Summary
Intravitreale injeksjoner ble utført i sauøyet med sikte på å levere virusmediert genterapi til netthinnen.
Abstract
Det finnes flere metoder for levering av terapeutiske midler til netthinnen, inkludert intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periokulær eller aktuell administrering. IVT-legemiddellevering innebærer en injeksjon i øyets glasslegeme, en gelatinøs substans som fyller øyets bakre kammer og opprettholder øyets form. Selv om IVT-ruten er mindre spesifikt målrettet enn subretinal levering, er den mye mindre invasiv og brukes mye i kliniske omgivelser for en rekke okulære sykdommer.
Vi har tidligere vist effekten av intravitreal tilførsel av et adenoassosiert virus (AAV)-mediert genterapiprodukt (AAV9). CLN5) hos sauer med en naturlig forekommende CLN5-form av nevronal ceroid lipofuscinose (NCL). Berørte sauer fikk IVT-genterapi i det ene øyet, mens det andre ubehandlede øyet fungerte som en intern kontroll. Retinal struktur og funksjon ble opprettholdt i det behandlede øyet opptil 15 måneder etter behandling, mens det ubehandlede øyet viste gradvis fallende funksjon og alvorlig atrofi under postmortemundersøkelse. Basert på sauestudiene ble CLN5-genterapiproduktet klarert som et kandidatutprøvingsmiddel (IND) av USA Food and Drug Administration i september 2021. Dette papiret beskriver den kirurgiske protokollen for IVT-levering av en terapeutisk viral vektor til saueøyet.
Introduction
Flere metoder kan brukes til å levere terapeutiske midler til netthinnen, inkludert intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periokulær eller aktuell administrering. Hver administrasjonsvei innebærer å overvinne barrierer som blod-retina-barrieren eller de indre og ytre begrensende membranene og har varierende effektivitetshastigheter avhengig av stoffet som leveres og det spesifikke retinale målet 1,2.
IVT-legemiddellevering innebærer en injeksjon i øyets glasslegeme, en gelatinøs substans som opptar øyets bakre kammer. Den primære funksjonen til glasslegemet er å opprettholde formen på øyekloden og holde okulært vev, som linsen og netthinnen, på plass. Glasslegemet består i stor grad av vann, med små mengder kollagen, hyaluronsyre og andre ikke-kollagenøse proteiner3. IVT-injeksjon er en enkel og vanlig prosedyre som brukes rutinemessig til å behandle et bredt spekter av okulære tilstander, inkludert aldersrelatert makuladegenerasjon, diabetisk makulært ødem, diabetisk retinopati, retinal vene okklusjon og flere arvelige retinale dystrofier 4,5.
Neuronal ceroid lipofuscinoses (NCL; Batten sykdom) er en gruppe dødelige lysosomale lagringssykdommer som forårsaker alvorlig degenerasjon av hjernen og netthinnen. Det er for tiden 13 kjente varianter av NCL som følge av mutasjoner i forskjellige gener (CLN1-8, CLN10-14) som hovedsakelig påvirker barn, men har varierende debutalder og sykdomsalvorlighetsgrad6. NCLs deler vanlige progressive symptomer, inkludert kognitiv og motorisk tilbakegang, anfall og tap av syn. Det finnes ingen kur mot NCL; Imidlertid er hjernestyrt enzymutskiftningsterapi for tiden i kliniske studier for CLN2 sykdom7,8, og AAV-mediert genterapi har vist stort løfte i prekliniske studier, med en klinisk studie for CLN5 genterapi forventet å begynne i 2022 9,10.
Mange andre arter utvikler naturlig forekommende former for NCL, inkludert katter, hunder, sauer og kyr. To sauemodeller av NCL er for tiden under aktiv studie i New Zealand: en CLN5 sykdomsmodell i Borderdale sauer og en CLN6 sykdomsmodell i South Hampshire sauer. Berørte sauer utviser mange av de kliniske og patologiske egenskapene til den menneskelige sykdommen, inkludert retinal atrofi og tap av syn10,11. Selv om hjernestyrt CLN5-genterapi hos sauer med CLN5-sykdom kan forhindre eller stoppe hjerneatrofi og klinisk tilbakegang, mister de behandlede sauene fortsatt synet9. Dette fremhevet behovet for å behandle netthinnen for å bevare synet og opprettholde en bedre livskvalitet, noe som førte til etablering av en protokoll for okulær genterapi hos sau.
Sauøyet representerer en god modell av det menneskelige øye på grunn av dets likhet i øyeklodens dimensjoner, glasslegemevolum og retinalstruktur10,12,13. Dette papiret beskriver den kirurgiske protokollen for IVT-levering av et lite volum (≤100 μL) terapeutisk viral vektor til saueøyet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av Lincoln University Animal Ethics Committee og er i tråd med US National Institutes of Health retningslinjer for omsorg og bruk av dyr i forskning og New Zealand Animal Welfare Act (1999). Borderdale sauer ble diagnostisert ved fødselen14 og vedlikeholdt ved Lincoln University forskningsgårder. Tre 3 måneder gamle homozygote (CLN5-/-) søyer fikk en enkelt IVT-injeksjon på venstre øye, med det ubehandlede høyre øyet som en intern kontroll. Elektroretinografi og patologidata ble sammenlignet med historiske sunne og berørte kontrolldata. Virusvektoren som ble brukt i denne studien var et selvkomplementært adenoassosiert virus serotype 9, som inneholdt kyllingbeta-virkningen (CBh) promotor og kodonoptimalisert sau CLN5 (scAAV9 / CBh-oCLN5opt). Virusvektoren ble levert av University of North Carolina Vector Core, NC, USA.
1. Prekirurgi
- Autoklav kirurgisk sett (figur 1).
- Rask sauene i 24 timer før operasjonen.
- Ta opp live vekter før operasjonen.
Figur 1: Intravitreal kirurgi kit. Instrumenter som kreves for IVT-kirurgi inkluderer (1) et spekulum for å holde øyelokkene åpne og (2) et par buede nese tang for å gripe bulbar konjunktivene og rotere øyet. (3) En rett nesehemostat er også inkludert som et alternativt instrument for å gripe bulbar konjunktivene og holde øyet på plass hvis det har rullet tilbake i øyets bane. Dette settet er autoklavert før operasjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Kirurgisk prosedyre
- Hold dyret og barber ullen fra den ene siden av nakken over jugularvenen ved hjelp av elektroniske klippere.
- Okkludere jugularvenen ved å påføre trykk ved foten av jugularsporet og visualiser den hevede venen.
- Trekk opp riktig mengde diazepam (0,3 mg/kg) og ketamin (7,5 mg/kg) i en steril sprøyte og fest en steril 20 G kanyle. Stikk nålen inn i vena jugularis og trekk forsiktig tilbake på stempelet for å sikre at blod kommer inn i navet og nålen er inne i venen. Når bekreftet, indusere gjennom intravenøs (jugulær) administrasjon.
- Umiddelbart etter induksjon, legg dyret i dorsal recumbency, forleng nakken og hold tungen opp og fremover, ved hjelp av et laryngoskop for å visualisere strupehodet. Utfør endotrakeal intubasjon ved forsiktig å sette inn et endotrakealrør (størrelse 6,0-9,0 avhengig av sauens størrelse) mellom stemmebåndene når dyret puster ut. Oppblås endotrakealmansjetten umiddelbart og fest røret med et slips rundt underkjeven. Bekreft luftstrømmen gjennom røret.
- Overfør sauene til operasjonsbordet og legg det i lateral recumbency.
- Koble umiddelbart endotrakealrøret til slangene på bedøvelsesmaskinen for levering av isofluran i 100% oksygen. Start først med 3% -4% isofluran og reduser deretter til 2% -3% for vedlikehold. Vær oppmerksom på spontan ventilasjon av sauene.
- Overvåk hjertefrekvens (puls), respirasjonsfrekvens, oksygenmetning, end-tidal CO2-nivåer og rektal kroppstemperatur gjennom hele prosedyren. Se tabell 1 for fysiologiske verdier for disse parametrene hos bedøvet sau (variabel, men bruk som veiledning).
- Plasser en stor, steril, firkantet drapering på en kirurgisk operasjonsvogn, etterfulgt av de sterile instrumentene.
- Plasser en steril, fenestrert kirurgisk drapering over øyet som skal injiseres.
- Desinfiser øyet aseptisk ved hjelp av en steril 20 ml sprøyte for å irrigere øyet med 1-5% povidon-jodoppløsning.
- Påfør 1-2 dråper Alcaine 0,5% W / V oftalmisk løsning, som lokalbedøvelse, til øyet.
- Monter et Nopa Barraquer-Colibri øyespekulum (10 mm) på øyelokkene for å holde øyet åpent.
- Ta tak i bulbar konjunktivene på det dorsolaterale aspektet av øyet med tang, og roter øyekulen ventromedialt.
| Bevisst | Bedøvet | Anbefalt kritisk intervensjonspunkt | |
| Hjertefrekvens (slag/min) | 50-80 (hvile) til 280 (aktiv) | 50-80 | <50, >100 |
| Respirasjonsfrekvens (pust/min) | 15-40 (hvile) til 350 (overopphetet) | 10-30 | <8, >40 |
| Oksygenmetning (mm Hg) | 95-100 | 98-100 | <90 |
| Endetidal CO2 (mm Hg) | 35-45 | 35-45 | >55 |
| Kroppstemperatur (°C) | 38.5-39.5 | 38.5-39.5 | <36, >40 |
Tabell 1: Fysiologiske verdier av parametere som skal overvåkes hos bedøvede sauer.
3. Viral forberedelse
- Oppbevar AAV vektor aliquots ved −80 °C til bruk.
- På operasjonsdagen, tine det nødvendige antall hetteglass for IVT-levering på is.
- Umiddelbart før administrering virvler virusvektoren aliquot og sentrifuge ved 400 × g i 10 s for å samle innholdet.
- Fortynn hver viral vektor aliquot i sterilt filtrert 1x fosfatbufret saltvann (PBS) til ønsket dose i et endelig volum på 100 μL. Klargjør vektorfortynninger i et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør med lav proteinbinding ved bruk av sterile filterpipettespisser. Kast alle forbruksvarer som har vært i kontakt med virusvektoren i desinfeksjonsmiddelløsning (se materialtabellen).
MERK: I den opprinnelige publikasjonen15 dosen av terapeutisk middel (AAV9. CLN5) var 1,9 x 1010 virusgenomer. Den anbefalte dosen vil variere avhengig av terapeutisk middel som administreres; Derfor er en dose ikke inkludert i standardprotokollen som presenteres her. - Trekk hele 100 μL av AAV vektorpreparatet inn i en steril, lavt dødt rom 1 ml sprøyte med en permanent påsatt kanyle på 28 G x 1/2 for umiddelbar injeksjon. Sørg for at tiden fra forberedelse til injeksjon er mindre enn 2 minutter.
4. Viral administrasjon
- Stikk kanylen ca. 7 mm bakre til sklera på øyets laterale side og vinklet bakre for å unngå linsen (figur 2 og figur 3). Administrer enkeltinjeksjonen på 100 μL som en bolus så nær netthinnen som mulig uten å forstyrre retinaloverflaten.
- Skyll øyet med ca. 10-15 ml 1-5% povidon-jodoppløsning etterfulgt av 10 ml saltvann før fjerning av spekulum og drapering.
- Snu sauen og gjenta med det andre øyet om nødvendig.
Figur 2: Ventromedial rotasjon av øyekloden . (A) Ta tak i bulbar konjunktiv med nontoothed tang og (B) roter ventromedialt (dvs. ned og mot snuten) for å eksponere den dorsolaterale overflaten av øyet for injeksjon. Forkortelser: V = ventral, D = dorsal, M = medial, L = lateral. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Innsprøytingssted og dybde. Nålen injiseres på det dorsolaterale aspektet av øyekulen, og nålakselens fulle lengde (0,5 tommer / 12,7 mm) settes inn i øyet. Legg merke til nålens vinkel mot øyets bakside for å unngå linsen og injiser så nær netthinnen som mulig. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Postoperativ ledelse
- Når prosedyren er fullført, må du stoppe isoflurangassinhalasjonsanestesien, skylle ledningen med 100 % oksygen, koble slangen fra endotrakealrøret og overføre sauene til postoperativ avdeling.
- Plasser sauene i sternal recumbency, med bena gjemt under, og overvåke til full gjenoppretting. Sørg for at dyrets munn er fri for hindringer.
- Når svelgningsrefleksen observeres, deflaterer du delvis mansjetten på endotrakealrøret og fjerner røret forsiktig fra munnen.
- Administrer en intramuskulær ikke-steroide antiinflammatorisk i biceps femorismuskelen i bakbenet, subkutane antibiotika på siden av nakken eller bak skulderen, og 0,5% kloramfenikol øyedråper til overflaten av øyekloden.
- Gi vann og mat (lucerne pellets og agner) når sauene kan stå uten hjelp.
- Administrer 0,5% kloramfenikol øyedråper 2-3 per dag i 7 dager etter operasjonen.
- Hold sauene innendørs over natten før du returnerer til utendørs paddock ca 24 timer etter operasjonen.
- Ta opp rektaltemperaturer daglig i 3 uker. Overvåk for eventuelle endringer i puls eller respirasjonsfrekvens, matforbruk, neurobehavior, kroppstemperatur, vekt, holdning, øyehelse og kliniske tegn på dårlig helse. Søk passende veterinærbehandling hvis det er indikasjoner på bivirkninger.
6. Vurdering av effekt in vivo
- Hvis målet med IVT-injeksjonen er å bevare synet, må du overvåke effekten in vivo ved hjelp av metoder som labyrinttesting eller elektroretinografi (ERG) for å vurdere retinalcellefunksjon eller optisk koherenstomografi (OCT) for å vurdere retinal struktur.
MERK: Disse effektmålene er godt beskrevet etter IVT-genterapi11,15,16.
7. Postmortem vevsanalyse
- Utfør saue-eutanasi ved en godkjent metode ved et passende endepunkt etter intravitreal injeksjonskirurgi.
MERK: Foreslåtte eutanasimetoder, for eksempel intravenøse veterinære eutanasimedisiner eller en penetrerende fangebolt til livmorhalsen etterfulgt av rask ekssanguinasjon, er detaljert andre steder15,16. - Høst saueøyekuler ved hjelp av kirurgisk skarp / stump buet saks. Klipp lateral og medial canthus for å øke øyekontaktåpningen og deretter systematisk kutte gjennom konjunktivfoldene, bindevevet, musklene og optisk nerve for å frigjøre øyekulen fra stikkontakten.
- Immersion-fix intakte, enukleerte øyekuler i 10% formalin i 2 timer, etterfulgt av postfiksering i Bouins løsning i 4 timer, noe som gjør et lite (0,5 cm) kutt i sclera for å tillate tilstrekkelig perfusjon. Alternativt kan du senke øyekulene i Davidsons løsning i 48 timer.
- Behandle seksjoner av øyevev via rutinemessig innebygging av parafinvoks og seksjonering ved 3-5 μm.
MERK: Fargingsprosedyrer for farging av hematoksylin og eosin (H&E) og immunhistokjemisk analyse er tidligere beskrevet15,16. - Vurder effekten i postmortemvev ved tiltak som total retinal tykkelse, retinal lagtykkelse, telling av ytre nukleære lag cellulære rader og immunhistokjemisk farging for retinale celletyper, retinal glia eller proteiner av interesse.
MERK: For protokoller for disse analysene, se tidligere publikasjoner15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekten av IVT-levering av en CLN5-genterapivektor ved dempende retinal dysfunksjon og degenerasjon hos sau med CLN5 NCL er tidligere demonstrert av denne forskningsgruppen15. Affiserte sauer fikk en enkelt 100 μL IVT-injeksjon av CLN5 pakket i en AAV serotype 9 (AAV9) vektor (AAV9. CLN5) inn i det ene øyet, med det kontralaterale øyet som en ubehandlet internkontroll. Synet ble vurdert månedlig fra injeksjonsalder (3 måneder) til endestadiumsykdom (18 måneder). Postmortemanalyse av retinal histologi ble utført på behandlede og ubehandlede øyne, samt alderstilpassede friske og CLN5-berørte kontroller.
Elektroretinografianalyse (ERG) viste bevart retinal funksjon i det behandlede øyet, mens det ubehandlede øyet falt på samme måte som CLN5-affiserte dyr (figur 4)15. Retinal histologi ble nesten normalisert i det behandlede øyet, med en total retinal tykkelse sammenlignbar med friske kontrolldyr i den sentrale netthinnen. Derimot var tykkelsen på den ubehandlede netthinnen sammenlignbar med CLN5-affiserte dyr (figur 5)15. Lysosomal lagring, et karakteristisk patologisk trekk ved NCL, ble ikke observert i det behandlede øyet, men var tilstede i det ubehandlede øyet15. Disse resultatene viser at genterapivektoren levert via IVT-injeksjon var i stand til å stoppe sykdomspatogenesen i det CLN5-berørte sauøyet. Uttrykket av glial fibrillært surt protein (GFAP), en markør for retinal stress og astroglia, var lavere i behandlede øyne enn i ubehandlede øyne, noe som indikerer at sykdomsassosiert betennelse ble dempet etter behandling (figur 6)15.
Figur 4: Mørktilpasset ERG-respons av CLN5-/- sau etter intravitreal tilførsel av AAV9. CLN5. (A) Gjennomsnittlige (± SEM) ERG-amplituder over tid hos de behandlede (mørkegrønne, n = 3) og ubehandlede (lysegrønne, n = 3) øynene til CLN5-/- sau, samt sunn kontroll (blå, n = 6) og CLN5-affisert (rød, n = 6) sau. (B) Representative ERG-spor fra behandlede og ubehandlede øyne og sunne kontroller og berørte sauer ved 5 (svart linje) og 17 (grå linje) måneder. * indikerer P < 0,05. Denne figuren gjengitt er fra Murray et al.15 med tillatelse fra Elsevier. Forkortelser: ERG = elektroretinografi; AAV = adeno-assosiert virus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Retinal tykkelse på CLN5-/- sau etter intravitreal levering av AAV9. CLN5. Representative fotomikrografier av H&E histologisk farging i behandlede og ubehandlede øyne hos CLN5-/- sau sammenlignet med alderstilpassede kontroller. Bilder og tykkelsesmålinger ble tatt på to steder; sentral retina (A-E) og perifer retina (F-J). (E) Gjennomsnittlig (± SEM) retinal tykkelse (μm) i den sentrale retina av de behandlede (mørkegrønne, n = 3) og ubehandlede (lysegrønne, n = 3) øynene sammenlignet med sunn kontroll (blå, n = 4) og CLN5-affisert (rød, n = 4) netthinnen. (J) Gjennomsnittlig (± SEM) retinal tykkelse (μm) i den perifere retina av de behandlede og ubehandlede øynene til CLN5-/- sau sammenlignet med sunn kontroll og CLN5 påvirket netthinnen. * indikerer P < 0,05, **** indikerer P < 0,0001. Skala barer = 50 μm. Dette tallet er gjengitt fra Murray et al.15 med tillatelse fra Elsevier. Forkortelser: NFL = nervefiberlag; GCL = ganglioncellelag; IPL = indre plexiform lag; INL = indre kjernelag; OPL = ytre plexiform lag; ONL = ytre atomlag; IS/OS = indre og ytre segmenter av fotoreseptorer; RPE = retinalt pigmentepitel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: GFAP-immunreaktivitet i netthinnen til CLN5-/- sau etter intravitreal tilførsel av AAV9. CLN5. Representative konfokale bilder av GFAP-immunreaktivitet i behandlede og ubehandlede øyne hos CLN5-/- sau sammenlignet med kontrollpersoner. (AD) GFAP-immunreaktivitet, (E-H) DAPI-kjernemarkør, (I-L) Sammenslåtte bilder av de to kanalene. Skala bar = 20 μm. Dette tallet er gjengitt fra Murray et al.15 med tillatelse fra Elsevier. Forkortelser: NFL = nervefiberlag; GCL = ganglioncellelag; INL = indre kjernelag; ONL = ytre atomlag; IS/OS = indre og ytre segmenter av fotoreseptorer; GFAP = glial fibrillært surt protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intravitreale injeksjoner er en av de vanligste kirurgiske prosedyrene i human oftalmologi og har vist seg å være effektive for å levere AAV-medierte genterapier til netthinnen hos sauer. Vi hadde tidligere vist effekten av AAV9. CLN5 genterapi leverte intravitrealt i dempende retinal dysfunksjon og degenerasjon hos sau med CLN5 NCL15. Det er håpet at oversettelsen av denne administrasjonsveien til menneskelige NCL-pasienter også vil vise seg å være gunstig.
Protokollen for små IVT-injeksjoner i et saueøye er relativt grei og ikke-invasiv, lett reproduserbar og lett for en ikke-ekspert å lære. Suksessen avhenger av målcellene i netthinnen, terapien som leveres, og plasseringen og retningen av selve injeksjonen. Selv om IVT-injeksjoner ofte antas å være mest effektive for å målrette indre retinale lag, har mange forskere vist effekten av IVT-injeksjoner i sykdommer der ytre retina er den primære plasseringen av sykdomspatogenese15,17,18,19. Forskjellene i funksjonelle og patologiske utfall etter IVT-injeksjoner er sannsynligvis også relatert til hvilken type behandling som gis. For eksempel har genterapi for å levere gener som koder for løselige proteiner (f.eks. CLN5) vist seg å være mye mer effektiv enn genterapier for å levere gener som koder for intracellulære eller membranbundne proteiner (f.eks. CLN6) 15. Uansett mål og type terapi, er det avgjørende å få injeksjonsstedet og vinkelen riktig for å maksimere effekten. Som beskrevet i protokollen, bør injeksjonsstedet for sau være ca. 7 mm bakre til sklera på det laterale aspektet av øyet og vinklet bakre for å målrette bakre glasslegeme. Sportsfiske av nålen er både for å unngå linsen og for å lede det injiserte stoffet så nær netthinnen som mulig. Bruk av en sikkerhetssprøyte med en permanent påsatt nål på 28 G (eller mindre) x 0,5 i nåler med lite dødt rom er avgjørende for å minimere injeksjonsrelatert ubehag og dødvolum som er igjen i nålen eller navet. Denne lengdenålen kan settes helt inn i sauøyet i bakre vinkel uten kirurgisk mikroskop og/eller risiko for punktering av netthinnen. Forskere som har tilgang til et kirurgisk mikroskop, kan bruke dette til å gi et ekstra nivå av sikkerhet rundt å unngå retinal forstyrrelse. Ellers er bruk av sikkerhetssprøyter og å være oppmerksom på dimensjonene til saueøyekulen i alderen som behandles, tilstrekkelig til å utføre denne prosedyren trygt15.
Når du tar tak i øyet for å rotere det medialt og eksponere injeksjonsstedet, er det viktig å bruke nontoothed atraumatiske instrumenter for å unngå å skade øyets delikate vev. Hvis øyet er plassert sentralt, er det relativt enkelt å ta tak i bulbar konjunktivene på grensen til sclera og iris og rotere med den ene hånden, mens du injiserer med den andre hånden. Men hvis øyet har rotert off-center, som kan forekomme under generell anestesi, er det ofte nødvendig å bruke en hemostat for å klemme på bulbar konjunktivene og rotere øyet på plass, slik at hemostaten er på plass for å fortsette med prosedyren.
Saueøyne er robuste og gjenvunnet godt etter IVT-behandling med AAV9 bærende sau CLN5, med bare en sau som utvikler uveitt i det behandlede øyet 1 uke etter injeksjon15. I dette tilfellet løste uveitt innen 1 uke og hadde ingen langsiktig innvirkning på synet. Bortsett fra dette ene tilfellet ble det ikke rapportert om negative effekter av IVT-injeksjoner i den første publiserte studien15, eller i de >30 ekstra dyrene i forskningsprogrammet injisert ved 3 måneder, 6 måneder eller 9 måneders alder etter protokollen beskrevet her. Imidlertid er det flere kvantitative målinger av injeksjonssikkerhet som forskere kanskje vil vurdere å legge til sine postoperative vurderinger. Disse inkluderer målinger av intraokulært trykk (IOP), fundus-avbildning eller OCT. Bilder av fundus før og etter injeksjon kan markere om det har vært noen forstyrrelse av netthinnen på grunn av injeksjonen, og på lang sikt kan gi en oversikt over retinal helse generelt.
I tilfelle der en fluorescerende markør injiseres, kan fluorescensavbildning av fundus hjelpe til med å visualisere spredningen av den injiserte markøren16,20. OCT kan brukes til å visualisere netthinnen i tverrsnitt in vivo for å identifisere potensiell strukturell skade etter injeksjon og måle tykkelsen på netthinnen over tid som respons på behandlingen. Visuell funksjon etter injeksjon kan også vurderes ved ERG eller labyrinttesting15,16. Ved IVT-virusmediert genterapi bør virkningen av immunresponsen og tilstedeværelsen av nøytraliserende antistoffer mot AAV-vektorer vurderes. Selv om det ikke er en del av protokollen som er skissert her for sau, foreslås det at forsøkspersoner testes for tilstedeværelse av anti-AAV-nøytraliserende antistoffer før genterapi, uavhengig av administrasjonsvei, for å øke transduksjonseffektiviteten16,21. Leserne henvises til en mer omfattende drøfting av spørsmålet om immunresponser mot AAV av Whitehead et al.22.
En vanlig komplikasjon under IVT-prosedyrer er subkonjunktivblødning (SCH)23, som kan oppstå hvis kapillærene i bulbar-konjunktivene punkteres under nålestikk. Heldigvis er SCH generelt ufarlig og løser seg i løpet av få dager; Det er imidlertid best å unngå konjunktiv kapillærer når du setter inn nålen. Etter IVT-injeksjon er det viktig å behandle de injiserte øynene med antibiotiske øyedråper (f.eks. kloramfenikol) og overvåke øynene for tegn på infeksjon eller betennelse (uveitt). En annen vanlig hendelse under IVT-prosedyrer er en økning i IOP. Disse økningene er oftest forbigående trykktopper i minuttene etter injeksjon og forårsaker ingen langvarig skade24,25. Det er imidlertid tilfeller der IOP bør vurderes og overvåkes. Når eksisterende okulære tilstander som glaukom er tilstede, eller når høyere volumer (≥100 μL) injiseres, bør IOP overvåkes nøye, og profylaktisk fremre kammerparasentese bør vurderes for å redusere trykket i øyekloden 4,16. I tillegg kan gjentatte pigger i IOP ved gjentatte IVT-injeksjoner være en bekymring og bør dempes som ovenfor4. Her demonstrerer vi IVT i forbindelse med en enkelt AAV-mediert genterapi; Derfor er de langsiktige konsekvensene av gjentatte injeksjoner ikke en viktig faktor.
Begrensninger av IVT-injeksjoner inkluderer behovet for å trenge gjennom anatomiske barrierer og lavere målspesifisitet sammenlignet med mer invasive metoder. Først vil det injiserte stoffet fortynnes i glasslegemet og har deretter en avstand for å diffundere gjennom glassplaten og retinalvevet til målcellene. Dette betyr at den indre netthinnen er lettere transducert enn den ytre retina etter IVT-injeksjon, og høyere doser kan være nødvendig for å motvirke fortynning26. Protokollen beskrevet her understreker viktigheten av å injisere så nær netthinnen som mulig for å redusere effekten av fortynning og diffusjon gjennom glasslegemet. Derfor settes hele lengden på 0,5 tommer/12,7 mm nåleskaftet inn i øyet. Den ekstra fordelen med å sette inn hele nållengden er den reduserte sjansen for væskerefluks under injeksjon 4,27.
Selv om denne nåværende protokollen utelater den, anbefales det å utsette fjerningen av nålen i flere minutter etter injeksjonen for ytterligere å redusere sjansene for væskerefluks. I tillegg bør injeksjonen gjøres sakte for å sikre at strålen av injisert væske ikke forstyrrer netthinnen eller forårsaker en rask spike i IOP, og en økt injeksjonshastighet påvirker ikke diffusjonshastigheten gjennom glasslegemet28,29. Den indre begrensende membranen (ILM) er den primære barrieren mellom glasslegemet og netthinnen, som fungerer for å begrense bevegelsen av molekyler inn i netthinnen30. Imidlertid kan permeabiliteten til ILM økes ved fordøyelse eller kirurgisk peeling og økes sannsynligvis i det syke øyet, noe som gjør penetrasjonen av terapeutiske molekyler lettere.
Når det gjelder målspesifisitet, har IVT-administrasjon minst sammenlignet med andre intraokulære ruter som subretinal og suprachoroidal, som diskutert ovenfor og andre steder10. Imidlertid utvikles nye generasjoner AAV-er rutinemessig for å inneholde modifikasjoner, noe som forbedrer målrettingen mot bestemte celletyper eller mer effektivt overvinner barrierer som ILM31. Bruken av slike modifiserte kapsider har økt transduksjonseffektiviteten etter IVT-administrasjon i en rekke modellarter 5,32,33.
Målet med genterapien beskrevet av Murray et al.15 var å levere en funksjonell kopi av CLN5-genet ; Derfor er et mål på effekt tilstedeværelsen av transduserte celler som uttrykker CLN5-protein. Vi har forsøkt å bruke immunhistokjemi for å oppdage CLN5-transduserte celler i netthinnen, slik vi rutinemessig gjør i sauehjernevev; Antistoffet som vi vanligvis bruker i frittflytende hjernevev, virker imidlertid ikke i paraffin-innebygd retinalvev. Feilsøking og undersøkelse av alternative måter å oppdage genet eller proteinet av interesse i netthinnen er i gang for å legge til vurdering av effekt. En potensiell måte å oppnå dette på er å injisere en viral vektor som inneholder et reportergen (for eksempel grønt fluorescerende protein; GFP) og vurdere GFP-ekspresjon via immunhistokjemi. En annen måte å vurdere effekt på er å bruke kvantitativ PCR for å vurdere nivåer av transgenuttrykk.
Utvikling av protokoller for IVT-injeksjoner hos store dyr er et avgjørende skritt mot behandling av degenerative sykdommer i netthinnen, spesielt sykdommer med en genetisk komponent, da IVT-genterapi er et lovende potensielt terapeutisk. For degenerative sykdommer der netthinnen allerede er skjør, utgjør IVT-behandling mindre risiko for netthinneløsning eller tåre. Gitt likhetene i størrelse og struktur av sauen og menneskelige øyne, er optimalisering av dose og volum av IVT-injeksjoner hos sau et relevant skritt mot oversettelse til klinikken. Dette papiret beskriver protokollen for IVT-injeksjon i sauøyet, som er trygt og viser en svært lav frekvens av okulære inflammatoriske responser. Denne metoden demonstrerer også effekten av AAV9-mediert okulær genterapi for å adressere retinalkomponenten av NCL hos sau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne anerkjenne Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) for hans hjelp til å etablere denne protokollen og utføre injeksjonene beskrevet av Murray et al.15. Forfatterne anerkjenner også finansiering fra CureKids New Zealand, Canterbury Medical Research Foundation, Neurogene Inc og Batten Disease Support and Research Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
References
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Grzybowski, A., et al. update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
- Pavlou, M., et al. Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders. EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392 (2021).
- Kousi, M., Lehesjoki, A. -E., Mole, S. E. Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses. Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).
- Wibbeler, E., et al. Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series. Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).
- Schulz, A., et al. Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease. The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).
- Mitchell, N. L., et al. Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease. Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Scientific Reports. 12 (1), 3670 (2022).
- Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Data in Brief. 37, 107188 (2021).
- Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs. Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).
- Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina. The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).
- Frugier, T., et al. A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3. Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).
- Murray, S. J., et al. Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease. Experimental Eye Research. 207, 108600 (2021).
- Ross, M., et al. Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia. Gene Therapy. , (2021).
- Boyd, R. F., et al. Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs. Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs. Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).
- Ross, M., et al. Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).
- Kotterman, M. A., et al. Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates. Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).
- Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment. Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).
- Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -Y., Kim, S. -W., Huh, K. Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).
- Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections. Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).
- Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).
- Ross, M., Ofri, R. The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).
- Henein, C., et al. Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes. Pharmaceutics. 11 (8), 371 (2019).
- Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PloS One. 16 (8), 0256344 (2021).
- Willekens, K., et al. Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).
- Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye. Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).
- Kiss, S. Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery. Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease. Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).
