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Medicine

ओविन आई में इंट्राविट्रल इंजेक्शन

Published: July 5, 2022 doi: 10.3791/63823
Automatic Translation
1, 1
1Faculty of Agriculture and Life Sciences, Lincoln University

Summary

रेटिना में वायरल-मध्यस्थता जीन थेरेपी देने के उद्देश्य से भेड़ की आंख में इंट्राविट्रल इंजेक्शन किए गए थे।

Abstract

रेटिना में चिकित्सीय एजेंटों के वितरण के लिए कई तरीके हैं, जिनमें इंट्राविट्रल (आईवीटी), सबरेटिनल, सुप्राकोरॉइडल, पेरिओकुलर या सामयिक प्रशासन शामिल हैं। आईवीटी दवा वितरण में आंख के विट्रियस ह्यूमर में एक इंजेक्शन शामिल है, एक जिलेटिनस पदार्थ जो आंख के पीछे के कक्ष को भरता है और आंखों के ग्लोब के आकार को बनाए रखता है। यद्यपि आईवीटी मार्ग उप-प्रसव की तुलना में कम विशेष रूप से लक्षित है, यह बहुत कम आक्रामक है और नेत्र रोगों की एक श्रृंखला के लिए नैदानिक सेटिंग्स में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

हमने पहले एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) -मध्यस्थता जीन थेरेपी उत्पाद (एएवी 9) के इंट्राविट्रल डिलीवरी की प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया था। सीएलएन 5) भेड़ में स्वाभाविक रूप से होने वाले सीएलएन 5 रूप के न्यूरोनल सेरोइड लिपोफसिनोसिस (एनसीएल)। प्रभावित भेड़ों को एक आंख में आईवीटी जीन थेरेपी मिली, दूसरी अनुपचारित आंख आंतरिक नियंत्रण के रूप में काम करती है। उपचार के 15 महीने बाद तक इलाज की गई आंखों में रेटिना संरचना और कार्य बनाए रखा गया था, जबकि अनुपचारित आंख ने पोस्टमॉर्टम परीक्षा के दौरान उत्तरोत्तर घटते कार्य और गंभीर शोष को प्रदर्शित किया। भेड़ के अध्ययन के आधार पर, सीएलएन 5 जीन थेरेपी उत्पाद को सितंबर 2021 में संयुक्त राज्य खाद्य और औषधि प्रशासन द्वारा एक उम्मीदवार जांच नई दवा (आईएनडी) के रूप में मंजूरी दी गई थी। यह पेपर ओविन आंख को एक चिकित्सीय वायरल वेक्टर के आईवीटी वितरण के लिए सर्जिकल प्रोटोकॉल का विवरण देता है।

Introduction

रेटिना में चिकित्सीय एजेंटों को वितरित करने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें इंट्राविट्रल (आईवीटी), सबरेटिनल, सुप्राकोरॉइडल, पेरिओकुलर या सामयिक प्रशासन शामिल हैं। प्रशासन के प्रत्येक मार्ग में रक्त-रेटिना बाधा या आंतरिक और बाहरी सीमित झिल्ली जैसी बाधाओं पर काबू पाना शामिल है और वितरित की जा रही दवा और विशिष्ट रेटिना लक्ष्य 1,2 के आधार पर प्रभावकारिता की अलग-अलग दर है।

आईवीटी दवा वितरण में आंख के विट्रियस ह्यूमर में एक इंजेक्शन शामिल है, एक जिलेटिनस पदार्थ जो आंख के पीछे के कक्ष पर कब्जा कर लेता है। विट्रियस हास्य का प्राथमिक कार्य आंखों के ग्लोब के आकार को बनाए रखना और ओकुलर ऊतकों, जैसे लेंस और रेटिना को जगह में रखना है। विट्रियस हास्य काफी हद तक पानी से बना होता है, जिसमें कोलेजन, हाइलूरोनिक एसिड और अन्य नॉनकोलेजेनस प्रोटीनकी थोड़ी मात्रा होती है। आईवीटी इंजेक्शन एक सरल और सामान्य प्रक्रिया है जिसका उपयोग नियमित रूप से नेत्र संबंधी स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के इलाज के लिए किया जाता है, जिसमें उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन, मधुमेह मैकुलर एडिमा, मधुमेह रेटिनोपैथी, रेटिना नस रोड़ा और कई विरासत में मिली रेटिना डिस्ट्रोफी 4,5 शामिल हैं।

न्यूरोनल सेरॉइड लिपोफसिनोस (एनसीएल; बैटन रोग) घातक लाइसोसोमल भंडारण रोगों का एक समूह है जो मस्तिष्क और रेटिना के गंभीर अध: पतन का कारण बनता है। वर्तमान में एनसीएल के 13 ज्ञात रूप हैं जो विभिन्न जीनों (सीएलएन 1-8, सीएलएन 10-14) में उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप हैं जो मुख्य रूप से बच्चों को प्रभावित करते हैं लेकिन शुरुआत और रोग की गंभीरता की अलग-अलग उम्र होतीहै। एनसीएल सामान्य प्रगतिशील लक्षण साझा करते हैं, जिसमें संज्ञानात्मक और मोटर गिरावट, दौरे और दृष्टि की हानि शामिल है। एनसीएल के लिए कोई इलाज नहीं है; हालांकि, मस्तिष्क-निर्देशित एंजाइम-प्रतिस्थापन चिकित्सा वर्तमान में सीएलएन 2 रोग 7,8 के लिए नैदानिक परीक्षणों में है, और एएवी-मध्यस्थता जीन थेरेपी ने प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में बहुत वादा दिखाया है, जिसमें सीएलएन 5 जीन थेरेपी के लिए नैदानिक परीक्षण 2022 9,10 में शुरू होने की उम्मीद है।

कई अन्य प्रजातियां एनसीएल के स्वाभाविक रूप से पाए जाने वाले रूपों को विकसित करती हैं, जिनमें बिल्लियां, कुत्ते, भेड़ और गाय शामिल हैं। एनसीएल के दो ओविन मॉडल वर्तमान में न्यूजीलैंड में सक्रिय अध्ययन के अधीन हैं: बॉर्डरडेल भेड़ में एक सीएलएन 5 रोग मॉडल और दक्षिण हैम्पशायर भेड़ में एक सीएलएन 6 रोग मॉडल। प्रभावित भेड़ मानव रोग की कई नैदानिक और रोग संबंधी विशेषताओं का प्रदर्शन करती हैं, जिसमें रेटिना शोष और दृष्टि का नुकसान10,11 शामिल है। यद्यपि सीएलएन 5 रोग के साथ भेड़ में मस्तिष्क-निर्देशित सीएलएन 5 जीन थेरेपी मस्तिष्क शोष और नैदानिक गिरावट को रोक या रोक सकती है, फिर भी इलाज की गई भेड़ अपनीदृष्टि खो देती है। इसने दृष्टि को संरक्षित करने और जीवन की बेहतर गुणवत्ता बनाए रखने के लिए रेटिना का इलाज करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला, जिससे भेड़ में ओकुलर जीन थेरेपी के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना हुई।

भेड़ की आंख मानव आंख के एक अच्छे मॉडल का प्रतिनिधित्व करती है क्योंकि आंख ग्लोब आयामों, विट्रियस वॉल्यूम और रेटिना संरचना 10,12,13 में इसकी समानता है। यह पेपर ओविन आंख को चिकित्सीय वायरल वेक्टर की एक छोटी मात्रा (≤100 μL) के आईवीटी वितरण के लिए सर्जिकल प्रोटोकॉल का विवरण देता है।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल लिंकन विश्वविद्यालय पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे और अनुसंधान में जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए यूएस नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ दिशानिर्देशों और न्यूजीलैंड पशु कल्याण अधिनियम (1999) के अनुरूप हैं। बॉर्डरडेल भेड़ का निदान जन्म14 में किया गया था और लिंकन विश्वविद्यालय अनुसंधान खेतों में बनाए रखा गया था। तीन 3 महीने के होमोजीगस (सीएलएन 5-/-) ईव्स को बाईं आंख में एक आईवीटी इंजेक्शन मिला, जिसमें अनुपचारित दाईं आंख आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करती है। इलेक्ट्रोरेटिनोग्राफी और पैथोलॉजी डेटा की तुलना ऐतिहासिक स्वस्थ और प्रभावित नियंत्रण डेटा से की गई थी। इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया वायरल वेक्टर एक स्व-पूरक एडेनो-संबद्ध वायरस सीरोटाइप 9 था, जिसमें चिकन बीटा एक्शन (सीबीएच) प्रमोटर और कोडन-अनुकूलित ओविन सीएलएन 5 (एससीएएवी 9 / सीबीएच-ओसीएलएन 5ओपीटी) शामिल थे। वायरल वेक्टर उत्तरी कैरोलिना वेक्टर कोर विश्वविद्यालय, एनसी, यूएसए द्वारा प्रदान किया गया था।

1. प्रीसर्जरी

  1. सर्जिकल किट को ऑटोक्लेव करें (चित्रा 1)।
  2. सर्जरी से पहले भेड़ को 24 घंटे के लिए उपवास करें।
  3. सर्जरी से पहले लाइव वजन रिकॉर्ड करें।

Figure 1
चित्रा 1: इंट्राविट्रल सर्जरी किट। आईवीटी सर्जरी के लिए आवश्यक उपकरणों में (1) पलकों को खुला रखने के लिए एक स्पेकुलम और (2) बुलबार नेत्रश्लेष्मला को पकड़ने और आंख को घुमाने के लिए घुमावदार-नाक बल की एक जोड़ी शामिल है। (3) एक सीधी नाक हेमोस्टैट को एक वैकल्पिक उपकरण के रूप में भी शामिल किया जाता है ताकि बुलबार नेत्रश्लेष्मला को पकड़ा जा सके और आंख को जगह पर पकड़ लिया जा सके यदि यह आंख की कक्षा में वापस लुढ़क गया है। सर्जरी से पहले इस किट को आटोक्लेव किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. सर्जिकल प्रक्रिया

  1. जानवर को रोकें और इलेक्ट्रॉनिक क्लिपर का उपयोग करके, गले की नस पर गर्दन के एक तरफ से ऊन को शेव करें।
  2. जुगुलर नाली के आधार पर दबाव डालकर जुगुलर नस को अवरुद्ध करें और उभरी हुई नस की कल्पना करें।
  3. डायजेपाम (0.3 मिलीग्राम / किग्रा) और केटामाइन (7.5 मिलीग्राम / किग्रा) की उचित मात्रा को बाँझ सिरिंज में खींचें और बाँझ 20 ग्राम सुई संलग्न करें। सुई को जुगुलर नस में डालें और धीरे से प्लंजर पर वापस खींचें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि रक्त हब में प्रवेश करता है और सुई नस के अंदर है। एक बार पुष्टि होने के बाद, अंतःशिरा (जुगुलर) प्रशासन के माध्यम से प्रेरित करें।
  4. प्रेरण के तुरंत बाद, पशु को पृष्ठीय पुनरावृत्ति में रखें, गर्दन का विस्तार करें, और स्वरयंत्र की कल्पना करने के लिए लैरींगोस्कोप का उपयोग करके जीभ को ऊपर और आगे रखें। पशु के सांस छोड़ने पर मुखर डोरियों के बीच धीरे से एंडोट्राचेल ट्यूब (आकार 6.0-9.0 भेड़ के आकार के आधार पर) डालकर एंडोट्राचेल इंटुबैशन करें। एंडोट्राचेल कफ को तुरंत फुलाएं और निचले जबड़े के चारों ओर एक टाई के साथ ट्यूब को सुरक्षित करें। ट्यूब के माध्यम से हवा के प्रवाह की पुष्टि करें।
  5. भेड़ को सर्जिकल टेबल पर स्थानांतरित करें और इसे पार्श्व पुनरावृत्ति में रखें।
  6. 100% ऑक्सीजन में आइसोफ्लुरेन के वितरण के लिए एंडोट्राचेल ट्यूब को एनेस्थेटिक मशीन की नली से तुरंत कनेक्ट करें। प्रारंभ में 3% -4% आइसोफ्लुरेन के साथ शुरू करें और फिर रखरखाव के लिए 2% -3% तक कम करें। भेड़ के सहज वेंटिलेशन का निरीक्षण करें।
  7. पूरी प्रक्रिया में हृदय (पल्स) दर, श्वसन दर, ऑक्सीजन संतृप्ति, अंत-ज्वारीय सीओ2 स्तर और मलाशय शरीर के तापमान की निगरानी करें। एनेस्थेटाइज्ड भेड़ (चर, लेकिन मार्गदर्शन के रूप में उपयोग) में इन मापदंडों के लिए शारीरिक मूल्यों के लिए तालिका 1 देखें।
  8. सर्जिकल ऑपरेटिंग कार्ट पर एक बड़ा, बाँझ, चौकोर ड्रेप रखें, इसके बाद बाँझ उपकरण।
  9. इंजेक्शन लगाने के लिए आंख के ऊपर एक बाँझ, फेनेस्टेड सर्जिकल ड्रेप रखें।
  10. 1-5% पोविडोन-आयोडीन समाधान के साथ आंख की सिंचाई करने के लिए बाँझ 20 एमएल सिरिंज का उपयोग करके आंख को कीटाणुरहित करें।
  11. आंखों पर स्थानीय एनेस्थेटिक के रूप में 1-2 बूंदें एल्केन 0.5% डब्ल्यू / वी नेत्र समाधान लागू करें।
  12. आंख खुली रखने के लिए पलकों पर एक नोपा बैराकर-कोलिब्री आंख स्पेकुलम (10 मिमी) फिट करें।
  13. बल के साथ आंख के डोरसोलेटरल पहलू पर बुलबार नेत्रश्लेष्मला को पकड़ें, और आंखों के ग्लोब को वेंट्रोमेडियल रूप से घुमाएं।
सचेत एनेस्थेटाइज्ड अनुशंसित महत्वपूर्ण हस्तक्षेप बिंदु
हृदय गति (धड़कन / 50-80 (आराम) से 280 (सक्रिय) 50-80 <50, >100
श्वसन दर (सांस / 15-40 (आराम) से 350 (ओवरहीट) 10-30 <8, >40
ऑक्सीजन संतृप्ति (मिमी एचजी) 95-100 98-100 <90
अंत-ज्वारीय सीओ2 (मिमी एचजी) 35-45 35-45 >55
शरीर का तापमान (°C) 38.5-39.5 38.5-39.5 <36, >40

तालिका 1: एनेस्थेटाइज्ड भेड़ों में निगरानी किए जाने वाले मापदंडों के शारीरिक मूल्य।

3. वायरल तैयारी

  1. उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर एएवी वेक्टर एलिकोट स्टोर करें।
  2. सर्जरी के दिन, बर्फ पर आईवीटी डिलीवरी के लिए आवश्यक शीशियों की संख्या को पिघलाएं।
  3. प्रशासन से तुरंत पहले, वायरल वेक्टर एलिकोट और सेंट्रीफ्यूज को 400 × ग्राम पर 10 सेकंड के लिए सामग्री एकत्र करने के लिए भंवर।
  4. बाँझ-फ़िल्टर किए गए 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (PBS) में प्रत्येक वायरल वेक्टर एलिकोट को 100 μL की अंतिम मात्रा में वांछित खुराक तक पतला करें। बाँझ फ़िल्टर पिपेट युक्तियों का उपयोग करके बाँझ 1.5 mL कम-प्रोटीन-बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में वेक्टर कमजोर पड़ने की तैयारी करें। कीटाणुनाशक समाधान में वायरल वेक्टर के संपर्क में आने वाले सभी उपभोग्य पदार्थों का निपटान करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: मूल प्रकाशन15 में चिकित्सीय एजेंट (एएवी 9) की खुराक। CLN5) 1.9 x 1010 वायरल जीनोम था। अनुशंसित खुराक चिकित्सीय एजेंट के आधार पर अलग-अलग होगी; इसलिए, यहां प्रस्तुत मानक प्रोटोकॉल में एक खुराक शामिल नहीं किया गया है।
  5. एएवी वेक्टर तैयारी के पूरे 100 μL को एक बाँझ, कम-मृत स्थान 1 एमएल सिरिंज में खींचें, जिसमें तत्काल इंजेक्शन के लिए सुई में स्थायी रूप से संलग्न 28 G x 1/2 हो। सुनिश्चित करें कि तैयारी से इंजेक्शन तक का समय 2 मिनट से कम है।

4. वायरल प्रशासन

  1. सुई को आंख के पार्श्व पहलू पर श्वेतपटल से लगभग 7 मिमी पीछे डालें और लेंस से बचने के लिए पीछे की ओर कोण करें (चित्रा 2 और चित्रा 3)। रेटिना सतह को परेशान किए बिना रेटिना के जितना संभव हो सके 100 μL के एकल इंजेक्शन को रेटिना के करीब रखें।
  2. स्पेकुलम और ड्रेप को हटाने से पहले आंख को लगभग 10-15 एमएल 1-5% पोविडोन-आयोडीन समाधान के साथ धोएं, इसके बाद 10 एमएल खारा लें।
  3. यदि आवश्यक हो तो भेड़ को पलटें और दूसरी आंख से दोहराएं।

Figure 2
चित्र 2: नेत्र ग्लोब का वेंट्रोमेडियल रोटेशन। (A) इंजेक्शन के लिए आंख की डोरसोलेटरल सतह को उजागर करने के लिए बुलबार नेत्रश्लेष्मला को नॉनटूथेड फोर्सप्स के साथ समझें और (B) वेंट्रोमेडियल रूप से (यानी, नीचे और स्नूट की ओर) घुमाएं। संक्षिप्तरूप: V = उदर, D = पृष्ठीय, M = औसत दर्जे का, L = पार्श्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: इंजेक्शन स्थान और गहराई। सुई को आंखों के ग्लोब के डोरसोलेटरल पहलू पर इंजेक्ट किया जाता है, और सुई शाफ्ट की पूरी लंबाई (0.5 इंच / 12.7 मिमी) आंख में डाली जाती है। लेंस से बचने के लिए आंख के पीछे की ओर सुई के कोण पर ध्यान दें और जितना संभव हो सके रेटिना के करीब इंजेक्ट करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. पोस्टऑपरेटिव प्रबंधन

  1. प्रक्रिया के पूरा होने पर, आइसोफ्लुरेन गैस इनहेलेशन एनेस्थीसिया को रोकें, लाइन को 100% ऑक्सीजन के साथ फ्लश करें, नली को एंडोट्राचेल ट्यूब से डिस्कनेक्ट करें, और भेड़ को रिकवरी रूम में स्थानांतरित करें।
  2. भेड़ों को उरोस्थि में रखें, पैरों को नीचे रखें, और पूरी तरह से ठीक होने तक निगरानी करें। सुनिश्चित करें कि जानवर का मुंह किसी भी बाधा से मुक्त है।
  3. जब निगलने वाला रिफ्लेक्स देखा जाता है, तो आंशिक रूप से एंडोट्राचेल ट्यूब के कफ को कम करें और धीरे से ट्यूब को मुंह से हटा दें।
  4. पिछले अंग के बाइसेप्स फेमोरिस मांसपेशियों में एक इंट्रामस्क्युलर नॉनस्टेरॉइडल एंटी-इंफ्लेमेटरी का प्रबंधन करें, गर्दन के किनारे या कंधे के पीछे चमड़े के नीचे एंटीबायोटिक्स, और आंखों के ग्लोब की सतह पर 0.5% क्लोरैम्फेनिकॉल आंख की बूंदें।
  5. एक बार जब भेड़ बिना किसी सहायता के खड़ी हो सकती है तो पानी और भोजन (ल्यूसर्न छर्रों और भूसी) प्रदान करें।
  6. सर्जरी के बाद 7 दिनों के लिए प्रति दिन 2-3% क्लोरैम्फेनिकॉल आई ड्रॉप ्स 0.5% प्रशासित करें।
  7. सर्जरी के लगभग 24 घंटे बाद आउटडोर पैडॉक पर लौटने से पहले भेड़ को रात भर घर के अंदर रखें।
  8. 3 सप्ताह के लिए प्रतिदिन मलाशय के तापमान को रिकॉर्ड करें। नाड़ी या श्वसन दर, भोजन की खपत, न्यूरोबिहेवियर, शरीर का तापमान, वजन, मुद्रा, आंखों के स्वास्थ्य और बीमार स्वास्थ्य के नैदानिक संकेतों में किसी भी बदलाव के लिए निगरानी करें। यदि प्रतिकूल घटनाओं के कोई संकेत हैं तो उचित पशु चिकित्सा उपचार की तलाश करें।

6. विवो में प्रभावकारिता का आकलन

  1. यदि आईवीटी इंजेक्शन का लक्ष्य दृष्टि को संरक्षित करना है, तो रेटिना संरचना का आकलन करने के लिए रेटिना सेल फ़ंक्शन या ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (ओसीटी) का आकलन करने के लिए भूलभुलैया परीक्षण या इलेक्ट्रोरेटिनोग्राफी (ईआरजी) जैसे तरीकों से विवो में प्रभावकारिता की निगरानी करें।
    नोट: इन प्रभावकारिता उपायों को आईवीटी जीन थेरेपी 11,15,16 के बाद अच्छी तरह से वर्णित किया गया है।

7. पोस्टमॉर्टम ऊतक विश्लेषण

  1. इंट्राविट्रल इंजेक्शन सर्जरी के बाद उचित समापन बिंदु पर एक अनुमोदित विधि द्वारा भेड़ इच्छामृत्यु करें।
    नोट: सुझाए गए इच्छामृत्यु के तरीके, जैसे कि अंतःशिरा पशु चिकित्सा इच्छामृत्यु दवाएं या ग्रीवा रीढ़ के लिए एक मर्मज्ञ कैप्टिव बोल्ट के बाद तेजी से उत्सर्जन,कहीं और विस्तृत हैं।
  2. सर्जिकल तेज/कुंद घुमावदार कैंची का उपयोग करके भेड़ की आंखों के ग्लोब की कटाई करें। आंखों के सॉकेट खोलने को बढ़ाने के लिए पार्श्व और औसत दर्जे के कैंथस को काटें और फिर सॉकेट से आंखों के ग्लोब को मुक्त करने के लिए नेत्रश्लेष्मला सिलवटों, संयोजी ऊतक, मांसपेशियों और ऑप्टिक तंत्रिका के माध्यम से व्यवस्थित रूप से काट लें।
  3. विसर्जन-फिक्स बरकरार, 2 घंटे के लिए 10% फॉर्मलिन में एन्यूक्लिएटेड आई ग्लोब, इसके बाद 4 घंटे के लिए बौइन के घोल में पोस्टफिक्सेशन होता है, जिससे पर्याप्त छिड़काव की अनुमति देने के लिए श्वेतपटल में एक छोटा (0.5 सेमी) कट जाता है। वैकल्पिक रूप से, 48 घंटे के लिए डेविडसन के घोल में आंखों के ग्लोब को डुबोएं।
  4. नियमित पैराफिन मोम एम्बेडिंग और 3-5 μm पर सेक्शनिंग के माध्यम से आंखों के ऊतकों के प्रक्रिया अनुभाग।
    नोट: हेमेटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला करने और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए धुंधला प्रक्रियाओं को पहले15,16 वर्णित किया गया है।
  5. कुल रेटिना मोटाई, रेटिना परत मोटाई, बाहरी परमाणु परत सेलुलर पंक्तियों की गणना, और रेटिना सेल प्रकारों, रेटिना ग्लिया, या रुचि के प्रोटीन के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने जैसे उपायों द्वारा पोस्टमॉर्टम ऊतक में प्रभावकारिता का आकलन करें।
    नोट: इन विश्लेषणों के प्रोटोकॉल के लिए, पिछले प्रकाशन15,16 देखें।

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Representative Results

सीएलएन 5 एनसीएल के साथ भेड़ में रेटिना डिसफंक्शन और अपघटन को कम करने में सीएलएन 5 जीन थेरेपी वेक्टर के आईवीटी वितरण की प्रभावकारिता पहले इस शोध समूह15 द्वारा प्रदर्शित की गई है। प्रभावित भेड़ों को एएवी सीरोटाइप 9 (एएवी 9) वेक्टर (एएवी 9) वेक्टर (एएवी 9) में पैक किए गए सीएलएन 5 का एकल 100 μL IVT इंजेक्शन प्राप्त हुआ। CLN5) एक आंख में, विपरीत आंख एक अनुपचारित आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करती है। दृष्टि का मूल्यांकन इंजेक्शन (3 महीने) से अंत-चरण की बीमारी (18 महीने) की उम्र से मासिक रूप से किया गया था। रेटिना हिस्टोलॉजी का पोस्टमॉर्टम विश्लेषण इलाज और अनुपचारित आंखों के साथ-साथ उम्र से मेल खाने वाले स्वस्थ और सीएलएन 5-प्रभावित नियंत्रणों पर किया गया था।

इलेक्ट्रोरेटिनोग्राफी (ईआरजी) विश्लेषण ने इलाज की गई आंखों में संरक्षित रेटिना फ़ंक्शन का प्रदर्शन किया, जबकि अनुपचारित आंख में सीएलएन 5 प्रभावित जानवरों (चित्रा 4)15) के समान तरीके से गिरावट आई। रेटिना हिस्टोलॉजी को उपचारित आंखों में लगभग सामान्यीकृत किया गया था, जिसमें केंद्रीय रेटिना में स्वस्थ नियंत्रण जानवरों के बराबर कुल रेटिना मोटाई थी। इसके विपरीत, अनुपचारित रेटिना की मोटाई सीएलएन 5 प्रभावित जानवरों (चित्रा 5)15) के बराबर थी। लाइसोसोमल स्टोरेज, एनसीएल की एक हॉलमार्क पैथोलॉजिकल विशेषता, इलाज की गई आंख में नहीं देखी गई थी, लेकिन अनुपचारित आंख15 में मौजूद थी। इन परिणामों से पता चलता है कि आईवीटी इंजेक्शन के माध्यम से वितरित जीन थेरेपी वेक्टर सीएलएन 5-प्रभावित भेड़ आंखों में रोग रोगजनन को रोकने में सक्षम था। रेटिना तनाव और एस्ट्रोग्लिया के एक मार्कर ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) की अभिव्यक्ति, अनुपचारित आंखों की तुलना में इलाज की गई आंखों में कम थी, यह दर्शाता है कि उपचार के बाद रोग से संबंधित सूजन क्षीण हो गई थी (चित्रा 6)15)।

Figure 4
चित्रा 4: एएवी 9 के इंट्राविट्रल डिलीवरी के बाद सीएलएन 5-/- भेड़ की अंधेरे-अनुकूलित ईआरजी प्रतिक्रियाएं। CLN5. (ए) सीएलएन 5-/- भेड़ों की उपचारित (गहरे हरे, एन = 3) और अनुपचारित (हल्के हरे, एन = 3) आंखों में समय के साथ औसत (± एसईएम) ईआरजी आयाम, साथ ही स्वस्थ नियंत्रण (नीला, एन = 6) और सीएलएन 5-प्रभावित (लाल, एन = 6) भेड़। (बी) प्रतिनिधि ईआरजी उपचारित और अनुपचारित आंखों और स्वस्थ नियंत्रण ों से निशान और 5 (काली रेखा) और 17 (ग्रे लाइन) महीनों की उम्र में प्रभावित भेड़। * P < 0.05 इंगित करता है। यह आंकड़ा एल्सेवियर की अनुमति के साथ मरे एट अल .15 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। संक्षेप: ईआरजी = इलेक्ट्रोरेटिनोग्राफी; एएवी = एडेनो से जुड़े वायरस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: एएवी 9 के इंट्राविट्रल डिलीवरी के बाद सीएलएन 5-/- भेड़ की रेटिना मोटाई। CLN5. उम्र से मेल खाने वाले नियंत्रणों की तुलना में सीएलएन 5-/- भेड़ों की उपचारित और अनुपचारित आंखों में एच एंड ई हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन के प्रतिनिधि फोटोमाइक्रोग्राफ। छवियां और मोटाई माप दो स्थानों में लिए गए थे; केंद्रीय रेटिना (ए-ई) और परिधीय रेटिना (एफ-जे)। (E) स्वस्थ नियंत्रण (नीला, n = 4) और CLN5-प्रभावित (लाल, n = 4) रेटिना की तुलना में उपचारित (गहरे हरे, n = 3) और अनुपचारित (हल्के हरे, n = 3) आंखों के केंद्रीय रेटिना में औसत (± SEM) रेटिना मोटाई (μm)। (जे) स्वस्थ नियंत्रण और सीएलएन 5 प्रभावित रेटिना की तुलना में सीएलएन 5-/- भेड़ की उपचारित और अनुपचारित आंखों के परिधीय रेटिना में औसत (± एसईएम) रेटिना मोटाई (μm)। * P < 0.05 इंगित करता है, **** P < 0.0001 को इंगित करता है। स्केल सलाखों = 50 μm. यह आंकड़ा एल्सेवियर की अनुमति के साथ मरे एट अल .15 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। संक्षेप: एनएफएल = तंत्रिका फाइबर परत; जीसीएल = नाड़ीग्रन्थि कोशिका परत; आईपीएल = आंतरिक प्लेक्सीफॉर्म परत; आईएनएल = आंतरिक परमाणु परत; ओपीएल = बाहरी प्लेक्सीफॉर्म परत; ओएनएल = बाहरी परमाणु परत; आईएस / ओएस = फोटोरिसेप्टर के आंतरिक और बाहरी खंड; आरपीई = रेटिना वर्णक उपकला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: एएवी 9 के इंट्राविट्रल डिलीवरी के बाद सीएलएन 5-/- भेड़ के रेटिना में जीएफएपी की कमी। CLN5. नियंत्रण की तुलना में सीएलएन 5-/- भेड़ों की उपचारित और अनुपचारित आंखों में जीएफएपी की कमी की प्रतिनिधि कंफोकल छवियां। (ए-डी) जीएफएपी विकृति, (ई-एच) डीएपीआई परमाणु मार्कर, (आई-एल) दो चैनलों की छवियों को विलय कर दिया। स्केल बार = 20 μm। यह आंकड़ा एल्सेवियर की अनुमति के साथ मरे एट अल .15 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। संक्षेप: एनएफएल = तंत्रिका फाइबर परत; जीसीएल = नाड़ीग्रन्थि कोशिका परत; आईएनएल = आंतरिक परमाणु परत; ओएनएल = बाहरी परमाणु परत; आईएस / ओएस = फोटोरिसेप्टर के आंतरिक और बाहरी खंड; जीएफएपी = ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इंट्राविट्रल इंजेक्शन मानव नेत्र विज्ञान में सबसे आम शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में से एक है और भेड़ के रेटिना में एएवी-मध्यस्थता जीन थेरेपी देने में प्रभावी साबित हुआ है। हमने पहले एएवी 9 की प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया था। CLN5 जीन थेरेपी ने CLN5 NCL15 के साथ भेड़ में रेटिना डिसफंक्शन और अपघटन को कम करने में इंट्राविट्रल रूप से वितरित किया। उम्मीद है कि प्रशासन के इस मार्ग का मानव एनसीएल रोगियों तक अनुवाद भी फायदेमंद साबित होगा।

भेड़ की आंख में छोटी मात्रा वाले आईवीटी इंजेक्शन के लिए प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल और गैर-आक्रामक, आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और एक गैर-विशेषज्ञ के लिए सीखने में आसान है। सफलता रेटिना के भीतर लक्ष्य कोशिकाओं, चिकित्सा वितरित की जा रही है, और इंजेक्शन के स्थान और दिशा पर निर्भर करती है। यद्यपि आईवीटी इंजेक्शन को अक्सर आंतरिक रेटिना परतों को लक्षित करने में सबसे प्रभावी माना जाता है, कई शोधकर्ताओं ने उन बीमारियों में आईवीटी इंजेक्शन की प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है जहां बाहरी रेटिना रोग रोगजनन 15,17,18,19 का प्राथमिक स्थान है। आईवीटी इंजेक्शन के बाद कार्यात्मक और पैथोलॉजिकल परिणामों में अंतर भी दिए गए चिकित्सा के प्रकार से संबंधित है। उदाहरण के लिए, घुलनशील प्रोटीन (जैसे, सीएलएन 5) को एन्कोडिंग जीन देने के लिए जीन थेरेपी को इंट्रासेल्युलर या झिल्ली-बाध्य प्रोटीन (जैसे, सीएलएन 6) 15 को एन्कोडिंग करने वाले जीन को वितरित करने के लिए जीन थेरेपी की तुलना में बहुत अधिक प्रभावी दिखाया गया है। लक्ष्य और चिकित्सा के प्रकार के बावजूद, प्रभावकारिता को अधिकतम करने के लिए इंजेक्शन साइट और कोण को सही करना महत्वपूर्ण है। जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है, भेड़ के लिए इंजेक्शन साइट आंख के पार्श्व पहलू पर श्वेतपटल से लगभग 7 मिमी पीछे की ओर होनी चाहिए और पीछे के विट्रियस को लक्षित करने के लिए पीछे की ओर कोण होना चाहिए। सुई का एंगलिंग लेंस से बचने और इंजेक्शन वाली दवा को रेटिना के जितना संभव हो उतना करीब निर्देशित करने के लिए है। कम-मृत अंतरिक्ष सुई में स्थायी रूप से संलग्न 28 जी (या छोटे) एक्स 0.5 के साथ एक सुरक्षा सिरिंज का उपयोग इंजेक्शन से संबंधित असुविधा और सुई या हब में शेष मृत मात्रा को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस लंबाई की सुई को शल्य चिकित्सा माइक्रोस्कोप के बिना पीछे के कोण पर भेड़ की आंख में पूरी तरह से डाला जा सकता है और / या रेटिना को पंक्चर करने का खतरा होता है। जिन शोधकर्ताओं के पास सर्जिकल माइक्रोस्कोप तक पहुंच है, वे रेटिना व्यवधान से बचने के बारे में निश्चितता का एक अतिरिक्त स्तर प्रदान करने के लिए इसका उपयोग कर सकते हैं। अन्यथा, सुरक्षा सिरिंज का उपयोग करना और इलाज की जा रही उम्र में भेड़ की आंखों के ग्लोब के आयामों के बारे में जागरूक होना इस प्रक्रियाको सुरक्षित रूप से करने के लिए पर्याप्त है।

आंख को घुमाने और इंजेक्शन साइट को उजागर करने के लिए आंख को पकड़ते समय, आंख के नाजुक ऊतक को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए नॉनटूथेड एट्रोमेटिक उपकरणों का उपयोग करना आवश्यक है। यदि आंख को केंद्रीय रूप से तैनात किया जाता है, तो श्वेतपटल और आईरिस की सीमा पर बुलबार नेत्रश्लेष्मला को पकड़ना और दूसरे हाथ से इंजेक्शन लगाते समय एक हाथ से घूमना अपेक्षाकृत सरल है। हालांकि, अगर आंख ऑफ-सेंटर घूम गई है, जो सामान्य संज्ञाहरण के तहत हो सकती है, तो अक्सर बुलबार नेत्रश्लेष्मला पर क्लैंप करने और आंख को स्थिति में घुमाने के लिए हेमोस्टैट का उपयोग करना आवश्यक होता है, जिससे प्रक्रिया को जारी रखने के लिए हेमोस्टैट को छोड़ दिया जाता है।

ओवीन सीएलएन 5 ले जाने वाले एएवी 9 के साथ आईवीटी उपचार के बाद भेड़ की आंखें मजबूत और अच्छी तरह से ठीक हो जाती हैं, इंजेक्शन15 के 1 सप्ताह बाद इलाज की गई आंखों में केवल एक भेड़ यूवाइटिस विकसित करती है। इस मामले में, यूवाइटिस 1 सप्ताह के भीतर हल हो गया और दृष्टि पर कोई दीर्घकालिक प्रभाव नहीं पड़ा। इस एक मामले के अलावा, पहले प्रकाशित अध्ययन15 में आईवीटी इंजेक्शन का कोई नकारात्मक प्रभाव नहीं बताया गया था, या अनुसंधान कार्यक्रम में >30 अतिरिक्त जानवरों को यहां वर्णित प्रोटोकॉल के बाद 3 महीने, 6 महीने या 9 महीने की उम्र में इंजेक्ट किया गया था। हालांकि, इंजेक्शन सुरक्षा के अतिरिक्त मात्रात्मक उपाय हैं जिन्हें शोधकर्ता अपने पोस्टऑपरेटिव आकलन में जोड़ने पर विचार करना चाह सकते हैं। इंजेक्शन से पहले और बाद में फंडस की छवियां इस बात पर प्रकाश डाल सकती हैं कि क्या इंजेक्शन के कारण रेटिना में कोई व्यवधान हुआ है और लंबी अवधि में, सामान्य रूप से रेटिना स्वास्थ्य का अवलोकन प्रदान कर सकते हैं।

उस मामले में जहां एक फ्लोरोसेंट मार्कर इंजेक्ट किया जाता है, फंडस की फ्लोरेसेंस इमेजिंग इंजेक्शन मार्कर16,20 के प्रसार की कल्पना करने में सहायता कर सकती है। ओसीटी का उपयोग विवो में क्रॉस सेक्शन में रेटिना की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है ताकि इंजेक्शन के बाद किसी भी संभावित संरचनात्मक क्षति की पहचान की जा सके और उपचार के जवाब में समय के साथ रेटिना की मोटाई को मापा जा सके। पोस्ट-इंजेक्शन दृश्य समारोह का मूल्यांकन ईआरजी या भूलभुलैया परीक्षण15,16 द्वारा भी किया जा सकता है। आईवीटी वायरल-मध्यस्थता जीन थेरेपी के मामले में, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रभाव और एएवी वैक्टर के एंटीबॉडी को बेअसर करने की उपस्थिति पर विचार किया जाना चाहिए। यद्यपि भेड़ के लिए यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल का हिस्सा नहीं है, यह सुझाव दिया जाता है कि जीन थेरेपी से पहले एंटी-एएवी न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी की उपस्थिति के लिए विषयों का परीक्षण किया जाता है, प्रशासन के मार्ग की परवाह किए बिना, पारगमन दक्षता16,21 को बढ़ाने के लिए। पाठकों को व्हाइटहेड एट अल.22 द्वारा एएवी के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के मुद्दे की अधिक व्यापक चर्चा के लिए संदर्भित किया जाता है।

आईवीटी प्रक्रियाओं के दौरान एक आम जटिलता सबकॉन्जक्टिवल हेमरेज (एससीएच) 23 है, जो तब हो सकती है जब सुई डालने के दौरान बुलबार नेत्रश्लेष्मला में केशिकाएं पंचर हो जाती हैं। सौभाग्य से, एससीएच आम तौर पर हानिरहित है और कुछ दिनों के भीतर हल हो जाता है; हालांकि, सुई डालते समय नेत्रश्लेष्मला केशिकाओं से बचना सबसे अच्छा है। आईवीटी इंजेक्शन के बाद, एंटीबायोटिक आई ड्रॉप (जैसे, क्लोरैम्फेनिकॉल) के साथ इंजेक्शन आंखों का इलाज करना और संक्रमण या सूजन (यूवाइटिस) के किसी भी लक्षण के लिए आंखों की निगरानी करना महत्वपूर्ण है। आईवीटी प्रक्रियाओं के दौरान एक और आम घटना आईओपी में वृद्धि है। ये वृद्धि इंजेक्शन के बाद के मिनटों में दबाव में सबसे अधिक क्षणिक स्पाइक्स हैं और24,25 तक चलने वाली कोई लंबे समय तक चलने वाली क्षति का कारण नहीं बनती हैं। हालांकि, ऐसे मामले हैं जहां आईओपी पर विचार किया जाना चाहिए और निगरानी की जानी चाहिए। जब ग्लूकोमा जैसी पहले से मौजूद ओकुलर स्थितियां मौजूद होती हैं, या जब उच्च मात्रा (≥100 μL) को इंजेक्ट किया जा रहा है, तो आईओपी की बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए, और रोगनिरोधी पूर्वकाल कक्ष पैरासेंटेसिस को आंखों के ग्लोब 4,16 में दबाव को कम करने के लिए माना जाना चाहिए। इसके अलावा, बार-बार आईवीटी इंजेक्शन के मामले में आईओपी में बार-बार स्पाइक्स एक चिंता का विषय हो सकता है औरइसे 4 से ऊपर के रूप में क्षीण किया जाना चाहिए। यहां, हम एकल एएवी-मध्यस्थता जीन थेरेपी के प्रयोजनों के लिए आईवीटी का प्रदर्शन कर रहे हैं; इसलिए, बार-बार इंजेक्शन के दीर्घकालिक परिणाम एक प्रमुख विचार नहीं हैं।

आईवीटी इंजेक्शन की सीमाओं में शारीरिक बाधाओं को भेदने की आवश्यकता और अधिक आक्रामक तरीकों की तुलना में कम लक्ष्य विशिष्टता शामिल है। सबसे पहले, इंजेक्शन वाले पदार्थ को विट्रियस में पतला किया जाएगा और फिर विट्रस गुहा और रेटिना ऊतक के माध्यम से लक्ष्य कोशिकाओं तक फैलने की दूरी होगी। इसका मतलब यह है कि आईवीटी इंजेक्शन के बाद आंतरिक रेटिना बाहरी रेटिना की तुलना में अधिक आसानी से ट्रांसड्यूस होता है, और कमजोर पड़ने का मुकाबला करने के लिए उच्च खुराक की आवश्यकता हो सकतीहै। यहां वर्णित प्रोटोकॉल रेटिना के करीब इंजेक्शन लगाने के महत्व पर जोर देता है ताकि विट्रियस शरीर के माध्यम से कमजोर पड़ने और प्रसार के प्रभावों को कम किया जा सके। इसलिए, 0.5 इंच / 12.7 मिमी सुई शाफ्ट की पूरी लंबाई आंख में डाली जाती है। पूर्ण सुई की लंबाई डालने का अतिरिक्त लाभ इंजेक्शन 4,27 के दौरान द्रव रिफ्लक्स की कम संभावना है।

यद्यपि यह वर्तमान प्रोटोकॉल इसे छोड़ देता है, लेकिन द्रव रिफ्लक्स की संभावना को और कम करने के लिए इंजेक्शन के बाद कई मिनटों के लिए सुई को हटाने में देरी करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, इंजेक्शन को धीरे-धीरे यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि इंजेक्शन तरल पदार्थ का जेट रेटिना को बाधित नहीं करता है या आईओपी में तेजी से स्पाइक का कारण नहीं बनता है, और इंजेक्शन की बढ़ी हुई गतिविट्रस 28,29 के माध्यम से प्रसार दर को प्रभावित नहीं करती है। आंतरिक सीमित झिल्ली (आईएलएम) विट्रियस और रेटिना के बीच प्राथमिक बाधा है, जो रेटिना30 में अणुओं के आंदोलन को प्रतिबंधित करने का कार्य करती है। हालांकि, आईएलएम की पारगम्यता पाचन या सर्जिकल छीलने से बढ़ सकती है और रोगग्रस्त आंखों में बढ़ने की संभावना है, जिससे चिकित्सीय अणुओं का प्रवेश आसान हो जाता है।

लक्ष्य विशिष्टता के संबंध में, आईवीटी प्रशासन में अन्य इंट्राओकुलर मार्गों जैसे सबरेटिनल और सुप्राकोरॉइडल की तुलना में सबसे कम है, जैसा कि ऊपर और कहीं और चर्चा की गईहै। हालांकि, एएवी की नई पीढ़ियों को नियमित रूप से संशोधनों को शामिल करने के लिए विकसित किया जा रहा है, जो विशेष सेल प्रकारों को लक्षित करते हैं या आईएलएम31 जैसी बाधाओं को अधिक कुशलता से दूर करते हैं। इस तरह के संशोधित कैप्सिड्स के उपयोग ने कई मॉडल प्रजातियों 5,32,33 में आईवीटी प्रशासन के बाद पारगमन दक्षता में वृद्धि की है।

मरे एट अल.15 द्वारा विस्तृत जीन थेरेपी का उद्देश्य सीएलएन 5 जीन की एक कार्यात्मक प्रतिलिपि प्रदान करना था; इसलिए, प्रभावकारिता का एक उपाय सीएलएन 5 प्रोटीन को व्यक्त करने वाली ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं की उपस्थिति है। हमने रेटिना में सीएलएन 5-ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करने का प्रयास किया है, जैसा कि हम नियमित रूप से भेड़ के मस्तिष्क के ऊतकों में करते हैं; हालांकि, एंटीबॉडी जो हम आमतौर पर मुक्त-फ्लोटिंग मस्तिष्क ऊतक में उपयोग करते हैं, पैराफिन-एम्बेडेड रेटिना ऊतक में काम नहीं करता है। प्रभावकारिता के आकलन में जोड़ने के लिए रेटिना में रुचि के जीन या प्रोटीन का पता लगाने के वैकल्पिक तरीकों का निवारण और जांच चल रही है। इसे प्राप्त करने का एक संभावित तरीका एक वायरल वेक्टर को इंजेक्ट करना है जिसमें एक रिपोर्टर जीन (जैसे हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन; GFP) और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से जीएफपी अभिव्यक्ति का आकलन करना। प्रभावकारिता का आकलन करने का एक और तरीका ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन करने के लिए मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग कर रहा है।

बड़े जानवरों में आईवीटी इंजेक्शन के लिए प्रोटोकॉल विकसित करना रेटिना के अपक्षयी रोगों, विशेष रूप से आनुवंशिक घटक के साथ बीमारियों के इलाज की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि आईवीटी जीन थेरेपी एक आशाजनक संभावित चिकित्सीय है। अपक्षयी रोगों के लिए जहां रेटिना पहले से ही नाजुक है, आईवीटी उपचार से रेटिना डिटेचमेंट या आंसू का खतरा कम होता है। भेड़ और मानव आंखों के आकार और संरचना में समानता को देखते हुए, भेड़ में आईवीटी इंजेक्शन की खुराक और मात्रा को अनुकूलित करना क्लिनिक में अनुवाद की दिशा में एक प्रासंगिक कदम है। यह पेपर भेड़ की आंख में आईवीटी इंजेक्शन के लिए प्रोटोकॉल का विवरण देता है, जो सुरक्षित है और ओकुलर भड़काऊ प्रतिक्रियाओं की बहुत कम दर दिखाता है। यह विधि भेड़ में एनसीएल के रेटिना घटक को संबोधित करने के लिए एएवी 9-मध्यस्थता ओकुलर जीन थेरेपी की प्रभावकारिता को भी प्रदर्शित करती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

स्टीव हीप (बीवीएससी, सर्टवीओफ्थल) को इस प्रोटोकॉल को स्थापित करने और मरे एट अल.15 द्वारा वर्णित इंजेक्शन का प्रदर्शन करने में उनकी सहायता के लिए स्वीकार करना चाहते हैं। लेखक क्योरकिड्स न्यूजीलैंड, कैंटरबरी मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, न्यूरोजीन इंक और बैटन डिजीज सपोर्ट एंड रिसर्च एसोसिएशन से वित्त पोषण को भी स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle Fisher Scientific, Auckland, New Zealand 05-561-28 Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar
1.5 mL microcentrifuge tube Sigma Aldrich HS4323 Autoclave tubes to sterilise prior to use
Anesthesia machine with gas bench and monitor  Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand
Antibiotic eye drops  Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol)
BrightMount plus anti-fade mounting medium Abcam, Cambridge, United Kingdom ab103748
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States 10236276001
Diazepam sedative Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand 5 mg/mL
Endotracheal tubes Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size
Eye speculum Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand KP151/14 Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)
Fenestrated surgical drape Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand DI583 Or similar 
Filter Tips Interlab, Auckland, New Zealand 10, 200, and 1,000 µL 
Formaldehyde solution (37%) Fisher Scientific, Auckland, New Zealand AJA809-2.5PL Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 Invitrogen Carlsbad, CA, USA  A-11012 Use at a dilution of 1:500
Isoflurane anesthetic Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand
Ketamine HCl anesthetic/analgesic PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand 100 mg/mL
Laryngoscope (veterinary) KaWe Medical, Denmark Miller C blade, size 2
Needles  Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand 302025 BD Hypodermic Needles, or similar
Non-steroidal anti-inflammatory Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand 49402/008 Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)
Non-toothed forceps Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand AB864/16 Or similar 
Non-toothed hemostat Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand AA150/12 Or similar 
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand 16210072
Oxygen (medical) BOC Gas, Christchurch, New Zealand D2 cylinder, gas code 180
Phosphate buffered saline  Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand 10010023 Sterile, filtered
Povidone-Iodine solution Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand 005835 Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine)
Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) Dako, Glostrup, Denmark Z0334 Use at a dilution of 1:2,500
Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 University of North Carolina Vector Core, NC, USA. scAAV9/CBh-oCLN5opt
Sodium Chloride 0.9% IV Solution Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand AHB1322 Commercial name: Saline solution 
Subcutaneous antibiotics Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin)
Surgical sharp blunt curved scissors  Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand SSSHBLC130
Terumo Syringe Luer Lock Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand SH159/SH160 Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline
Virkon Disinfectant Powder EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ 28461115

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चिकित्सा अंक 185
ओविन आई में इंट्राविट्रल इंजेक्शन
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Murray, S. J., Mitchell, N. L.… More

Murray, S. J., Mitchell, N. L. Intravitreal Injections in the Ovine Eye. J. Vis. Exp. (185), e63823, doi:10.3791/63823 (2022).

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