Summary
تم إجراء الحقن داخل الجسم الزجاجي في عين الأغنام بهدف تقديم العلاج الجيني بوساطة فيروسية إلى شبكية العين.
Abstract
هناك عدة طرق لتوصيل العوامل العلاجية إلى شبكية العين ، بما في ذلك داخل الجسم الزجاجي (IVT) ، تحت الشبكية ، فوق المشيمية ، حول العين ، أو الإدارة الموضعية. يتضمن توصيل الدواء IVT حقنا في الخلط الزجاجي للعين ، وهي مادة هلامية تملأ الغرفة الخلفية للعين وتحافظ على شكل كرة العين. على الرغم من أن طريق IVT أقل استهدافا بشكل محدد من الولادة تحت الشبكية ، إلا أنه أقل توغلا ويستخدم على نطاق واسع في الإعدادات السريرية لمجموعة من أمراض العين.
لقد أثبتنا سابقا فعالية التوصيل داخل الجسم الزجاجي لمنتج العلاج الجيني بوساطة الفيروس الغدي (AAV9). CLN5) في الأغنام مع شكل CLN5 يحدث بشكل طبيعي من داء الشحمي العصبي السيرويد (NCL). تلقت الأغنام المصابة العلاج الجيني IVT في عين واحدة ، مع العين الأخرى غير المعالجة بمثابة عنصر تحكم داخلي. تم الحفاظ على بنية الشبكية ووظيفتها في العين المعالجة لمدة تصل إلى 15 شهرا بعد العلاج ، في حين أظهرت العين غير المعالجة انخفاضا تدريجيا في الوظيفة وضمورا شديدا أثناء فحص ما بعد الوفاة. بناء على دراسات الأغنام ، تم مسح منتج العلاج الجيني CLN5 كدواء جديد تجريبي مرشح (IND) من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية في سبتمبر 2021. توضح هذه الورقة بالتفصيل البروتوكول الجراحي لتوصيل IVT لناقل فيروسي علاجي إلى عين الأغنام.
Introduction
يمكن استخدام عدة طرق لتوصيل العوامل العلاجية إلى شبكية العين ، بما في ذلك داخل الجسم الزجاجي (IVT) ، أو تحت الشبكية ، أو فوق المشيمية ، أو حول العين ، أو الموضعية. يتضمن كل طريق من طرق الإدارة التغلب على الحواجز مثل حاجز الدم والشبكية أو الأغشية الداخلية والخارجية المحددة وله معدلات متفاوتة من الفعالية اعتمادا على الدواء الذي يتم تسليمه وهدف الشبكية المحدد 1,2.
يتضمن توصيل الدواء IVT حقنا في الخلط الزجاجي للعين ، وهي مادة هلامية تحتل الغرفة الخلفية للعين. تتمثل الوظيفة الأساسية لخلط الجسم الزجاجي في الحفاظ على شكل كرة العين والحفاظ على أنسجة العين ، مثل العدسة والشبكية ، في مكانها. يتكون الخلط الزجاجي إلى حد كبير من الماء ، مع كميات صغيرة من الكولاجين وحمض الهيالورونيك والبروتينات غير الكولاجينية الأخرى3. حقن IVT هو إجراء بسيط وشائع يستخدم بشكل روتيني لعلاج مجموعة واسعة من حالات العين ، بما في ذلك التنكس البقعي المرتبط بالعمر ، والوذمة البقعية السكرية ، واعتلال الشبكية السكري ، وانسداد الوريد الشبكي ، والعديد من ضمور الشبكية الموروث 4,5.
ليبوفوسينوس سيرويد عصبي (NCL; مرض باتن) هي مجموعة من أمراض التخزين الليزوزومية القاتلة التي تسبب تنكسا شديدا في الدماغ والشبكية. يوجد حاليا 13 متغيرا معروفا من NCL ناتجة عن طفرات في جينات مختلفة (CLN1-8 ، CLN10-14) تؤثر في الغالب على الأطفال ولكن لها أعمار متفاوتة من البداية وشدة المرض6. تشترك NCLs في الأعراض التقدمية الشائعة ، بما في ذلك التدهور المعرفي والحركي والنوبات وفقدان الرؤية. لا يوجد علاج ل NCL. ومع ذلك ، فإن العلاج ببدائل الإنزيم الموجه للدماغ يخضع حاليا للتجارب السريرية لمرض CLN27,8 ، وقد أظهر العلاج الجيني بوساطة AAV وعدا كبيرا في الدراسات قبل السريرية ، مع تجربة سريرية للعلاج الجيني CLN5 من المتوقع أن تبدأ في عام 2022 9,10.
تطور العديد من الأنواع الأخرى أشكالا طبيعية من NCL ، بما في ذلك القطط والكلاب والأغنام والأبقار. يخضع حاليا نموذجان من الأغنام من NCL للدراسة النشطة في نيوزيلندا: نموذج مرض CLN5 في أغنام بوردرديل ونموذج مرض CLN6 في أغنام جنوب هامبشاير. تظهر الأغنام المصابة العديد من السمات السريرية والمرضية للمرض البشري ، بما في ذلك ضمور الشبكية وفقدان الرؤية10,11. على الرغم من أن العلاج الجيني CLN5 الموجه للدماغ في الأغنام المصابة بمرض CLN5 يمكن أن يمنع أو يوقف ضمور الدماغ والتدهور السريري ، إلا أن الأغنام المعالجة لا تزال تفقد رؤيتها9. وقد سلط ذلك الضوء على الحاجة إلى علاج شبكية العين للحفاظ على الرؤية والحفاظ على نوعية حياة أفضل ، مما أدى إلى إنشاء بروتوكول للعلاج الجيني للعين في الأغنام.
تمثل عين الأغنام نموذجا جيدا للعين البشرية نظرا لتشابهها في أبعاد كرة العين وحجم الجسم الزجاجي وبنية الشبكية10،12،13. تفصل هذه الورقة البروتوكول الجراحي لتوصيل IVT بحجم صغير (≤100 ميكرولتر) من الناقل الفيروسي العلاجي إلى عين الأغنام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة لينكولن وتتماشى مع إرشادات المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة لرعاية الحيوانات واستخدامها في الأبحاث وقانون رعاية الحيوان النيوزيلندي (1999). تم تشخيص أغنام بوردرديل عند الولادة14 وتم الاحتفاظ بها في مزارع أبحاث جامعة لينكولن. تلقت ثلاث نعاج متماثلة الزيجوت (CLN5-/-) تبلغ من العمر 3 أشهر حقنة IVT واحدة في العين اليسرى ، مع عمل العين اليمنى غير المعالجة كعنصر تحكم داخلي. تمت مقارنة بيانات تخطيط كهربية الشبكية وعلم الأمراض ببيانات التحكم التاريخية الصحية والمتأثرة. كان الناقل الفيروسي المستخدم في هذه الدراسة عبارة عن فيروس مرتبط بالغدي مكمل ذاتيا من النمط المصلي 9 ، يحتوي على مروج عمل بيتا الدجاج (CBh) والأغنام CLN5 المحسنة للكودونات (scAAV9 / CBh-oCLN5opt). تم توفير الناقل الفيروسي من قبل جامعة نورث كارولينا فيكتور كور ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكية.
1. قبل الجراحة
- الأوتوكلاف عدة الجراحية (الشكل 1).
- صوم الأغنام لمدة 24 ساعة قبل الجراحة.
- سجل الأوزان الحية قبل الجراحة.
الشكل 1: طقم الجراحة داخل الجسم الزجاجي. تشمل الأدوات المطلوبة لجراحة IVT (1) منظار لإبقاء الجفون مفتوحة و (2) زوج من ملقط الأنف المنحني للإمساك بالملتحمة البصلية وتدوير العين. (3) يتم تضمين مرقئ الأنف المستقيم أيضا كأداة بديلة للإمساك بالملتحمة البصلية وتثبيت العين في مكانها إذا عادت إلى مدار العين. يتم تعقيم هذه المجموعة قبل الجراحة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
2. الإجراء الجراحي
- كبح جماح الحيوان ، وباستخدام كليبرز الإلكترونية ، حلق الصوف من جانب واحد من الرقبة على الوريد الوداجي.
- قم بسد الوريد الوداجي عن طريق الضغط على قاعدة الأخدود الوداجي وتصور الوريد المرتفع.
- ضع الكمية المناسبة من الديازيبام (0.3 ملغ/كغ) والكيتامين (7.5 ملغ/كغم) في حقنة معقمة وأرفق إبرة معقمة وزنها 20 غ. أدخل الإبرة في الوريد الوداجي واسحب المكبس برفق للتأكد من دخول الدم إلى المحور وأن الإبرة داخل الوريد. بمجرد التأكيد ، يتم الحث من خلال الحقن الوريدي (الوداجي).
- مباشرة بعد الحث ، ضع الحيوان في راقد ظهري ، ومد الرقبة ، وأمسك اللسان لأعلى وللأمام ، باستخدام منظار الحنجرة لتصور الحنجرة. قم بإجراء التنبيب الرغامي عن طريق إدخال أنبوب القصبة الهوائية برفق (الحجم 6.0-9.0 حسب حجم الأغنام) بين الحبال الصوتية عند زفير الحيوان. قم بنفخ الكفة الرغامية على الفور وقم بتأمين الأنبوب برباط حول الفك السفلي. تأكد من تدفق الهواء عبر الأنبوب.
- نقل الأغنام إلى طاولة الجراحة ووضعها في راقد جانبي.
- قم بتوصيل أنبوب القصبة الهوائية على الفور بخراطيم آلة التخدير لتوصيل إيزوفلوران في أكسجين 100٪. ابدأ في البداية ب 3٪ -4٪ إيزوفلوران ثم قلل إلى 2٪ -3٪ للصيانة. مراقبة التهوية التلقائية للأغنام.
- مراقبة معدل ضربات القلب (النبض) ، ومعدل التنفس ، وتشبع الأكسجين ، ومستويات CO2 في نهاية المد والجزر ، ودرجة حرارة الجسم المستقيم طوال العملية. انظر الجدول 1 لمعرفة القيم الفسيولوجية لهذه المعلمات في الأغنام المخدرة (متغير ، ولكن يستخدم كإرشاد).
- ضع ستارة كبيرة ومعقمة ومربعة على عربة العمليات الجراحية ، متبوعة بالأدوات المعقمة.
- ضع ستارة جراحية معقمة ومغطاة على العين المراد حقنها.
- تطهير العين بشكل معقم باستخدام حقنة معقمة سعة 20 مل لري العين بمحلول بوفيدون اليود 1-5٪.
- ضع 1-2 قطرات من Alcaine 0.5٪ W / V محلول العيون ، كمخدر موضعي ، على العين.
- قم بتركيب منظار العين Nopa Barraquer-Colibri (10 مم) على الجفون لإبقاء العين مفتوحة.
- أمسك الملتحمة البصلية على الجانب الظهري الجانبي للعين بالملقط ، وقم بتدوير كرة العين من الناحية البطنية.
| واعي | التخدير | نقطة التدخل الحرجة الموصى بها | |
| معدل ضربات القلب (يدق / دقيقة) | 50-80 (بقية) إلى 280 (نشط) | 50-80 | <50 ، >100 |
| معدل التنفس (أنفاس / دقيقة) | 15-40 (بقية) إلى 350 (محموم) | 10-30 | <8 , >40 |
| تشبع الأكسجين (مم زئبق) | 95-100 | 98-100 | <90 |
| ثاني أكسيد الكربون في نهاية المد والجزر2 (مم زئبق) | 35-45 | 35-45 | >55 |
| درجة حرارة الجسم (°C) | 38.5-39.5 | 38.5-39.5 | <36 ، >40 |
الجدول 1: القيم الفسيولوجية للمعلمات التي يجب مراقبتها في الأغنام المخدرة.
3. التحضير الفيروسي
- قم بتخزين حصص ناقل AAV عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- في يوم الجراحة ، قم بإذابة العدد المطلوب من القوارير لتسليم IVT على الجليد.
- مباشرة قبل الإعطاء ، دوامة القسمة الفيروسية الناقل وأجهزة الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 10 ثوان لجمع المحتويات.
- قم بتخفيف كل قلمة ناقل فيروسي في محلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (PBS) إلى الجرعة المطلوبة في حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر. تحضير تخفيفات النواقل في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 مل منخفض البروتين باستخدام أطراف ماصة مرشح معقمة. تخلص من جميع المواد الاستهلاكية التي كانت على اتصال مع الناقل الفيروسي في محلول مطهر (انظر جدول المواد).
ملاحظة: في المنشور الأصلي15 جرعة العامل العلاجي (AAV9. CLN5) كان 1.9 × 1010 جينومات فيروسية. تختلف الجرعة الموصى بها اعتمادا على العامل العلاجي الذي يتم إعطاؤه. لذلك ، لم يتم تضمين جرعة في البروتوكول القياسي المقدم هنا. - ارسم 100 ميكرولتر كاملة من مستحضر ناقل AAV في حقنة معقمة منخفضة الميتة سعة 1 مل مع إبرة 28 جم × 1/2 متصلة بشكل دائم للحقن الفوري. تأكد من أن طول الوقت من التحضير إلى الحقن أقل من 2 دقيقة.
4. الإدارة الفيروسية
- أدخل الإبرة حوالي 7 مم خلف الصلبة على الجانب الجانبي للعين وزاوية خلفية لتجنب العدسة (الشكل 2 والشكل 3). تطبيق حقنة واحدة من 100 ميكرولتر كبلعة قريبة من شبكية العين قدر الإمكان دون إزعاج سطح الشبكية.
- شطف العين مع ما يقرب من 10-15 مل من 1-5 ٪ محلول بوفيدون اليود تليها 10 مل من المياه المالحة قبل إزالة المنظار والستارة.
- اقلب الخروف وكرر بالعين الأخرى إذا لزم الأمر.
الشكل 2: الدوران البطني لكرة العين . (أ) أمسك الملتحمة البصلية بالملقط غير المسنن و (ب) قم بالدوران البطني (أي لأسفل ونحو الخطم) لكشف السطح الظهري الوحشي للعين للحقن. الاختصارات: V = بطني ، D = ظهري ، M = وسطي ، L = جانبي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: موقع الحقن وعمقه. يتم حقن الإبرة على الجانب الظهري الجانبي من كرة العين ، ويتم إدخال الطول الكامل لعمود الإبرة (0.5 بوصة / 12.7 مم) في العين. لاحظ زاوية الإبرة باتجاه مؤخرة العين لتجنب العدسة والحقن بالقرب من شبكية العين قدر الإمكان. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
5. إدارة ما بعد الجراحة
- عند الانتهاء من الإجراء ، أوقف التخدير باستنشاق غاز الأيزوفلوران ، واغسل الخط بالأكسجين بنسبة 100٪ ، وافصل الخرطوم عن أنبوب القصبة الهوائية ، وانقل الأغنام إلى غرفة الإنعاش.
- ضع الخروف في رقد القص ، مع وضع الأرجل تحته ، وراقبه حتى الشفاء التام. تأكد من خلو فم الحيوان من أي عوائق.
- عند ملاحظة منعكس البلع ، قم بتفريغ الكفة جزئيا من الأنبوب الرغامي وإزالة الأنبوب برفق من الفم.
- تطبيق مضاد التهاب غير ستيرويدي عضلي في العضلة ذات الرأسين الفخذية للطرف الخلفي، والمضادات الحيوية تحت الجلد على جانب الرقبة أو خلف الكتف، وقطرات العين الكلورامفينيكول 0.5٪ على سطح كرة العين.
- توفير الماء والغذاء (كريات لوسيرن والقشر) بمجرد أن تتمكن الأغنام من الوقوف دون مساعدة.
- يتم تطبيق 0.5٪ قطرات العين الكلورامفينيكول 2-3 يوميا لمدة 7 أيام بعد الجراحة.
- احتفظ بالأغنام في الداخل طوال الليل قبل العودة إلى الحلبة الخارجية بعد حوالي 24 ساعة من الجراحة.
- سجل درجات حرارة المستقيم يوميا لمدة 3 أسابيع. راقب أي تغييرات في النبض أو معدل التنفس ، واستهلاك الطعام ، والسلوك العصبي ، ودرجة حرارة الجسم ، والوزن ، والموقف ، وصحة العين ، والعلامات السريرية لاعتلال الصحة. اطلب العلاج البيطري المناسب إذا كانت هناك أي مؤشرات على الأحداث السلبية.
6. تقييم الفعالية في الجسم الحي
- إذا كان الهدف من حقن IVT هو الحفاظ على الرؤية ، راقب الفعالية في الجسم الحي بطرق مثل اختبار المتاهة أو تخطيط كهربية الشبكية (ERG) لتقييم وظيفة خلايا الشبكية أو التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) لتقييم بنية الشبكية.
ملاحظة: تم وصف تدابير الفعالية هذه بشكل جيد بعد العلاج الجيني IVT11،15،16.
7. تحليل الأنسجة بعد الوفاة
- إجراء القتل الرحيم للأغنام بطريقة معتمدة في نقطة نهاية مناسبة بعد جراحة الحقن داخل الجسم الزجاجي.
ملاحظة: طرق القتل الرحيم المقترحة ، مثل أدوية القتل الرحيم البيطرية عن طريق الوريد أو صاعقة أسيرة مخترقة للعمود الفقري العنقي متبوعة بالاستنزاف السريع ، مفصلة في مكان آخر15,16. - حصاد كرات عين الأغنام باستخدام مقص منحني حاد / حادة جراحية. قم بقطع العلبة الجانبية والإنسية لزيادة فتحة محجر العين ثم قم بقطع طيات الملتحمة والنسيج الضام والعضلات والعصب البصري بشكل منهجي لتحرير كرة العين من التجويف.
- تثبيت الغمر سليم ، كرات العين منزوعة النواة في 10٪ فورمالين لمدة 2 ساعة ، تليها التثبيت اللاحق في محلول بوين لمدة 4 ساعات ، مما يجعل قطعا صغيرا (0.5 سم) في الصلبة للسماح بالتروية الكافية. بدلا من ذلك ، قم بإصلاح كرات العين في حل ديفيدسون لمدة 48 ساعة.
- معالجة أقسام أنسجة العين عن طريق تضمين شمع البارافين الروتيني وتقسيمه عند 3-5 ميكرومتر.
ملاحظة: تم وصف إجراءات تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) والتحليل الكيميائي المناعي سابقا15،16. - تقييم الفعالية في أنسجة ما بعد الوفاة من خلال تدابير مثل سمك الشبكية الكلي ، وسمك طبقة الشبكية ، وعدد الصفوف الخلوية للطبقة النووية الخارجية ، والتلوين الكيميائي المناعي لأنواع خلايا الشبكية ، أو الدبقية في الشبكية ، أو البروتينات ذات الأهمية.
ملاحظة: للاطلاع على بروتوكولات هذه التحليلات، انظر المنشورات السابقة15، 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إثبات فعالية توصيل IVT لناقل العلاج الجيني CLN5 في تخفيف ضعف الشبكية وانحطاطها في الأغنام باستخدام CLN5 NCL من قبل مجموعة البحث15 هذه. تلقت الأغنام المصابة حقنة IVT واحدة 100 ميكرولتر من CLN5 معبأة في ناقل AAV من النمط المصلي 9 (AAV9) (AAV9. CLN5) في عين واحدة ، مع العين المقابلة بمثابة عنصر تحكم داخلي غير معالج. تم تقييم الرؤية شهريا من العمر عند الحقن (3 أشهر) إلى المرحلة النهائية من المرض (18 شهرا). تم إجراء تحليل ما بعد الوفاة لأنسجة الشبكية على العيون المعالجة وغير المعالجة ، بالإضافة إلى الضوابط الصحية المتطابقة مع العمر والمتأثرة ب CLN5.
أظهر تحليل تخطيط كهربية الشبكية (ERG) الحفاظ على وظيفة الشبكية في العين المعالجة ، بينما انخفضت العين غير المعالجة بطريقة مماثلة للحيوانات المصابة ب CLN5 (الشكل 4)15. كانت أنسجة الشبكية شبه طبيعية في العين المعالجة ، مع سمك شبكي إجمالي يمكن مقارنته بالحيوانات الضابطة السليمة في الشبكية المركزية. في المقابل ، كان سمك شبكية العين غير المعالجة مشابها للحيوانات المصابة ب CLN5 (الشكل 5) 15. لم يلاحظ التخزين الليزوزومي ، وهو سمة مرضية مميزة ل NCL ، في العين المعالجة ولكنه كان موجودا في العين غير المعالجة15. توضح هذه النتائج أن ناقل العلاج الجيني الذي تم تسليمه عن طريق الحقن الوريدي كان قادرا على وقف التسبب في المرض في عين الأغنام المصابة ب CLN5. كان التعبير عن البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، وهو علامة على إجهاد الشبكية والخلايا النجمية ، أقل في العيون المعالجة منه في العيون غير المعالجة ، مما يشير إلى أن الالتهاب المرتبط بالمرض قد تم تخفيفه بعد العلاج (الشكل 6)15.
الشكل 4: استجابات ERG المتكيفة مع الظلام ل CLN5-/- الأغنام بعد الولادة داخل الجسم الزجاجي ل AAV9. CLN5. (أ) متوسط سعة ERG (± SEM) بمرور الوقت في العيون المعالجة (الأخضر الداكن ، n = 3) وغير المعالجة (الأخضر الفاتح ، n = 3) للأغنام CLN5 - / - ، وكذلك الأغنام الضابطة الصحية (الأزرق ، n = 6) و CLN5 المتأثرة (الأحمر ، n = 6). (ب) آثار ERG التمثيلية من العيون المعالجة وغير المعالجة والضوابط الصحية والأغنام المصابة في عمر 5 (الخط الأسود) و 17 (الخط الرمادي). * يشير إلى P < 0.05. هذا الرقم المستنسخ مأخوذ من Murray et al.15 بإذن من Elsevier. الاختصارات: ERG = تخطيط كهربية الشبكية ؛ AAV = الفيروس المرتبط بالغدي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: سمك الشبكية ل CLN5-/- الأغنام بعد الولادة داخل الجسم الزجاجي ل AAV9. CLN5. صور مجهرية تمثيلية للتلطيخ النسيجي H&E في العيون المعالجة وغير المعالجة للأغنام CLN5 - / - مقارنة بالضوابط المتطابقة مع العمر. تم التقاط الصور وقياسات السمك في موقعين. الشبكية المركزية (A-E) والشبكية المحيطية (F-J). (ه) متوسط سمك الشبكية (± SEM) (ميكرومتر) في الشبكية المركزية للعيون المعالجة (الأخضر الداكن ، ن = 3) وغير المعالجة (الأخضر الفاتح ، ن = 3) مقارنة بالسيطرة الصحية (الأزرق ، ن = 4) و CLN5 المتأثرة (الأحمر ، ن = 4). (ي) متوسط سمك الشبكية (± SEM) (ميكرومتر) في الشبكية المحيطية للعيون المعالجة وغير المعالجة لأغنام CLN5-/- مقارنة بالسيطرة السليمة والشبكية المصابة CLN5. * يشير إلى P < 0.05 ، **** يشير إلى P < 0.0001. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. هذا الرقم مستنسخ من Murray et al.15 بإذن من Elsevier. الاختصارات: NFL = طبقة الألياف العصبية ؛ GCL = طبقة خلية العقدة ؛ IPL = طبقة الضفيرة الداخلية ؛ INL = الطبقة النووية الداخلية ؛ OPL = طبقة الضفيرة الخارجية ؛ ONL = الطبقة النووية الخارجية ؛ IS / OS = الأجزاء الداخلية والخارجية للمستقبلات الضوئية ؛ RPE = ظهارة صبغة الشبكية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: النشاط المناعي GFAP في شبكية الأغنام CLN5 - بعد الولادة داخل الجسم الزجاجي ل AAV9. CLN5. صور تمثيلية متحدة البؤر للتفاعل المناعي GFAP في العيون المعالجة وغير المعالجة للأغنام CLN5 - مقارنة بالشواهد. (أ - د) النشاط المناعي GFAP ، (E-H) علامة DAPI النووية ، (I-L) صور مدمجة للقناتين. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. هذا الرقم مستنسخ من Murray et al.15 بإذن من Elsevier. الاختصارات: NFL = طبقة الألياف العصبية ؛ GCL = طبقة خلية العقدة ؛ INL = الطبقة النووية الداخلية ؛ ONL = الطبقة النووية الخارجية ؛ IS / OS = الأجزاء الداخلية والخارجية للمستقبلات الضوئية ؛ GFAP = البروتين الحمضي الليفي الدبقي ؛ DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحقن داخل الجسم الزجاجي هي واحدة من أكثر العمليات الجراحية شيوعا في طب العيون البشري وقد أثبتت فعاليتها في تقديم العلاجات الجينية بوساطة AAV إلى شبكية الأغنام. لقد أثبتنا سابقا فعالية AAV9. قدم العلاج الجيني CLN5 داخل الجسم الزجاجي في تخفيف ضعف الشبكية وانحطاطها في الأغنام باستخدام CLN5 NCL15. ومن المأمول أن تكون ترجمة هذا الطريق من الإدارة لمرضى NCL من البشر مفيدة أيضا.
بروتوكول حقن IVT صغير الحجم في عين الغنم واضح نسبيا وغير جراحي ، وقابل للتكرار بسهولة ، ويسهل على غير الخبراء تعلمه. يعتمد النجاح على الخلايا المستهدفة داخل شبكية العين ، والعلاج الذي يتم تقديمه ، وموقع واتجاه الحقن نفسه. على الرغم من أنه غالبا ما يعتقد أن حقن IVT هي الأكثر فعالية في استهداف طبقات الشبكية الداخلية ، فقد أثبت العديد من الباحثين فعالية حقن IVT في الأمراض التي تكون فيها الشبكية الخارجية هي الموقع الرئيسي للإمراض المرضي15،17،18،19. من المحتمل أيضا أن ترتبط الاختلافات في النتائج الوظيفية والمرضية بعد حقن IVT بنوع العلاج المعطى. على سبيل المثال، ثبت أن العلاج الجيني لتوصيل الجينات التي تشفر البروتينات القابلة للذوبان (على سبيل المثال، CLN5) أكثر فعالية بكثير من العلاجات الجينية لتوصيل الجينات التي تشفر البروتينات داخل الخلايا أو المرتبطة بالغشاء (على سبيل المثال، CLN6)15. بغض النظر عن الهدف ونوع العلاج ، من الأهمية بمكان تصحيح موقع الحقن والزاوية لزيادة الفعالية. كما هو موضح في البروتوكول ، يجب أن يكون موقع حقن الأغنام حوالي 7 مم خلف الصلبة على الجانب الجانبي للعين وبزاوية خلفية لاستهداف الجسم الزجاجي الخلفي. إن تحريك الإبرة هو تجنب العدسة وتوجيه الدواء المحقون بالقرب من شبكية العين قدر الإمكان. يعد استخدام حقنة أمان مع إبرة متصلة بشكل دائم 28 جم (أو أصغر) × 0.5 في إبرة الفضاء المنخفض الميت أمرا بالغ الأهمية لتقليل الانزعاج المرتبط بالحقن والحجم الميت المتبقي في الإبرة أو المحور. يمكن إدخال إبرة الطول هذه بالكامل في عين الغنم بزاوية خلفية بدون مجهر جراحي و / أو خطر ثقب الشبكية. يمكن للباحثين الذين لديهم إمكانية الوصول إلى المجهر الجراحي استخدام هذا لتوفير مستوى إضافي من اليقين حول تجنب اضطراب الشبكية. خلاف ذلك ، فإن استخدام محاقن الأمان وإدراك أبعاد كرة عين الأغنام في العمر الذي يتم علاجه يكفي لتنفيذ هذا الإجراء بأمان15.
عند إمساك العين لتدويرها وسطيا وكشف موقع الحقن ، من الضروري استخدام أدوات غير مسننة غير رضحية لتجنب إتلاف الأنسجة الحساسة للعين. إذا تم وضع العين مركزيا ، فمن السهل نسبيا الإمساك بالملتحمة البصلية عند حدود الصلبة والقزحية وتدويرها بيد واحدة ، أثناء الحقن باليد الأخرى. ومع ذلك ، إذا كانت العين قد استدارت خارج المركز ، والتي يمكن أن تحدث تحت التخدير العام ، فمن الضروري في كثير من الأحيان استخدام مرقئ لتثبيت الملتحمة البصلية وتدوير العين في موضعها ، وترك مرقئ في مكانه لمواصلة الإجراء.
عيون الأغنام قوية وتتعافى جيدا بعد العلاج IVT مع AAV9 تحمل الأغنام CLN5 ، مع خروف واحد فقط يصاب بالتهاب القزحية في العين المعالجة بعد أسبوع واحد من الحقن15. في هذه الحالة ، تم حل التهاب القزحية في غضون 1 أسبوع ولم يكن له أي تأثير طويل المدى على الرؤية. بصرف النظر عن هذه الحالة الواحدة ، لم يتم الإبلاغ عن أي آثار سلبية لحقن IVT في الدراسة المنشورة الأولى15 ، أو في >30 حيوانا إضافيا في برنامج البحث تم حقنها في عمر 3 أشهر أو 6 أشهر أو 9 أشهر باتباع البروتوكول الموصوف هنا. ومع ذلك ، هناك مقاييس كمية إضافية لسلامة الحقن قد يرغب الباحثون في التفكير في إضافتها إلى تقييمات ما بعد الجراحة. وتشمل هذه مقاييس ضغط العين (IOP) أو تصوير قاع العين أو OCT. يمكن أن تبرز صور قاع العين قبل الحقن وبعده ما إذا كان هناك أي اضطراب في شبكية العين بسبب الحقن ، وعلى المدى الطويل ، يمكن أن توفر نظرة عامة على صحة الشبكية بشكل عام.
في حالة حقن علامة الفلورسنت ، يمكن أن يساعد التصوير الفلوري لقاع العين في تصور انتشار العلامة المحقونة16,20. يمكن استخدام OCT لتصور شبكية العين في المقطع العرضي في الجسم الحي لتحديد أي ضرر هيكلي محتمل بعد الحقن وقياس سمك الشبكية بمرور الوقت استجابة للعلاج. يمكن أيضا تقييم الوظيفة البصرية بعد الحقن عن طريق ERG أو اختبار المتاهة15,16. في حالة العلاج الجيني بوساطة الفيروسات IVT ، ينبغي النظر في تأثير الاستجابة المناعية ووجود الأجسام المضادة المعادلة لنواقل AAV. على الرغم من أنه ليس جزءا من البروتوكول الموضح هنا للأغنام ، إلا أنه يقترح أن يتم اختبار الأشخاص لوجود أجسام مضادة معادلة ل AAV قبل العلاج الجيني ، بغض النظر عن طريق الإعطاء ، لزيادة كفاءة النقل16,21. تتم إحالة القراء إلى مناقشة أكثر شمولا لمسألة الاستجابات المناعية ل AAV بواسطة Whitehead et al.22.
من المضاعفات الشائعة أثناء إجراءات IVT النزف تحت الملتحمة (SCH)23 ، والذي يمكن أن يحدث إذا تم ثقب الشعيرات الدموية في الملتحمة البصلية أثناء إدخال الإبرة. لحسن الحظ ، SCH غير ضار بشكل عام ويحل في غضون أيام قليلة. ومع ذلك ، فمن الأفضل تجنب الشعيرات الدموية الملتحمة عند إدخال الإبرة. بعد الحقن الوريدي، من المهم علاج العيون المحقونة بقطرات العين المضادة للمضادات الحيوية (مثل الكلورامفينيكول) ومراقبة العينين بحثا عن أي علامات للعدوى أو الالتهاب (التهاب العنبية). حدث شائع آخر خلال إجراءات IVT هو زيادة IOP. هذه الزيادات هي الأكثر شيوعا طفرات عابرة في الضغط في الدقائق التالية للحقن ولا تسبب أي ضرر طويل الأمد24,25. ومع ذلك ، هناك حالات يجب فيها النظر في IOP ومراقبته. عند وجود حالات بصرية موجودة مسبقا مثل الجلوكوما ، أو عند حقن كميات أكبر (≥100 ميكرولتر) ، يجب مراقبة IOP عن كثب ، ويجب النظر في بزل الغرفة الأمامية الوقائي لتقليل الضغط في كرة العين 4,16. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون الارتفاعات المتكررة في IOP في حالة الحقن الوريدي المتكرر مصدر قلق ويجب تخفيفها على النحو الوارد أعلاه4. هنا ، نحن نعرض IVT لأغراض علاج جيني واحد بوساطة AAV. لذلك ، فإن العواقب طويلة المدى للحقن المتكررة ليست اعتبارا رئيسيا.
تشمل قيود حقن IVT الحاجة إلى اختراق الحواجز التشريحية وخصوصية الهدف الأقل مقارنة بالطرق الأكثر توغلا. أولا ، سيتم تخفيف المادة المحقونة في الجسم الزجاجي ثم يكون لها مسافة تنتشر عبر التجويف الزجاجي وأنسجة الشبكية إلى الخلايا المستهدفة. هذا يعني أن الشبكية الداخلية تتحول بسهولة أكبر من الشبكية الخارجية بعد حقن IVT ، وقد تكون هناك حاجة إلى جرعات أعلى لمواجهة التخفيف26. يؤكد البروتوكول الموصوف هنا على أهمية الحقن بالقرب من شبكية العين قدر الإمكان للتخفيف من آثار التخفيف والانتشار عبر الجسم الزجاجي. لذلك ، يتم إدخال الطول الكامل لعمود الإبرة 0.5 بوصة / 12.7 مم في العين. الميزة الإضافية لإدخال طول الإبرة بالكامل هي انخفاض فرصة ارتجاع السوائل أثناء الحقن 4,27.
على الرغم من أن هذا البروتوكول الحالي يحذفه ، فمن المستحسن تأخير إزالة الإبرة لعدة دقائق بعد الحقن لتقليل فرص ارتجاع السوائل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يتم الحقن ببطء للتأكد من أن نفاثة السائل المحقون لا تعطل شبكية العين أو تسبب ارتفاعا سريعا في IOP ، ولا تؤثر زيادة سرعة الحقن على معدلات الانتشار من خلال الجسم الزجاجي28,29. الغشاء الداخلي المحدد (ILM) هو الحاجز الأساسي بين الجسم الزجاجي والشبكية ، والذي يعمل على تقييد حركة الجزيئات في شبكية العين30. ومع ذلك ، يمكن زيادة نفاذية ILM عن طريق الهضم أو التقشير الجراحي ومن المحتمل أن تزداد في العين المريضة ، مما يجعل تغلغل الجزيئات العلاجية أسهل.
فيما يتعلق بخصوصية الهدف ، فإن إعطاء IVT هو الأقل مقارنة بالطرق الأخرى داخل العين مثل تحت الشبكية وفوق المشيمية ، كما تمت مناقشته أعلاه وفي أماكن أخرى10. ومع ذلك ، يتم تطوير أجيال جديدة من AAVs بشكل روتيني لاحتواء التعديلات ، والتي تعزز استهداف أنواع معينة من الخلايا أو التغلب على الحواجز بشكل أكثر كفاءة مثل ILM31. أدى استخدام هذه القفيصات المعدلة إلى زيادة كفاءة النقل بعد إعطاء IVT في عدد من الأنواع النموذجية5،32،33.
كان الهدف من العلاج الجيني المفصل من قبل Murray et al.15 هو تقديم نسخة وظيفية من جين CLN5 . لذلك ، فإن أحد مقاييس الفعالية هو وجود خلايا محولة تعبر عن بروتين CLN5. لقد حاولنا استخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية للكشف عن الخلايا المنقولة CLN5 في شبكية العين ، كما نفعل بشكل روتيني في أنسجة دماغ الأغنام. ومع ذلك ، فإن الجسم المضاد الذي نستخدمه عادة في أنسجة المخ العائمة الحرة لا يعمل في أنسجة الشبكية المضمنة بالبارافين. يجري استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحقيق في طرق بديلة للكشف عن الجين أو البروتين ذي الأهمية في شبكية العين لإضافة إلى تقييم الفعالية. إحدى الطرق المحتملة لتحقيق ذلك هي عن طريق حقن ناقل فيروسي يحتوي على جين مراسل (مثل البروتين الفلوري الأخضر. GFP) وتقييم تعبير GFP عن طريق الكيمياء الهيستولوجية المناعية. هناك طريقة أخرى لتقييم الفعالية وهي استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لتقييم مستويات التعبير الجيني المحور.
يعد تطوير بروتوكولات لحقن IVT في الحيوانات الكبيرة خطوة حاسمة نحو علاج الأمراض التنكسية في شبكية العين ، وخاصة الأمراض ذات المكون الوراثي ، حيث يعد العلاج الجيني IVT علاجا محتملا واعدا. بالنسبة للأمراض التنكسية حيث تكون الشبكية هشة بالفعل ، فإن علاج IVT يشكل خطرا أقل لانفصال الشبكية أو تمزقها. نظرا لأوجه التشابه في حجم وهيكل الأغنام والعيون البشرية ، فإن تحسين جرعة وحجم حقن IVT في الأغنام يعد خطوة ذات صلة نحو الترجمة إلى العيادة. توضح هذه الورقة بالتفصيل بروتوكول حقن IVT في عين الغنم ، وهو آمن ويظهر معدلا منخفضا جدا من الاستجابات الالتهابية للعين. توضح هذه الطريقة أيضا فعالية العلاج الجيني العيني بوساطة AAV9 لمعالجة مكون الشبكية من NCL في الأغنام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور ستيف هيب (BVSc ، CertVOphthal) لمساعدته في إنشاء هذا البروتوكول وإجراء الحقن التي وصفها موراي وآخرون 15. يقر المؤلفون أيضا بالتمويل من CureKids New Zealand ، ومؤسسة كانتربري للأبحاث الطبية ، وشركة Neurogene Inc ، وجمعية دعم وأبحاث مرض باتن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | 05-561-28 | Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sigma Aldrich | HS4323 | Autoclave tubes to sterilise prior to use |
| Anesthesia machine with gas bench and monitor | Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand | ||
| Antibiotic eye drops | Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand | Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol) | |
| BrightMount plus anti-fade mounting medium | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab103748 | |
| DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States | 10236276001 | |
| Diazepam sedative | Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand | 5 mg/mL | |
| Endotracheal tubes | Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom | Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size | |
| Eye speculum | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | KP151/14 | Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) |
| Fenestrated surgical drape | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | DI583 | Or similar |
| Filter Tips | Interlab, Auckland, New Zealand | 10, 200, and 1,000 µL | |
| Formaldehyde solution (37%) | Fisher Scientific, Auckland, New Zealand | AJA809-2.5PL | Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen Carlsbad, CA, USA | A-11012 | Use at a dilution of 1:500 |
| Isoflurane anesthetic | Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand | ||
| Ketamine HCl anesthetic/analgesic | PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand | 100 mg/mL | |
| Laryngoscope (veterinary) | KaWe Medical, Denmark | Miller C blade, size 2 | |
| Needles | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 302025 | BD Hypodermic Needles, or similar |
| Non-steroidal anti-inflammatory | Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand | 49402/008 | Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam) |
| Non-toothed forceps | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AB864/16 | Or similar |
| Non-toothed hemostat | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AA150/12 | Or similar |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 16210072 | |
| Oxygen (medical) | BOC Gas, Christchurch, New Zealand | D2 cylinder, gas code 180 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand | 10010023 | Sterile, filtered |
| Povidone-Iodine solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | 005835 | Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine) |
| Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP) | Dako, Glostrup, Denmark | Z0334 | Use at a dilution of 1:2,500 |
| Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5 | University of North Carolina Vector Core, NC, USA. | scAAV9/CBh-oCLN5opt | |
| Sodium Chloride 0.9% IV Solution | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | AHB1322 | Commercial name: Saline solution |
| Subcutaneous antibiotics | Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand | Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin) | |
| Surgical sharp blunt curved scissors | Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand | SSSHBLC130 | |
| Terumo Syringe Luer Lock | Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand | SH159/SH160 | Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline |
| Virkon Disinfectant Powder | EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ | 28461115 |
References
- Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye. Neural Regeneration Research. 17 (8), 1755-1756 (2022).
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Research. 19 (3), 323-344 (2000).
- Grzybowski, A., et al. update on intravitreal injections: Euretina expert consensus recommendations. Ophthalmologica. 239 (4), 181-193 (2018).
- Pavlou, M., et al. Novel AAV capsids for intravitreal gene therapy of photoreceptor disorders. EMBO Molecular Medicine. 13 (4), 13392 (2021).
- Kousi, M., Lehesjoki, A. -E., Mole, S. E. Update of the mutation spectrum and clinical correlations of over 360 mutations in eight genes that underlie the neuronal ceroid lipofuscinoses. Human Mutation. 33 (1), 42-63 (2012).
- Wibbeler, E., et al. Cerliponase alfa for the treatment of atypical phenotypes of CLN2 disease: A retrospective case series. Journal of Child Neurology. 36 (6), 468-474 (2021).
- Schulz, A., et al. Study of intraventricular cerliponase alfa for CLN2 disease. The New England Journal of Medicine. 378 (20), 1898-1907 (2018).
- Mitchell, N. L., et al. Longitudinal in vivo monitoring of the CNS demonstrates the efficacy of gene therapy in a sheep model of CLN5 Batten disease. Molecular Therapy. 26 (10), 2366-2378 (2018).
- Murray, S. J., Mitchell, N. L. Natural history of retinal degeneration in ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Scientific Reports. 12 (1), 3670 (2022).
- Russell, K. N., Mitchell, N. L., Wellby, M. P., Barrell, G. K., Palmer, D. N. Electroretinography data from ovine models of CLN5 and CLN6 neuronal ceroid lipofuscinoses. Data in Brief. 37, 107188 (2021).
- Shafiee, A., McIntire, G. L., Sidebotham, L. C., Ward, K. W. Experimental determination and allometric prediction of vitreous volume, and retina and lens weights in Göttingen minipigs. Veterinary Ophthalmology. 11 (3), 193-196 (2008).
- Shinozaki, A., Hosaka, Y., Imagawa, T., Uehara, M. Topography of ganglion cells and photoreceptors in the sheep retina. The Journal of Comparative Neurology. 518 (12), 2305-2315 (2010).
- Frugier, T., et al. A new large animal model of CLN5 neuronal ceroid lipofuscinosis in Borderdale sheep is caused by a nucleotide substitution at a consensus splice site (c.571+1G>A) leading to excision of exon 3. Neurobiology of Disease. 29 (2), 306-315 (2008).
- Murray, S. J., et al. Intravitreal gene therapy protects against retinal dysfunction and degeneration in sheep with CLN5 Batten disease. Experimental Eye Research. 207, 108600 (2021).
- Ross, M., et al. Outer retinal transduction by AAV2-7m8 following intravitreal injection in a sheep model of CNGA3 achromatopsia. Gene Therapy. , (2021).
- Boyd, R. F., et al. Photoreceptor-targeted gene delivery using intravitreally administered AAV vectors in dogs. Gene Therapy. 23 (2), 223-230 (2016).
- Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Science Translational Medicine. 5 (189), (2013).
- Gearhart, P. M., Gearhart, C., Thompson, D. A., Petersen-Jones, S. M. Improvement of visual performance with intravitreal administration of 9-cis-retinal in Rpe65-mutant dogs. Archives of Ophthalmology. 128 (11), 1442-1448 (2010).
- Ross, M., et al. Evaluation of photoreceptor transduction efficacy of capsid-modified adeno-associated viral vectors following intravitreal and subretinal delivery in sheep. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 719-729 (2020).
- Kotterman, M. A., et al. Antibody neutralization poses a barrier to intravitreal adeno-associated viral vector gene delivery to non-human primates. Gene Therapy. 22 (2), 116-126 (2015).
- Whitehead, M., Osborne, A., Yu-Wai-Man, P., Martin, K. Humoral immune responses to AAV gene therapy in the ocular compartment. Biological Reviews. 96 (4), 1616-1644 (2021).
- Yun, C., Oh, J., Hwang, S. -Y., Kim, S. -W., Huh, K. Subconjunctival hemorrhage after intravitreal injection of anti-vascular endothelial growth factor. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (9), 1465-1470 (2015).
- Christensen, L., Cerda, A., Olson, J. L. Real-time measurement of needle forces and acute pressure changes during intravitreal injections. Clinical & Experimental Ophthalmology. 45 (8), 820-827 (2017).
- Allmendinger, A., Butt, Y. L., Mueller, C. Intraocular pressure and injection forces during intravitreal injection into enucleated porcine eyes. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 166, 87-93 (2021).
- Ross, M., Ofri, R. The future of retinal gene therapy: Evolving from subretinal to intravitreal vector delivery. Neural Regeneration Research. 16 (9), 1751-1759 (2021).
- Henein, C., et al. Hydrodynamics of intravitreal injections into liquid vitreous substitutes. Pharmaceutics. 11 (8), 371 (2019).
- Park, I., Park, H. S., Kim, H. K., Chung, W. K., Kim, K. Real-time measurement of intraocular pressure variation during automatic intravitreal injections: An ex-vivo experimental study using porcine eyes. PloS One. 16 (8), 0256344 (2021).
- Willekens, K., et al. Intravitreally injected fluid dispersion: Importance of injection technique. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1434-1441 (2017).
- Peynshaert, K., Devoldere, J., De Smedt, S. C., Remaut, K. In vitro and ex vivo models to study drug delivery barriers in the posterior segment of the eye. Advanced Drug Delivery Reviews. 126, 44-57 (2018).
- Kiss, S. Vector Considerations for Ocular Gene Therapy. Adeno-associated virus vectors offer a safe and effective tool for gene delivery. Retinal Physician. 17, 40-45 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Gene therapy targeting the inner retina rescues the retinal phenotype in a mouse model of CLN3 Batten disease. Human Gene Therapy. 31 (13-14), 709-718 (2020).
- Kleine Holthaus, S. -M., et al. Neonatal brain-directed gene therapy rescues a mouse model of neurodegenerative CLN6 Batten disease. Human Molecular Genetics. 28 (23), 3867-3879 (2019).
