen forskel i klassificeringen af tilfælde som CF eller ikke-CF, ville det være tilstrækkeligt at anbringe otte brønde til analyse, hvilket reducerede omkostningerne.
For yderligere validering skal roma udføres på forsøgspersoner med tvetydige diagnoser. Organoider kan opbevares i en biobank til senere forskning i personlig medicin til dem, der er diagnosticeret med CF16. ROMA kunne også spille en rolle i en personlig medicin tilgang. For eksempel kunne IR detektere udseendet af et centralt lumen efter inkubation af organoider af forsøgspersoner med resterende CFTR-funktion, men før stimulering med en potentiator og forskolin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denne undersøgelse blev finansieret af den belgiske CF-patientforening "Mucovereniging/Association Muco", forskningsbevillingen fra det belgiske samfund for pædiatri BVK-SBP 2019 og et tilskud fra UZ Leuven Fund for Translational Biomedical Research. Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker de patienter og forældre, der deltog i denne undersøgelse. Vi takker Abida Bibi for alt dyrkningsarbejde med organoiderne. Vi takker Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz og Bernard Wenderickx for logistisk støtte. Vi takker også Mucovereniging/Association Muco, og specifikt Stefan Joris og Dr. Jan Vanleeuwe, for deres støtte og finansiering. Vi takker alle samarbejdspartnere fra det belgiske organoidprojekt: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liège, Belgien), Linda Boulanger (Universitetshospitaler Leuven, Belgien), Georges Casimir (HUDERF, Bruxelles, Belgien), Benedicte De Meyere (Universitetshospitalet Gent, Belgien), Elke De Wachter (Universitetshospitalet Bruxelles, Belgien), Danny De Looze (Universitetshospitalet Gent, Belgien), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Bruxelles, Belgien), Laurence Hanssens (HUDERF, Bruxelles), Christiane Knoop (CHU Erasme, Bruxelles, Belgien), Monique Lequesne (Universitetshospitalet Antwerpen, Belgien), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Stephanie Van Biervliet (Universitetshospitalet Gent, Belgien), Eva Van Braeckel (Universitetshospitalet Gent, Belgien), Kim Van Hoorenbeeck (Universitetshospitalet Antwerpen, Belgien), Eef Vanderhelst (Universitetshospitalet Bruxelles, Belgien), Stijn Verhulst (Universitetshospitalet Antwerpen, Belgien), Stefanie Vincken (Universitetshospitalet Bruxelles, Belgien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
References
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).
- Cystic Fibrosis Mutation Database. , Available from: http://www.genet.sickkids.on.ca/ (2022).
- CFTR2. , Available from: https://www.cftr2.org/ (2022).
- Farrell, P. M., et al. Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation. The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).
- Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).
- Friedmacher, F., Puri, P. Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung's disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications. Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Cuyx, S., et al. Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis. Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).
- Wilschanski, M., et al. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
- Ramalho, A. S., et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis. European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).
