Summary
Bu protokol, kistik fibroz (KF) için yeni bir tanısal test olan rektal organoid morfoloji analizini (ROMA) tanımlamaktadır. Morfolojik özellikler, yani yuvarlaklık (dairesellik indeksi, CI) ve bir lümenin varlığı (yoğunluk oranı, IR), CFTR fonksiyonunun bir ölçüsüdür. 189 deneğin analizi, CF ve CF olmayan arasında mükemmel bir ayrım olduğunu göstermiştir.
Abstract
Kistik fibrozis (KF) tanısı her zaman kolay değildir, özellikle ter klorür konsantrasyonu orta ve / veya ikiden az hastalığa neden olan CFTR mutasyonları tanımlanabilir. Fizyolojik CFTR testleri (nazal potansiyel fark, bağırsak akımı ölçümü) tanı algoritmasına dahil edilmiştir, ancak her zaman hazır veya uygulanabilir değildir (örneğin, bebeklerde). Rektal organoidler, belirli koşullar altında kültürlendiğinde rektal biyopsi kriptlerinden izole edilen kök hücrelerden büyüyen 3D yapılardır. CF olmayan deneklerden gelen organoidler yuvarlak bir şekle ve sıvı dolu bir lümene sahiptir, çünkü CFTR aracılı klorür taşınması suyu lümene yönlendirir. Kusurlu CFTR fonksiyonuna sahip organoidler şişmez, düzensiz bir şekil alır ve görünür lümeni yoktur. KF ve KF olmayan organoidler arasındaki morfolojideki farklılıklar, yeni bir CFTR fizyolojik testi olarak 'Rektal Organoid Morfoloji Analizi'nde (ROMA) ölçülmüştür. ROMA testi için, organoidler 96 delikli plakalar halinde kaplanır, kalsein ile boyanır ve konfokal mikroskopta görüntülenir. Morfolojik farklılıklar iki indeks kullanılarak ölçülür: Dairesellik indeksi (CI) organoidlerin yuvarlaklığını ölçer ve yoğunluk oranı (IR) merkezi bir lümenin varlığının bir ölçüsüdür. CF olmayan organoidler, CF organoidlerine kıyasla yüksek CI ve düşük IR'ye sahiptir. ROMA indeksleri, CF'siz 22 denekten KF'li 167 deneği mükemmel bir şekilde ayırt etti ve ROMA'yı KF tanısına yardımcı olmak için çekici bir fizyolojik CFTR testi haline getirdi. Rektal biyopsiler çoğu hastanede her yaşta rutin olarak yapılabilir ve doku organoid kültür ve ROMA için merkezi bir laboratuvara gönderilebilir. Gelecekte, ROMA in vitro CFTR modülatörlerinin etkinliğini test etmek için de uygulanabilir. Bu raporun amacı, ROMA için kullanılan yöntemleri tam olarak açıklamak ve diğer laboratuvarlarda replikasyona izin vermektir.
Introduction
Kistik fibroz (KF), KF transmembran iletkenlik regülatörü (KFTR) genindeki mutasyonların neden olduğu otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. CFTR proteini, birkaç epitel1'in hidrasyonunu sağlayan bir klorür ve bikarbonat kanalıdır. KF, öncelikle solunum yolu hastalığı olarak kendini gösteren, aynı zamanda gastrointestinal sistemi, pankreası, karaciğeri ve üreme sistemini de etkileyen, yüksek yüklü, yaşamı kısaltan, çok sistemli bir hastalıktır2.
Hastalığa neden olan CFTR mutasyonları, CFTR'nin miktarında veya fonksiyonunda bir azalmaya yol açar ve bu da mukus dehidrasyonuna neden olur. CFTR genindeki 2.000'den fazla varyant3 olarak tanımlanmıştır, bunlardan sadece 466'sı 4iyice karakterize edilmiştir.
CF tanısı, ter klorür konsantrasyonu (SCC) 60 mmol / L eşiğinin üzerinde olduğunda veya hastalığa neden olan iki CFTR mutasyonu (CFTR2 veritabanına göre) 4,5 tanımlandığında yapılabilir. Ter testlerinin yaklaşık% 4-5'inde ortaya çıkan sadece orta derecede yüksek (30-60 mmol / L) SCC'si olan deneklerde6 ve değişen veya bilinmeyen klinik sonuçlara sahip CFTR mutasyonlarında, KF uyumlu semptomları veya pozitif bir yenidoğan tarama testi olsa bile, tanı doğrulanamaz veya dışlanamaz. Bu olgular için ikinci basamak fizyolojik KFTR testleri (nazal potansiyel fark (NPD) ve intestinal akım ölçümleri (ICM)) tanı algoritmasına dahil edilmiştir. Bu testler çoğu merkezde hazır değildir ve her yaşta, özellikle de bebeklerde5.
Rektal organoidler, rektal biyopsi ile elde edilen bağırsak kriptlerinden Lgr5(+) erişkin bağırsak kök hücrelerinden yetiştirilen 3D yapılardır7. Organoidler, CF8'de modülatör tedavisinin test edilmesi gibi biyomedikal araştırmalarda giderek daha fazla kullanılmaktadır. Uygulanabilir bir biyopsi, emme veya forseps biyopsisi ile elde edilebilir, bu prosedür sadece minimum rahatsızlığa neden olur ve bebeklerde bile güvenlidir, düşük komplikasyon oranları9. Rektal biyopsilerden izole edilen kriptler kök hücrelerle zenginleştirilir ve spesifik kültürleme koşulları altında, bunlar rektal organoidler halinde kendi kendini organize eder. Bu organoidlerin morfolojisi, epitel hücrelerinin apikal zarında bulunan CFTR'nin ekspresyonu ve işlevi ile belirlenir. Fonksiyonel CFTR, klorür ve suyun organoid lümene girmesine izin verir, böylece CF olmayan organoidlerin şişmesine neden olur. CF organoidleri şişmez ve görünür lümen 10,11'e sahip değildir.
Rektal organoid morfoloji analizi (ROMA), organoid morfolojisindeki bu farklılıklara dayanarak KF ve KF dışı organoidler arasında ayrım yapılmasına olanak sağlar. CF olmayan organoidler daha yuvarlaktır ve görünür bir lümene sahipken, bunun tersi CF organoidleri için geçerlidir. Bu analiz için, hastaya özgü organoidler, 96 kuyucuklu bir plakanın 32 kuyusuna kaplanır. 1 günlük büyümeden sonra, organoidler kalsein yeşili ile boyanır ve konfokal bir mikroskopta görüntülenir. CF olmayan organoidler daha dairesel bir şekil ve daha az floresan bir orta kısım gösterir, çünkü lümen sıvı içerir ve kalsein sadece hücreleri boyar. Morfolojideki bu farklılıklar iki ROMA indeksi kullanılarak ölçülür: dairesellik indeksi (CI) organoidlerin yuvarlaklığını ölçerken, yoğunluk oranı (IR) merkezi bir lümenin varlığının veya yokluğunun bir ölçüsüdür. Bu raporda, tekniğin çoğaltılmasına izin vermek için bu ayrımcı indeksleri elde etmek için protokolü ayrıntılı olarak açıklayacağız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan dokusunu içeren tüm prosedürler için Etik Kurul Araştırma UZ/KU Leuven (EC araştırması) tarafından onay alınmıştır. Tüm araştırmalar bilgilendirilmiş onam ve / veya ebeveynlerin, temsilcilerin ve / veya hastaların onayı ile gerçekleştirilmiştir.
NOT: Rektal biyopsileri ve organoidleri içeren tüm prosedürler, araştırmacıyı herhangi bir biyolojik tehlikeden korumak ve kültürlerin kontaminasyon riskini en aza indirmek için laminer bir akışta yapılmalıdır. Herhangi bir laboratuvar prosedürüne gelince, araştırmacılar numuneleri manipüle etmek için her zaman laboratuvar önlüğü, eldiven ve güvenlik gözlüğü giymelidir.
1. Rektal biyopsi, yetişkin kök hücrelerin kriptlerden izolasyonu ve organoid kültür
- Medya üretimi ve kullanımı, organoid kültürü, biyobankacılık için bölme, genişleme ve dondurma dahil olmak üzere protokolün bu ilk kısmı için, daha önce yayınlanmış iki protokolüizleyin 8,12.
- Kısacası, aşağıdaki adımların atılması gerekir:
- Forseps veya emme cihazı ile üç ila dört rektal biyopsi alın ve yukarıda belirtilen protokolde açıklandığı gibi Ad-DF + ++ ortamı ile steril bir kapta (örneğin, 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü) toplayın.
- Biyopsileri buz üzerinde veya 4 ° C'de merkezi bir laboratuvara taşıyın. Diğer merkezlere ulaşım mümkündür ve nakliye 48 saate kadar sürdüğünde bile kalite önemli ölçüde etkilenmez. Taşımanın 6 saatten fazla sürmesi bekleniyorsa, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü yerine 6 mL Ad-DF + ++ ortamına sahip 15 mL'lik bir konik tüp kullanın.
- Biyopsileri, enkazı ve yağ dokusu gibi epitel olmayan dokuları çıkarmak için süpernatant temizlenene kadar soğuk PBS'de yıkayın.
- Kriptoları ayırmak için biyopsileri EDTA (son konsantrasyon 10 mM) ile inkübe edin. Kriptleri bir bazal membran matrisine yerleştirin. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için kültürlemenin ilk haftasında ortama geniş spektrumlu antibiyotikler (gentamisin 50 μg / mL ve vankomisin 50 μg / mL) ekleyin.
- Kriptolar tomurcuklandığında ve kapatılıp çoğaldığında, genellikle 7 gün sonra mekanik bölünme gerçekleştirin.
- Elde edilen organoidleri yaklaşık her 7 günde bir bölün. Bu şekilde, kültürü genişletin, yedek örnekleri bir biyobankada dondurun veya organlar tahliller için kullanın.
2. ROMA için organoid kaplama (1. gün)
- Kaplama için organoidleri mekanik olarak ayırın
- Soğuk Ad-DF + ++ ortamı ile iki kez yıkayarak 24 kuyucuklu bir plakadan üç iyi büyümüş kuyudan organoidleri toplayın, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve mikroskop altında değerlendirin12.
- Organoidlerin canlı ve yüksek kalitede olduğundan emin olun, bu genellikle daha önce bölündükten sonra 5-7 günlük büyümeden sonra elde edilebilir (Şekil 1).
- Organoidleri yukarıda belirtilen protokol 8,12'ye göre mekanik olarak bölün. Organoidlerin çoğunluğu, parlak alan mikroskobu kullanılarak değerlendirildiği gibi, ilk gözleme kıyasla yeterince küçük olana kadar tekrarlayın.
- Genellikle organoid-orta çözeltinin üst 4 / 5'inin yeni bir mikrosantrifüj tüpünde toplanmasına karşılık gelen daha küçük organoidleri toplayın, çünkü büyük organoidler yerçekimi nedeniyle tüpün dibine batar ve küçük organoidler orta sütunun üst kısmında asılı kalır.
- Daha küçük organoidlerin numunesini 2 dakika boyunca 0,3 x 1000 g'da santrifüj edin ve ortamı atın.
- Daha küçük organoidlerin peletini %40-%50 bazal membran matrisinin 130 μL'sinde seyreltin (Ad-DF+++ medium12 ile seyreltilir).
- 200 μL mikropipet kullanarak iyice askıya alın.
- Organoidleri 96 delikli bir plakaya yerleştirin
- 20 μL'lik bir pipet kullanarak, önceden ısıtılmış 96 delikli bir plakanın 32 kuyusunda organ organoidleri bulunur. Her bir kuyucuğun, önceki adımda üretilen organoid-matris çözeltisinin bir 4 μL damlasını içerdiğinden emin olun.
- Çözeltideki organoidler, yerçekimine bağlı aşağı doğru yer değiştirmesi nedeniyle tüpün dibinde bir pelet oluşturma eğilimindedir. Bunu önlemek ve düzgün bir kaplama sağlamak için, organoid-matris çözeltisini 200 μL'lik bir mikropipet kullanarak düzenli olarak yeniden askıya alın (örneğin, dört ila sekiz kuyucuğu kapladıktan sonra her seferinde).
- Damlanın kuyunun kenarlarına doğru akmasını önlemek için her damlayı kuyunun ortasına yerleştirin, bu da daha sonra görüntü kalitesini düşürür.
- Üst üste binen organoidler olmadan kuyu başına yaklaşık 30 organoid (minimum 15, maksimum 90) hedefleyin.
- Bu organoidlerin gece boyunca inkübe edilmesi gerekeceğini ve bu süre zarfında hafifçe büyüyeceğini ve kaplama yoğunluğu çok yüksekse üst üste binmeye başlayabileceğini unutmayın.
- İlk bir veya iki kuyuyu kapladıktan sonra 5x büyütme hedefine sahip bir parlak alan mikroskobu kullanarak kaplama yoğunluğunu kontrol edin.
- Kaplama yoğunluğu çok yüksekse, istenen kaplama yoğunluğuna ulaşılana kadar bazal membran matrisinin eklenmesiyle organoid-matris çözeltisini kademeli olarak seyreltin (Şekil 2).
- Kaplamadan sonra, organoidlerin çoğunun aynı odak düzleminde olduğundan emin olmak için plakayı düz bir yüzeye hafifçe dokunun.
- Plakayı inkübe edin
- Bodrum membran matrisinin jelleşmesine izin vermek için 96 delikli plakayı 37 ° C'de ve 8-10 dakika boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
- Her bir kuyucuğa 50 μL insan kolon organoid ortamı +/+12 ekleyin ve 16-24 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.
- Forskolin veya CFTR modülatörleri eklemeyin, böylece organoidler bazal koşullar altında büyür.
3. Konfokal mikroskopi kullanarak organoid görüntüleme (2. gün)
- Kalsein yeşili ile organoidleri lekeleyin
- 50 μg kalsein yeşili içeren bir şişeye 50 μL dimetilsülfoksit (DMSO) ekleyerek 1 mM'lik bir kalsein yeşili stok çözeltisi hazırlayın.
- 200 μL Ad-DF+++'a (konsantrasyon 6 μM) 1.2 μL stok çözeltisi ekleyerek çalışan bir kalsein yeşili çözeltisi hazırlayın.
- Bu kalsein karışımından 5 μL'yi, organoidlerin kaplandığı 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin (son kalsein konsantrasyonu 0.6 μM). Bu adımı gerçekleştirirken kuyunun içindeki matris damlasına dokunmayın ve yerinden çıkarmayın.
- Kalsein yeşilinin tüm kuyucukta homojen dağılımını sağlamak için plakayı kapakla birkaç kez döndürün ve hafifçe eğin.
- Kuyucuklardaki tüm organoidlerin lekelenmesini sağlamak için plakayı 37 ° C'de 15-30 dakika ve% 5 CO2'de tekrar inkübe edin.
- Plakayı konfokal mikroskopa aktarın
- Plakayı otomatik bir aşama ve entegre inkübatör ile konfokal mikroskopa aktarın. Plakanın plaka tutucusuna iyi sabitlendiğinden emin olun.
- 37 °C ve %5 CO2'de inkübasyon isteğe bağlıdır, ancak görüntüleme işleminin kısa süresi (yaklaşık 10 dakika) göz önüne alındığında gerekli değildir.
- Organoidlere odaklanma (Şekil 3)
- Konfokal mikroskopu kullanarak, her bir kuyucuktaki organoidlerin optimal x/y pozisyonunu ve odağını (z pozisyonu) manuel olarak belirleyin ve bu pozisyonları görüntüleme yazılımına kaydedin.
- En iyi odak, organoidlerin mümkün olan en keskin şekilde tanımlanması ve organoid damlasının mümkün olan en büyük kısmının görselleştirilmesi anlamına gelir. Lekenin dağılımı yeterli değilse, 3.1.4 ve 3.1.5 adımlarını tekrarlayın (örneğin, fazladan 5-10 dakika boyunca inkübe edin).
- 488 nm'de emisyon ve 515 nm'de uyarma (kalsein floresansının görselleştirilmesi için özel) ve 5x LD büyütme hedefi ile canlı hücre görüntüleme ayarlarını kullanın.
- Konfokal mikroskop ile 32 kuyucuğun organoid resimlerini elde edin (Şekil 3 ve Şekil 4).
- 1024 piksel x 1024 piksel çözünürlük (piksel boyutu 2,5 μm x 2,5 μm) ve 16 bit derinlikle görüntüleri tek yönlü olarak çekin.
- CF ve CF olmayan organoidler arasındaki morfolojik farklılıkların optimal olarak görselleştirilmesi için lazer yoğunluğunu ve ana kazancını seçin (örneğin, lekesiz su dolu merkezi lümen (varsa) ile lekeli bir hücresel sınır arasındaki ayrım).
NOT: Ana kazanç ve dolayısıyla floresan sinyali çok düşük olduğunda organoidler doğru şekilde tanımlanmayacaktır; Master kazancın çok yüksek ayarlanması, homojen çok yüksek sinyal yoğunluğuna sahip organoidlerle görüntülerle sonuçlanacak ve daha ince morfolojik farklılıkların görüntülenmesini önleyecektir (Şekil 2). - Mikroskop formatında 32 kuyucuğun tümü için kuyucuk başına bir resim kaydedin ve bunları TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.
4. Görüntü analizi (Şekil 5)
- TIFF dosyalarını görüntü analiz yazılımına yükleyin.
- Operatör tarafından belirlenen dışlama kriterlerine dayanarak ilk kalite kontrolünü gerçekleştirin (Şekil 2): birçok farklılaşmış veya ölü yapı veya döküntü, yetersiz kaplama yoğunluğu, çok fazla (örneğin, üst üste binen) veya çok az organoid ve yetersiz floresan dağılımı (organoidler açıkça tanımlanmamış, arka plan sinyali çok yüksek).
NOT: Bu adım, adım 3.4'te görüntüleri TIFF dosyaları olarak dışa aktarmadan önce de gerçekleştirilebilir. - Görüntüleri analiz için hazırlama
- 1 piksel 2,5 μm x 2,5 μm'ye karşılık gelecek şekilde görüntüleri yeniden kalibre edin.
- Bir Ağ Verileri oluşturun ve açın (. ND) her organoid kültür için 32 resmin tümünün dosyası, konu başına 32 resmin hepsinin eşzamanlı analizini sağlar.
- Organoidleri tanımlayın
- 4.500 düşük yoğunluk eşiği ve 65.535 üst eşik kullanarak yapıları tanımlayın (Pürüzsüz ve Temiz işlevleri kapalı; Dolgu Delikleri işlevi açık; x3'te ayrı işlev).
NOT: Bu, floresan yapıları, varsa tarif edilen yapıdaki lümen de dahil olmak üzere Dolgu Delikleri ile tanımlar.
- 4.500 düşük yoğunluk eşiği ve 65.535 üst eşik kullanarak yapıları tanımlayın (Pürüzsüz ve Temiz işlevleri kapalı; Dolgu Delikleri işlevi açık; x3'te ayrı işlev).
- Organoidleri sayın
- Tüm yapıları seçin ≥40 μm.
- ND Ölçümünü Güncelle düğmesini tıklayın (her ölçüm gerektiğinde); sayılan organoidler numaralandırılacaktır.
NOT: Bu, 32 kuyudaki toplam organoid sayısına eşittir, ölü hücreler gibi küçük döküntüler hariç tutulur.
- İndekslerin hesaplanması için yoğunluk ve döngüselliğin ölçülmesi
- Tüm yapıları ≥60 μm olarak seçin ve sayın.
NOT: Bu, CF veya CF olmayanlar için tipik morfolojiyi gösterecek kadar büyük organoidleri sayar. Organoidler >40 μm ve <60 μm, hem CF olmayan hem de CF'de küçük ve yoğundur. - Resmin kenarlıklarına dokunan tüm yapıları kaldırın. Bunu, morfolojileri doğru bir şekilde ölçülemediğinden, tamamen görünmeyen organoidleri çıkarmak için yapın.
- Her ≥60 μm yapının kenarlığından 1 piksel (= 2,5 μm) aşındırın. Bu, organoidleri çevreleyen dağınık kalsein floresan halesini ortadan kaldırır.
- Her yapının ortalama yoğunluğunu ölçün. Bu şekilde, organoidlerin ortalama floresansı ölçülür.
- Tüm yapıları ≥60 μm'yi tekrar seçin ve sınırlara temas eden tüm yapıları kaldırın.
- Her ≥60 μm yapının kenarlığından 10 piksel (= 25 μm) aşındırın.
NOT: CF olmayan organoidlerde, bu hücresel sınırı aşındırır ve sadece lümeni bırakır. CF organoidlerinde, bu, kalan iç kısımla kabaca aynı floresana sahip olan organoidin dış kısmını aşındırır. - Her aşınmış yapının ortalama yoğunluğunu ölçün. Bu şekilde, organoidlerin orta kısmının ortalama floresansı ölçülür.
- Her yapının daireselliğini ölçün. Bu, organoidlerin ortalama daireselliğine karşılık gelir.
- Tüm yapıları ≥60 μm olarak seçin ve sayın.
- İkinci kalite kontrolünü gerçekleştirin: yazılım tarafından belirlenen dışlama kriterleri. Organoidlerin% 50'sinden azı (yapılar ≥40 μm olarak tanımlanır) ≥60 μm olduğunda, yeterli organoidin CF veya CF olmayanlara özgü morfolojiyi gösterecek kadar büyük olması gerektiğinden, resim kümesini hariç tutun. Ayrıca, 32 kuyuda <500 veya >3.000 organoid (yapılar ≥40 μm olarak tanımlanır) bulunduğunda da hariç tutun.
5. Görüntüleme yazılımındaki indeksleri ölçün (Şekil 6)
- Dairesellik indeksini (CI) ölçün.
NOT: Bu, 32 kuyunun tamamındaki tüm organoidlerin ortalama daireselliği olan adım 4.6'da ölçülen ortalama daireselliğe karşılık gelir. CI,
CF'de CF olmayan organoidlerden daha düşük olan organoidlerin yuvarlaklığını ölçer. - Yoğunluk oranını (IR) ölçme
- IR'yi, her ≥60 μm yapının sınırından 25 μm aşındırdıktan sonra yoğunluk ölçümünün ortalamasını, her ≥60 μm yapının sınırından 2,5 μm aşındırdıktan sonra yoğunluk ölçümünün ortalamasına bölerek hesaplayın.
NOT: IR, merkezi bir lümenin varlığını veya yokluğunu ölçer. IR, CF'ye
eşittir ve CF'de CF olmayan organoidlerden daha yüksektir.
- IR'yi, her ≥60 μm yapının sınırından 25 μm aşındırdıktan sonra yoğunluk ölçümünün ortalamasını, her ≥60 μm yapının sınırından 2,5 μm aşındırdıktan sonra yoğunluk ölçümünün ortalamasına bölerek hesaplayın.
- Analiz sürecini basitleştirin
- Verileri kopyaladıktan sonra bu endeksleri otomatik olarak hesaplamak için elektronik tablo yazılımını kullanarak standart bir çalışma sayfası hazırlayın (Şekil 7).
- IR'yi hesaplamak için:
- Her ≥60 μm yapının sınırından 2,5 μm aşındırdıktan sonra yoğunluk ölçümünü yapın. Hesaplama için ortalamayı kullanın (payda).
- Her ≥60 μm yapının sınırından 25 μm aşındırdıktan sonra yoğunluk ölçümünü yapın. Hesaplama için ortalamayı kullanın (pay).
- CI'yi hesaplamak için, tüm kuyucuklardaki tüm organoidlerin daireselliğini alın. Ortalama CI'ye karşılık gelir.
NOT: Büyük görüntü gruplarının analizi gerektiğinde, bölüm 4'te açıklandığı gibi görüntü analizi işlemi, kalibre edilmiş ND dosyalarından başlayarak ve tüm adımların birleştirildiği bir makro çalıştırılarak yarı otomatik hale getirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rutin klinik ziyaretler sırasında 212 denekten organoidler toplandı. Rektal biyopsi prosedürü sırasında veya sonrasında herhangi bir yan etki meydana gelmedi. Organoidler, genotip ve klinik bilgi gibi özne özelliklerine kör olan bir araştırmacı tarafından görüntülendi. Düşük kaliteli görüntüler nedeniyle, 23 denek hariç tutuldu. Başarılı ve başarısız organoid kültürlere ve görüntü edinimine örnekler Şekil 2'de görülebilir.
KF'li 167 deneğin organoidleri ve iki hastalığa neden olan CFTR mutasyonu (CFTR2 veritabanı4 tarafından tanımlandığı gibi) ve 22 KF dışı denek analiz edildi. Kültür başına ortalama organoid miktarı 1.519 idi (kuyu başına yaklaşık 40-50 organoid). Analiz için dahil edilen kültür başına ortalama organoid miktarı% 77 idi (60 μm'≥ yapı sayısının, tipik CF veya CF olmayan morfolojiyi yansıtacak kadar büyük organoidlerin fraksiyonuna karşılık gelen yapı sayısına ≥40 μm'ye bölünmesi).
IR ve CI, KF'li ve KF'siz deneklerden organoidler arasında ayrım yaptı (p < 0.001) (Tablo 1). Doğrusal diskriminant analizi ile, sadece 32 kuyunun tümünden elde edilen veriler kullanıldığında (Şekil 8) değil, aynı zamanda her kültür için rastgele sekiz kuyu seçildiğinde (Şekil 9) CF ve CF olmayan arasında mükemmel ayrım (AUC = 1) elde edilmiştir.
Şekil 10, dairesellik için değerlerin dağılımını, organoidin orta kısmının yoğunluğunu ve dört açıklayıcı kültür (iki CF, iki CF olmayan) için tüm organoidin yoğunluğunu gösteren histogramları göstermektedir.
Şekil 1: İyi yetiştirilmiş ve yaşayabilir organoidlerin görüntüleri . (A) CF'si olmayan bir kişiden organoidler ve (B) CF'li bir kişiden organoidler. Her iki kültür de önceki bölünmeden sonra 7 gün boyunca yetiştirildi. Görüntüler, 5x hedefli bir parlak alan mikroskobu kullanılarak yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Konfokal mikroskopta organoid görüntülemenin gösterilmesi. (A) İyi kalitede CF organoidleri; (B) iyi kalitede CF olmayan organoidler; (C) Kaplama yoğunluğu çok düşük: temsili görüntüleme için yeterli organoid yok; (D) çok yüksek kaplama yoğunluğu: organoidlerin üst üste binmesi, yeterli kalsein boyamasını ve morfolojinin değerlendirilmesini önler; (E) Kalsein boyama ile ilgili bir sorun veya ana kazanç ayarının çok düşük olması nedeniyle yoğunluğun çok düşük olması; (F) Ana kazanç ayarının çok yüksek olması nedeniyle yoğunluk çok yüksek: küçük lümenler aşırı pozlanmış floresan sinyali ile maskelenebilir; (G) ayrı hücrelerin görülebildiği ve morfolojinin artık değerlendirilemediği ölü ve patlamış organoidler; (H) kök hücre durumunun kaybolduğu, genellikle organoid yapıların ortasında yüksek floresan sinyalleri olan, tipik CF veya CF olmayan morfolojiyi yansıtmayan kalın yapılar olarak ortaya çıkan, farklılaşmış organoidler; (I) arka plan sinyali, ya arka plana difüzyonla çok uzun zaman önce gerçekleştirilmiş olan kalsein boyaması nedeniyle ya da ana kazanç ayarının çok yüksek olması nedeniyle çok yüksek; (J) organoidlerin yetersiz mekanik bölünmesi, tahlil için çok büyük bırakılması, iyi boyanmaması ve CF veya CF olmayan morfolojiyi yeterince yansıtmaması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Organoidlere odaklanma ve resim alma . (A) Edinme sekmesini seçin. Gerçek zamanlı görüntüleme için aşağıdaki Canlı düğmesine tıklayın. (B) 488 nm emisyonlu canlı hücre görüntüleme ayarlarını kullanın. (C) 1024 piksel x 1024 piksel çözünürlükte ve piksel başına 16 bit derinlikte görüntü. Tek yönlü görüntüleme parametresini seçin. (D) Şekil ve lümenin varlığı veya yokluğu gibi organoid özelliklerin görüntülenmesini optimize etmek için ana kazancı optimum floresan yoğunluğu için ayarlayın. (E) Organoid kültür başına 32 kuyunun her biri için tek pozisyonları (x, y ve z) kaydedin. (F) Önceden tanımlanmış protokolü çalıştırmak ve seçilen parametrelere göre görüntü almak için Denemeyi Başlat düğmesine tıklayın. (G) Görüntüler tamamlandıktan sonra kaydedilebilir veya Otomatik Kaydet düğmesiyle otomatik kaydetme ayarlanabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Görüntüleri analiz için dışa aktarma. (A) İşleme sekmesini seçin ve birden fazla organoid kültürün görüntülerini tek bir prosedürde dışa aktarmak için Toplu İşlem düğmesine tıklayın. (B) Ekle düğmesine tıklayın ve analiz için gereken kaydedilmiş görüntüleri seçin. (C) Yöntem olarak görüntü dışa aktarmayı seçin. (D) Görüntüleri TIFF dosyaları olarak dışa aktarın, 8 bit'e dönüştürmeyin ve sıkıştırmayın veya yeniden boyutlandırmayın. Orijinal verileri yanmış grafikler olmadan dışa aktarın. Sahne parametresiyle 96 delikli plakanın 32 kuyusunu seçin. Yeniden döşemeyin. (E) Seçilen parametreleri kullanarak ayıklamak için Uygula düğmesine tıklayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Görüntüleme yazılımındaki organoid görüntülerin analizi. (A) Nesne ölçümü parametrelerini ayarlamak için sonuçlar bölümünün (kırmızı yıldız işareti) üzerindeki gri çubuğa sağ tıklayın. Dairesellik ve ortalama yoğunluk ekleyin. (B) Dosya > İçe / Dışa Aktar'a tıklayın > Bir kültürün TIFF dosyalarını tek bir ND dosyasında birleştirmek için Dosya dizisinden ND dosyası oluşturun. (C) İstediğiniz dosyayı seçin ve onaylayın; 32 fotoğraf birleştirilecektir (kırmızı yıldız işareti). (D) Belgeyi Yeniden Kalibre Et > Yeniden Kalibrasyon'a tıklayın. (E) Açılır pencerede Piksel Boyutu'na tıklayın. (F) 1 piksel boyutunda 2,5 μm girin. (G) Resim artık piksel yerine mikrometrelere (kırmızı yıldız işareti) yeniden kalibre edilecektir. (H) Eşiği Tanımla > İkili Olarak Tanımla'yı tıklatın. (I) Boyut seçimi açılır pencerede yapılabilir. Minimum boyut organoid sayımı için 40 μm ve organoid morfoloji analizi için 60 μm'dir. Her zaman Pürüzsüz ve Temiz işlevini kapatın, Dolgu Delikleri işlevini açın ve Ayrı x3 girin. Tüm çerçevelere uygulayın. (J) Yazılım, tanımlanan yapıların tanımını gösterecektir. A adımından seçilen parametreleri analiz etmek ve çıktı olarak almak için ND Ölçümünü Güncelle düğmesine tıklayın. (K) Dışa aktarma düğmesinin yanındaki aşağı bakan oku tıklayın ve panoya veri seçin. (L) Veri çıktısını panoya kopyalamak için Dışa Aktar düğmesine tıklayın. Veriler artık bir elektronik tabloya yapıştırılabilir. (M) Yeni bir ölçüm yapılmadan önce sonuçlar bölümünü boşaltmak için Verileri Sıfırla düğmesine tıklayın. (N) Yoğunluk oranının hesaplanması için yoğunluk ölçümü için erozyon yapılması gerektiğinde, İkili > Erode'u tıklatın. Kenarlıklara Dokunan Nesneleri Kaldır işlevi aynı açılır menüde bulunabilir. (O) Erozyon için şekilde gösterilen matrisi seçin ve istediğiniz sayıyı seçin (organoidleri çevreleyen halenin çıkarılması için 1 piksel veya 2,5 μm, varsa bir lümeni çevreleyen hücresel sınırın çıkarılması için 10 piksel veya 25 μm). Bu şeklin tam ekran panelleri için lütfen Ek Dosya'ya bakın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Rektal organoidlerin (üst paneller) ve CF'li (alt paneller) kişilerden alınan görüntüleri. CF'li ve CF'siz deneklerin rektal organoidleri arasındaki morfolojik farklılıkları ölçmek için kullanılan IR (yoğunluk oranı; merkezi panel) ve CI (dairesellik indeksi; sağ panel) olmak üzere iki indeksi hesaplama yöntemlerinin gösterimi. IR, üç adımda hesaplanan merkezi bir lümenin varlığını veya yokluğunu ölçer: (I) organoidlerin küresel floresan yoğunluğunu hesaplayın: Her yapının etrafındaki çevreleyen 'hale'yi çıkarmak için 1 piksel (2.5 μm) aşındırın ve kalan tüm organoidin ortalama floresan yoğunluğunu ölçün; (II) organoidlerin merkezi floresan yoğunluğunu hesaplayın: hücresel sınırı organoidlerden çıkarmak ve kalan yapının ortalama floresan yoğunluğunu ölçmek için her yapının etrafında 10 piksel (25 μm) aşındırın; (III) IR, CF'ye 
eşittir ve CF'de CF olmayan organoidlerden daha yüksektir. CI, 
CF'de CF olmayan organoidlerden daha düşük olan organoidlerin yuvarlaklığını ölçer. CF: kistik fibroz; IR: yoğunluk oranı; CI: döngüsellik indeksi. Bu rakam Cuyx ve ark.13'ün izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: CI ve IR'nin hesaplanması için bir elektronik tablo örneği. Çıktı ( Şekil 5'te tanımlandığı gibi dairesellik ve ortalama yoğunluk) her iki erozyon adımı için elektronik tabloya kopyalanır. Görüntüleme yazılımı, her parametre için ortalama değerleri otomatik olarak ekler. Bu araçlar, elektronik tabloda tercih edilen bir hücreye kopyalanabilir ve daha sonra CI ve IR'nin hesaplanması için kullanılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Her bir deneğin hastalık durumuna, pankreas durumuna ve ter klorür konsantrasyonuna göre yoğunluk oranı (IR) ve dairesellik indeksi (CI) değerleri. Çizgi, doğrusal diskriminant analizi ile elde edilen optimal ayırt etme çizgisini temsil eder. CF: kistik fibroz; Not: pankreas yeterli; PI: pankreas yetersiz; SCC: ter klorür konsantrasyonu. Bu rakam Cuyx ve ark.13'ün izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: ROMA indekslerinin hesaplanması. ROMA indekslerinin denek başına rastgele sekiz kuyu kullanılarak ve aynı istatistiksel metodoloji kullanılarak hesaplanması, 32 kuyu kullanan sonuçlarla karşılaştırılabilirdi. Yine mükemmel ayrımcılık elde edildi. CI: döngüsellik indeksi; IR: yoğunluk oranı. Bu rakam Cuyx ve ark.13'ün izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Belirli bir kültürdeki her bir organoidde ölçülen değerlerin dağılımını gösteren histogramlar. Dairesellik parametresi, organoidin orta kısmı için yoğunluk parametresi ve tüm organoid için yoğunluk parametresi tasvir edilmiştir (sütunlar). İki KF ve iki KF olmayan kültürde sonuçlar gösterilmiştir (satırlar). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya: Şekil 5'in tam çözünürlüklü sunumu. İndirmek için lütfen tıklayınız.
| CF | CF olmayan | p-değeri | |
| n | 167 | 22* | |
| IR | 1.11 (0.93–1.34) | 0.76 (0.61–0.88) | <0,001 |
| CI | 0.59 (0.49–0.70) | 0.79 (0.73–0.84) | <0,001 |
| Yaş (yıl) | 18 (0–60) | 44 (0–77) | <0,001 |
| Cinsiyet | 85 erkek (%51) 82 kadın (%49) |
11 erkek (%50) 11 kadın (%50) |
>0,999 |
| SCC (mmol/l) (n = 164) | 97.61 (36–160) | ||
| SCC düşük (<87 mmol/L) veya yüksek (≥87 mmol/L) | 41 düşük (%25) 123 yüksek (%75) |
||
| Pankreas durumu (n = 165) | 28 PS (%17) 137 PI (%83) |
Tablo 1: Rektal organoid morfoloji analizi (ROMA) kullanılarak hesaplanan deneklerin ve indekslerin temel özellikleri. n veya ortalama ve aralık. CF: kistik fibroz; IR: yoğunluk oranı; CI: döngüsellik indeksi; SCC: ter klorür konsantrasyonu; PI: pankreas yetersiz; Not: pankreas yeterli. *yedi taşıyıcı, üç taşıyıcı olmayan, iki otozomal dominant polikistik böbrek hastalığı, altı ülseratif kolit, bir polip taraması, inflamatuar barsak hastalığı ile ilgili bir çalışmaya dahil edilen üç sağlıklı kontrol. Bu tablo Cuyx ve ark.13'ün izniyle yeniden basılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rektal organoid morfoloji analizi (ROMA) için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. ROMA, IR ve CI ile hesaplanan iki indeks, organoidleri CF'li deneklerden CF'siz olanlardan mükemmel doğrulukla ayırdı. ROMA böylece SCC'yi ve şu anda mevcut olan diğer testleri 13,14,15'i tamamlayan yeni bir fizyolojik CFTR testi olarak işlev görebilir.
Protokol, CFTR işlevsel olduğunda yuvarlak bir şekle ve merkezi lümene sahip olan bağırsak organoidlerinin kullanımına bağlıdır,10,11'den önce açıklandığı gibi. Organoidler, yeni KF tedavilerinin değerlendirilmesinde giderek daha fazla kullanılmaktadır (örneğin, FIS testi8'de). ROMA protokolü FIS tahlil protokolü ile entegre edilebilir, FIS tahlili için olduğu gibi 32 kuyu düzelticiler olmadan gece boyunca inkübe edilir. Bu kuyucuklar, kalsein yeşili ilavesinden sonra, ancak forskolin ve / veya güçlendiricilerin eklenmesinden önce görüntülenebilir. Bu şekilde, 96 kuyucuklu bir plaka, her bir hasta için hem tanısal hem de kişiselleştirilmiş terapötik araştırmalar için kullanılabilir. Tanı dışında, ROMA bilinmeyen öneme sahip varyantların karakterizasyonunda da bilgi sağlayabilir.
Bu protokolün en büyük pratik engeli muhtemelen bağırsak organoid kültürlerinin başlatılması olacaktır. Bununla birlikte, çoğu genel hastanede, rektal emme biyopsileri, standart bir protokole göre ve bebeklerde bile düşük komplikasyon oranları ile elde edilebilir9. Biyopsilerden organoidlerin üretilmesi sadece bağırsak kriptlerinin varlığını gerektirirken, ICM için daha yüksek kalitede tam kalınlıkta biyopsiler gereklidir12,15. Biyopsiler, bir organoid kültürü oluşturmak için merkezi bir laboratuvara ve daha sonra burada açıklanan standartlaştırılmış ve yarı otomatik protokol kullanılarak ROMA 9,12'ye taşınabilir. ROMA için 32 kuyudan sekiz kuyuya indirgenme, vakaların KF veya KF olmayan olarak sınıflandırılmasında bir fark göstermediğinden, analiz için sekiz kuyunun kaplanması yeterli olacaktır, böylece maliyet düşürülecektir.
Daha fazla doğrulama için, ROMA belirsiz tanıları olan deneklerde yapılmalıdır. Organoidler, CF16 teşhisi konanlar için kişiselleştirilmiş tıbba yönelik daha sonraki araştırmalar için bir biyobankada saklanabilir. ROMA kişiselleştirilmiş bir tıp yaklaşımında da rol oynayabilir. Örneğin, IR, artık CFTR fonksiyonuna sahip deneklerin organoidlerini inkübe ettikten sonra, ancak bir güçlendirici ve forskolin ile uyarılmadan önce merkezi bir lümenin görünümünü tespit edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu çalışma, Belçika KF hastaları derneği "Mucovereniging / Association Muco", Belçika Pediatri Derneği BVK-SBP 2019 Araştırma Bursu ve UZ Leuven Translasyonel Biyomedikal Araştırma Fonu'ndan bir hibe tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışmaya katılan hasta ve velilere teşekkür ederiz. Abida Bibi'ye organoidlerle yaptığı tüm kültür çalışmaları için teşekkür ederiz. Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz ve Bernard Wenderickx'e lojistik destek için teşekkür ederiz. Ayrıca Mucovereniging/Association Muco'ya ve özellikle Stefan Joris ve Dr. Jan Vanleeuwe'ye destekleri ve finansmanları için teşekkür ederiz. Belçika Organoid Projesi'nden tüm işbirlikçilere teşekkür ederiz: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liège, Belçika), Linda Boulanger (Üniversite Hastaneleri Leuven, Belçika), Georges Casimir (HUDERF, Brüksel, Belçika), Benedicte De Meyere (Üniversite Hastanesi Gent, Belçika), Elke De Wachter (Üniversite Hastanesi Brüksel, Belçika), Danny De Looze (Üniversite Hastanesi Gent, Belçika), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Brüksel, Belçika), Laurence Hanssens (HUDERF, Brüksel), Christiane Knoop (CHU Erasme, Brüksel, Belçika), Monique Lequesne (Anvers Üniversite Hastanesi, Belçika), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hastanesi Anvers), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hastanesi Anvers), Stephanie Van Biervliet (Gent Üniversitesi Hastanesi, Belçika), Eva Van Braeckel (Üniversite Hastanesi Gent, Belçika), Kim Van Hoorenbeeck (Üniversite Hastanesi Anvers, Belçika), Eef Vanderhelst (Üniversite Hastanesi Brüksel, Belçika), Stijn Verhulst (Anvers Üniversite Hastanesi, Belçika), Stefanie Vincken (Brüksel Üniversite Hastanesi, Belçika).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
References
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).
- Cystic Fibrosis Mutation Database. , Available from: http://www.genet.sickkids.on.ca/ (2022).
- CFTR2. , Available from: https://www.cftr2.org/ (2022).
- Farrell, P. M., et al. Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation. The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).
- Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).
- Friedmacher, F., Puri, P. Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung's disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications. Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Cuyx, S., et al. Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis. Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).
- Wilschanski, M., et al. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
- Ramalho, A. S., et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis. European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).
