Summary
在羊眼中进行玻璃体内注射，目的是将病毒介导的基因治疗传递到视网膜。
Abstract
有几种方法可以将治疗剂输送到视网膜，包括玻璃体内 （IVT）、视网膜下、脉络膜上、眼周或局部给药。IVT药物输送涉及注射到眼睛的玻璃体中，玻璃体是一种充满眼睛后房并保持眼球形状的凝胶状物质。虽然IVT途径的特异性目标性不如视网膜下递送，但它的侵入性要小得多，并且在临床环境中广泛用于一系列眼部疾病。
我们之前证明了玻璃体内递送腺相关病毒（AAV）介导的基因治疗产物（AAV9.CLN5）在绵羊中具有天然存在的CLN5形式的神经元蜡样脂褐质沉着症（NCL）。受影响的绵羊一只眼睛接受IVT基因治疗，另一只未经治疗的眼睛作为内部对照。治疗后15个月内，接受治疗的眼睛保持视网膜结构和功能，而未经治疗的眼睛在尸检时表现出进行性下降和严重萎缩。根据绵羊研究，CLN5基因治疗产品于2021年9月被美国食品药品监督管理局批准为候选研究新药（IND）。本文详细介绍了IVT将治疗性病毒载体递送到绵羊眼的手术方案。
Introduction
有几种方法可用于将治疗剂输送到视网膜，包括玻璃体内 （IVT）、视网膜下、脉络膜上、眼周或局部给药。每种给药途径都涉及克服诸如血液 - 视网膜屏障或内部和外部限制膜之类的屏障，并且根据所输送的药物和特定的视网膜靶标1，2具有不同的疗效率。
IVT药物输送涉及将注射到眼睛的玻璃体中，玻璃体是一种占据眼睛后房的凝胶状物质。玻璃体的主要功能是维持眼球的形状并保持眼组织（如晶状体和视网膜）就位。玻璃体液主要由水组成，少量胶原蛋白、透明质酸和其他非胶原蛋白3。IVT注射是一种简单而常见的程序，常规用于治疗各种眼部疾病，包括年龄相关性黄斑变性，糖尿病黄斑水肿，糖尿病视网膜病变，视网膜静脉阻塞和几种遗传性视网膜营养不良4，5。
神经元蜡样脂褐素糖（NCL;巴顿病）是一组致命的溶酶体贮积病，会导致大脑和视网膜严重退化。目前有13种已知的NCL变异，由不同基因（CLN1-8，CLN10-14）的突变引起，主要影响儿童，但发病年龄和疾病严重程度为6。NCL具有共同的进行性症状，包括认知和运动衰退，癫痫发作和视力丧失。NCL无法治愈;然而，脑定向酶替代疗法目前正在针对CLN2疾病7，8进行临床试验，AAV介导的基因疗法在临床前研究中显示出巨大的前景，CLN5基因治疗的临床试验预计将于2022年开始9，10。
许多其他物种发展出天然存在的NCL形式，包括猫，狗，羊和牛。NCL的两种绵羊模型目前正在新西兰积极研究中：Borderdale绵羊的CLN5疾病模型和南汉普郡绵羊的CLN6疾病模型。受影响的绵羊表现出人类疾病的许多临床和病理特征，包括视网膜萎缩和视力丧失10，11。尽管在患有CLN5疾病的绵羊中进行脑定向CLN5基因治疗可以预防或阻止脑萎缩和临床衰退，但接受治疗的绵羊仍然会失去视力9。这突出了治疗视网膜以保护视力和保持更好生活质量的必要性，从而建立了绵羊眼部基因治疗方案。
羊眼代表了人眼的良好模型，因为它在眼球尺寸、玻璃体体积和视网膜结构10、12、13 方面相似。本文详细介绍了IVT将小体积（≤100μL）治疗性病毒载体输送到羊眼的手术方案。
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Protocol
所有实验方案均由林肯大学动物伦理委员会批准，并符合美国国立卫生研究院关于在研究中照顾和使用动物的指南和新西兰动物福利法案（1999）。边境代尔绵羊在14 岁出生时被诊断出来，并在林肯大学的研究农场饲养。三只3个月大的纯合子（CLN5-/-）母羊接受了左眼单次IVT注射，未经治疗的右眼作为内部对照。将视网膜电图和病理学数据与历史健康和受影响的对照数据进行比较。本研究中使用的病毒载体是自互补的腺相关病毒血清型9，含有鸡β作用（CBh）启动子和密码子优化的绵羊 CLN5 （scAAV9 / CBh-oCLN5opt）。病毒载体由美国北卡罗来纳州北卡罗来纳大学载体核心提供。
1. 术前
- 高压灭菌手术套件（图1）。
- 手术前禁食绵羊24小时。
- 手术前记录活体重。
图1：玻璃体内手术套件。 IVT手术所需的器械包括（1）保持眼睑张开的窥器，以及（2）一对弯曲的鼻钳，用于抓住延髓结膜并旋转眼睛。（3）还包括直鼻止血器作为替代仪器，用于抓住延髓结膜，并在眼睛回滚回眼眶时将眼睛固定到位。该套件在手术前进行高压灭菌。 请点击此处查看此图的大图。
2. 外科手术
- 约束动物，并使用电子剪刀从颈静脉的一侧剃掉颈部的羊毛。
- 通过在颈静脉沟底部施加压力来阻塞颈静脉，并观察凸起的静脉。
- 将适量的地西泮（0.3mg / kg）和氯胺酮（7.5mg / kg）抽入无菌注射器中，并连接无菌20 G针头。将针头插入颈静脉并轻轻拉回柱塞，以确保血液进入枢纽并且针头在静脉内。一旦确诊，通过静脉（颈）给药诱导。
- 诱导后，立即将动物置于背卧中，伸展颈部，将舌头向上和向前保持，使用喉镜观察喉部。当动物呼气时，通过在声带之间轻轻插入气管插管（大小 6.0-9.0，取决于绵羊的大小）来进行气管插管。立即给气管内袖带充气，并在下颌用系带固定插管。确认通过管子的气流。
- 将绵羊转移到手术台上，并将其放在侧面卧位。
- 立即将气管插管连接到麻醉机的软管上，以在100%氧气中输送异氟醚。最初从3%-4%异氟醚开始，然后减少到2%-3%进行维持治疗。观察羊的自发通风。
- 在整个手术过程中监测心脏（脉搏）频率、呼吸频率、血氧饱和度、潮气末 CO2 水平和直肠体温。有关麻醉绵羊中这些参数的生理值，请参见 表1 （可变，但用作指导）。
- 将一个大的无菌方形布放在外科手术车上，然后放置无菌器械。
- 将无菌开窗手术窗帘放在要注射的眼睛上。
- 使用无菌20毫升注射器无菌消毒眼睛，用1-5%聚维酮碘溶液冲洗眼睛。
- 将1-2滴Alcaine 0.5%W / V眼用溶液作为局部麻醉剂涂抹在眼睛上。
- 将Nopa Barraquer-Colibri眼窥器（10毫米）安装到眼睑上，以保持眼睛睁开。
- 用镊子抓住眼睛背外侧的延髓结膜，并向腹内侧旋转眼球。
| 意识 | 麻醉 | 推荐的关键干预点 | |
| 心率（心跳/分钟） | 50-80（静止）至 280（活动） | 50-80 | <50， >100 |
| 呼吸频率（呼吸/分钟） | 15-40（休息）至350（过热） | 10-30 | <8， >40 |
| 血氧饱和度（毫米汞柱） | 95-100 | 98-100 | <90 |
| 潮气末二氧化碳（毫米 汞柱） | 35-45 | 35-45 | >55 |
| 体温（°C） | 38.5-39.5 | 38.5-39.5 | <36， >40 |
表1：麻醉绵羊中要监测的参数的生理值。
3. 病毒制备
- 将AAV载体等分试样储存在-80°C直至使用。
- 在手术当天，解冻所需数量的小瓶，以便在冰上进行IVT输送。
- 在给药前，涡旋病毒载体等分试样并以400× g 离心10秒以收集内容物。
- 在无菌过滤的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中将每个病毒载体等分试样稀释至所需剂量，最终体积为 100 μL。 使用无菌过滤移液器吸头在无菌 1.5 mL 低蛋白结合微量离心管中制备载体稀释液。将所有与病毒载体接触的消耗品丢弃在消毒液中（见 材料表）。
注意：在原始出版物15 中治疗剂（AAV9。CLN5）是1.9 x 1010 病毒基因组。推荐剂量将根据所施用的治疗剂而有所不同;因此，此处介绍的标准方案中未包含剂量。 - 将全部 100 μL AAV 载体制剂吸入无菌、低死区 1 mL 注射器中，并永久连接的 28 G x 1/2 针头立即注射。确保从制备到注射的时间长度小于2分钟。
4. 病毒给药
- 将针头插入眼睛外侧巩膜后方约7毫米处，并向后倾斜以避开晶状体（图2 和 图3）。在不干扰视网膜表面的情况下，单次注射 100 μL 作为推注。
- 用大约 10-15 mL 的 1-5% 聚维酮碘溶液冲洗眼睛，然后用 10 mL 盐水冲洗眼睛，然后取出窥器和悬垂物。
- 将羊翻过来，如果需要，用另一只眼睛重复。
图2：眼球的心内侧旋转 。 （A）用无齿镊子抓住延髓结膜和（B）腹内侧旋转（即向下和朝向鼻子）以暴露眼睛的背外侧表面进行注射。缩写：V = 腹侧，D = 背侧，M = 内侧，L = 侧侧。 请点击此处查看此图的大图。
图3：注射位置和深度。 将针头注射在眼球的背外侧，并将针杆的整个长度（0.5英寸/12.7毫米）插入眼中。注意针头朝向眼睛后部的角度，以避开晶状体并尽可能靠近视网膜注射。 请点击此处查看此图的大图。
5.术后管理
- 手术完成后，停止异氟醚气体吸入麻醉，用100%氧气冲洗管路，断开软管与气管插管的连接，然后将绵羊转移到恢复室。
- 将绵羊放在胸骨卧位，双腿藏在下面，并监测直至完全恢复。确保动物的嘴没有任何障碍物。
- 当观察到吞咽反射时，部分放气气管插管的袖带，轻轻地将管子从口腔中取出。
- 在后肢股二头肌内注射非甾体抗炎药，在颈部侧面或肩后皮下注射抗生素，将 0.5% 氯霉素滴眼液注射至眼球表面。
- 一旦绵羊可以独立站立，就提供水和食物（卢塞恩颗粒和谷壳）。
- 手术后 7 天，每天服用 0.5% 氯霉素滴眼液 2-3 次。
- 将绵羊留在室内过夜，然后在手术后约24小时返回室外围场。
- 每天记录直肠温度，持续 3 周。监测脉搏或呼吸频率、食物消耗、神经行为、体温、体重、姿势、眼睛健康和健康不良临床体征的任何变化。如果有任何不良事件的迹象，请寻求适当的兽医治疗。
6. 评估体内疗效
- 如果IVT注射的目标是保护视力，则通过迷宫测试或视网膜电图（ERG）等方法监测 体内 疗效以评估视网膜细胞功能或光学相干断层扫描（OCT）以评估视网膜结构。
注意：这些疗效措施在IVT基因治疗11，15，16之后得到了很好的描述。
7. 尸检组织分析
- 玻璃体内注射手术后，在适当的终点通过批准的方法对绵羊实施安乐死。
注意：建议的安乐死方法，例如静脉注射兽医安乐死药物或对颈椎进行穿透性固定螺栓，然后快速放血，详见其他专题15，16。 - 使用手术锋利/钝弯剪刀收获羊眼球。切开外眦和内眦以增加眼窝开口，然后系统地切开结膜褶皱、结缔组织、肌肉和视神经，将眼球从眼窝中解放出来。
- 将完整的去核眼球浸入10%福尔马林中2小时，然后在Bouin溶液中后固定4小时，在巩膜上切开一个小（0.5厘米）以允许足够的灌注。或者，将眼球浸入戴维森溶液中48小时。
- 通过常规石蜡包埋和切片在3-5μm处处理眼组织切片。
注意：苏木精和伊红（H&E）染色和免疫组织化学分析的染色程序已在前面描述过15，16。 - 通过视网膜总厚度、视网膜层厚度、外核层细胞行计数以及视网膜细胞类型、视网膜胶质细胞或目标蛋白质的免疫组织化学染色等措施评估死后组织中的疗效。
注意：有关这些分析的协议，请参阅以前的出版物15，16。
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Representative Results
该研究小组先前已证明 IVT 递送 CLN5 基因治疗载体在减轻 CLN5 NCL 绵羊视网膜功能障碍和变性的功效15.受影响的绵羊接受单次 100 μL IVT 注射包装在 AAV 血清型 9 （AAV9） 载体 （AAV9.CLN5）进入一只眼睛，对侧眼睛作为未经治疗的内部对照。从注射年龄（3个月）到终末期疾病（18个月）每月评估视力。对治疗和未治疗的眼睛以及年龄匹配的健康和受CLN5影响的对照组进行了视网膜组织学的尸检分析。
视网膜电图（ERG）分析显示，治疗的眼睛的视网膜功能保留，而未治疗的眼睛以与CLN5影响的动物类似的方式下降（图4）15。接受治疗的眼睛的视网膜组织学几乎正常化，视网膜总厚度与中央视网膜的健康对照动物相当。相比之下，未经处理的视网膜厚度与受CLN5影响的动物相当（图5）15。溶酶体贮积是NCL的标志性病理特征，在治疗的眼睛中未观察到，但存在于未治疗的眼睛中15。这些结果表明，通过IVT注射递送的基因治疗载体能够阻止受CLN5影响的羊眼中的疾病发病机制。神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是视网膜应激和星形胶质细胞的标志物，在治疗的眼睛中的表达低于未经治疗的眼睛，表明治疗后疾病相关的炎症减弱（图6）15。
图 4：玻璃体内递送 AAV9 后 CLN5-/- 绵羊的暗适应 ERG 反应。CLN5. （A）CLN5-/- 绵羊的经过治疗（深绿色，n = 3）和未处理（浅绿色，n = 3）眼睛以及健康对照（蓝色，n = 6）和CLN5受影响（红色，n = 6）绵羊中随时间推移的平均（± SEM）ERG振幅。（B）来自治疗和未治疗的眼睛和健康对照以及5个月（黑线）和17个月（灰线）的受影响绵羊的代表性ERG痕迹。* 表示 P < 0.05。转载的图来自Murray et al.15 ，并经爱思唯尔许可。缩写：ERG = 视网膜电图;AAV = 腺相关病毒。 请点击此处查看此图的大图。
图5：玻璃体内输送AAV9后CLN5-/-绵羊的视网膜厚度。CLN5.与年龄匹配的对照组相比，CLN5-/-绵羊治疗和未治疗眼睛中H&E组织学染色的代表性显微照片。在两个位置拍摄图像和厚度测量;中央视网膜 （A-E） 和周边视网膜 （F-J）。（E）与健康对照（蓝色，n = 4）和CLN5影响（红色，n = 4）视网膜的中央视网膜的平均（±SEM）视网膜厚度（μm）与健康对照（蓝色，n = 4）和CLN5影响（红色，n = 4）视网膜的比较。（J）CLN5-/-绵羊治疗和未治疗眼睛周边视网膜的平均（±SEM）视网膜厚度（μm）与健康对照组和CLN5受影响的视网膜相比。* 表示 P < 0.05，**** 表示 P < 0.0001。比例尺 = 50 μm。该图经爱思唯尔许可转载自Murray et al.15。缩写：NFL = 神经纤维层;GCL = 神经节细胞层;IPL = 内部丛状层;INL = 内核层;OPL = 外层丛状层;ONL = 外核层;IS/OS = 光感受器的内部和外部部分;RPE = 视网膜色素上皮。请点击此处查看此图的大图。
图 6：玻璃体内递送 AAV9 后 CLN5-/- 绵羊视网膜中的 GFAP 免疫反应性。CLN5.与对照组相比，CLN5-/-绵羊治疗和未治疗眼睛中GFAP免疫反应性的代表性共聚焦图像。（公元至日）GFAP免疫反应性，（E-H）DAPI核标志物，（I-L）两个通道的合并图像。比例尺 = 20 μm。该图经爱思唯尔许可转载自Murray et al.15。缩写：NFL = 神经纤维层;GCL = 神经节细胞层;INL = 内核层;ONL = 外核层;IS/OS = 光感受器的内部和外部部分;GFAP = 神经胶质纤维酸性蛋白;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
玻璃体内注射是人类眼科中最常见的外科手术之一，已被证明可有效将AAV介导的基因疗法输送到绵羊的视网膜。我们之前已经证明了AAV9的功效。CLN5基因治疗在玻璃体内使用CLN5 NCL15减轻绵羊视网膜功能障碍和变性。希望将这种给药途径转化为人类NCL患者也将证明是有益的。
小容量IVT注射到羊眼的方案相对简单和非侵入性，易于重现，并且易于非专家学习。成功取决于视网膜内的靶细胞、正在提供的治疗以及注射本身的位置和方向。尽管IVT注射通常被认为在靶向视网膜内层方面最有效，但许多研究人员已经证明了IVT注射在视网膜外层是疾病发病机制的主要位置的疾病中的功效15，17，18，19。IVT注射后功能和病理结果的差异也可能与给予的治疗类型有关。例如，递送编码可溶性蛋白质（例如CLN5）的基因的基因疗法已被证明比递送编码细胞内或膜结合蛋白（例如CLN6）的基因的基因疗法更有效15。无论治疗的目标和类型如何，正确的注射部位和角度以最大限度地提高疗效至关重要。如方案所述，绵羊的注射部位应位于眼睛外侧巩膜后方约 7 毫米处，并向后倾斜以靶向玻璃体后部。针头的角度既是为了避开晶状体，也是为了将注射的药物尽可能靠近视网膜。使用带有永久连接的28 G（或更小）x 0.5英寸低死角针的安全注射器对于最大限度地减少注射相关的不适和针头或轮毂中残留的死体积至关重要。这种长度的针头可以以后角完全插入羊眼，而无需手术显微镜和/或刺穿视网膜的风险。可以使用手术显微镜的研究人员可以使用它来为避免视网膜破裂提供额外的确定性。否则，使用安全注射器并了解被治疗年龄时羊眼球的尺寸足以安全地执行此程序15。
当抓住眼睛将其内侧旋转并暴露注射部位时，必须使用无齿无创伤器械，以避免损坏眼睛的脆弱组织。如果眼睛位于中央，则相对容易抓住巩膜和虹膜边界的延髓结膜并用一只手旋转，同时用另一只手注射。但是，如果眼睛旋转偏离中心（可能在全身麻醉下发生），通常需要使用止血器夹住延髓结膜并将眼睛旋转到位，将止血器留在原位以继续手术。
羊眼健壮，用携带绵羊 CLN5的AAV9进行IVT治疗后恢复良好，只有一只绵羊在注射后1周在治疗的眼睛中发展为葡萄膜炎15。在这种情况下，葡萄膜炎在1周内消退，对视力没有长期影响。除了这一个案例外，在第一个发表的研究15中没有报告IVT注射的负面影响，或者在研究计划中按照此处描述的方案在3个月，6个月或9个月大时注射的>30只动物中没有报告IVT注射的负面影响。然而，研究人员可能要考虑将注射安全性的其他定量措施添加到他们的术后评估中。这些包括眼内压 （IOP）、眼底成像或 OCT 的测量。 注射前后的眼底图像可以突出显示是否由于注射而导致视网膜有任何破坏，并且从长远来看，可以提供一般视网膜健康的概述。
在注射荧光标记物的情况下，眼底的荧光成像可以帮助可视化注射标记物16，20的扩散。OCT可用于可视化 体内 横截面的视网膜，以识别注射后的任何潜在结构损伤，并测量视网膜随时间推移的厚度以响应治疗。注射后的视觉功能也可以通过ERG或迷宫测试15，16来评估。在IVT病毒介导的基因治疗的情况下，应考虑免疫应答的影响和AAV载体中和抗体的存在。虽然不是此处概述的绵羊方案的一部分，但建议在基因治疗之前测试受试者是否存在抗AAV中和抗体，无论给药途径如何，以提高转导效率16，21。读者可以参考Whitehead等人对AAV免疫反应问题的更全面的讨论22。
IVT 手术中的常见并发症是结膜下出血 （SCH）23，如果在针插入过程中刺穿延髓结膜中的毛细血管，就会发生结膜出血。幸运的是，SCH通常是无害的，并在几天内消退;但是，插入针头时最好避免结膜毛细血管。注射IVT后，重要的是用抗生素滴眼液（例如氯霉素）治疗注射的眼睛，并监测眼睛是否有任何感染或炎症迹象（葡萄膜炎）。IVT手术中的另一个常见事件是眼压增加。这些增加最常见的是注射后几分钟内压力的短暂峰值，不会造成长期损害24，25。但是，在某些情况下，应考虑和监控 IOP。当存在青光眼等预先存在的眼部疾病时，或当注射量较大（≥100μL）时，应密切监测眼压，并应考虑预防性前房穿刺术以减轻眼球压力4，16。此外，在重复IVT注射的情况下，眼压的反复峰值可能是一个问题，应如上所述减弱4。在这里，我们正在演示IVT用于单一AAV介导的基因治疗;因此，反复注射的长期后果不是主要考虑因素。
IVT注射的局限性包括需要穿透解剖屏障，以及与更具侵入性的方法相比，靶标特异性较低。首先，注射的物质将在玻璃体中稀释，然后有一定距离通过玻璃体腔和视网膜组织扩散到靶细胞。这意味着IVT注射后，视网膜内比视网膜外更容易转导，并且可能需要更高的剂量来抵消稀释26。这里描述的方案强调了尽可能靠近视网膜注射的重要性，以减轻稀释和扩散通过玻璃体的影响。因此，将 0.5 in/12.7 mm 针轴的全长插入眼中。插入整个针头长度的另一个优点是减少了注射过程中液体回流的机会4，27。
尽管当前的方案省略了它，但建议在注射后将针头移除延迟几分钟，以进一步减少液体反流的机会。此外，注射应缓慢进行，以确保注射的液体射流不会破坏视网膜或导致眼压快速飙升，并且增加的注射速度不会影响通过玻璃体的扩散速率28，29。内限制膜（ILM）是玻璃体和视网膜之间的主要屏障，其功能是限制分子进入视网膜30。然而，ILM的通透性可以通过消化或手术脱皮来增加，并且在患病的眼睛中可能会增加，从而使治疗分子更容易渗透。
关于靶点特异性，IVT给药与其他眼内途径（如视网膜下和脉络膜上）相比最少，如上所述10。然而，新一代AAV正在定期开发以包含修饰，以增强对特定细胞类型的靶向或更有效地克服诸如ILM31之类的障碍。在许多模式物种中，使用这种修饰衣壳提高了IVT给药后的转导效率5，32，33。
Murray等人详述的基因治疗的目的是提供CLN5基因的功能拷贝;因此，疗效的一种衡量标准是存在表达CLN5蛋白的转导细胞。我们试图使用免疫组织化学来检测视网膜中的CLN5转导细胞，就像我们在绵羊脑组织中所做的那样;然而，我们通常在自由漂浮的脑组织中使用的抗体在石蜡嵌入的视网膜组织中不起作用。正在对视网膜中感兴趣的基因或蛋白质进行故障排除和研究替代方法，以增加疗效评估。实现这一目标的一种潜在方法是注射含有报告基因（例如绿色荧光蛋白;GFP）以及通过免疫组织化学评估GFP表达。评估疗效的另一种方法是使用定量PCR来评估转基因表达水平。
制定大型动物IVT注射方案是治疗视网膜退行性疾病的关键一步，特别是具有遗传成分的疾病，因为IVT基因疗法是一种有前途的潜在治疗方法。对于视网膜已经脆弱的退行性疾病，IVT治疗带来较少的视网膜脱离或撕裂风险。鉴于绵羊和人眼的大小和结构相似，优化绵羊IVT注射的剂量和体积是转化为临床的相关步骤。本文详细介绍了将IVT注射到羊眼中的方案，该方案是安全的，并且显示出非常低的眼部炎症反应率。该方法还证明了AAV9介导的眼部基因疗法对解决绵羊NCL视网膜成分的疗效。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
作者要感谢Steve Heap博士（BVSc，CertVOphthal）在建立该协议和执行Murray等人描述的注射方面的帮助15。作者还感谢来自CureKids New Zealand，Canterbury医学研究基金会，Neurogene Inc和Batten Disease Support and Research Association的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
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